专利名称：治疗血管疾病的方法
技术领域：
本发明涉及医学科学，特别是用活化的蛋白C治疗血管疾病。
背景技术：
蛋白C是一种丝氨酸蛋白酶和天然的抗凝剂，它通过在凝血级联中灭活因子Va和VIIIa从而在体内平衡的调节中扮演重要角色。人蛋白C主要在肝脏进行体内合成，形式为461个氨基酸组成的单个多肽。此前体分子进行多步翻译后修饰，包括1)将含42个氨基酸的信号序列裂解；2)由单链酶原的155位蛋白水解除去赖氨酸残基，在156位上蛋白水解除去精氨酸残基，制备双链形式的分子(即155个氨基酸残基的轻链通过二硫桥连接在含丝氨酸蛋白酶的262个氨基酸残基组成的重链上)；3)对簇聚在轻链的头42个氨基酸中的9个谷氨酸残基进行维生素K依赖性的羧基化，得到9个γ-羧基谷氨酸残基；及4)在四个位点(一个在轻链中，三个在重链中)连接碳水化合物。该重链含有构建良好的，Asp 257、His 211和Ser 360的丝氨酸蛋白酶三联体。最后，在钙离子的存在下，此循环的双链酶原被磷脂表面上的凝血酶体内活化。除去重链N末端的十二肽导致活化，产生具有酶活性的活化蛋白C(aPC)。
与其它蛋白质相联系，蛋白C可能作为最重要的凝血负调节物。换言之，蛋白C酶系统代表了抗凝的主要生理机制。
凝血系统最好看作链反应，其中酶原连续活化为活性丝氨酸蛋白酶，最后产生酶凝血酶，该酶通过有限的蛋白水解将血浆纤维蛋白原转变为不溶性胶纤维蛋白。凝血级联中的两个关键为通过凝血因子IXa将凝血因子X转变为Xa，以及通过凝血因子Xa将凝血酶原转变为凝血酶。这两个反应都发生在细胞表面，尤其是在血小板表面。这两个反应都需要辅因子。主要的辅因子因子V和因子VIII以相对无活性的前体形式在该系统中循环，但是当头几个凝血酶分子形成时，凝血酶循环回来并通过有限的蛋白水解活化这些辅因子。这些活化的辅因子Va和VIIIa通过约五个数量级放大加速凝血酶原向凝血酶及因子X向因子Xa的转化。活化的蛋白C绝大多数情况下优选两种血浆蛋白底物，对其进行水解和不可逆的破坏。这些血浆蛋白底物为凝血因子Va和VIIIa的活化形式。活化的蛋白C只最小程度地降解无活性的前体，凝血因子V和VIII。在狗体内，已表明活化的蛋白C极剧增加主要生理纤维蛋白分解酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)的循环浓度。体外试验表明活化的蛋白C提高人全血中纤维蛋白的溶解。因此，活化的蛋白C代表了人体内纤维蛋白溶解的重要助手。
今天，对血管梗塞包括栓塞性中风的有效治疗手段很少。用tPA治疗，如果在中风发作3小时内使用，最近已得到FDA的同意。用肝素或口服抗凝剂治疗中风，虽然偶尔有利，但是要冒血液流进梗塞的脑部的高度风险。
Griffin等在美国专利5084274中提出用重组aPC(r-aPC)治疗狒狒模型的血管梗塞或血栓栓塞。Griffin要求保护的治疗栓塞性梗塞的剂量水平为0.2mg/kg/小时至1.1mg/kg/小时。但是，申请人发现这些剂量水平显著地超出了r-aPC的生理毒性范围。例如，对非人类灵长类动物的预临床毒理学研究表明r-aPC进行96小时输液的安全值限制在最高剂量为0.05mg/kg/小时左右。因此，Griffin等教导的最低剂量即0.2mg/kg/小时是申请人为人类建立的毒性剂量的4倍。因此，即使是Griffin教导的最低剂量也要冒血液流进梗塞的脑部的高度风险，于是恶化了中风伴发的神经性疾病。因此，即使基于Griffin等的教导，也存在确定用aPC治疗人动脉血栓形成的有效治疗方法的需求。
与上述研究者的教导相反，本申请人发现仅需r-aPC的低剂量治疗即可用于治疗栓塞性休克。aPC的给药有利于预防微血管和大血管梗塞性动脉血栓的局部扩展，降低中风导致的神经疾病。
发明概述本发明提出了一种对患有血管梗塞和动脉血栓栓塞疾病的病人进行治疗的方法，该方法包括给所述患者使用剂量为约0.01mg/kg/小时至约0.05mg/kg/小时的活化的蛋白C。
本发明还提供了适于连续输液给药的单位剂型，其中含有单位剂量容器，该容器中含有约5mg至约20mg的活化的蛋白C，其适于剂量约0.01mg/kg/小时至约0.05mg/kg/小时的给药。
发明详述正如本文公开和要求保护的，为了本发明的目的，将下列术语限定如下。
aPC或活化的蛋白C指重组或血浆来源的蛋白C。虽然aPC也可包括具有蛋白C的蛋白水解、酰胺分解、酯分解及生物(抗凝剂或促纤维蛋白溶解)活性的其它种类或衍生物，但是aPC包括并优选人蛋白C。蛋白C衍生物的实例由Gerlitz等的美国专利5453373和Foster等的美国专利5516650描述，它们的全部教导在此作为参考。
APTT-活化的部分促凝血酶原激酶时间。
AU-酰胺分解单元。
HPC-人蛋白C酶原。
MEA-2-氨基乙醇。
tPA-组织纤溶酶原激活物。
r-HPC-重组人蛋白C酶原。
r-aPC-重组活化的蛋白C，体外或体内由活化的蛋白C酶原，或由原核细胞、真核细胞或转基因动物直接分泌(例如由人肾293细胞以酶原的形式分泌)蛋白C的活化形式产生，然后通过本领域技术人员熟知的技术纯化并活化，见Yan的美国专利4981952和Cottingham的WO97/20043，它们全部的教导在此引为参考。
连续输液—在特定的时间内基本不间断地连续向血管内注入某种溶液。
快速浓注—以一定的量(称为bolus)在不超过120分钟的时间内注射某种药物。
适于给药-优选由冻干aPC制备的、适于以治疗剂的形式使用的制剂或溶液。
酶原—蛋白水解酶的酶灭活的前体。本文中使用的蛋白C酶原指分泌的、不论是一个或两个链的蛋白C的灭活形式。
申请人已发现非人类灵长类动物的预临床研究表明96小时输入r-aPC的安全值限定在最大剂量为0.05mg/kg/小时左右。当与现有技术相比时这些数据是意想不到的。事实上，基于原来的预临床和临床研究，对人来说r-aPC的剂量水平高于上述毒理学研究建立的毒性范围。
本发明为患有血管梗塞和动脉血栓栓塞疾病的病人提供了治疗方法，该方法包括给所述患者使用剂量为约0.01mg/kg/小时至约0.05mg/kg/小时的活化的蛋白C。以低剂量使用活化的蛋白C对治疗栓塞性中风而不伴发可能与高剂量有关的出血问题来说是有利的。本发明还说明了在人临床试验中如何使用重组的人蛋白C(r-aPC)确定r-aPC的血浆浓度(实施例1)。
本发明还说明了在闭塞性冠状动脉血栓症的犬模型中静脉内使用r-aPC对完全闭塞的冠状动脉再灌注的作用(实施例2)。令人惊奇的是，用r-aPC治疗的六只动物中有5只显示了血管再灌注，而就此比较而言，六只对照动物没有显示血管再灌注。
本发明涉及用活化的蛋白C治疗血管梗塞或动脉栓塞疾病，包括栓塞性中风、外周动脉血栓形成、来源于心脏或外周动脉的血栓、急性心肌梗塞和冠状动脉疾病。
按照制备药用组合物的已知方法可配制aPC。此aPC优选非肠道给药，以确保它以有效形式转运到血流中，该给药通过以连续输液的方式在约一至约四十八小时内注射适当的剂量来进行。更优选适量的aPC通过连续输液方式给药约4至约36小时。更加优选适量的aPC通过连续输液的方式给药约12至约24小时。最优选适量的aPC通过连续输液的方式给药约24小时。在中风诊断后，aPC的给药应尽快开始。
aPC的给药量为约0.01mg/kg/小时至约0.05mg/kg/小时，相当于约20mg/70kg/24小时至约84mg/70kg/24小时。当该剂量水平确定为每24小时的特定剂量时，本领域技术人员会意识到这是指定的剂量水平而不必要限定为24小时输液，相反可包括不同时间的连续输液，例如，约一至约四十八小时。更优选aPC的给药量为约0.01mg/kg/小时至0.04mg/kg/小时(约20mg/kg/24小时至约67mg/70kg/24小时)。而更加优选的aPC给药量为约0.01mg/kg/小时至0.03mg/kg/小时(约20mg/70kg/24小时至约50mg/kg/小时)。最优选aPC给药量为约0.024mg/kg/小时(约40mg/70kg/24小时)。
或者，通过在约5分钟至约30分钟内以快速浓注的方式注射适当剂量/小时的一部分，接着用适当的剂量连续输液约23小时至约47小时，这样得到了在24小时至48小时内的适当的给药量。
如上所述，上述aPC的剂量水平与Griffin等要求的治疗血栓栓塞的剂量范围0.2mg/kg/小时至11mg/kg/小时形成对比。相反，本文中要求的剂量水平相当于其剂量的十分之一或约0.01mg/kg/小时至约0.05mg/kg/小时。最优选的、治疗本文中描述的血栓梗塞的aPC给药剂量水平为约0.024mg/kg/小时。应着重指出本文中最优选的剂量水平0.024mg/kg/小时比Griffin要求的最低剂量低8倍而比Griffin要求的最高剂量低约44倍。
制备例1制备人蛋白C通过本领域技术人员熟知的技术在人肾293细胞中产生重组的人蛋白C(rHPC)，例如，见Yan的美国专利4981952，将其全部教导在此引为参考。编码人蛋白C的基因在Bang等的美国专利4775624中公开并要求保护，将其全部教导在此引为参考。用于在293细胞中表达人蛋白C的质粒为质粒pLPC，它公开于Bang等的美国专利4992373，将其全部教导在此引为参考。质粒pLPC的构建也描述于欧洲专利0445939和Grinnell等，1987，Bio/Technology 51189-1192，将它们的全部教导在此引为参考。简单地说，将此质粒转染入293细胞，鉴定稳定的转化体，在无血清的介质中进行传代培养并生长。发酵后，通过微量过滤得到无细胞的培养基。
用Yan的美国专利4981952的技术的修改方式由培养液中分离人蛋白C，将其全部教导在此引为参考。在其被阴离子交换树脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)吸收前在EDTA中制备澄清的培养基，浓度为4mM。用4倍柱体积的20mM Tris，200mM NaCl，pH 7.4洗涤并用2倍柱体积的20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4洗涤后，用20mMTris，150mM NaCl，10mM氯化钙，pH 7.4洗脱结合的重组的人蛋白C酶原。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，洗脱后的洗脱蛋白纯度超过95％。
制备此蛋白的3M氯化钠溶液，然后用疏水作用树脂(ToyopearlPhenyl 650M，TosoHaas)完成对此蛋白的进一步纯化，该树脂在20mMTris，3M氯化钠，10mM氯化钙，pH 7.4中平衡。用2倍柱体积的不含氯化钙的平衡缓冲液洗涤后，用20mM Tris，pH 7.4洗脱重组的人蛋白C。
通过除去残余的钙离子制备用于活化的洗脱蛋白。将此重组的人蛋白C通过金属亲和柱(Chelex-100，BioRad)除去钙离子，并再结合于阴离子交换树脂(Fast Flow Q，Pharmacia)上。这两种柱按序排列并在20mM Tris，150mM氯化钠，5mM EDTA，pH 6.5中平衡。加入蛋白后，在从此系列中脱离前，用1倍柱体积的相同缓冲液洗涤Chelex-100柱。在用0.4M氯化钠，20mM Tris-乙酸盐，pH 6.5洗脱前用3倍柱体积的平衡缓冲液洗涤此阴离子交换柱。通过UV280nm检测重组的人蛋白C和重组的活化的蛋白C溶液的蛋白浓度，其消光系数分别为E0.1％＝1.85或1.95。
制备例2重组的人蛋白C的活化在pH 7.5，50mM HEPES存在下，在4℃，将凝血酶偶联到活化的CH-Sepharose(琼脂糖凝胶)4B(Pharmacia)上。用约5000单位凝血酶/ml树脂，在已经填入柱的树脂上进行此偶联反应。在加入浓度为0.6ml/l循环溶液的MEA前，将此凝血酶溶液通过此柱循环约3小时。将含有MEA的溶液再循环10-12小时以保证将树脂上未反应的胺彻底封闭。封闭后，用10倍体积的1M氯化钠，20mM Tris，pH 6.5洗涤凝血酶偶联的树脂以除去非特异性结合的蛋白质，并在活化缓冲液中平衡后用于活化反应。
将纯化的rHPC配制EDTA的5mM溶液(螯合任何残余的钙离子)并用20mM Tris，pH 7.4或20mM Tris-乙酸盐，pH6.5稀释到浓度为2mg/ml。将此物质通过在37℃用50mM氯化钠及20mM Tris pH 7.4或20mM Tris-乙酸盐pH6.5平衡的凝血酶柱。调节流速使rHPC和凝血酶树脂之间的接触时间为20分钟。收集流出物并立即检测酰胺分解活性。如果此物质与建立的aPC标准相比不具有特定的活性(酰胺分解)，将其再在凝血酶柱上循环以将rHPC彻底活化。然后，用20mM上述缓冲液对此物质进行1∶1稀释，其pH为7.4至6.0之间的任何值(优选较低的pH以防止自身降解)，以便在等待下一个处理步骤的同时将此aPC以较低浓度保持。
除去由此aPC物质中滤出的凝血酶，这是通过将此aPC与在含有150mM氯化钠的活化缓冲液(20mM Tris，pH 7.4或优选20mM Tris-乙酸盐，pH6.5)中平衡的阴离子交换树脂(Fast Flow Q，Pharmacia)结合来完成的。凝血酶通过此柱并用2-6倍体积的20mM平衡缓冲液洗脱。使用梯度步骤用存在于5mM Tris-乙酸盐，pH6.5或20mM Tris，pH7.4中的0.4M氯化钠洗脱结合的aPC。用较大体积的洗脱液使对此十二肽的除去更彻底。将由此柱中洗脱的物质以冷冻溶液(-20℃)或冻干粉的形式保存。
采用Bechman DU-7400二极管测定分光光度计，通过测定由合成底物H-D-Phw-Pip-Arg-对硝基苯胺(S-2238)中释放的对硝基苯胺来确定aPC的酰胺分解活性(AU)，该底物购自Kabi Vitrum。活化的蛋白C的一个单位确定为在25℃，pH7.4，在405nm使用对硝基苯胺的消光系数为9620M-1cm-1，在1分钟内释放1μmol的对硝基苯胺需要的酶的量。
在活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)凝集测定中，通过测定凝血时间的延长确定活化的蛋白C的抗凝活性。在稀释缓冲液(1mg/ml放射免疫检测级BSA，20mM Tris，pH7.4，150mM氯化钠，0.02％叠氮钠)制备标准曲线，其中蛋白C的浓度为125-1000ng/ml，而样品在此浓度范围内以若干种稀释度制备。向每个样品比色杯中，加入50μl冷的马血浆和50μl重建的活化的部分促凝血酶原激酶时间试剂(APTT试剂，Sigma)，并在37℃孵育5分钟。孵育后，向每个比色杯中加入50μl适当的样品或标准物。用稀释缓冲液代替样品或标准物确定基准凝集时间。向每个样品或标准物中加入50μl 37℃的30mM氯化钙后开始使用成纤维测量仪(fibrometer)(CoAScreener Hemostasis Analyzer，American Labor)的记时器。由标准曲线的线性回归方程计算出样品中活化的蛋白C的浓度。此处报告的凝集时间为三个重复试验最小值的平均值，包括标准曲线样品。
上述描述可以使具有本领域适当技术的人员制备aPC，并将其用于治疗栓塞性中风。
实施例1aPC的人血浆浓度在24小时内，6位病人以1mg/m2/小时或约0.024mg/kg/小时接受aPC静脉输液。所用aPC为冻干制剂，其中含10mg aPC，5mM Tris乙酸盐缓冲液和100mM氯化钠，用2ml水重新溶解并调整pH至6.5。
用免疫捕获-酰胺分解测定检测aPC的血浆浓度。在枸橼酸盐抗凝剂和aPC的可逆抑制剂苯甲脒的存在下收集血液。通过用固定在微量板上的aPC特异性鼠单克隆抗体，C3，从血浆中捕获此酶。洗涤除去此抑制剂并用寡肽产色底物检测aPC的酰胺分解活性。在37℃孵育16-20小时后，在405nm检测吸收值，并用加权线性曲线拟合算法分析数据。由标准曲线估计的aPC浓度，其浓度范围在0-100ng/ml。此测定的定量限制值为1.0ng/ml。在约24小时内测定aPC的剂量水平和血浆浓度。血浆浓度为2ng/ml至小于100ng/ml。优选的血浆浓度为约20ng/ml至80ng/ml。最优选的血浆浓度为约30ng/ml至约60ng/ml，而最最优选的为约50ng/ml。因此，在治疗栓塞性中风中，0.024mg/kg/小时的剂量在24小时中产生了最优选的血浆浓度，却没有较高剂量产生的伴发出血问题。
实施例2闭塞性冠状动脉血栓形成的犬模型中诱发的再灌注用戊巴比妥钠(30mg/kg，i.v.)麻醉十二只狗(17-22kg，两种性别，Butler Farms)并通入室内空气。放置插管以测量血压，给药并在颈动脉、股静脉和颈静脉分别采集血样。进行左胸廓切开术，将心脏悬挂在心包支架上，并分离出邻近第一个主斜分枝的左弯曲冠状动脉(LCCA)的2cm节断。在LCCA上分别装置电磁流动探针、刺激电极和外部咬合器来检测冠状动脉血流，制造血管损伤并提供严重的狭窄。通过放置刺激电极(阳极)接触血管的内膜侧并用100μA直流电刺激此阳极(此电路通过将阴极放置在皮下位点完成)来引起血管损伤。此制造损伤的电流持续60分钟，然后不论此血管闭塞与否都停止电流。由开始引起血管损伤至血管达到彻底闭塞约需60分钟。全部血管闭塞后30分钟(即冠状血管血流为0持续30分钟)，2.0mg/kg/小时aPC或20ml Tris缓冲液，pH7.4(载体)的连续静脉输液输注2小时。由LCCA损伤引起时刻开始起4小时后制备。检测动脉血压、心率和冠状血管血流并分析。在此试验过程中的不同时间点，采集血样来测定全血的凝血时间(Hemochron 801)，用SimplateII出血时间测定装置测定齿龈模板的出血时间。在整个试验中收集第二套血样(枸橼酸抗凝)来检测血浆纤溶酶原激活剂抑制剂1(PAI-1)。用IMUBINDTM血浆PAI-1 ELISA试剂盒(American Diagnostica)测定血浆PAI-1浓度。用单个ANOVA分析所有数据(以平均值±SEM表示)的统计学差异，随后用Student-Neuman-Keuls分析其在p＜0.05的水平具有显著性。用Fisher′s Exact检验分析再灌注和开通的发生率的p＜0.05。
连续输入2.0mg/kg/小时的aPC，在2小时药物输入结束时使APTT全血凝血时间增加了6倍(表1)。在此试验的末期，APTT开始回到正常值。对凝血酶凝血时间或模板出血时间未观察到影响。结果见表2。
表2在麻醉的狗中aPC对凝血和模板出血时间的作用处理 参数前药 60分钟120分钟结束输入 输入载体 凝血酶 36±138±4 33±1 34±1a 时间(秒)(n＝6)APTT(秒) 100±695±589±10 91±10模板出血时间 132±15 182±14 152±15159±13(秒)aPC*凝血酶 33±1 34±134±1 34±1(n＝6)时间(秒)APTT96±6 573±237 670±209 138±13(秒) * *模板出血时间 199±41 272±84 204±20193±39(秒)用于载体组的剂量方案为20ml Tris缓冲盐水输入2小时而在总血管闭塞后30分钟使用aPC(2.0mg/kg/小时×2小时)。
*表示对于载体组统计学差异水平p＜0.05。每个数值表示平均值±SEM。
表3指明了静脉使用aPC对总闭塞冠状动脉的作用。冠状动脉的总栓塞闭塞时间在2个组中相似66±7分钟和62±6分钟，分别是载体处理和aPC处理组的数值。在aPC治疗组中6个血管中的5个表现出再灌注，而接受载体组6个血管没有一个再灌注；达到再灌注的时间在aPC治疗组为128±17分钟。在aPC治疗组的冠状动脉血流显著比相应的载体处理组大；在再灌注期间aPC治疗组达到了13.7±2.7ml/分钟，而流量为1069±623ml(这表示在此组中恢复了冠状动脉血栓形成前的约60-70％的血流)。接触aPC的5个血管中的3个在4小时试验的后期仍开通。因此，此数据表明在闭塞性冠状动脉血栓形成犬模型的治疗中aPC是有效的。
表3在犬冠状动脉血栓形成模型中aPC对冠状动脉血流恢复的作用
*表示较载体组统计学差异为p＜0.05。每个数值表示平均值±SEM。
在整个试验中采集的血样表明aPC的静脉输液和纤溶酶原激活剂研究者-1(PAI-1)的循环浓度之间存在显著联系。aPC静脉输液结束时，血浆PAI-1浓度降低了80％。aPC输液停止期间，血浆PAI-1浓度开始回到输液前的浓度。
虽然在此种犬模型中这些剂量浓度似乎比对人要求保护的剂量要高，申请人发现狗对人类活化的蛋白C特别不敏感，因此要求保护的剂量水平对人是合适的。
权利要求
1.一种对患有血管梗塞和动脉血栓栓塞疾病的病人进行治疗的方法，其中包括给所述病人使用剂量约0.01mg/kg/小时至约0.05mg/kg/小时的活化的蛋白C。
2.权利要求1所述的方法，其中血管梗塞或血栓栓塞疾病是栓塞性中风。
3.权利要求2栓塞的方法，其中包括给所述病人使用剂量约0.01mg/kg/小时至约0.03mg/kg/小时的活化的蛋白C。
4.权利要求3栓塞的方法，其中包括给所述病人使用剂量约0.024mg/kg/小时的活化的蛋白C。
5.权利要求4所述的方法，其中活化的蛋白C是人的活化的蛋白C。
6.权利要求1所述的方法，其中活化的蛋白C是以连续输液约1至约48小时的方式给药的。
7.权利要求6所述的方法，其中活化的蛋白C以连续输液约12至约36小时的方式给药。
8.权利要求7所述的方法，其中活化的蛋白C以连续输液约24小时的方式给药。
9.权利要求8所述的方法，其中活化的蛋白C是人的活化的蛋白C。
10.权利要求9所述的方法，其中包括使用约0.024mg/kg/小时的活化的蛋白C。
11.权利要求1所述的方法，其中活化的蛋白C以快速浓注的方式给药。
12.权利要求11的方法，其中活化的蛋白C的快速浓注给药后接着进行连续输液。
13.含有5至20mg的活化的蛋白C的单元剂量容器。
14.权利要求13所述的容器，其中活化的蛋白C是冻干的。
15.权利要求13所述的容器，其中活化的蛋白C溶解于灭菌溶液中，其适于以0.01mg/kg/小时至0.05mg/kg/小时的剂量给药。
16.权利要求13所述的单元剂量，其中给药是通过连续输液约1至48小时的形式进行的。
17.用作以约0.01mg/kg/小时至约0.05mg/kg/小时的剂量治疗血管梗塞和动脉血栓栓塞疾病的药物的活化的蛋白C。
全文摘要
本发明公开了一种通过使用活化的蛋白C对患有血管梗塞和血栓栓塞疾病包括栓塞性中风症状的病人进行治疗的方法。aPC的使用提供了引起出血并发症可能性低、选择性高的治疗剂。aPC的给药对预防微血管和大血管梗塞动脉血栓的局部扩展是有利的,因此降低了由中风产生的神经缺陷。
文档编号C12N9/64GK1252726SQ98803535
公开日2000年5月10日 申请日期1998年3月24日 优先权日1997年3月24日
发明者B·W·格林内利, D·C·霍维, C·V·杰克森 申请人:伊莱利利公司