专利名称：一种重组lfa3基因,及其融合基因与产物的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体的说，涉及一种重组LFA3基因，及其融合基因与产物。
背景技术：
近年来人们认识到，T淋巴细胞的激活需要至少2个信号，第一信号为T细胞抗原受体(TCR)和抗原提呈细胞表面MHC/抗原肽复合物结合产生所产生，这两种配体的结合需要特异性识别，与免疫反应的特异性有密切关系。第二信号为T细胞表面的其它辅助分子与抗原提呈细胞表面的相应配体结合产生，该信号又称为共刺激信号，目前已经发现了多种配体对。如果T细胞仅受到第一信号的刺激而无辅助信号的刺激，T细胞不但不被激活，而且还有可能造成该T细胞凋亡，在体内造成克隆无反应性(anergy)。
T细胞、抗原提呈细胞表面参与产生共刺激作用的分子统称为共刺激分子。目前公认的共刺激通路包括CD2LFA3途径、B7CD28途径和CD11aICAM-1途径等。这些信号传导途径在T细胞的免疫功能调节方面具有十分重要的作用，任何一种信号传导途径的阻断都有可能导致免疫功能下调。
借此原理，可以开发出自身免疫疾病如银屑病的治疗药物。从基因工程角度来看，开发这类药物的策略主要有三种。一种是研制信号通道相关蛋白的单克隆抗体，一种是研制信号通道相关蛋白的受体蛋白，一种是利用信号通道相关蛋白的拮抗剂。这三种策略都是利用一种(或多种)可以与信号通道蛋白特异性结合的蛋白来阻断信号传导过程。
CD2又称淋巴细胞功能相关抗原2(lymphocyte function associated antigen 2，LFA-2)或绵羊红细胞(SRBC)受体，为跨膜单链分子，表达于T细胞、胸腺细胞和NK细胞。分子量约50kDa，其成熟蛋白由332个氨基酸组成，其前体有一个19个氨基酸组成的信号肽。人CD2分子的配体是CD58(LFA-3)，其结构与CD2相似，亦为跨膜单链，其前体蛋白有一个28个氨基酸的信号肽，成熟蛋白由233个氨基酸组成。上述两者均属Ig超家族成员。CD58分布较广，表达于T、B细胞、单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、血小板、红细胞以及某些非造血细胞表面。CD2与CD58结合，能增强T细胞与APC或靶细胞间粘附，促进T细胞对抗原识别和CD2所介导的信号转导。
美国BIOGEN公司开发了一种FLA3-Ig融合蛋白(商品名Amevive)，由于该融合蛋白保留了与配体CD2结合的FLA3膜外区，在与表达有CD2分子的T细胞接触后，可以与CD2结合，阻断抗原呈递细胞(APC)表面的LFA3分子与CD2结合，从而阻断T细胞的激活、增殖和分化，抑制IL-2、IFN-γ、IL-8等细胞因子的产生。另一方面，融合蛋白的Fc段可以与细胞表面的Fc受体结合，使单核细胞、NK细胞向T细胞聚集，通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，造成T细胞的凋亡。Amevive上市后用于治疗银屑病，并取得了良好的治疗效果。但是还有许多银屑病患者对Amevive的治疗表现为无反应性，因此，临床上需要一种特异性更强、亲和力更高的替代产品。
发明内容
本发明需要解决的第一个技术问题是提供一种新的重组LFA3基因，具有天然LFA3基因-接头-天然LFA3基因的结构。
本发明需要解决的第二个技术问题是提供一种新的融合基因，含有上述的重组LFA3基因和与之融合的人Ig抗体Fc片段基因。
本发明需要解决的第三个技术问题是提供一种含有该融合基因的重组表达载体。
本发明需要解决的第四个技术问题是提供一种含有该重组表达载体的宿主细胞。
本发明需要解决的第五个技术问题是提供一种重组LFA3-Ig融合基因的蛋白表达产物在制备治疗自身免疫疾病药物中的用途。
本发明的发明构思是这样的利用基因工程的方法，可以将本来位于细胞膜表面的特异性受体蛋白分子和免疫球蛋白(抗体)人工地组合起来，形成融合蛋白。一般是取编码膜蛋白的细胞外区和抗体恒定区的DNA序列，连接成融合基因，在适当的载体和细胞中表达，得到一个天然状态下不存在的融合蛋白分子，它既有细胞表面受体与其原有配体结合的特性，又象抗体一样为可溶性分子，且半衰期长，作用时间较为持久。和人源化抗体相比，受体(配体)的亲和力更强，而且全部蛋白成分都为人体固有，因此人源化的程度要比从鼠源抗体改造过来的抗体高，在体内不会引起免疫反应。目前已有多种可溶性受体被制备出来，根据它们所含有的不同细胞膜受体细胞外区，可产生各种特定的功能。人CD2分子的配体LFA-3则可以竞争性地与CD2分子结合，从而阻断CD2/LFA3这一共刺激通路。
同时，为避免在融合蛋白中出现非天然的氨基酸序列，我们在LFA3与Fc段的连接处没有设计酶切位点连接，而是采用Overlaping PCR法进行连接。
在本发明中，“LFA3-Ig融合蛋白”是指由人LFA3可溶部分与人抗体Fc片段融合所形成的融合蛋白。
本发明的技术内容如下本发明公开了一种重组LFA3基因，其特征在于，所述的重组LFA3基因具有天然LFA3基因-接头-天然LFA3基因的结构，所述的重组LFA3基因具有SEQID NO1所示的序列，所述接头的序列编码的氨基酸序列为(Ala3Ser2)3，亦即SEQID NO2。该氨基酸序列的DNA序列之一为5′-GCTGC TGCTT CTTCT GCCGCTGCTT CTTCT GCTGC CGCTT CTTCT-3′(SEQ ID NO3)。
本发明还公开了一种融合基因，其特征在于，所述的融合基因含有上述重组LFA3基因和与之融合的人Ig抗体Fc片段基因，其序列如SEQ ID NO4所示。
该融合基因的蛋白质产物，包含重组LFA3和人Ig抗体Fc片段，其序列如SEQ IDNO5所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体含有LFA3-Fc融合基因，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。所述的载体可以是本领域熟知的各种适合转染哺乳动物细胞的表达载体。
本发明还公开了一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有上述的重组载体。所述的宿主细胞选自CHO细胞，Hela细胞，小鼠Ltk-(4)细胞和猴肾VERO细胞等各种常用哺乳动物工程细胞株。
本发明所提供的重组LFA3基因，由于该基因由两个天然LFA3基因通过人工设计的接头序列连接而成，具有了两个CD2结合部位，增加了亲和力，能更有效的阻断抗原呈递细胞(APC)表面的LFA3分子与CD2结合，从而阻断T细胞的激活、增殖和分化，抑制IL-2、IFN-γ、IL-8等细胞因子的产生。同时通过构建的重组载体，使该LFA3-Ig融合基因的蛋白产物表达量保持较高的水平。
本发明还提供了该重组LFA3-Ig融合基因的蛋白产物在制备治疗自身免疫疾病药物中的用途，自身免疫疾病包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、移植排斥反应、银屑病、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病等，这里优选银屑病。
图1APC细胞与T细胞相互作用的几种信号通道。
图2LFA3-Ig融合蛋白结构示意图，两个LFA3之间用接头连接，LFA3-Ig利用重组DNA技术构建的LFA3的胞外区与人抗体IgG Fc段的融合蛋白，其N-末端含有人LFA3的细胞外段，随后是人IgG1的重链铰链区、CH2和CH3区。
图3LFA3-Ig融合基因的扩增示意图，其中，1、2、3、4、5、6分别代表引物1、2、3、4、5、6。
图4本发明融合蛋白与Amevive对混合淋巴细胞反应的抑制结果。
具体实施例方式
下面将结合实施例进一步详细的描述本发明，然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
实施例1 重组LFA3融合基因的设计和制备1、引物设计引物15’-GCTAGCGCCGCCACCATGGTTGCTGGGAGCGACGCGGGG-3’(SEQ ID NO6)引物25’-AGCAGAAGAAGCAGCGGCAGAAGAAGCAGCAGCATTAGTCAATGCACA-3’(SEQID NO7)引物35’-TCTGCCGCTGCTTCTTCTGCTGCCGCTTCTTCTTTTTCCCAACAAATA(SEQ IDNO8)引物45’-TGTGTGAGTTTTGTCAGTTAGTGTGGGAGA-3’(SEQ ID NO9)引物55’-TCTCCCACACTAACTGACAAAACTCACACA-3’(SEQ ID NO10)引物65’-TACTCGAGTCATTTACCCGG-3’(SEQ ID NO11)引物1为5’-有义引物，包含NheI酶切位点、Koak序列，以及编码人LFA3信号肽的起始部分cDNA序列；引物2为3’-反义引物，序列与编码人LFA-3膜外区末端氨基酸的cDNA序列互补，并包含了部分(Ala3Ser2)3的接头序列；引物3为5’-有义引物，包含部分(Ala3Ser2)3的接头序列及LFA3膜外段成熟序列的起始5个氨基酸的cDNA；引物4，5完全互补，5为5’-有义引物，4为3’-反义引物，非下划线部分的密码子与目的基因编码LFA3结尾部分氨基酸的cDNA序列；其中下划线部分的密码子与目的基因编码IgG1Fc段的起始部分氨基酸cDNA的互补序列；引物6为3’-反义引物，其中含有终止密码子TGA(3’→5’)，随后是Xho的酶切位点。
2、重组LFA3基因的设计和制备取正常人外周血10ml，用Ficoll密度梯度法分离单个核细胞，取1×107细胞，用PBS洗涤后离心沉淀，弃上清，用TRIZAL试剂抽提总RNA。
根据试剂盒要求的操作步骤，以PBMC的总RNA为模板，引物1、2及引物3、4按照常规方法分别进行RT-PCR。
以上述RT-PCR获得的产物为模板，引物为1、4进行Overlap-PCR，反应条件按常规方法进行。在琼脂糖凝胶电泳上获得分子大小约为801bp的单一条带进行凝胶回收。用Promega公司的PCR产物克隆试剂盒将所获得的cDNA插入pGEM-T载体中，常规方法转化大肠杆菌TG1菌株，经蓝白斑筛选初选出候选克隆，PCR鉴定确认阳性克隆，然后进行cDNA测序。测序结果显示，获取的基因序列与设计序列完全一致。
所获得的重组LFA3基因为两个LFA3基因之间由接头序列连接，该接头序列的DNA序列为SEQ ID NO3。其编码的氨基酸序列为(Ala3Ser2)3(SEQ IDNO2)。该氨基酸序列的DNA序列之一为5′-GCTGC TGCTT CTTCT GCCGCTGCTT CTTCT GCTGC CGCTT CTTCT-3′(SEQ ID NO3)。
3、人IgG1 Fc片段的获得以含有人IgG1恒定区基因的载体pMG18为膜板，引物5、6按下列方法进行PCR反应体系的组成
反应条件预变性94℃，2分钟；主循环94℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，3分钟；循环数20后延伸72℃，5分钟。
PCR过程在PROGENE GENIUS热循环仪上进行。
获得IgG1的Fc段。PCR产物进行凝胶胶回收，用Promega公司的PCR产物克隆试剂盒将所获得的cDNA插入pGEM-T载体中，常规方法转化大肠杆菌TG1菌株，经蓝白斑筛选初选出候选克隆，PCR鉴定确认了阳性克隆，然后进行cDNA测序。测序结果显示，获取的基因序列与理论序列完全一致。
4、LFA3-Ig融合基因的获得以上述步骤2和3获得的片段为模板，引物为1、6，按上述步骤3的方法进行PCR，扩增出1-6片段(LFA3)2-Ig。完毕后将产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中有一条分子量在1455bp左右的单一带，与预期的1455大小一致。用Promega公司的PCR产物克隆试剂盒将所获得的cDNA插入pGEM-T载体中，常规方法转化大肠杆菌TG1菌株，经蓝白斑筛选初选出候选克隆，PCR鉴定确认阳性克隆，然后进行cDNA测序，确认序列完全正确的克隆，即为LFA3-Ig。
实施例2 LFA3-Ig融合蛋白的表达1、融合基因表达载体的构建将实施例1的产物LFA3-Ig基因分别用Nhe I和Xho I(Phamacia)(10U/ul)消化pUC 18和表达质粒pMSG(Phamacia)。酶切反应37℃反应过夜。酶切产物在0.8％琼脂糖电泳上进行分离鉴定，用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收大小约为大小正确的片段。
分别用T4 DNA连接酶(10U/uI)将LFA3/接头/Fc连接到pMSG载体的Nhe I和Xho I位点。
按照常规方法(见Sambrook等，1989)用连接所得重组pMSG转化大肠杆菌DH5a菌株，并在IPTG/X-Gal平板培养基上进行蓝白斑筛选。各取白斑10个接种于LB液体培养基37℃培养后抽取质粒如前所述进行酶切鉴定，每种融合基因至少获得4个具有正确大小的插入片段的克隆，作为候选克隆。
将上述候选克隆中的两个进行DNA测序。根据测序结果，分别确认插入片段的序列与设计的完全一致。
2、CHO细胞的转化与表达取带有上述重组pMSG的大肠杆菌菌株，分别接种于500mI加入了氨苄青霉素的2xYT液体培养基，37℃，260rpm震荡培养16小时。用Qiagen公司的″Ultrapure Plasmid Purification Kit”抽提质粒DNA，抽提过程按照厂家提供的说明书进行。
用脂质体法转染CHO细胞，转染试剂盒购自Invitrogene公司(lipofectamine2000 transfection reagent，11668-027)。转染时取上述纯化的pMSG质粒100微克作为DNA样品对CHO细胞进行转染，转染操作程序按照厂家的说明书进行。
转染后的CHO细胞经连续3个月的氨甲喋呤(MTX)筛选，其浓度从0.05μM到10μM，每两周增加一次浓度，每次MTX的用量约为前一次的2倍，具体视细胞生长情况而定。细胞培养按照常规进行，培养基为15％胎牛血清(Gibco)+RPMI 1640/DEME，于37℃，5％CO2培养箱中培养。然后按照常规极度稀释法进行单克隆化。应用ELISA方法分别检测其融合蛋白的表达量，总共得到克隆89个。
在DEME培养基中常规培养，经ELISA上述部分克隆LFA3-Ig的表达强度进行了研究，具体数据如下
以上数据说明，本发明的重组LFA3-Ig融合基因表达水平较高，对该蛋白质的规模生产具有重要的经济价值。
实施例3 FLA3-Ig融合蛋白结合Jurkat细胞表面CD2及亲和常数的测定人T淋巴瘤细胞Jurkat表面表达CD2，我们利用流式细胞术检测了重组人LFA3-Ig融合蛋白及Amevive与抗CD2单克隆抗体TS2/18(ATCC HB195)竞争结合Jurkat表面CD2的能力。
1、试验原理人T淋巴瘤细胞系Jurkat(ATCC TIB152)细胞膜表面表达CD2，LFA3及抗CD2单克隆抗体均可与CD2特异结合。荧光标记的抗CD2单克隆抗体与细胞结合的量效曲线应为“S”形，即随着标记物浓度的增加，荧光强度也逐渐增加，直至达到饱和(结合曲线)；若存在LFA3-Ig融合蛋白对FITC-CD2 mAb的竞争，在FITC-CD2 mAb浓度固定(结合曲线的亚饱和点)的条件下，随着加入的LFA3-Ig融合蛋白浓度的增加，细胞结合的FITC-CD2 mAb量逐渐减少，荧光强度减弱，因此量效曲线呈反“S”形或“乙”字形；在靶细胞和FITC-融合蛋白相同的条件下，EC50值越小，则说明加入的LFA3-Ig融合蛋白与标记抗体竞争的能力越强，即LFA3-Ig融合蛋白的亲和力越高。
2、材料和试剂1)测活细胞株人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞(ATCC TIB152)，传代培养于含10％新生牛血清的RPMI1640/DMEM(1∶1)培养液；2)培养条件37℃，5％CO2，饱和湿度；3)含1％NBS的PBS(PBSS)；4)本发明重组人LFA3-Ig融合蛋白；5)Amevive，Biogen公司，批号P21020；6)异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD2单克隆抗体(透析法标记)；7)流式细胞仪美国Becton Dickinson公司FACScan。
3、试验方法1)Amevive，用PBSS稀释至2000μg/mL，加入等体积4μg/mL的FITC-CD2 mAb。
2)rhLFA3-Ig融合蛋白，用PBSS稀释至200μg/mL，加入等体积4μg/mL的FITC-CD2 mAb。
3)然后分别用2μg/mL的FITC-CD2 mAb连续2倍比稀释Amevive及本发明rhLFA3-Ig融合蛋白。
4)对数生长期的Jurkat细胞，PBSS调整细胞密度至1×106/mL，然后将细胞悬液分至流式专用管中，0.1mL/管。
5)200g离心5分钟，弃上清。
6)将Amevive和本发明rhLFA3-Ig融合蛋白的序列稀释液加入步骤5的流式管中，0.1ml/管，每一浓度设2复管，另外设3组对照，①只加2μg/mL的FITC-CD2mAb为空白对照，②加入2μg/mL FITC-CD2 mAb及1000μg/mL同型抗体的细胞悬液为阴性对照，③只加入PBSS的细胞悬液类似于阳性对照，每组对照设2复管。冰浴避光45分钟。
7)PBSS洗涤细胞两次，200g离心5分钟，重悬于300μL PBSS中。
8)上机检测。
4、结果分析采用Origin6.0拟合标准曲线横坐标为Amevive或本发明rhLFA3-Ig融合蛋白浓度，纵坐标为荧光强度几何均数的平均数，曲线为反“S”形，选用Logistic4参数方程回归模型。
该软件给出的回归方程为Y＝(A-B)/[1+(X/C)D]+B根据该方程，X＝+∞时，Y＝B，即最高限；当X＝0时，Y＝A，即最低限；而当X＝C时，Y＝(A+B)/2，即半数有效。因此C的数值即为半数有效浓度(EC50)。
5、结果表1 Amevive及本发明rhLFA3-Ig融合蛋白竞争结合试验结果总结
相对亲和力为rhLFA3-Ig融合蛋白亲和力与Amevive的比值，从表1中的数据可以看到，本发明所提供的LFA3-Ig的亲和力约为对照品Amevive的10倍。
实施例4 rhLFA3-Ig融合蛋白对混合淋巴细胞反应的抑制1、试验原理混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture，MLC)或称混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)是来源于两个个体的淋巴细胞在体外混合培养时，由于细胞表面HLA-II类抗原中的DR和DP抗原不同，可相互刺激对方淋巴细胞转化(称为双向MLC)，并产生多种淋巴因子，促进NK、CTL、LAK等杀伤细胞活性。若将刺激的一方淋巴细胞先用丝裂霉素C(mitomycine C)或放射线照射处理，使该细胞失去增殖能力，但仍保持刺激对方淋巴细胞增殖能力的试验称为单向MLC；如不加上述处理，则双方互相刺激，称为双向MLC。MLC反应可通过3H-TdR掺入率或形态学检测法以及MTT法检测反应细胞的增殖能力。在淋巴细胞相互刺激转化的过程中，共刺激分子间的相互结合发挥着重要的作用，CD2/LFA-3是重要的共刺激分子对，若加入外源性LFA3，则可竞争结合淋巴细胞表面CD2，从而抑制MLR。
2、材料和试剂1)玻璃纤维滤膜及负压抽滤装置，闪烁液及液闪计数仪；
2)台式离心机Eppendorf公司产品；3)生物安全柜台湾造鑫公司产品；4)细胞培养箱美国Revco产品；5)流式细胞仪美国Becton Dickinson公司FACScan；6)培养瓶、离心管、移液管、移液器、无菌吸嘴；7)3H-TdR中科院上海原子核研究所产品，比放射活性30Ci/mmol，放射性浓度1mCi/mL。
8)淋巴细胞分离液9)肝素10)细胞培养试剂，小牛血清，杭州四季青生物工程研究所产品；RPMI1640培养基，GIBCO公司产品。
11)磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)及含1％小牛血清的PBS(PBSS)。
12)健康志愿者新鲜外周静脉血。
3、试验方法分别取两位健康志愿者(A、B)肝素抗凝静脉血10mL，淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，无血清RPMI1640洗涤3次，每次1000rpm离心10min。
计数，并用含20％FCS的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至2.0×105/mL。
rhLFA3-Ig融合蛋白用含20％FCS的RPMI1640完全培养液稀释至4000ng/mL；用含20％FCS的RPMI1640完全培养液稀释rhLFA3-Ig融合蛋白，至浓度为4000、2000、1000、500、250及125ng/mL(注意样品在后续步骤中加入等体积的细胞悬液中时还要稀释1倍，故终浓度分别为2000、1000、500、250、125及62.5ng/mL)。
Amevive用含20％FCS的RPMI1640完全培养液稀释至40000ng/mL；用含20％FCS的RPMI1640完全培养液稀释Amevive，至浓度为40000、20000、10000、5000、2500及1250ng/mL(注意样品在后续步骤中加入等体积的细胞悬液中时还要稀释1倍，故终浓度分别为20000、10000、5000、2500、1250及625ng/mL)。
A、B两个不同个体的淋巴细胞悬液，检测双向MLR，于96孔细胞培养板中各孔加入两种细胞悬液各50μL，最弱反应对照(min)加入同一个体的单个核细胞100μL。
将rhLFA3-Ig融合蛋白及Amevive稀释液加入上述96孔细胞培养板，100μL/孔，最强反应对照(max)孔(分别为含每组两种不同的淋巴细胞的孔)加入含20％FCS的RPMI1640完全培养液，100μL/孔，最弱反应对照也加入含20％FCS的RPMI1640完全培养液，100μL/孔，设置3个复孔，37℃，5％CO2温箱培养6d。
终止培养前20h每孔加入0.5Ci 3H-TdR。
用细胞收集器将细胞吸附在玻璃纤维滤纸片上，用生理盐水充分洗涤，洗去游离的3H-TdR；将滤纸片烘干后，用镊子按其顺序分别依次放入盛有闪烁液的塑料管内；β闪烁仪自动测定样品1min。
4、结果分析计算刺激指数(Stimulator Index，SI)SI＝(加入样品混合淋巴细胞反应cpm均值-最弱反应对照管cpm均值)/(最强反应对照管cpm均值-最弱反应对照管cpm均值)。
表2rhLFA3-Ig融合蛋白对MLR的抑制作用
表3Amevive对MLR的抑制作用
绘制rhLFA3-Ig融合蛋白及Amevive的抑制比例图4，rhLFA3-Ig融合蛋白可明显抑制MLR，抑制能力为Amevive的10倍。
以上结果表明，本发明的rhLFA3-Ig融合蛋白在亲和力、特异性方面均显著优于Amevive。
序列表<110>上海中信国健药业有限公司<120>一种重组LFA3基因，及其融合基因与产物<150>CN200610026070.X<151>2006-04-26<160>11<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>771<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(771)<223>重组LFA3核苷酸序列<400>1ATGGT TGCTG GGAGC GACGC GGGGC GGGCC CTGGG GGTCC TCAGC GTGGT CTGCC TGCTG 60CACTG CTTTG GTTTC ATCAG CTGTT TTTCC CAACA AATAT ATGGT GTTGT GTATG GGAAT 120GTAAC TTTCC ATGTA CCAAG CAATG TGCCT TTAAA AGAGG TCCTA TGGAA AAAAC AAAAG 180GATAA AGTTG CAGAA CTGGA AAATT CTGAA TTCAG AGCTT TCTCA TCTTT TAAAA ATAGG 240GTTTA TTTAG ACACT GTGTC AGGTA GCCTC ACTAT CTACA ACTTA ACATC ATCAG ATGAA 300GATGA GTATG AAATG GAATC GCCAA ATATT ACTGA TACCA TGAAG TTCTT TCTTT ATGTG 360CTTGA GTCTC TTCCA TCTCC CACAC TAACT TGTGC ATTGA CTAAT GCTGC TGCTT CTTCT 420GCCGC TGCTT CTTCT GCTGC CGCTT CTTCT TTTTC CCAAC AAATA TATGG TGTTG TGTAT 480GGGAA TGTAA CTTTC CATGT ACCAA GCAAT GTGCC TTTAA AAGAG GTCCT ATGGA AAAAA 540CAAAA GGATA AAGTT GCAGA ACTGG AAAAT TCTGA ATTCA GAGCT TTCTC ATCTT TTAAA 600AATAG GGTTT ATTTA GACAC TGTGT CAGGT AGCCT CACTA TCTAC AACTT AACAT CATCA 660GATGA AGATG AGTAT GAAAT GGAAT CGCCA AATAT TACTG ATACC ATGAA GTTCT TTCTT 720TATGT GCTTG AGTCT CTTCC ATCTC CCACA CTAAC TTGTG CATTG ACTAA T771<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(15)<223>接头氨基酸序列<400>2Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser1 5 10 15<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(45)<223>接头核苷酸序列<400>3GCTGC TGCTT CTTCT GCCGC TGCTT CTTCT GCTGC CGCTT CTTCT45<210>4<211>1455<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(1455)<223>融合基因核苷酸序列<400>4ATGGT TGCTG GGAGC GACGC GGGGC GGGCC CTGGG GGTCC TCAGC GTGGT CTGCC TGCTG 60CACTG CTTTG GTTTC ATCAG CTGTT TTTCC CAACA AATAT ATGGT GTTGT GTATG GGAAT 120GTAAC TTTCC ATGTA CCAAG CAATG TGCCT TTAAA AGAGG TCCTA TGGAA AAAAC AAAAG 180GATAA AGTTG CAGAA CTGGA AAATT CTGAA TTCAG AGCTT TCTCA TCTTT TAAAA ATAGG 240GTTTA TTTAG ACACT GTGTC AGGTA GCCTC ACTAT CTACA ACTTA ACATC ATCAG ATGAA 300GATGA GTATG AAATG GAATC GCCAA ATATT ACTGA TACCA TGAAG TTCTT TCTTT ATGTG 360CTTGA GTCTC TTCCA TCTCC CACAC TAACT TGTGC ATTGA CTAAT GCTGC TGCTT CTTCT 420GCCGC TGCTT CTTCT GCTGC CGCTT CTTCT TTTTC CCAAC AAATA TATGG TGTTG TGTAT 480GGGAA TGTAA CTTTC CATGT ACCAA GCAAT GTGCC TTTAA AAGAG GTCCT ATGGA AAAAA 540CAAAA GGATA AAGTT GCAGA ACTGG AAAAT TCTGA ATTCA GAGCT TTCTC ATCTT TTAAA 600AATAG GGTTT ATTTA GACAC TGTGT CAGGT AGCCT CACTA TCTAC AACTT AACAT CATCA 660
GATGA AGATG AGTAT GAAAT GGAAT CGCCA AATAT TACTG ATACC ATGAA GTTCT TTCTT 720TATGT GCTTG AGTCT CTTCC ATCTC CCACA CTAAC TTGTG CATTG ACTAA TGACA AAACT 780CACAC ATGCC CACCG TGCCC AGCAC CTGAA CTCCT GGGGG GACCG TCAGT CTTCC TCTTC 840CCCCC AAAAC CCAAG GACAC CCTCA TGATC TCCCG GACCC CTGAG GTCAC ATGCG TGGTG 900GTGGA CGTGA GCCAC GAAGA CCCTG AGGTC AAGTT CAACT GGTAC GTGGA CGGCG TGGAG 960GTGCA TAATG CCAAG ACAAA GCCGC GGGAG GAGCA GTACA ACAGC ACGTA CCGTG TGGTC 1020AGCGT CCTCA CCGTC CTGGG GCAGG ACTGG CTGAA TGGCA AGGAG TACAA GTGCA AGGTC 1080TCCAA CAAAG CCCTC CCAGC CCCCA TCGAG AAAAC CATCT CCAAA GCCAA AGGGC AGCCC 1140CGAGA ACCAC AGGTG TACAC CCTGC CCCCA TCCCG GGATG AGCTG ACCAA GAACC AGGTC 1200AGCCT GACCT GCCTG GTCAA AGGCT TCTAT CCCAG CGACA TCGCC GTGGA GTGGG AGAGC 1260AATGG GCAGC CGGAG AACAA CTACA AGACC ACGCC TCCCG TGCTG GACTC CGACG GCTCC 1320TTCTT CCTCT ACAGC AAGCT CACCG TGGAC AAGAG CAGGT GGCAG CAGGG GAACG TCTTC 1380TCATG CTCCG TGATG CATGA GGCTC TGCAC AACCA CTACA CGCAG AAGAG CCTCT CCCTG 1440TCTCC CGGTA AATGA1455<210>5<211>456<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(456)<223>融合基因氨基酸序列<400>5Phe Ser Gln Gln Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His1 5 10 15Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys20 25 30Asp Lys Val Ala Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser35 40 45Phe Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile50 55 60Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro65 70 75 80Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu85 90 95Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Ala Ala Ala Ser Ser100 105 110Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Phe Ser Gln Gln Ile Tyr115 120 125Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn Val Pro130 135 140
Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala Glu Leu145 150 155 160Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr165 170 175Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser180 185 190Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp Thr Met195 200 205Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Leu Thr210 215 220Cys Ala Leu Thr Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala225 230 235240Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro245 250 255Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val260 265 270Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val275 280 285Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln290 295 300Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln305 310 315 320Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala325 330 335Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro340 345 350Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr355 360 365Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser370 375 380Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr385 390 395 400Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr405 410 415Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe420 425 430Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys435 440 445Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 455<210>6<211>39<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(39)<223>引物核苷酸序列<400>6GCTAG CGCCG CCACC ATGGT TGCTG GGAGC GACGC GGGG 39<210>7<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(48)<223>引物核苷酸序列<400>7AGCAG AAGAA GCAGC GGCAG AAGAA GCAGC AGCAT TAGTC AATGC ACA48<210>8<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(48)<223>引物核苷酸序列<400>8TCTGC CGCTG CTTCT TCTGC TGCCG CTTCT TCTTT TTCCC AACAA ATA48<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(30)
<223>引物核苷酸序列<400>9TCTCC CACAC TAACT GACAA AACTC ACACA30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(30)<223>引物核苷酸序列<400>10TGTGT GAGTT TTGTC AGTTA GTGTG GGAGA30<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<223>引物核苷酸序列<400>
TACTC GAGTC ATTTA CCCGG20
权利要求
1.一种重组LFA3基因，其特征在于，所述的重组LFA3基因具有天然LFA3基因-接头-天然LFA3基因的结构。
2.权利要求1所述的重组LFA3基因，其特征在于，所述的重组LFA3基因具有SEQ ID NO1所示的序列。
3.权利要求1所述的重组LFA3基因，其特征在于，所述接头的序列编码的氨基酸序列为(Ala3Ser2)3，亦即SEQ ID NO2。
4.权利要求3所述的重组LFA3基因，其特征在于，所述的接头的DNA序列为SEQ ID NO3。
5.一种融合基因，其特征在于，所述的融合基因含有权利要求1所述的重组LFA3基因和与之融合的人Ig抗体Fc片段基因，其序列如SEQ IDNO4所示。
6.权利要求5所述融合基因的蛋白质产物，包含重组LFA3和人Ig抗体Fc片段，其序列如SEQ ID NO5所示。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体含有权利要求5所述的基因序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求7所述的重组载体。
9.权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自CHO细胞，Hela细胞，小鼠Ltk-(4)细胞和猴肾VERO细胞之一。
10.权利要求6所述的融合基因的蛋白质产物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种重组LFA3基因，具有SEQ ID NO1所示的序列，还公开了一种含有重组LFA3基因和与之融合的人Ig抗体Fc片段基因的融合基因，以及该融合基因的蛋白质产物。本发明还提供了含有该融合基因的重组表达载体，宿主细胞，以及该重组LFA3－Ig融合基因在制备治疗自身免疫疾病的药物中的用途。本发明的重组LFA3融合基因表达水平较高，对该蛋白质的规模生产具有重要的经济价值。
文档编号C12N15/62GK101089180SQ20071010148
公开日2007年12月19日 申请日期2007年4月23日 优先权日2006年4月26日 公开号200710101482.X
发明者郭亚军, 候盛, 谈珉, 钱卫珠 申请人:上海中信国健药业有限公司