专利名称：校正异常基因产物功能的物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及能校正异常基因产物的物质的筛选方法及其应用。更具体而言，本发明涉及一种依据基因与病因的关系，使用从与人类疾病相关的结构基因的分析中获得的信息(例如用来阐明基因多态性与疾病间因果关系的信息)产生药物的方法，还涉及根据所述药物产生新方法制备的、能校正异常基因产物的物质的应用。
背景技术：
常规药物筛选技术主要基于对疾病病理机制的研究，以试图着眼于作用机制而探索新药物发展的可行性。这种病理机制代表发病机理的结果，而不是原因。由于这个原因，因为不能获得所希望的临床效果、意外毒性的临床表现或其它这样的障碍，甚至由筛选系统获得的先导化合物也常常被放弃开发。自1990年以来，基因组研究作为一种新技术引起了注意。对广泛涉及生物学和医学的遗传信息的分析研究所获得的大量遗传信息，预期可为阐明基因多态性与疾病间因果关系提供线索，并且使基于致病原因的药物的鉴定和产生成为可能。
在以下所示的步骤中阐述了来源于这种遗传信息、作用于致病原因的药物开发方法。具体地，这种药物开发策略包括●疾病相关基因的序列和功能的确定，●确定与致病原因相关的基因，进行遗传信息的功能分析，以及●根据关于作为致病原因的基因的信息筛选候选药物。
目前，基于与基因组计划相关的遗传信息的药物产生方法还处于确定疾病相关基因序列和功能的初始阶段，全世界都在进行努力以阐明疾病与遗传异常之间的关系。
尽管在阿尔茨海默氏病和高血压中已报道了一些疾病相关基因，但要花费相当长的时间来完全阐明这些疾病的病理学，因为多种危险因子仍有待于阐明。对于肥胖症，致病原因将很快阐明；在不久的将来很快会开发出一种抗肥胖药物。对于非胰岛素依赖性糖尿病，糖尿病的致病因子很快将在基因水平上得以证明。对于心脏疾病，已发现了一种与心肌梗死相关的基因。这些及其它的成果提示，在不久的将来很可能将发现一种具有新作用机制的药物。在癌症研究中，发现病原或危险因子基因的努力已不断产生好的结果。然而，应当指出，不同的癌症类型包括高度的多样性，因此，为完全阐明每一类型的致病原因，必须获得更多的发现。
大多数阿尔茨海默氏病(AD)患者是遗传性状未知的单发病例。然而，少数家族性阿尔茨海默氏病(FAD)病例显示常染色体显性遗传。对这种FAD的病原基因的证明将会导致单发性AD的病理学的阐明以及随后治疗药物的开发。最近已广泛进行了关于FAD基因的研究。结果，迄今已显示早期发作FAD的许多家族中第14条染色体紧密连锁，在少数家族中位于第21条染色体中的β淀粉样前体蛋白基因异常。
相反，对于占阿尔茨海默氏病病例大多数的单发性阿尔茨海默氏病，或家族性迟发性阿尔茨海默氏病，直到最近几年仍不清楚其分子遗传病因学。然而，最近几年已根据一种假说进行了研究，这种假说是，这些疾病可能是许多遗传危险因子参与的多因子遗传性疾病。1993年，Corder等人报道了APO E4(载脂蛋白E基因的一种多态)是阿尔茨海默氏病的一种遗传危险因子(科学(Science)，261，第921页，1993)。他们分析了大量阿尔茨海默氏病患者的APO E，确定蛋白质遗传多态性中的APO E4是一种遗传危险因子。根据他们的报道，在家族性迟发型阿尔茨海默氏病患者组中，APO E4的发生率显著高于正常健康受试者组。同样，将阿尔茨海默氏病患者分为3组(不携带APO E4的组、携带APO E4的杂合子组、携带APO E4的纯合子组)，证明当APO E4发生率增加时，该疾病的发作年龄越来越小。
同样，对于除APO E4之外的危险因子正在进行活跃的研究，如VLDL受体的遗传多态性，VLDL受体是一种载脂蛋白E受体。
对于肥胖症，最近鉴定了ob蛋白(自然(Nature)，372，第425页，1994)，并且报道存在一种反馈路线，其中肥胖促进脂肪细胞中ob蛋白的表达和分泌，ob蛋白随后刺激下丘脑饱腹中枢抑制食物摄取并增加能量消耗。现在正应用被称为ob/ob小鼠的遗传性肥胖模型小鼠进行研究，以将ob蛋白(leptin)与人的肥胖联系起来。另外，肥胖与β3肾上腺素受体之间的关系也引起了注意。换句话说，肥胖能够因能量消耗减少及能量摄取过量而发展。
在人类以及大鼠和小鼠中，过量的食物摄取和肥胖被认为可能会刺激交感神经系统β3受体活性，从而增加能量消耗并导致产热，尤其是在棕色脂肪细胞等中。也可将这种途径看作一种抑制肥胖发展的反馈机制。在由于β3受体先天性异常而使这种反馈途径不能起作用的情况中，甚至肥胖或过量的食物摄取都不能促进能量消耗，这样导致进一步肥胖。实际上，已报道了在Pima印第安部落中有β3肾上腺素受体的一种突变，其中第64位的Trp残基被Arg残基取代，该部落的特征是肥胖症和糖尿病的高发生率[新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)，333，第343页(1995)]。在高加索和芬兰血统的人中鉴定到相同的突变。这种基因突变不同于糖尿病中的已知基因变异(胰岛素、胰岛素受体、葡糖激酶和线粒体的基因中的突变)，可以以很高的频率观察到，在高加索人中约8％，在Pima印第安人中约31％。因此，现在已认识到，肥胖可能是在基因水平上引起的疾病而不是一个习惯或文化问题。
已知非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)是由于遗传和环境因素两者的相互作用而发展的。其发病机理与涉及许多基因而不是单个基因的多因子遗传相关。尽管这些遗传因子有待于阐明，但已经知道一些候选基因。糖尿病发病机理的危险因子的阐明，将有助于糖尿病的早期诊断、早期治疗和发病的预防，并且将降低具有并发症的糖尿病加重情况下所需的医疗费用，因此是十分希望的，能降低由于该疾病的医疗费用。
可能深入参与NIDDM的候选基因包括引起胰岛素分泌异常的基因和引起胰岛素耐受的基因。在这些基因中，那些被认为导致胰岛素分泌异常的基因包括胰岛素葡糖激酶的基因和线粒体的基因。迄今为止已鉴定的参与骨骼肌或肝胰岛素敏感性降低(胰岛素耐受)的基因包括胰岛素受体的基因和葡糖激酶的基因，葡糖激酶是参与肝糖摄取的一种酶。这些基因中的异常可导致NIDDM。
已广泛研究了葡糖激酶异常与MODY(年轻人中的成熟发作糖尿病)疾病之间的因果关系。葡糖激酶是胰B细胞和肝细胞葡萄糖代谢的限速酶。该酶的候选基因非常令人感兴趣，因为NIDDM的病理特征即胰岛素的异常分泌和胰岛素耐受可用单基因异常来解释。MODY也是常染色体显性遗传的NIDDM的一种早期发作亚型，在年龄低于25岁时发展这种疾病，伴随有葡糖激酶的突变，推测这种突变是该病的病因。
已研究了胰岛素受体异常与NIDDM之间的关系。胰岛素受体由总共1355个氨基酸残基组成；已证明一个点突变能引起胰岛素耐受性。胰岛素受体异常表现为共显性遗传，其中，甚至在杂合子中也出现表型，纯合子中表现一种略强的表型。
除了这些研究之外，也研究了线粒体基因异常与NIDDM的联系。这3种类型的基因异常，即葡糖激酶、胰岛素受体和线粒体基因的异常，可看作是糖尿病的病因，因为每一种都通过单基因异常而引起了糖尿病的一种特殊亚型。然而，上述β3肾上腺素受体不能被认为是病原基因，尽管它能作为NIDDM的强致病因子。似乎β3肾上腺素受体基因与参与NIDDM肥胖发病机理的其它一些基因一起，是处于环境因素的影响之下。
众所周知，环境因素参与高血压的发病和发展。然而，最近几年已经阐明了高血压的遗传倾向性。但是，对于报道占高血压病例90％以上的原发性高血压，尽管已经证明了与其发病机理相关的遗传因子，仍需要更多的时间来完全阐明其病理学。
人类高血压的特征是多因子遗传、不完全的外显率和受环境因素强烈影响。当前，使用人群进行遗传分析的方法包括(1)对于明显的家族性疾病，使用家族成员的DNA进行的连锁分析，(2)患病同胞配对法，它使用患病同胞对的DNA，以及(3)关联研究法。在这些方法中，对于显示强遗传背景的高血压的特殊形式，连锁分析在其病原基因的鉴定中非常有用，而患病同胞配对法和关联研究法用来分析原发性高血压的遗传危险因子。
推测为大多数高血压患者病因的原发性高血压，还未进行广泛的连锁分析，这是因为难以跨越3代收集DNA(部分由于发病较慢)。在此情况下，患病同胞配对法最近产生了值得注意的结果。
1992年，Jeunemaitre等人鉴定了血管紧张肽原基因中的15种变异，并在美国犹它(Utah)州和法国巴黎对于高血压同胞对使用了患病同胞配对法，证明外显子2中的M235T(第235个密码子发生了从Met到Thr的单碱基替换)变异与高血压显著相关(细胞(Cell)，71，第169页，1992)。
在重度高血压病例中这种相关性更强；该突变显示出能提高TT基因型以及ACD/DD多态性基因型的人中血液血管紧张肽原的浓度。
关于AII1型受体基因中的点突变(A1166C)与高血压相关性的一篇报道(高血压(Hypertension)，24，第63页，1994)中报道，在AT1-R基因敲除小鼠中血压降低，在AII2型受体基因敲除小鼠中血压升高(美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92，第3521页，1995；自然，377，第744页，1995)，发表的其它资料提示AII异常受体基因可能以某种方式遗传性参与血压调节。
此外，Zee等人报道，在高血压患者中低密度脂蛋白受体基因中的异常与肥胖相关(生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，189，第965页，1992)，Hagihara等人报道GJP(间隙连接蛋白)基因座位参与SHR体重(高血压研究(Hypertens.Res.)，18，第63页，1995)。
尽管如上所述在基因水平上对高血压的研究已取得了持续进展，但似乎需要相当长的时间来进一步阐明其本质的病原因子，因为必须进行长期的广泛的遗传免疫学研究。
也已经在基因水平上研究了参与心脏疾病的因子。美国波士顿Bringham与Woman’s医院的一群研究者报道，他们定位了2种可抑制心肌梗死的基因和1种可提高心肌梗死危险率的基因(自然遗传学(NatureGenetics)，13，第429页，1996)。
尽管认为许多恶性肿瘤具有遗传性，但显示称作常染色体显性遗传的遗传成分肿瘤只在更少数病例中发展。仍只存在少数这类肿瘤，它们与阐明了的染色体或基因联系起来了。
大多数癌症不适用基于单基因变异的孟德尔遗传学，或者不能用候选基因方法在基因水平上对这些疾病进行病因的探索。然而，这并不意味着普通癌症不总是单发的或遗传的。遗传病因学研究显示，特定癌症患者的亲属具有发展相似肿瘤的高危险率。因此，从多因子遗传学的观点来看，假定多种环境因素和遗传因子充当了肿瘤发生的前提是合理的。
如上所述，多因子遗传学模型适用于癌症；实际上，癌症是基因相关性疾病。已经证明肿瘤发生通过多个步骤发生，是癌基因和抑癌基因中多种异常协同积累的结果。
对于结肠癌，已广泛研究了多步肿瘤发生过程。推测癌基因(如Ras)中的变异会激活细胞增殖。相反，肿瘤抑制基因p53的异常会使正常基因的作用失活，导致无法控制细胞增殖。
美国哥伦比亚大学(Columbia University)的一群研究者最近成功地克隆了PTI-1，一种能促进细胞从前列腺肥大到前列腺癌恶化的基因。PTI-1充当着从良性腺瘤到恶性肿瘤的开关。
这一因子是一种能调节翻译过程从而影响翻译的基因。它是与多肽链延伸因子EF1a(50kd)同源的46kd蛋白质。PTI-1被认为是由于EF1中的点突变和缺失产生。相同研究组的研究证实，在他们的16名进行性前列腺癌患者中有15名具有PTI-1的表达。
尽管为发现多种疾病的病因或危险因子基因的努力不断产生好的结果，但要完全阐明致病概况，仍需获得更多的信息。
确定疾病相关基因的序列和功能后确定致病原因并对遗传信息进行功能分析的步骤，对于判断该基因的异常是否为疾病发展的结果或一种致病原因来说是一项重要的任务。当在此使用时，如果基因的异常(即突变)与疾病的发作相关，则认为该基因是疾病的“病因”。
然而，在以前的步骤(疾病相关基因的发现)中获得的信息仅仅是基因序列信息。当前几乎没有方法可以用来从这种信息中精确推断出基因或基因产物的功能。
敲除转基因小鼠制备技术现在可能是最可行的方法。然而在当前的技术中，基因操作对活生物体的意外严重损伤常常导致死产分娩或新生死亡，这样妨碍了研究的进展。假如有进一步的进展，预期敲除转基因小鼠制备技术对基因功能的分析将有重要贡献。
尽管生物信息学能用于基因功能的阐明，但当前仍处于搜集基础信息的初始阶段。基因序列测定的速度已显著提高；人cDNA序列已经公开到相当的程度。在以后几年中，预期大量大学和基因组投资公司在基因功能分析方面将取得进展，尽管他们的努力将伴随着许多困难。基础信息的这种数量上的增长可能对未知时间后通过生物信息学显著促进基因功能的分析具有协同作用，成为基因功能分析的一种有力工具。
通过疾病相关基因的序列和功能分析鉴定出病因基因后，即可依据前两步骤获得的信息开展第三步-开发新药物。然而，对于这种药物产生还没有完善的技术。
发明概述相对于此背景，需要建立一种新技术，用来根据分析与人类疾病相关的结构基因所获得的信息鉴定和/或产生药物，这种信息阐明了基因多态性与疾病之间的因果关系。本发明提供这样一种药物开发的新技术，以及在此基础上能校正异常基因产物的物质的新应用。
在试图解决上述问题的广泛研究之后，本发明者从由人细胞制备的cDNA文库中或从市售的来源于人细胞的cDNA文库中成功地克隆了异常基因产物(异常受体等)的基因，并使用这些基因转化的细胞发展了本发明。
本发明涉及一种产生药物的方法，这种方法是从致病原因着手，这不同于常规新药发展方法，因常规方法是基于发病机理的结果，如发病机制和药物作用机制。本发明的药物产生技术的应用使一种完全不同于常规方法的药物产生方法成为可能。本发明对脑/中枢神经系统相关疾病的治疗药物的开发具有重要影响，其中天然存在的配体为低分子量。
更具体而言，本发明提供(1)一种药物组合物，该药物组合物中包含一种能使异常基因产物以类似于野生型基因产物的方式起作用、即校正异常基因产物的物质，和一种药学可接受的载体，(2)根据段落(1)的药物组合物，该物质是异常基因产物的一种激动剂或拮抗剂，(3)根据段落(1)的药物组合物，其中该异常基因产物是一种异常受体、异常通道、异常信号或异常酶，(4)根据段落(1)的药物组合物，它包含一种能校正异常操纵基因的物质，可用于预防和/或治疗由异常受体引起的疾病，(5)根据段落(4)的药物组合物，其中异常受体引起的疾病是由含异常受体的细胞中信号转导系统活性的实质性降低引起的疾病，(6)根据段落(4)的药物组合物，其中异常受体引起的疾病是由天然配体对含异常受体之细胞的转移系统的作用实质性缺乏引起的疾病，(7)根据段落(4)的药物组合物，其中异常受体引起的疾病是天然配体对异常受体的亲和力实质性降低引起的疾病，(8)根据段落(6)的药物组合物，其中信号转导系统是基于效应物质细胞内浓度变化的信号转导系统，该效应物质细胞内浓度变化是由天然配体和受体的结合引起的，(9)根据段落(6)的药物组合物，其中效应物质是cAMP、肌醇磷酸或钙离子，(10)根据段落(4)的药物组合物，其中能校正异常受体的物质是作用于正常受体的物质，(11)根据段落(4)的药物组合物，其中能校正异常受体的物质是不作用于正常受体的物质，(12)能校正异常基因产物的物质的一种应用，用于该异常基因产物引起的疾病的治疗，(13)根据段落(12)的应用，其中该异常基因产物是一种异常受体，(14)筛选能校正异常基因产物的物质的一种方法，它包括使异常基因产物与受试物质接触，并测定该物质对该产物的校正活性，(15)根据段落(14)的筛选方法，其中该异常基因产物是一种异常受体，
(16)筛选治疗异常基因产物所致疾病的物质的一种方法，它包括使异常基因产物与受试物质接触，并测定该物质对该产物的校正活性，(17)能基本校正患有异常受体所致疾病的哺乳动物中含有异常受体之细胞的信号转导系统的药物筛选方法，该方法包括使异常受体与受试物质接触，并测定该物质对该受体的校正活性，(18)根据段落(16)的筛选方法，其中该异常受体是通过在细胞中表达编码异常受体的基因而制备的一种异常受体，(19)根据段落(16)的筛选方法，其中编码异常受体的基因是通过对由患有异常受体所致疾病的哺乳动物细胞制备的基因、以及由不含异常受体的相同种哺乳动物细胞制备的基因进行比较分析而确定的异常受体编码基因，(20)可用于治疗异常基因产物所致疾病的药物的制备方法，它包括使异常基因产物与受试物质接触，测定该物质对该产物的校正活性，并制备可基本校正含异常基因产物之细胞的信号转导系统的物质，(21)可用于治疗异常受体所致疾病的物质的制备方法，它包括使异常受体与受试物质接触，测定该物质对该受体的校正活性，并制备可基本校正含异常受体之细胞的转移系统的物质，(22)根据段落(21)的方法，其中该异常受体是通过在细胞中表达编码异常受体的基因而制备的一种异常受体，(23)根据段落(22)的方法，其中编码异常受体的基因是通过对由患有异常受体所致疾病的哺乳动物细胞制备的基因、以及由不含异常受体的相同种哺乳动物细胞制备的基因进行比较分析而确定的异常受体编码基因，(24)通过在细胞中表达编码异常基因产物的基因而获得的一种异常基因产物的应用，用于筛选可治疗所述产物所致疾病的物质，(25)根据段落(24)的应用，其中该异常基因产物是一种异常受体，(26)通过在细胞中表达编码该异常基因产物的基因而获得的一种异常基因产物的应用，用于筛选可正常作用于该产物的物质，以及(27)根据段落(26)的应用，其中该异常基因产物是一种异常受体。
发明详述术语“异常基因产物”在此使用时包括但不限于异常受体、异常通道、异常信号和异常酶。上述术语“异常”意思是对应于基因产物的结构基因的突变体，特别是体内自然发生的突变体，该突变体能引起疾病，这是由于这样一种事实，作用于正常基因产物的物质(例如，作用于正常受体的配体，如体内存在的天然配体)的反应性不同于所述物质作用于正常基因产物的反应性。同样，优选地，异常基因产物和正常基因产物能相似地起作用，即，校正异常基因产物的物质导致异常基因产物正常作用后，该异常基因产物显示的效应(例如，含正常受体之细胞的信号转导系统中效应物质的细胞内浓度变化)应类似于正常基因产物被作用物质作用后所显示的效应。
异常基因产物引起的疾病包括但不限于阿尔茨海默氏病(例如家族性阿尔茨海默氏病、单发性阿尔茨海默氏病)、精神分裂症、抑郁症、高血压(例如原发性高血压)、肥胖症、糖尿病(例如非胰岛素依赖性糖尿病)、心脏病(例如心肌梗死)、癌症(例如结肠癌、前列腺癌)、风湿病、变应性疾病(例如遗传性过敏症)和动脉硬化，优先选择的是阿尔茨海默氏病、精神分裂症、抑郁症、高血压、肥胖症、糖尿病、癌症等等。
术语“异常受体”在此使用时理解为包括在其体内结构基因中含有突变、导致对物质(如天然配体)的亲和力实质性改变的(例如降低、增强等，优选地降低)的受体，尤其包括由于该天然配体的亲和力实质性改变而引起疾病的受体。术语“实质性改变”在以上使用时意思是，当比较天然配体对正常和异常受体的亲和力时，改变为能引起疾病的程度，这种改变可以是显著或不显著的任何改变，只要它能引起疾病即可。同样，优选地，异常受体和正常受体能有相似的功能，即，针对异常受体的校正物质导致异常受体正常作用后，该异常受体显示的效应(例如，含正常受体之细胞的信号转导系统中效应物质细胞内浓度的变化)应类似于正常受体被其天然配体作用后产生的效应。优选地，含异常受体的细胞的信号转导系统与含正常受体的细胞的信号转导系统相同。换句话说，如果由于受体基因的突变使天然配体的亲和力实质性降低，即使含异常受体的细胞具有与含正常受体的细胞相同的信号转导系统，含异常受体的细胞的信号转导系统基本上也不能起作用，这可引起疾病。然而，根据本发明方法，应用能与异常受体结合、并能校正含异常受体之细胞的信号转导系统的异常受体激动剂将能有效地预防或治疗这种疾病。
由异常受体引起的疾病可以是任何疾病，只要它是由天然配体亲和力的实质性改变引起的。这些疾病包括天然配体对受体的亲和力实质性降低引起的疾病，天然配体基本上不能作用于含异常受体之细胞的信号转导系统而引起的疾病，含异常受体之细胞的转移系统活性实质性降低引起的疾病，以及含异常受体之细胞的信号转导系统中异常信号传导或过度信号传导引起的疾病。更具体而言，这些疾病包括阿尔茨海默氏病(例如家族性阿尔茨海默氏病、单发性阿尔茨海默氏病)、精神分裂症、抑郁症、高血压(例如原发性高血压)、肥胖症、糖尿病(例如非胰岛素依赖性糖尿病)、心脏病(例如心肌梗死)、癌症(例如结肠癌、前列腺癌)、风湿症、变应性疾病(例如遗传性过敏症)和动脉硬化，优先选择的是阿尔茨海默氏病、精神分裂症、抑郁症、高血压、肥胖症、糖尿病、癌症等等。
能校正异常受体的物质包括该异常受体的激动剂和拮抗剂，分别被称为“异常受体激动剂”和“异常受体拮抗剂”。当适合于靶疾病时使用这些物质。例如，在天然配体对受体的亲和力实质性降低引起的疾病中，在天然配体基本上不能作用于含异常受体之细胞的信号转导系统而引起的疾病中，在含异常受体之细胞的转移系统活性实质性降低引起的疾病中，以及其它这类疾病中，优选地使用异常受体激动剂。在含异常受体之细胞的信号转导系统中异常信号传导或过度信号传导引起的疾病中，以及其它这类疾病中，优选地使用异常受体拮抗剂。同样，能校正异常受体的物质可以是作用于正常受体的物质或不作用于正常受体的物质，其选择取决于靶疾病，优先选择基本上不能作用于正常受体的物质。
这类信号转导系统包括基于效应物质(例如cAMP、肌醇磷酸、钙离子)细胞内浓度变化的系统，这些效应物质胞内浓度变化是由于天然配体和受体的结合引起的。
术语“异常通道”在此使用时理解为包括在其结构基因中含有突变、导致作用于正常通道的物质(例如阻断剂、打开剂)的亲和力实质性改变的通道，优先选择的是由于该作用物质亲和力的实质性改变而引起疾病的通道。同样，优选地，异常通道和正常通道能有相似的功能，即，针对异常通道的校正物质导致异常通道正常作用后，该异常通道显示的效应(例如，闸门关闭或打开)应类似于正常通道被其作用物质作用后显示的效应。由异常酶引起的疾病包括阿尔茨海默氏病(例如家族性阿尔茨海默氏病、单发性阿尔茨海默氏病)、精神分裂症、抑郁症、高血压(例如原发性高血压)、肥胖症、糖尿病(例如非胰岛素依赖性糖尿病)、心脏病(例如心肌梗死)、癌症(例如结肠癌、前列腺癌)、风湿症、变应性疾病(例如遗传性过敏症)和动脉硬化，优先选择的是阿尔茨海默氏病、精神分裂症、抑郁症、高血压、肥胖症、糖尿病、癌症等等。
术语“异常信号”在此使用时理解为包括在其结构基因中含有突变、导致作用于正常信号的物质(例如促进或抑制信号的信号转导的物质)的亲和力实质性改变的信号，优先选择的是由于该作用物质的亲和力实质性改变而引起疾病的信号。同样，优选地，异常信号和正常信号能有相似的功能，即，使用针对异常信号的校正物质校正异常信号后，该异常信号显示的效应(例如，离子、营养等的运输)应类似于正常信号被其作用物质作用后显示的效应。
由异常信号引起的疾病包括阿尔茨海默氏病(例如家族性阿尔茨海默氏病、单发性阿尔茨海默氏病)、精神分裂症、抑郁症、高血压(例如原发性高血压)、肥胖症、糖尿病(例如非胰岛素依赖性糖尿病)、心脏病(例如心肌梗死)、癌症(例如结肠癌、前列腺癌)、风湿病、变应性疾病(例如遗传性过敏症)和动脉硬化，优先选择的是阿尔茨海默氏病、精神分裂症、抑郁症、高血压、肥胖症、糖尿病、癌症等等。
术语“异常酶”在此使用时理解为包括在其结构基因中含有突变、导致对作用于正常酶的物质(例如激活剂、抑制剂)的亲和力实质性改变的酶，优先选择的是由于该作用物质的亲和力实质性改变而引起疾病的酶。同样，优选地，异常酶和正常酶能有相似的功能，即，使用针对异常酶的校正物质校正异常酶后，该异常酶显示的效应(例如，底物蛋白质激活)应类似于正常酶被其作用物质作用后显示的效应。
由异常酶引起的疾病包括阿尔茨海默氏病(例如家族性阿尔茨海默氏病、单发性阿尔茨海默氏病)、精神分裂症、抑郁症、高血压(例如原发性高血压)、肥胖症、糖尿病(例如非胰岛素依赖性糖尿病)、心脏病(例如心肌梗死)、癌症(例如结肠癌、前列腺癌)、风湿病、变应性疾病(例如遗传性过敏症)和动脉硬化，优先选择的是阿尔茨海默氏病、精神分裂症、抑郁症、高血压、肥胖症、糖尿病、癌症等等。
通过将由患有该异常基因产物所致疾病的哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴、人，优选地人)细胞制备的基因与由不患该病、因此不含该异常基因产物的相同种哺乳动物细胞制备的基因相比较，能鉴定出编码异常基因产物(例如异常受体)的基因。
经基因序列和功能分析鉴定为致病基因的异常基因(例如，编码来源于人细胞的异常基因产物的基因，优选地编码来源于人细胞的异常受体的基因，等等)，能通过例如以下所述的方法制备。
首先，从该基因产物起源的动物种的细胞(如人细胞)中，优选地从患有该异常基因产物所致疾病的动物细胞中，制备编码异常基因产物的RNA。从这些材料中制备RNA的有效方法包括硫氰酸胍法[J.W.Chirgwin等人，生物化学(Biochemistry)，18卷，5294页(1979)]。
向如此获得的RNA中加入寡dT引物或随机寡核苷酸后，在反转录酶的存在下能合成cDNA。可在有义引物和反义引物的存在下进行PCR，两种引物都是为了从标准cDNA制剂中扩增异常基因产物的cDNA，它们是根据该产物的公布序列或分析鉴定的序列获得的，可按市售试剂盒(如Cetus/Perkin-Elmer所生产的)说明书的指导进行PCR。通过普遍已知的方法(如琼脂糖电泳)能分离扩增的cDNA，然后从凝胶中回收。可通过双脱氧核苷酸合成链终止法[T.Messing等人，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)，9卷，309页(1981)]测定该cDNA的碱基序列。
同样能使用含克隆cDNA的质粒，或用适当的限制酶切后插入所希望的另一种载体中。
可使用任何载体，只要它能在宿主中复制即可。当宿主是埃希氏杆菌(Escherichia)属的细菌(如大肠杆菌(Escherichia coli))时，这类载体包括大肠杆菌衍生的质粒，如pBR322[F.Bolivar等人，基因(Gene)，2卷，95页(1979)]、pBR325、pUC12和pUC13。当宿主是酵母时，这类载体包括酵母衍生的质粒，如pSH19[S.Harashima等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，4卷，771页(1984)]和pSH19-1(欧洲专利申请公布EP-A-0235430)。当宿主是动物细胞时，这类载体包括，如pSV2-X[R.C.Mulligan和P.Berg，美国国家科学院学报，78卷，2072页(1981)]和pcD-X[H.Okayama和P.Berg，分子细胞生物学，3卷，280页(1983)]，pSV2-X是由SV40 ori插入pBR322中产生的。当宿主是昆虫细胞时，这类载体包括，如杆状病毒转移载体pVL1392和pVL1393[厂商(InvitrogenCorporation，CA，美国)提供的手册(MAXBACtm杆状病毒表达系统，手册1.4版)]。
克隆的cDNA在其5’端可具有翻译起始密码子(ATG)，在其3’端可具有翻译终止密码子(TAG、TGA或TAA)。为增强该cDNA的表达，优选地将启动子序列连接至上游并与之有效连接。
任何启动子都能用于本发明，只要它适合于用来表达目的基因的宿主即可。当宿主是大肠杆菌时，这类启动子包括T7启动子、trp启动子、tac启动子、lac启动子和λPL启动子，优先选择T7启动子。当宿主是酵母时，这类启动子包括GAPDH启动子、PGK启动子、PHO5启动子和ADH启动子，优先选择GAPDH启动子。当宿主是动物细胞时，这类启动子包括SV40衍生的启动子、逆转录病毒启动子和人巨细胞病毒启动子。当宿主是昆虫细胞时，这类启动子包括核型多角体病毒的多角体蛋白启动子。
能从相应的基因中制备启动子。也可以化学合成。表达载体可包含信号序列、前原序列等，这些序列可选自已知的信号，只要它们能在宿主中起作用即可。
使用如此构建的含DNA的重组表达质粒，可产生转化体。
宿主包括，例如埃希氏杆菌属的细菌、酵母、动物细胞和昆虫细胞。埃希氏杆菌属的细菌包括大肠杆菌K12 DH1[B.Low，美国国家科学院学报，60卷，160页(1968)]、C600[R.K.Appleyard，遗传学(Genetics)，39卷，440页(1954)]、MM294[K.Backman等人，美国国家科学院学报，73卷，4174页(1976)]和N4830[M.E.Gottesman等人，分子生物学杂志，140卷，57页(1980)]。酵母包括，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AH22R-[A.Miyanohara等人，美国国家科学院学报，80卷，1页(1983)]、NA87-11A、DKD-5D、NA74-3A和NA74-3Ap-[Y.Kaisho等人，酵母(Yeast)，5卷，91页(1989)]以及粟酒酵母(Saccharomycespombe)ATCC38399(h-leu1-32)和TH168(h90 ade6-M210 ural leu1)[M.Kishida和C.Shimada，当代遗传学(Current Genetics)，10卷，443页(1986)]。动物细胞包括，如猿猴COS-7细胞、猿猴Vero细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠L细胞、人FL细胞，它们都是贴壁细胞，以及小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0细胞等)、小鼠YAC-1细胞、小鼠MethA细胞、小鼠P388细胞和小鼠EL-4细胞，它们都是悬浮细胞。昆虫细胞包括Sf9细胞。
埃希氏杆菌属的细菌能按照如T.Maniatis等人[《分子克隆》，ColdSpring Harbor Laboratory，249页(1982)]所述的方法转化。酵母能按照如A.Hinnen(美国国家科学院学报，75卷，1929页(1978))所述的方法转化。动物细胞能按照如M.Wigler等人在《细胞》14卷725页(1978)中描述的方法转化。昆虫细胞能按照厂商(Invitrogen Corporation)提供的手册(MAXBACtm杆状病毒表达系统，手册1.4版)转化。
用普遍已知的方法培养如此获得的转化体。
优选地用来培养宿主是埃希氏杆菌属细菌的转化体的培养基包括，如含葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培养基[J.H.Miller，《分子遗传学实验》，431页，Cold Spring Harbor Laboratory(1972)]。为了必要时提高启动子的效率，可加入化学试剂，如异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)或吲哚基-3-丙烯酸。培养通常是在大约15-43℃下进行约3-24小时，必要时通气和/或搅动。
用于培养宿主是酵母的转化体的培养基包括，如Burkholder基本培养基[K.L.Bostian等人，美国国家科学院学报，77卷，4504页(1980)]。优选地，将该培养基调节至pH约5-8。培养通常是在大约20-35℃下进行约24-72小时，必要时通气和/或搅动。
用于培养宿主是动物细胞的转化体的培养基包括，如含约5-20％胎牛血清的MEM培养基[H.Eagle，科学，130卷，432页(1959)]、DMEM培养基[R.Dulbecco和G.Freeman，病毒学(Virology)，8卷，396页(1959)]、RPMI-1640培养基[G.E.More等人，美国医学学会杂志(Journalof the American Medical Association)，199卷，519页(1967)]、199培养基[J.F.Morgan等人，实验生物学与医学会学报(Proceedings of theSociety for Experimental Biology and Medicine)，73卷，1页(1950)]和ASF104培养基(Ajinomoto)。培养通常是在大约30-40℃下进行约15-60小时，必要时通气和/或搅动。
用于培养宿主是昆虫细胞的转化体的培养基包括，如TNM-FH培养基[W.F.Hink等人，自然，226卷，466页(1990)]。培养通常是在大约15-30℃下进行约24-72小时，必要时通气和/或搅动。
根据本发明，通过普遍已知的分离和纯化方法的适当结合能分离表达产物(异常基因产物，如异常受体)。这些已知的分离和纯化方法包括基于溶解度差异的方法，如盐析和溶剂沉淀；主要基于分子量差异的方法，如透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；基于电荷差异的方法，如离子交换层析；基于特异亲和力的方法，如亲和层析；基于疏水性差异的方法，如反相高效液相层析；以及基于等电点差异的方法，如等电聚焦。
使用大肠杆菌、培养的动物细胞、培养的昆虫细胞等通过基因工程技术表达异常基因产物，能大量、高纯度地产生目的产物。
当如此获得的异常基因产物为游离形式时，能通过已知的方法或基于此的方法将其转化为盐。当以盐的形式获得异常基因产物时，能通过普遍已知的方法或基于此的方法将其转化为游离形式或另一种盐。
同样，使用异常基因产物的cDNA在真核细胞中表达该产物(例如人的异常受体等)并使用获得的异常基因产物寻找能校正它的化合物是可能的。另外，通过使用编码特定异常基因产物的基因作为DNA探针，用Northern印迹法能确定体内表达的异常基因产物中的mRNA含量。此外，制备抗该异常基因产物的抗体并用原位杂交法定量测定体内的该产物也是可能的。
该异常基因产物可用于筛选能校正异常基因产物的物质，筛选能用于治疗异常基因产物所致疾病的药物(例如，筛选能校正患有异常受体所致疾病的哺乳动物中具有该异常受体之细胞的转移系统的药物)，并能用于其它目的，尤其可用于筛选温血动物(如人)中疾病相关性异常受体的激动剂或拮抗剂。
以下更具体地描述上述筛选方法。
上述异常基因产物可用于寻找其校正物质。换句话说，它可提供一种筛选能校正异常基因产物的物质的方法，其中使该产物与受试物质接触，以确定该受试物质对异常基因产物的作用。
有用的受试物质包括已知的配体、合成化合物、肽、蛋白质等，以及温血哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、猴、人)的组织提取物和细胞培养上清液。例如，可将这种组织提取物、细胞培养上清液等加入上述异常基因产物中，随后经监测校正活性等进行分级分离，以最后得到单一的校正物质。
具体地，该筛选方法通过以下方法来举例说明，即通过构建异常基因产物(如异常受体)的表达系统，并将受试物质加入表达系统中，从而检验对该产物具有校正活性的物质(例如肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物)。特别地，在筛选异常受体的校正物质中，优选使用通过在细胞中表达编码异常受体的基因而制备的异常受体。
更具体而言，本发明提供能校正异常基因产物的物质的筛选方法，其特征在于①当使标记的受试物质与异常基因产物(如异常受体)接触时，测定与该产物结合的标记物质的量，②当使标记的受试物质与含异常基因产物(如异常受体)的细胞或该细胞的膜部分接触时，测定与该细胞或膜部分结合的标记受试物质的量，③当使标记的受试物质与异常基因产物(如异常受体)接触时，测定与该产物结合的标记受试物质的量，该产物是通过培养含有编码该产物的DNA的转化体而表达于该转化体细胞膜上的，④当使受试物质与含异常基因产物(如异常受体)的细胞接触时，使用经该产物的细胞刺激活性(例如生长促进、细胞内蛋白质磷酸化的促进或抑制)测定受试物质的校正活性，以及⑤当使受试物质与异常基因产物(如异常受体)接触时，使用经该产物的细胞刺激活性(例如生长促进、细胞内蛋白质磷酸化的促进或抑制)测定受试物质的校正活性，该产物是通过培养含有编码该产物的DNA的转化体而表达于该转化体细胞膜上的。
标记的受试物质包括用[3H]、[125I]、[14C]、[135S]或其它放射性同位素标记的物质。
以下描述了筛选能校正异常基因产物的物质的实例步骤。
首先，通过在适当的缓冲液中悬浮含异常受体的细胞或其膜部分，制备标准的异常受体制剂。能使用任何缓冲液，只要它不妨碍受试物质-异常受体的结合即可。这类缓冲液包括pH约4-10(优选地pH6-8)的磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液。为了降低非特异性结合，可向缓冲液中加入表面活性剂(如CHAPS、吐温80(商品名)(Kao-Atlas)、毛地黄皂苷和脱氧胆酸盐)，以及多种蛋白质(如牛血清白蛋白和明胶)。同样，为了抑制受体和受试物质被蛋白酶降解，可加入蛋白酶抑制剂，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、亮抑蛋白酶肽、E-64(由Peptide Institute，Inc.生产)和胃蛋白酶抑制剂。向0.01ml-10ml该受体溶液中加入标记了指定量(5000cpm-500000cpm)的[3H]、[125I]、[14C]等的受试物质。也提供了含过量未标记受试物质的反应管，以测定非特异性结合(NSB)的量。在0℃-50℃、优选地4℃-37℃进行反应20分钟-24小时、优选地30分钟-3小时。反应完成后，将反应混合液通过玻璃纤维滤纸等过滤，并用适量的相同缓冲液洗涤，之后使用液体闪烁计数器或γ-计数器测定玻璃纤维滤器中的残留放射性。从总结合(B)中减去非特异性结合(NSB)获得0cpm以上放射性(B-NSB)的受试物质可被选择为该异常受体的配体。
为估计受试物质对异常受体的校正活性，首先将含异常受体的细胞培养于多孔培养板等中。在激动剂测定之前，将培养基替换为新鲜的培养基或对细胞无毒的适当缓冲液，随后在受试物质的存在下温育指定的一段时间，然后提取细胞或回收上清液，并用适当的方法定量测定所得产物。当由于细胞中所含降解酶而难以检测细胞刺激活性指标物质的产生时，可在测定前加入该降解酶的抑制剂。受试物质的校正活性的估计方法包括，当使受试物质与含异常基因产物的细胞接触时，测定经该产物的活性(例如生长促进、细胞内蛋白质磷酸化的促进或抑制)或细胞内信号转导系统中效应物质浓度的变化(例如cAMP、肌醇磷酸、钙离子等)，或者，当使受试物质与通过培养含有异常受体编码DNA的转化体而表达于该转化体细胞膜上的异常受体接触时，测定经异常基因产物的活性(例如生长促进、细胞内蛋白质磷酸化的促进或抑制)或细胞内信号转导系统中效应物质浓度的变化(例如cAMP、肌醇磷酸、钙离子等)。
同样，本发明提供了可用于治疗异常基因产物所致疾病的药物的产生方法，其中该方法包括使异常基因产物(如异常受体)与受试物质接触，估计该物质对该产物的校正活性，并制备认为可基本校正异常基因产物的药物。本发明也提供了可用于治疗异常基因产物所致疾病的药物的制备方法，其中该方法包括使异常受体与受试物质接触，估计该物质对该异常受体的校正活性，并制备认为可基本校正含异常受体之细胞的信号转导系统的药物。因此，根据分析与人类疾病相关的结构基因所获得的信息，建立了一种药物开发或制备的新方法，这种信息用来阐明基因突变与疾病之间的因果关系。
如此产生的药物能以例如片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等的形式口服使用，必要时它们都可以用糖包被，或者以可注射制剂的形式非口服使用，如无菌水溶液和悬液或其它药学上可接受的液体。同样将如此获得的药物与生理学可接受的载体(carrier)、调味剂、赋形剂、载体(vehicle)、防腐剂、稳定剂、粘合剂等以药物制备中普遍承认的方法相混合，制成单位施用形式，能产生希望的预防/治疗剂。
能混合于片剂、胶囊等中的添加剂包括，例如，粘合剂如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯树胶，赋形剂如晶体纤维素，溶胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸，润滑剂如硬脂酸镁，甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精，以及调味剂如薄荷和樱桃。当单位施用形式是胶囊时，上述材料中可进一步掺入液体载体如油和脂肪。注射用的无菌组合物能通过药物制备的普通方法配制，如通过在载体如注射用水中溶解或悬浮活性成分、天然存在的植物油如芝麻油和椰子油等。注射用的含水液体包括生理盐水和含葡萄糖和其它助剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠)的等渗溶液，并且可以与适当的助溶剂如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂(如polysorbate80(商品名)、HCO-50)等结合使用。油状液体包括芝麻油和豆油，并且可以与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。
也可用缓冲液(如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、安慰剂(如氯化苯甲烃胺、盐酸普鲁卡因)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇)、防腐剂(如苯甲醇、苯酚)、抗氧化剂等配制含水液体。通常将如此制备的可注射液体填充至合适的安瓿中。因为如此获得的制剂甚至在低剂量时也是有效的，从而比较安全，毒性也低，所以能对如温血哺乳动物(例如大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴、人)施用。作为高血压治疗剂时，口服施用的剂量对于成人(体重60kg)通常为每天约0.1mg-100mg，优选地约1.0-50mg，更优选地约1.0-20mg，这取决于靶疾病、症状等。非口服施用时，以可注射制剂的形式施用药物是有利的，对于成人(体重60kg)每日施用剂量为每次施用约0.01mg-30mg，优选地约0.1-20mg，更优选地约0.1-10mg，这取决于施用的患者、靶器官、症状、施用方法等。对于其它动物种，可按每60kg体重换算施用相应的剂量。
此外，本发明提供一种能校正异常基因产物的物质在治疗该异常基因产物(如异常受体)所致疾病中的应用，提供了通过在细胞中表达编码异常基因产物(如异常受体)的基因而获得的异常基因产物在筛选治疗该产物所致疾病的物质的应用，提供了通过在细胞中表达编码异常基因产物(如异常受体)的基因而获得的异常基因产物在筛选该产物的一种校正物质中的应用，等等。
实施本发明的最佳方式碱基、氨基酸和本说明书中使用的其它物质的缩写基于IUPAC-IUB生物化学命名委员会所规定的缩写，或在相关领域中通用的缩写。以下给出了一些实例。当氨基酸中可存在光学异构体时，除非另外说明，否则是L构型。
DNA脱氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶SDS十二烷基硫酸钠Gly甘氨酸(G)Ala丙氨酸(A)Val缬氨酸(V)Leu亮氨酸(L)Ile异亮氨酸(I)Ser丝氨酸(S)Thr苏氨酸(T)Cys半胱氨酸(C)1/2Cys胱氨酸一半Met甲硫氨酸(M)Glu谷氨酸(E)Asp天冬氨酸(D)Lys赖氨酸(K)Arg精氨酸(R)His组氨酸(H)Phe苯丙氨酸(F)Tyr酪氨酸(Y)Trp色氨酸(W)Pro脯氨酸(P)Asn天冬酰胺(N)
Gln谷氨酰胺(Q)Apr氨苄青霉素抗性基因Ter四环素抗性基因以下通过下列实施例更详细地描述了本发明，这些实施例只用作例证，不解释为对本发明的限制。
实施例1人β3肾上腺素能受体cDNA的克隆为通过PCR方法扩增人β3肾上腺素能受体cDNA，参照人β3肾上腺素能受体的已知核苷酸序列[J.M.Lelias等人，FEBS Lett.，324卷，127页(1993)]，合成下列两条引物(1号和2号)。
1号有义引物5′-ATTTGGGAGACCCCCTCCTTCCTTCTTTCC-3′(SEQ ID NO1)2号反义引物5′-ACAGAGTTGTTGCTTCTTGTCCTTCAGGCC-3′(SEQ ID NO2)使用Takara Ex Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)和包括的缓冲液，进行下列PCR反应。用0.5μl人脂肪细胞衍生的cDNA文库(CLONTECHLaboratories，Inc.)作为模板，将5μl附带的PCR反应缓冲液(10倍稀释)、4μl dNTP混合物、0.5μl(2.5U)Takara Ex Taq和2种引物的每一种(上述1号引物与λgt11正向引物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的组合以及上述1号引物与λgt11反向引物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的组合；每种100pmol)加入一个管中，并用无菌蒸馏水稀释至50μl。进行PCR反应，94℃2分钟、61℃1分钟和72℃1分钟，25个循环；将两管混合；向5μl该反应混合液中加入两种引物(上述1号和2号；每种100pmol)，随后于94℃2分钟、55℃1分钟和72℃1分钟30个循环进行PCR反应。经1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，证实扩增的DNA片段的位置对应于由人β3肾上腺素能受体的核苷酸序列所预计的大小(1310bp)。从琼脂糖凝胶中回收该DNA片段，插入质粒载体pUC19(TakaraShuzo Co.，Ltd.)的SmaI位点，产生p19-hβ3R。通过双脱氧核苷酸合成链终止法[T.Messing等人，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)，9卷，309页(1981)]测定cDNA的核苷酸序列，证实它与公布的序列相同。
实施例2人β3肾上腺素能受体突变体(Trp64Arg)DNA的制备合成用于诱变的合成寡核苷酸，如下使用Mutan-Super Express Km(Takara Shuzo Co.，Ltd.)产生突变体用于诱变的3号寡核苷酸5′-TGGCCATCGCCCGGACTCCGAG-3′(SEQ ID NO3)通过用限制性酶EcoRI和XbaI消化实施例1所述的质粒p19-hβ3R获得DNA片段，将其从琼脂糖凝胶中回收，插入该试剂盒(Takara ShuzoCo.，Ltd.)附带的质粒载体pKF18k的EcoRI和XbaI位点之间，产生p18k-hβ3R。使用10ng该DNA作为模板，在用无菌蒸馏水稀释至50μl的5pmol附带的选择性引物、5pmol上述5号引物、5μl反应缓冲液(10倍稀释)、4μl dNTP混合物和0.5μl(2.5U)TaKaRa LA Taq的存在下，进行PCR反应，94℃1分钟、55℃1分钟和72℃3分钟，25个循环，随后通过乙醇沉淀回收DNA。将该DNA溶于5μl无菌蒸馏水中；使用2μl该溶液，将该DNA引入附带的大肠杆菌MV1184株中，产生能在含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上生长的转化体。在这些转化体中，对几个克隆进行突变位点处的核苷酸序列测定；将证实具有引入突变的一个克隆命名为p18k-hβ3(W64R)R。
实施例3用于人β3肾上腺素能受体基因在动物细胞中表达的重组DNA的制备用EcoRI和XbaI消化实施例1中所述的质粒p19-hβ3R后，从琼脂糖凝胶中回收人β3肾上腺素能受体cDNA片段。然后，将上述cDNA片段插入pME18S[R.Sasada等人，生物化学与生物物理学研究通讯，190卷，1173页(1993)]的EcoRI和XbaI位点之间，产生表达质粒phβ3R201，pME18S是一种用于在动物细胞中瞬时表达的载体。然后，如下所述插入新霉素抗性基因(neo)，一种药物抗性标记，以筛选显示稳定表达的细胞系。首先，将由SV40早期启动子、neo基因和SV40聚腺苷酸化信号组成的片段插入质粒phβ3R201的KpnI和SspI位点之间，产生质粒phβ3R203。
用EcoRI和XbaI消化实施例2中所述的质粒p18k-hβ3(W64R)R后，从琼脂糖凝胶中回收人β3肾上腺素受体变体cDNA片段。进行与以上所示相同的步骤，制备质粒phβ3(W64R)R201和phβ3(W64R)R203。
实施例4人β3肾上腺素能受体基因在动物细胞中的表达如下使用哺乳动物转染试剂盒(STRATAGENE，CA，美国)将实施例3中所述的每种质粒(phβ3R203和phβ3(W64R)R203)都引入CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中向80cm2摇瓶中加入15ml完全培养基[含10％(v/v)FCS(胎牛血清)的Ham F-12培养基(LIFE TECHNOLOGIES，INC.)]，并接种5×105个CHO细胞。在5％二氧化碳存在下37℃培养过夜后，将该培养基替换为10ml上述培养基。向30μg实施例1所述的质粒(phβ3R203)中加入无菌水至450ml后，将该试剂盒所含的50μl溶液#1、然后500μl溶液#2混合于450ml中。将该混合液置于室温15分钟后，向细胞上逐滴加入1ml等份并与之混合，随后在3％二氧化碳存在下37℃培养过夜。下一天，去除培养基；用F-12培养基(不含血清)洗涤细胞表面后，加入15ml完全培养基(10％FCS/F-12)，随后在5％二氧化碳存在下37℃培养过夜。下一天，将上述细胞以每孔约200个细胞接种至12孔板，板中补充有含10％FCS的D-MEM-F-12培养基(Nikken Seibutsu Igaku Kenkyujo)，随后过夜培养，之后将细胞在含400μg/ml G418(LIFE TECHNOLOGIES，INC.)的培养基(10％FCS/D-MEM/F-12)中进一步培养，每3至4天更换培养基，直到观察到集落形成。发现大量集落形成后，将每孔1到几个集落接种于24孔板中培养，板中补充有含400μg/ml G418(2ml/孔)的10％FCS/D-MEM/F-12培养基，收获G418抗性细胞(初级克隆)。然后，对于初级克隆中收获的2至3孔细胞，将每孔10个集落接种于含提高浓度的800μg/mlG418的24孔板中培养，收获G418抗性细胞。从这些细胞中，通过以下实施例5所述的方法筛选出一个显示人β3肾上腺素能受体高表达的细胞系(次级克隆)。
实施例5显示人β3肾上腺素能受体表达的细胞中cAMP活性的测定如下使用cAMP ELA SYSTEM(Amersham，UK)测定cAMP产生活性将实施例4中在24孔板上获得的显示人β3肾上腺素能受体表达的细胞(CHO/phβ3R203和CHO/phβ3(W64R)R203)的培养基替换为不含G418的培养基(10％FCS/D-MEM/F-12)；加入0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Wako Pure Chemical Industries)。在5％二氧化碳存在下37℃培养30分钟后，加入10-5异丙基肾上腺素[(±)-异丙基肾上腺素，Funakoshi]，随后进一步培养30分钟。然后，用4℃PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤细胞表面三次；加入300μl 0.1N盐酸，随后在95℃煮10分钟。从每孔中收集25μl等份，溶解于75μl该试剂盒附带的测定缓冲液中。将该溶液的50μl等份与100μl抗cAMP兔抗体一起加入固定有抗兔IgG驴抗体的试剂盒组分96孔微量滴定板的每一孔中，之后将板置于4℃1小时。然后，加入100μl HRP标记的cAMP；将板置于4℃1小时后，每孔洗4次，随后加入150μl TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)；将板置于室温60分钟后，向每孔中加入100μl 1.0N硫酸，随后进行450nm波长的吸收光谱测定。筛选出一个在异丙基肾上腺素存在下显示增加的cAMP产生活性的细胞系，异丙基肾上腺素是β肾上腺素能受体的一种激动剂。
实施例6人β3肾上腺素能受体突变体的配体结合活性的测定制备表达人β3肾上腺素能受体Trp64Arg变体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，用于寻找与人β3肾上腺素受体Trp64Arg变体特异结合的化合物。用冰预冷的磷酸盐缓冲液洗三次后，将表达人β3肾上腺素能受体Trp64Arg变体的CHO细胞浸于冰预冷的低渗溶液(1mM Tris-HCl缓冲液，pH7.2)中10分钟；分离细胞，随后于4℃18000rpm离心15分钟，回收含有该受体的细胞膜组分。加入TME缓冲液(75mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4、12.5mM氯化镁、1.5mM EDTA、4μM去甲丙咪嗪、5μg/ml亮抑蛋白酶肽、1μg/ml苯甲脒、5μg/ml胰蛋白酶抑制剂和40μg/mlbasitlacine)后，用25号注射针头均匀地悬浮获得的细胞膜组分，产生标准受体制剂。将制备的标准受体制剂(含10-30μg，基于蛋白质)、[125I]-iodocyanopindrole(240pM，DuPont-MEN，美国)和受试化合物混合；用TME缓冲液调节至250μl的终体积后，将混合液置于室温下90分钟。使用玻璃纤维滤器(GF/B，Packard Instrument Co.，Inc.，美国)和细胞收获器(Filter Mate Cell Harvester，Packard InstrumentCo.，Inc.，美国)抽滤该混合液；用闪烁计数器(TopCount微量培养板闪烁计数器，Packard Instrument Co.，Inc.，美国)测定滤器中的放射性。在加至100μM终浓度的(S)-(-)-心得安(Sigma，美国)存在下定量测定非特异性结合。
实施例7表达人β3肾上腺素能受体突变体的CHO细胞中cAMP渐增活性的测定将表达人β3肾上腺素能受体Trp64Arg变体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系接种于96孔微量滴定板中(1×104个细胞/孔)；长满后培养72小时，加入受试化合物；将板置于37℃40分钟(100μl/孔)。用4℃磷酸盐缓冲液洗细胞三次后，加入0.1N盐酸，随后于95℃煮10分钟。从每孔中收集25μl等份，溶解于75μl cAMP EIA SYSTEM(Amersham，UK)附带的测定缓冲液中；从该溶液中取出50μl样品，如下所述用上述cAMP EIASYSTEM定量测定。将以上样品(50μl)和100μl抗cAMP兔抗体加入固定有抗兔IgG驴抗体的96孔微量滴定板中后，将板置于4℃2小时；加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的cAMP后，将板置于4℃1小时。对每孔抽气，用洗涤液洗板4次(400μl/孔)。然后，向每孔中加入150μl四甲基联苯胺(一种HRP的底物)，随后于室温振摇温育60分钟。最后，加入100μl1.0N硫酸终止反应，之后通过450nm波长的吸收光谱测定定量cAMP。获得的结果证明，CHO细胞中cAMP浓度的增加取决于所加入的化合物的浓度，与不含化合物的情况相比这种增加是显著的。
实施例8化合物筛选根据依照实施例6的方法的化合物筛选法，能获得对人β3肾上腺素能受体Trp64Arg变体显示高亲和力的化合物。依照实施例7的方法测试化合物表明，显示人β3肾上腺素能受体Trp64Arg变体表达的CHO细胞中，cAMP浓度随化合物浓度增加。
在此提及的所有参考文献都引入作为参考。已特别参照其优选实施方案详细描述了本发明。然而，应当理解，本领域的技术人员在考虑本公开内容后可进行本发明精神和所述内容的修改和改进。
序列表SEQ ID NO1序列长度30序列类型核酸链型单链序列类别有义序列ACAGAGTTGT TGCTTCTTGT CCTTCAGGCCSEQ ID NO2序列长度30序列类型核酸链型单链序列类别反义序列ACAGAGTTGT TGCTTCTTGT CCTTCAGGCCSEQ ID NO3序列长度22序列类型核酸链型单链序列类别有义序列TGGCCATCGC CCGGACTCCG AG
权利要求
1.一种药物组合物，其中包含一种能使异常基因产物以类似于野生型基因产物的方式起作用的物质和一种药学可接受的载体。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中该物质是异常基因产物的一种激动剂或拮抗剂。
3.根据权利要求1的药物组合物，其中该异常基因产物是一种异常受体、异常通道、异常信号或异常酶。
4.根据权利要求1的药物组合物，其中该异常基因产物是一种异常受体，并且该组合物用于异常受体所致疚病的预防和/或治疗中。
5.根据权利要求4的药物组合物，其中异常受体引起的疾病包括由含异常受体之细胞的信号转导系统活性的实质性降低引起的疾病。
6.根据权利要求4的药物组合物，其中异常受体引起的疾病包括由天然配体对含异常受体之细胞的信号转导系统的作用实质性缺乏引起的疾病。
7.根据权利要求4的药物组合物，其中异常受体引起的疾病包括天然配体对异常受体的亲和力实质性降低引起的疾病。
8.根据权利要求6的药物组合物，其中信号转导系统包括基于效应物质细胞内浓度变化的信号转导系统，该浓度变化是由天然配体和受体的结合引起的。
9.根据权利要求6的药物组合物，其中信号转导系统进一步包括选自cAMP、肌醇磷酸或钙离子的效应物质。
10.根据权利要求4的药物组合物，其中能校正异常受体的物质是作用于正常受体的物质。
11.根据权利要求4的药物组合物，其中能校正异常受体的物质是不作用于正常受体的物质。
12.用于治疗动物中由异常基因产物引起的疾病的方法，包括对动物提供有效量的能校正异常基因产物的物质。
13.根据权利要求12的用途，其中该异常基因产物是一种异常受体。
14.能校正异常基因产物的物质的筛选方法，它包括使异常基因产物与受试物质接触，并测定该物质对该产物的校正活性。
15.根据权利要求14的筛选方法，其中该异常基因产物是一种异常受体。
16.可用于治疗异常基因产物所致疾病的物质的筛选方法，该方法包括使异常基因产物与受试物质接触，并测定该物质对该产物的校正活性。
17.可用于使患有异常受体所致疾病的哺乳动物中具有异常受体之细胞的信号转导系统恢复正常功能的药物的筛选方法，该方法包括使异常受体与受试物质接触，并测定该物质对该受体的活性，其中所述活性是恢复细胞正常功能的活性。
18.根据权利要求16的筛选方法，其中该异常受体是通过在细胞中表达编码异常受体的基因而制备的一种异常受体。
19.根据权利要求16的筛选方法，其中编码异常受体的基因是通过对由患有该异常受体所致疾病的哺乳动物细胞制备的基因与由不含异常受体的相同种哺乳动物的细胞制备的基因进行比较分析而确定的异常受体编码基因。
20.可用于治疗异常基因产物所致疾病的药物的制备方法，它包括使异常基因产物与受试物质接触，测定该物质对该产物的活性，并制备评定为可实质上校正含异常基因产物之细胞的信号转导系统的物质，其中所述活性是恢复基因产物野生型活性的活性。
21.可用于治疗异常受体所致疾病的物质的制备方法，它包括使异常受体与受试物质接触，测定该物质对该异常受体的活性，并制备评定为可实质上校正含异常受体之细胞的信号转导系统的物质，其中该活性是恢复受体野生型活性的活性。
22.根据权利要求21的方法，其中该异常受体是通过在细胞中表达编码异常受体的基因而制备的一种异常受体。
23.根据权利要求22的方法，其中编码异常受体的基因是通过对由患有异常受体所致疾病的哺乳动物细胞制备的基因与由不含异常受体的相同种哺乳动物的细胞制备的基因进行比较分析而确定的异常受体编码基因。
24.能校正异常基因产物的物质的筛选方法，它包括在细胞中表达编码异常基因产物的基因，分离异常基因产物，对异常基因产物提供一种物质，以及测定该物质对该基因产物的校正活性。
25.根据权利要求24的方法，其中该异常基因产物是一种异常受体。
26.根据权利要求24的方法，其中该物质是通常能修正该产物的物质。
全文摘要
提供了能校正异常基因产物的物质的应用,该物质通过一种新的药物产生技术制备,这种技术集中于病因,使用分析与疾病相关的结构基因所获得的信息。因此本发明包括(1)一种药物组合物,它包含一种能校正异常基因产物的物质,(2)一种方法,其中使用该物质治疗由该产物引起的疾病,(3)该物质的一种筛选方法,以及(4)可用于治疗该产物所致疾病的药物的制备方法。
文档编号C12Q1/25GK1251653SQ98803790
公开日2000年4月26日 申请日期1998年4月1日 优先权日1997年4月2日
发明者藤野政彦 申请人:武田药品工业株式会社