专利名称：一种新的癌胎基因及其基因产物和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从T-淋巴瘤文库中获得的新的cDNA克隆。此新cDNA克隆被称为Pem，它能与胎盘和胚胎阶段中特异性表达的转录产物杂交。Pem cDNA顺序编码一种细胞内亲水性蛋白质，与其它DNA或蛋白质序列都没有显著的序列相似性。本发明的DNA序列和重组DNA分子均特征性地编码一种新的蛋白质，其具有下列特点(1)由T-淋巴瘤细胞表达;(2)在正常胸腺，激活的脾细胞，肠系淋巴组织或骨髓中都不表达;在成年脑，肝，大肠或卵巢中都不能检测到;(3)在不灭的或癌细胞系中表达;(4)在胚胎发育过程中发达。在下文中可以看到，该DNA序列，重组DNA分子和生产胚胎发育过程中表达的该新蛋白质的过程及生产大体上纯的新的Pem蛋白，在操纵胚胎发育调节，改变肿瘤发生表型方面可能有用处，也可能有益于对含有Pem致癌基因的肿癌进行定位。
很多参与发育过程的基因已在无脊椎生物如黑腹果蝇，Caenorhabditis elegans和Saccharomyces cerevisiae中鉴定出来。在哺乳动物系统中，只有少数在整体水平上起作用的基因已被鉴定。(Blau1988 Cell 53673)例如肌肉中专一表达的基因，MyoDl和Myo-genin已成为鼠发育的遗传控制的重要模型。体节和肢芽分别在妊娠第8和第10天开始表达和MyoDl(Sasson，et al，(1989)Nature341303-308)，并且在体外控制对成肌细胞谱系的转换(Davis，et al，(1987)Cell51987-1000)，Hox-5基因复合体在妊娠第九天后鼠肢芽中的表达表现出一种有趣的模式，尽管这些基因编码的功能还尚未详尽，在鼠发育的早期和中期阶段几乎还没有遗传标记还作为标志。例如，分节始于小鼠妊娠的第八天，但未发现与分节起始过程专一有关的基因。(Rossant and Joyner(1989)Trends in Genetics 5277-283)。
不灭和完全转化的细胞经常转录一些基因，这些基因在正常哺乳动物发育过程中表达，并被认为对发育有影响(Reviewed，Ruddon(1987)Gene Derepression in cancer cells，in Cancer Biology，Oxford U-niversity Press，New York，Pages 431-436)。在有些情况下，这些癌胎基因似乎与赘生性表型无关。例如，甲胎蛋白在不灭细胞和许多肿瘤细胞中表达。另外一些情况下，在细胞向转化的表型转变的过程中，随发育过程进行调控的基因起主要作用。例如，原癌基因C-myc，C-src，C-fos和C-fms都在胚胎发育过程中表达，并已实验证明在体外调控发育步骤(for Review，see Adamson(1987)Placenta 8449-466)。
在免疫系统发育中，干细胞进入胸腺经分化和成熟，形成T-淋巴细胞。当T细胞在胸腺内径历不同的发育阶段时，许多或者被激活或者被抑制。例如，在这个时期，细胞表面需要IL-2受体，CD4或(和)CD8。这些分化标志对T细胞发育和(或)功能有着重要作用。正在发育的T淋巴细胞中，许多基因的表达水平提高。这样基因包括抗原的T细胞受体，以及标志物CD4和CD8。在许多其他抗原在淋巴细胞中准确功能被了解之前，这些抗原也已被用作T细胞的标志物。就在最近发现T细胞抗原Pgp1帮助淋巴细胞生存在胸腺中，而T200(CD45)则作为胞内信号的一个成分。另一个T细胞标志物，Thy1，尚未发现与之有关的功能。
SL12.4细胞具有CD4/CD8双重阴性表型，因而类似于发育较为早期的淋巴细胞。并且，他们也不表达T细胞受体α亚单位。但是SL12.4细胞在胸腺上皮单层细胞上共培养后，可被诱导在其表面稳定地表达CD4和CD8。经过这种处理，也可以诱导出TCR-αmRNA。因此，看来SL12.4细胞具有进行分化和成熟的能力。这种独特的生物系统在一定程序上模拟了胸腺微环境。
有许多基因已被鉴定，这些基因首先是在发育过程中的胸腺细胞内表达。许多这类基因都编码蛋白，这些蛋白质的表达是T细胞前体在免疫系统中变得有功能所必需的，例如(1)TCR编码抗原，这种抗原是抗原识别所必需的;(2)CD25(IL2受体)其表达是细胞对细胞分裂素IL2发生反应所必要的;(3)在抗原识别过程中对信号转导具有重要作用的基因产物，如CD3，CD4，CDS，CD45;(4)某些基因产物与胸腺细胞移位到靶器官上有关;(5)参与T细胞激活的基因产物(Fowlkes and Pardoll，Advances in lmmunology 44207-264(1989);Hood，et al，(1985)Cell40225-229;Rothenberg and Lugo，Develop.Biol.1121-17(1985);Adkins et al.，Ann.Rev，lmmunol.5325-365(1987);Crabtree，Science 243343-355(1989);Kwon and Weissman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA861963-1967(1989)。在胸腺细胞亚系中存在着显著的多相性，各个亚系具有各自不同的表达基因的组合。在许多类的胸腺细胞中，对一些(并非全部)种类的基因的表达已进行了详细的分析;编码产物在T细胞发育和位移中起作用的基因还有待鉴定，特别是在那些数目极少，持续片刻的前体胸腺细胞中表达的基因。
由于存在胸腺细胞的多样性，因而不可能分级分离得到足够量或纯度的前体胸腺细胞来研究发育过程中出现的基因逐次表达。正是基于这个原因，淋巴瘤和白血病细胞系在研究淋巴样发育中的基因表达时被广泛应用(Greaves(1986)Science 234697-704;Hanley-Hyde and Lynch(1986)Ann.Rev.lmmunol.4621-649)。有大量的文献报道指出，数目极少，持续久刻的前体胸腺细胞是向恶性转化的靶细胞，而且在肿瘤细胞中，转化的靶细胞的一些性质得到了保留。转化失常时，肿瘤细胞中一些意想不到的基因表达也常常停止。在造血瘤细胞中对“失常的”基因表达的研究发现极少的正常前体细胞亚系表达这类基因(Greaves(1986)Science 234697-704;Hanley-Hyde and Lynch(1986)Ann.Rev.lmmunol.4621-649;Pierce and Speers(1988)Cancer Res.481996-2004)。
鼠和人淋巴瘤细胞系由单个个体产生的多相性，是因为个体细胞成熟的程度的差异形成的。建立的T淋巴瘤细胞系的多相性已被用于获得关系极近的细胞克隆，这些克隆只有少数性质不同。Hedrick，et al，(Hedrick，et al.(1984)Nature 308149-153)用差异克隆技术估计，T细胞和B细胞在100个左右的基因表达上有差异。这样看来关系极近的T淋巴瘤细胞可能只有更少的基因表达上有差异。这些细胞克隆使我们能用纯净的细胞群体进行工作，这些细胞具有已详知和稳定的表型，只在少数性质上有差异。SL12T淋巴瘤模式系统已经建立，用以提供一个关系紧密的细胞群。(Hays，et al.(1986)lnt.J.Cancer 30597-601;Mac Leod，et al(1984)Cancer Res 441784-1790;Mac Lead，et al.(1985)J.Nat Camcer lnst 74875-882;Moc Leod，et al.(1986)Proc Narl.Acad.Sci.USA836989-6993;Siegal，et al(1987)J.Exp.Med.1661702-1715)。
SL12.4细胞与成熟中期的胸腺细胞相似(Fowlkes and Pardoll(1989)Advances in lmmunol.44207-264)。这两个细胞克隆在生物学性质上不同。SL12.4细胞产生肿瘤，对糖皮质激素诱导的溶菌敏感，而SL12.3细胞引起扩散性的肿瘤，对糖皮质激素引起的裂列具有抗性。
此项发明提供了一个新的cDNA序列，一个基因产物(Pem)蛋白质，以及这个新的cDNA序列及Pem基因产物的应用。在这项发明中，从T淋巴瘤获得的一个cDNA克隆(Pem)所代表的一个新基因，其序列和表达特点都作了介绍。来源于一些谱系的转化的和细胞表达Pem转录物。本项发明的DNA序列和重组DNA分子都特征性地编码一种新蛋白质，其具有下列特点(1)在T淋巴瘤细胞表达，(2)在正常胸腺，激活的脾细胞，肠系淋巴组织，或骨髓中都不表达;在成年脑，肝，大肠或卵巢中都不能检测到(3)在/或癌细胞系中表达，(4)在胚胎发育过程中表达。在下文中可以看到，该DNA序列，重组DNA分子和生产胚胎发育过程中表达的该新蛋白质的过程及生产大体上纯的新的Pem蛋白质，在操纵胚胎发育调节，改变肿瘤发生表型方面可能有作用。也可能会有益于对含有Pem致癌基因的肿癌进行定位。
尽管在成体组织中，Pem基因的表达未被检测到，在鼠胎发育过程中Pem基因顺次表达，首先是在早期胚胎，随后在胚外组织表达。Pem在胎发育过程中表达，并在不灭细胞和赘生性细胞系存在，这与癌胎基因所预期的性状是一致的。这段Pem cDNA序列可以作为一个标志，用于赘生性细胞及参与早期胚胎发育的细胞。
经过对本发明示图的简要说明及随后的详细介绍之后，可以对此项发明的对象、特性及优越性有进一步的了解。
图示简解
图1示Pem cDNA的序列及推测的蛋白质顺序。
图2证实Pem mRNA在细胞系中的表达。
图3证明在胎发育过程中Pem mRNA的表达。
为了对此项发明介绍得更为清楚，下面的部分是对其的详细说明。
在说明的过程中，可能会用到下列术语“寄主”在此不仅指原核生物，也包括真核生物如酵母、线虫及植物和动物细胞。
“原核生物”包括所有能被表达本发明Pem或重组Pem蛋白质(rPemP)的DNA所转化的细菌。
“真核生物”包括所有能被某DNA所转化的酵母真菌，动物和植物的细胞，该DNA也是用于表达本发明的Pem或重组Pem蛋白质(rPemP)。
编码本项发明Pem蛋白的DNA可从任何哺乳动物中所到，所需要的是Pem蛋白(PemP)在原核或真核生物中表达所必须的遗传序列。在此推荐来源于小鼠能表达Pem蛋白质的Pem DNA。特别还要提出那些在多种动物间(如小鼠，兔，海狮或人)存在免疫交叉反应的Pem DNA序列。
编码本项发明Pem蛋白的一个重组DNA分子，可以采用本文中提到的任何常规技术用于转化。特别是运用一个包括本项发明Pem蛋白编码顺序的载体的方法进行原核生物的转化。
对本身Pem蛋白质氨基酸顺序相比较，本发明的T细胞重组蛋白(rpem)在末端两侧会多出或缺少一些氨基酸。
当术语“大体上纯净”用于本发明的Pem蛋白质时，是指该多肽基本上无自然状态下常与之混杂的其他蛋白质，电泳或色谱反应、洗脱曲线、抗原活性结果稳定且重复性好。术语“大体上纯净”并不排除人工合成的Pem蛋白质混合物中存在有其他化合物。
制备融合的，操作上连锁的基因，并在细菌中表达的方法已经形式，并在U.S.Patent No.4，366，246，中有报道，在此收录在参考文献中，其中介绍的遗传构造和方法可用于在真核生物和原核生物寄主中表达Pem蛋白。
原核生物寄主包括革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌，如大肠杆菌，S.tymphimurium，Serratia marcescens及Bacillus Subtilis真核寄主包括酵母如Pichia Pastoris或哺乳动物细胞。
一般来说，结合寄主采用带有启动子序列的表达载体有利于插入的DNA片段的有效转录。表达载体都特征性地包含复制起始区，启动子，终止子及在转化细胞中提供表型选择的特异基因。转化的寄主可以按本文中的方法进行发酵或培养，以得到理想的细胞生长。
能用于本发明的启动子包括(当然不局限于这些)recA，trp，lac，tac，bacteriophage lambda pR or pL，MMTV，SV40。能用于此发明的一些质粒或噬菌体的例子见Maniatis，et al.Molecalar cloning，Cold spring Harbor Laboratories，1982;其他的见本文并可方便地确证。
根据本文中描述的方法或其他的方法(譬如，用一个溶源性噬菌体转移遗传物质)，可以将本发明用于任何一个“修饰过的”寄主，使之成为能表达Pem蛋白基因的原核生物或真核生物。
一个基因就是一般DNA序列，通过它的模板或信使RNA编码一条特异多肽的氨基酸顺序。术语cDNA是指去除插入序列的基因。术语rDNA是指通过在体外剪切cDNA或基因组DNA序列得到的一个重组分子。
一个克隆载体是指一个质粒、噬菌体DNA或在寄主细胞内能够复制的其他DNA顺序，克隆载体特征性地具有一个或数个内切酶识别位点，在此处DNA序列可以一种特定的方式切开而不至产生DNA基本生物功能的丧失，克隆载体还具有一个用于转化细胞鉴定的标志。标志一般有四环素抗性，新霉素抗性或者氨苄青霉素抗性。单词“载体”有时是指克隆载体。
一个表达载体类似于一个克隆载体，但它能在某些调控序列的控制下在寄主中表达某个给定的结构基因。
寄主用Pem蛋白质基因组转化，特别有利于产生Pem蛋白和多肽。
Pem蛋白可以由Pem蛋白的完整氨基酸序列组成，或者仅包含一个特异决定簇。一只用Pem重组蛋白免疫的动物能产生抗体，抗体会和重组或自然产生多肽的抗原决定簇结合。因此，包含Pem的重组蛋白可以进行商业性生产。
术语“个体”包括任何动物，一般主要指哺乳动物，特别是一只啮齿类动物，一只猫，狗，牛或一个人。
检测标记是指任何能被检测的分子。常用检测标记为放射性标记包括(不局限于)32P，14C，125I，3H和35S。生物素标记的核苷酸可通过缺刻翻译，酶催化或化学方法整合进DNA或RAN中。生物素标记的探针在杂交后，通过使用avidin/streptavidin，荧光的、酶促的或胶质金复合物进行检测。其他的荧光化合物，可免疫检测的荧光衍生物或生物素类似也可用于核酸标记。核酸也可依靠结合一个蛋白来进行标记。放射性或荧光标记的组蛋白H1，酶(碱性磷酸酶，过氧化物酶)，或单链结合蛋白(SSB)与核酸相结合的方法都可以利用。
两个来源SL12T淋巴瘤细胞系的细胞克隆，根据它们基因表达的差异及在同源动物寄主中引起肿瘤能力的不同，被挑选出来用于分离新的分化表达的基因。(Hays，et al.(1986)lnt.J.Cancer 38597-601;Mac Leod，et al.(1984)Cancer Res441784-1790;Mac Leod，et al.(1985)J.Nat.Cancer lnst，74875-882;Mac Leod，et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 836989-6993;Siegal，et al.(1987)J.Exp.Med.1661702-1715;Weinroth，et al(1985)Cancer Res.454804-4809;Wilkinson，et al.(1988)EMBO J.7101-109 and Table l for a Summary of phenotypes)。SL12.3细胞系表达极少数与T细胞功能有关的基因，在同源动物中恶性极大，形成扩散的浸染性肿瘤。而SL12.4细胞除TCR-alpha外表达TCR/CD3复合物中所有成份的mRNA;在某些方面，这种细胞与胸腺细胞发育过程中期的胸腺细胞类似。SL12.4细胞致瘤能力要弱一些，产生凸出的乳突瘤。
为分离只有SL12.4细胞在表达而在SL12.3细胞中不表达的基因的cDNA克隆，采用经典的差异筛选与排除法杂交富集探针技术相结合的方法(Similar to Filmus，et al.(1989)Mol.Cell.Biol.84243-4249，as described in detail elsewhere(Mac Leod，et al(1990)Cell Growth Differ.1271-279)。
本项专利提供DNA序列和重组DNA分子，另外还提供鉴定细胞中是否具有此序列的探针和方法，及将此序列导于无该序列细胞中的手段。
此外，此项专利还提供一个抑制新Pem序列表达的方法即给携带有正常Pem DNA序列的细胞提供反义RNA顺序或编码反义RNA的DNA序列，抑制编码Pem蛋白的RNA合成，本项发明中另一项技术清楚表明，本发明的任何蛋白的抗体都可用来阻止配体与蛋白，与靶药物的结合及其他因子(如标记物)与表达此蛋白的细胞结合。
此发明提供了一个新的cDNA序列，一个基因产物(Pem)蛋白，新的cDNA序列及与之相应的Pem基因蛋白产物的应用。此cDNA序列长839bp，包括一个长的开放阅读密码框架，从碱基对91至720，推测编码一个210个氨基酸构成的蛋白质。(表1)表1右边的数字是指核苷酸顺序。左边的数字推测的氨基酸的位置，序列中出现的第一个甲硫氨酸下面划有横线。DNA序列3’末端的(X)表示此处是14个腺苷酸残基组成的poly(A)尾巴。依赖于(AMP/CGMP的激酶(AG)，蛋白激酶C(C)和酪蛋白激酶Ⅱ(CK)的可能存在的磷酸化位点，通过intelli Genetics Programs在Ser或Thr附近查找每种激酶的一定的保守顺序，而得以鉴查出来。保守的多聚腺苷酸化序列，AATAAA，位于poly(A)5′端50bp处。第一个甲硫氨酸密码子(5′末端91bp处)被Kozak保守序列(G/AXXATGG)所包围，Kozak保守序列提供有效的转移起始位点(Kozak 1986)。Pem的有义转录物由T7多聚酶制备，在网织红细胞裂解物中产生了与推测分子量相同大小的蛋白质(23Kda，数据未列入)。因而，第一个甲硫氨酸在体外转录转译实验中作为转译的起始位点。Pem cDNA克隆(839bp，排除poly(A)尾巴)与除去poly(A)尾巴的Pem转录产物(0.9kb)大小相近。因而Pem cDNA克隆似乎接近全部长度。
Pem蛋白质是亲水性的，不存在前导序列，无与N结合糖基化位点，也没有可能的跨膜区域，因此，Pem不像是在细胞膜中分泌或插入到细胞膜中，但具备一个胞内蛋白质的特性。推测出的Pem蛋白包含有蛋白激酶C，酪蛋白激酶和依赖(AMP)/cGMP激酶对Ser和Thr磷酸化的保守序列，如图1所示。因用DNA和推测的氨基酸序列在Genbank和瑞士蛋白质数据库检索都未发现与其他已知的基因和蛋白产物有显著的相似性，Pem代表一种新基因。
在对本发明进行综述之后，接下来用特殊的例子来说明帮助理解。这些例子只是用来说明，而不是变成一种限制，除非特别说明。
例1细胞的分离，鉴定及培养A.淋巴瘤细胞系T淋巴瘤细胞系SL12.1，SL12.3，SL12.4及它们形成的体细胞杂种，其分离，鉴定及培养条件在下列文献中已有详述Hays，et al.(1986)Int.J.Cancer 38597-601;Mac Leod，et al.(1984)Can-cer Res 441784-1790;Mac Leod，et al.(1985)J.Nat.Cancer.Inst.74875-882;Mac Leod，et al，(1986)Proc，Natl.Acad.Sci.USA 836989-6993;and Weinroth，et al.(1985)Cancer Res.454804-4809，这些都收到在参考文献中。SL12.3和SL12.4细胞克隆的表型总结于表1中。转录表达，表面蛋白表达，致瘤性和肿瘤类型分别用Northern分析，流式细胞光度法及将克隆的细胞注射到同源动物身上等方法来确定。TCR-β1.0和1.3kb转录产物分别编码(D)-J-C和V-D-J-C序列。糖皮质激素反应通过细胞在1mM的地塞米松中生长而确定。
表1
SL12.4和SL12.3细胞无性繁殖系的表型性质SL12.4 SL12.3Thy-1 ++ +++TCR-alpha - +TCR-β1.0kb + -mRNA 1.3kb - -TCR-gamma - -TCR-delta - -CD3-gamma + -CD＃-delat + -CD3-epsilon + +/-CD3-zeta + +CD2 + +CD4 - -CD8 - -Thy-1 ++ ++Pgp-1 - +ThB + -表面现象 TL + +T200 + +H-2Kk- -IL2r + +Jlld + +CD3-epsilon - -Mel-14 + NT糖皮质激素敏感性 S R肿瘤发生性 低 高肿瘤型 外节点 扩散卵巢 肌肉R＝细胞耐溶性，S＝溶解敏感性。
SAK8细胞(Gasson and Bourgeois J.Cell.Biol.96409-415(1983))从Dr.Gasson获得。淋巴瘤细胞培养在Dulbecoo改进的Ea-gle培养基中，培养基中补充有10%胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素和链霉素。两个人类卵巢癌细胞系2008(Disaea，et al.Am.J.Ob-stet.Gynecol.114979-989(1972))和COLO 316(Woods，et al.Cancer Res.394449-4459(1979))培养在RPMI培养基1640中，培养基中被充有5%牛犊血清，谷氨酰胺，1%Fungi-bact(Irvine Scientific，Santa Ana，Californin)。当细胞用于制备RNA时，当细胞长至对数生长期，大约密度为5-8×105细胞/ml(Wilkinson and Mac Leod EMBO J.7101-109(1988))。来自BALB/C小鼠的脾细胞在3×106细胞/ml时接种，在收集RNA以前用10μg/ml ConA刺激两天。
B.SL12.4细胞和胸腺表皮单层细胞共培养SL12.4细胞和胸腺表皮单层细胞共培养条件。最主要的，SL12.4细胞的接种浓度要使得共培养三天之后，最终浓度达到1×106细胞/ml。TEL或TEPI在第三天之前开始融合。细胞在37℃生长在ulbecco改进的Eagle′s Medium中，培养基中添加了10%胎牛血清，谷氨酰胺和青霉素/链霉素。
C.用于20.2表达研究的细胞系下列来源的细胞系被用于20.2表达研究胚胎癌F9和PCC4(Bernstine，et al.(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.703899-3903)，垂体瘤ATt20(Buonassisi，et al.(1962)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.481184-1192)，胸腺表皮TEPI(Beardsley，et al.(1983)Proc，Natl，Acad.Sci.USA.806005-6009)，乳房表皮MME(E-vans(1988)Science 240889-894)12.9)，3T3(ATCC No.92)MET依照Freshney方法制备(Freshney(1983)In Culture of Animal Cells.Alan R.Inc.Pages 99-110)，B细胞杂种瘤PS.G8，B/T淋巴瘤WEHI-21，巨噬细胞P388D1，胸腺表皮TEL，嗜碱细胞RBL-1，T细胞杂种瘤2H10v，成神经细胞瘤N4TG1，骨髓瘤S194/5，T淋巴瘤SL12.3，RS4.2，SAK8，BW5147，AKR1，EL-4，体细胞杂种SL12.3×SL12.4，T细胞杂种瘤BO-4H、H9.1。细胞培养在Dulbecco改进的Eagle′s培养基中，培养基中补充10%胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素和链霉素。用于制备RNA的细胞培养至对数期，浓度为5-8×105细胞/ml时收集细胞。取自BALB/C小鼠的脾细胞以3×106细胞/ml接种在RPMI 1640中，添加如前的成份，在收集RNA之前用10μg/ml ConA刺激6，24，48或72小时。
例2克隆及筛选的方法从SL12.4细胞得到的Poly(A)+mRNA作为模板制备双链(ds)cDNA(Gubler and Hoffman(1983)Gene 25263-269)。在甲基化的ds DNA上加上ECORI接头。去磷酸化的λgt10臂(Stratagene)和cD-NA连结起来，依照制造商的推荐条件用Stratagene包装抽提物，将其包装到λ噬菌体中(Huynh，et al.in D.Glover(ed.)(1984)DNA Cloning TechniquesA Practical Approach.IRL Press，Oxford，U.K.)。
排除杂交基本上按Heclrick，et al.(1984)Nature308149-153和Timberlake(1980)Dev.Biol.78497-503，最近介始的方法进行。单链cDNA是10mg poly(A)+SL124 RNA加入250mc的32P dcTP(Amersham)，并在存在100μg/ml放线菌素D条件下合成的，与25mg SL12.3细胞的Poly(A)+RNA在68℃ 8ml体积中杂交18小时，直至达到Rot为1260(mol/升×秒)。杂交后，经羟磷灰石柱层析收集单链cDNA。从1μg SL12.4 cNDA出发，大约120ng(12%的输入cDNA具有3×107cpm)被回收，作为探针与两张150mm硝酸纤维素滤膜杂交，每张滤膜都载有20，000λgt10噬菌斑。从SL12.3λgt10文库中复印的第一张膜与由SL12.4mRNA得到的总cDNA杂交，第二张膜用上述SL12.4排除富集过的cDNA杂交。这种方法与Filmus，et al.用过的方法类似。经过两次筛选(用分次制备的探针)，得到的纯化的λ噬菌体克隆噬斑被鉴定为SL12.4特有的。随后用Northern分析证实该克隆只与SL12.4细胞的mRNA杂交，而不与SL12.3细胞的mRMA杂交。cRNA插入片段经限制性内切酶HindⅢ和BglⅡ消化从λDNA上切下，用低融点凝胶(Sea Kem)分离，并亚克隆到HindⅢ和BamHI酶切过的质粒载体PT7/T3(Bethesda Re-search Labratory)。插入片段不能被EWRI从噬菌体上切除，因为在所有分离物中EcoRI位点都受到损伤。(Kuziel，et al.(1987)Nucl.Acid.Res.153181)。用Pem cDNA，从λZAPⅡSL12 cDNA文库中得到了15个克隆。这些克隆覆盖了成熟mRNA转录产物的全部长度。
例3Northern印迹法分析用异硫氰酸胍法从细胞系和组织中分离总细胞RNA(Maniatis，et al.(1983)In Molecular CloningA Laboratory Manual。Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，按照Wilkin-son方法有所修改(Wilkinson，et al.(1988)EMBO J.7101-109)。用吖啶橙染色(Maniatis，et al.(1983)In Molecular CloningA Labora-tory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，New York)和与肌动蛋白，CHO-A和/或Cyclophillin cDNA杂交的办法，来估计每个加样孔加样量以及RNA转移相等。对于组织，方法有所修改，氯化铯离心后得到的RNA沉淀悬浮在10mM Tris(pH8)，0.5%SDS，5mM EDTA中，随后用酚∶氯仿∶异戊醇(24∶24∶1)抽提两次，氨仿∶2-丁醇∶异戊醇(20∶5∶1)抽提两次。RNA印迹时10mg的RNA在1%琼脂糖-甲醛凝胶中电泳，转移至尼纶膜上(Maniatis，et al.1982)。Northem印迹膜在10%硫酸右旋糖酐，50%甲酰胺中与随机寡聚体引物合成的32P标记的cDNA插入片段42℃杂交12-18小时(Meinkoth and Wahl 1984)。为去除标记探针，RNA印迹膜用0.1×SSPE和0.1%SDS在90℃洗脱(Maniatis，et al.(1982)in“Molecular CloningA Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，冷却到室温，空气中干燥，真空保存至下次杂交时使用。RNA的大小通过与BRL RNA高分子量和低分子量梯度相比较而确定。
例4Southern印迹法分析从细胞，T淋巴瘤和小鼠-仓鼠体细胞杂种及其他种类组织分离得到的总的细胞DNA被限制性酶EcoRI降解。每个电泳加样孔加入20mg降解的DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳，转移至尼纶膜上基本上按Mein Koth和Wahl的方法(Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.13267-284)，杂交和洗脱按Northern印迹分析的方法进行。
B.20.2的Southern印迹法分析20.2的Southern印迹法分析除下面特别指出的以外，按前面的方法进行。
总的细胞DNA从SL12.4细胞，小鼠和仓鼠肝及体细胞杂种中分离。小鸡和人肝的DNA购自Clonetec，Palo Alto，California。DNA根据供应厂家的条件用例子中提到的限制性内切酶进行降解。每个加样孔加入10μg降解DNA，0.8%琼脂糖凝胶Tris乙酸缓冲液中电泳至少48小时，转移至尼纶膜上，杂交和洗脱见Northern印迹法分析。从其他物种得到的DNA印迹膜洗脱时条件要温和一些，最后洗涤在室温下2×SSPE中进行。
总的细胞DNA按Maniatis的方法分离(Maniatis，et al.1982)，用限制性酶EcoRI降解。每个加样孔加20μg降解的DNA，0.7%琼脂糖凝胶，Tris乙酸缓冲液中电泳，按Maniatis的方法转移至尼纶膜上，洗脱的方法见Northern印迹法。
例5DNA序列分析由Pem cDNA克隆确定出限制性内切酶图谱，片段亚克隆到pT7T3;质粒通过氯化铯梯度纯化，用序列分析酶试剂(U.S.Biochem-ical corp.，Cleveland，Ohio)直接用双链双脱氧序列分析法进行序列分析。部分序列用寄主质粒的引物确定，其他cDNA的专一寡核苷酸引物(17核苷酸引物)由VCSD Cancer Center Core Molecular Biolo-gy Facility，双条链都作全序列分析，所有顺序至少由两次反应确定。运用Microgenia和Intelli Genetics计算机程序将重叠序列信息连结起来，进行最初的序列分析。推测的蛋白质的性质由Prosite pro-gram from lntelli Genetics确定。得到的DNA和推测蛋白质序列在Swiss蛋白质和EMBL数据库中导查相似性。
例6Pem之cDNA及其预期编码的蛋白质序列为了决定cDNA和Pem基因编码的蛋白质序列，着手寻找对应于参与分化和/或瘤形成的基因的新cDNA。为此，选择了两个密切相关的T-淋巴瘤细胞克隆SL12.4和SL12.3，其成熟水平和肿瘤发生性质不同。在分析了10种细胞表面抗原和12种特异mRNA基础上，得到有关细胞克隆，代表着T-细胞发育的特定各阶段或特定世系(Mac Leod等，(1984)Cancer Res.441784-1790;Mac Leod等，(1985)J.Natl.Cancer Inst.74875-882;Mac Leod等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA836989-6993;Hays等，(1986)Int.J.Cancer 38597-601;Mac Leod等，(1990)Cell Growth Differ.1271-279)。
有一cDNa克隆20.2，从中鉴定出在胎盘和胚胎中表达的转录本，命名为Pem。
该cDNA序列长839bp，从第91碱基对到第720，包含单一长的开放阅读框架，编码含210个氨基酸的蛋白质(图1)。图中右边的数字示核苷酸位置，左边的数字示预期氨基酸的位置。序列中第一个甲硫氨酸划线下标。聚腺苷化信号保守序列AATAAA也划线标出。DNA序列3′末端(X)表示poly(A)尾巴一串14个腺苷酸残基。利用Intelli Genetics程序，鉴定有关激酶作用的Ser或Thr残基周围特定保守序列，而从中找到依赖于cAMP/cGMP激酶(AG)，蛋白激酶C(C)和酪蛋白激酶Ⅱ(CK)作用的潜在磷酸化位点。聚腺苷化保守序列AATAAA位于poly(A)区5′端50bp处。第一个甲硫氨酸密码子(距序列5′91bp处)围绕有Kozak保守序列(G/A XXATGG)，提供了有效的翻译起点(Kozak(1986)Cell44283-292)。利用T7聚合酶制备Pem有意义转录本，在网织红细胞裂解液中翻译，产生了具预期分子量的蛋白质(23kd，数据未显示)。这样，在体外转录一翻译实验中，第一个甲硫氨酸是作为翻译起始点的。Pem cDNA克隆长度(839bp，不包含poly(A)尾)与Pem转录本长度(0.9kb)相近，后者poly(A)尾已去除(数据未显示)。这样看来Pem cDNA克隆是近乎全长的。
该Pem蛋白质具亲水性，不包含前导序列，N-连接的糖基化作用位点，亦无任何潜在的跨膜区域。因此，Pem蛋白质不象是分泌型蛋白质，也不象会插入细胞膜中，而是具有一种细胞内蛋白质性质。预期的Pem蛋白质包含被蛋白激酶C，酪蛋白液酶和依赖于cAMP/cGMP的激酶作用的Ser和Thr磷酸化保守序列，如图1所示。由于在Gen Bank和瑞士蛋白质数据库中没有发现该DNA及其编码氨基酸序列与其他已知基因或基因产物有任何显著相似性，因此Pem代表一新的基因。
例7Pem转录本的表达为了查明Pem转录本在不灭和转化细胞系中的表达，利用northern法分析鉴定表达Pem转录本的组织和细胞类型。Pem转录本在一种T-淋巴瘤细胞中大量存在，但在成体胸腺淋巴样组织，静止的或活化的脾细胞，肠系淋巴样组织或骨髓中不能检测到，也不能在成年脑，肝，大肠或卵巢中检测到。此外，在胰腺，心脏，肺，胃，肾或垂体中，也没发现Pem转录本。
由于Pem cDNA克隆是从一转化细胞系中分离到的，故在其他不灭和转化细胞系中估价Pem基因表达(图2)。为了获取在所有细胞系中Pem MRNA表达状况，用32P标记的Pem克隆插入片段与Northern吸印产物杂交，估价Pem mRNA在下列鼠细胞系中的表达F9，Pcc4(胚胎癌);ATt20(垂体);TEPI(胸腺上皮);MME(乳房上皮);3T3(不灭成纤维细胞);MEF(正常鼠胚成纤维细胞);SL12.4(T-淋巴瘤);PS.G8(B细胞杂交瘤;WEHI-21(B/T-淋巴瘤);P388D1(巨噬细胞);TEL(胸腺上皮);RBL-1(嗜碱细胞);ZH10v(T-细胞杂交瘤);N4TG1(成神经细胞瘤);S194/5(骨髓瘤);SL12.3，RS4.2，SAK8，BW5147，AKR1，EL-4(T-淋巴瘤);SL12.3×SL12.4(体细胞杂种);及BO-4H.H.9.1(T-细胞杂交瘤)。所有样品上样和RNA转移的相似性通过18S和28S RNA吖啶橙染色和用32P标记的Cyclophillin(Cy)探针与吸附产物杂交来估价，CY探针能识别在大多数鼠细胞系中具相同水平的CY转录本(Takahoshi等(1989)Nature337473-475)。
两具多能性干细胞特点的胚胎癌细胞系(F9和PCC4)表达Pem基因。但表达量显著不同。不灭3T3成纤维细胞大量表达Pem，而正常胚成纤维细胞表达的Pem mRNA至少少30倍。在起源于神经元，垂体，巨噬细胞和乳房上皮的细胞系中，Pem是表达的。相反，在胸腺上皮细胞系和大多数试验过的B细胞及T细胞瘤与杂交瘤细胞系中，Pem转录本实际上检测不到，虽然-B细胞杂交瘤(PS.G8)和两T-淋巴瘤细胞系(Pem)表达Pem转录本(图2)。图2显示1.1kb转录本最为显著;但是有些细胞还表达一种3.3kb的mRNA。1.1Kb和3.3kb的转录本都富集于poly(A)选择的RNA中，两者都存在于SL12.4细胞的细胞质区域。
Pem基因表达无任何明显的谱系特异性，各细胞系中mRNA量变异亦大，这些表明有可能在体内或在体外延长培养后，基因已经随机丢失，失活，转移，或扩增。以前的Southern分析显示，在SL12.3(Pem-)和SL12.4(Pem+)之间，在另一Pem-T-淋巴瘤细胞系SAK8中，都不能检测到Pem基因带的深浅或Pem基因大小的差别(Mac Leod等(1990)Cell Growth Differ.1271-279)。随之试验了从几个表达大量Pem mRNA的细胞系(SL12.4，ATt20，F9，MME，N4TG1，和EL4)来的DNA，任何带深浅(拷贝数)或大小差异都未检测到。这样，基因缺失，大规模遗传重排，或基因扩增等与细胞系中Pem MRNA累积差异可能是无关的。
例8胚胎发育过程中Pem基因表达Pem基因表达模式类似于癌胎基因，因为Pem转录本存在于转化和不灭细胞系，胚胎癌干细胞，而不存在于成体组织(Ruddon(1987)Gene Derepression in Cancer Cells，In Cancer Biology OXford U-niversity Press，New York，pages 431-436)。为了进一步探索Pem属于这类基因的可能性，在鼠发育不同阶段的胚胎和胚外组织中估价了转录本水平。如图3所示，从妊娠不同时期的胚胎，胎盘(P)，和卵黄囊(Y)中制备RNA。图3显示，早至胚胎发育6天就能检测到Pem转录本。第6天的胚胎包含胚外组织。Pem mRNA在第7天或第8天很多，但到第9天及以后，表达急剧减少，虽然仍可典型观察到一弱信号(图3)。与之相反，在第7天或第8天的胎盘或卵黄囊中，很少检测到Pem转录本;但在第9天上转录本增加到高的水平，随后各阶段保持如此。第10天和第18天的胚胎，胎盘和卵黄囊与第12天到16天的具有类似的Pem mRNA表达模式(未显示)。吸印产物用探针杂交，如图2所述。胚胎和胚外组织中Pem基因表达模式导致两个有意义的结论(1)Pem mRNA在胚胎中仅短暂高水平积累(第7天和第8天)，虽然在后面阶段特定胚胎世系中会保持高水平;(2)胚胎中Pem mRNA表达与观察到的胚外组织中的表达是交互的。
例9Pem是一种癌胎基因Pem基因在胚胎发生过程中以阶段特异性方式表达，而且在很多不同的不灭和转化细胞系中表达。在试验过的成体组织中，其表达不能检测到。由于这些不寻常的表达特征符合于癌胎基因特征(Ruddon(1987)Gene Derepression in Cancer Cells，in Cancer Biology，Oxford University Press，New York，pages 431-436)，Pem可以作为不灭细胞和/或参与鼠早期发育细胞的有用的标记。第9天胚中Pem转录本急剧下降，而妊娠同一时期胎盘和卵黄囊中Pem转录本变多，这一观察提示可能Pem+细胞从胚中迁移到胚外区域。来自胚外中胚层(衍生自内细胞团)的细胞产生胎盘和卵黄囊细胞，于是具有这种迁移细胞的特征。虽然Pem基因在胎发育过程中特异表达，但是不能排除它在成体中仍有功能。Pem基因可被存在于成体组织中数目不多的或短暂的先祖细胞表达。由于成体和胎儿先祖细胞都被认为是转化/不灭过程的靶子(Pierce和Speers(1988)Cancer Res.481996-2004)，Pem mRNA被很多不灭和转化细胞系表达这一结果与此概念符合。去调节导致Pem在不灭细胞中过量或组成型表达，这可由此对其连续细胞增殖能力起作用。
为了防止或控制由于Pem过量表达或组成型表达引起的异常增殖，同源重组基因疗法或靶基因失活方法可用来抑制该基因功能或抑制有功能基因产物的表达。为此目的，使用了Pem基因的基因组克隆。在Pem基因内插入一选择性标记，使基因失去编码或表达有功能产物的能力，由此使Pem基因失活。然后通过电穿孔法或显微注射法，将突变基因转移至胚干细胞或建立的细胞系中。选择出合适整入选择标记的细胞，转移至个体胚泡中。包含如此转化的Pem基因之一个或二个等位基因的个体可被选择出来。
本领域行家将容易鉴别，本发明非常适于实施目标，得到结果，获取所提及的及本发明内在固有益处。此文描述的各组分，方法，步骤和技术为当前更常用的代表性的，作为示例，而不是用来限制本发明的范围。本领域行家可由此作些改变，作它用，只要在本发明精神之内，不超出所附权利要求书的范围。
权利要求
1.一种由重组技术产生的多肽，其特征在于其包含Pem基因编码的一种Pem蛋白质的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的多肽，其特征在于以基本纯化形式存在的。
3.根据权利要求1或2的多肽，其特征在于其中所说Pem蛋白由一种T-淋巴瘤细胞的DNA所编码。
4.根据权利要求1的多肽，其特征在于其中所说氨基酸序列由示于图1的核酸所编码。
5.包含示于图1的核苷酸序列的cDNA探针。
6.一种检测赘生性细胞的方法，其特征在于其包含在杂交条件下根据权利要求5的探针与靶细胞群体温育。
7.一种对待赘生性细胞的方法，其特征在于其包含一种失活突变型Pem基因插入赘生性细胞。
8.一种包含根据权利要求5的cDNA序列编码的氨基酸序列的多肽。
9.根据权利要求8的多肽，其特征在于以基本纯化形式存在的。
10.一种包含编码Pem蛋白质的DNA序列的表达载体。
11.根据权利要求10的表达载体，其特征在于其中所说表达载体指一种能在一种宿主中复制的质粒，它包含(可操作的连锁方式存在)a.)一个复制起点;b.)一个启动子;和c.)编码Pem蛋白质的DNA序列。
12.根据权利要求11的表达载体，其特征在于其中所说的表达载体指一种能在一种原核宿主中复制的噬菌体或质粒，它包含(可操作的连锁方式存在)a.)一个原核复制起点;b.)一个原核启动子;和c.)编码Pem蛋白的DNA序列。
13.根据权利要求11的表达载体，其特征在于其中所说表达载体从包括pMAMneo，pNEO/Tfr-NC和pMAM/neo/Tfr-NC的群体中选译。
14.一种包含编码Pem蛋白质的DNA序列的载体。
15.根据权利要求14的载体，其特征在于其中所说载体从包括一种质粒，一种噬菌体和一种装配型质粒的群体中分离。
16.根据权利要求15的载体，其特征在于其中所说载体为pT7T3-20.2，其中ATCC登记号68304。
17.一种由一种重组DNA分子转化的宿主，其特征在于其中所说重组DNA分子包含一种编码Pem蛋白质的DNA序列。
18.根据权利要求17的宿主，其特征在于为大肠杆菌。
19.一种产生Pem蛋白质的方法，其特征在于其包括a)用编码T-细胞蛋白质的一种DNA序列转化一宿主;b)表达所说DNA序列;和c)回收所说Pem蛋白质。
20.一种药剂配方，其特征在于其有助于在包含致免疫有效量Pem蛋白质的个体中，诱导抗Pem蛋白质抗体的产生。
21.根据权利要求20的药剂配方，其特征在于其中所说Pem蛋白质通过根据权利要求19的方法产生。
全文摘要
本发明提供了一种新的cDNA序列(Pem)，一种基因蛋白质产物，及该种新cDNA序列和Pem基因产物的用途。本发明的DNA序列和重组DNA分子都特征编码一种新的蛋白质，其具下列特点(1)由T-淋巴瘤细胞表达；(2)不在正常胸腺，激活脾细胞，肠系淋巴样组织或骨髓中表达，也不能在成体脑，肝，大肠或卵巢中检测到；(3)在不灭或癌细胞系中表达；和(4)在胚发育过程中表达。
文档编号C12N5/10GK1060871SQ9110959
公开日1992年5月6日 申请日期1991年9月28日 优先权日1990年10月1日
发明者卡罗尔L·麦克里屋特 申请人:研究发展基金会