专利名称：血糖调节相关的新基因、其蛋白产物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与血糖调节相关的新基因，命名为pank4(又称fang-1)，本发明还涉及所述基因编码的蛋白质产物，以及所述基因和蛋白质在血糖调节及糖尿病治疗中的用途。本发明的基因初步鉴别为一种新的泛酸激酶基因。
背景技术：
众所周知，II型糖尿病是一种多基因遗传病。目前认为参与胰岛素信号传导途径、葡萄糖转运途径、糖原合成途径、脂肪酸的吸收和合成、脂细胞分化途径的有关蛋白质分子都可能与糖尿病的发生相关。研究糖尿病发病机理，阐明分子机制、鉴定血糖调节基因及其功能的研究对糖尿病的预防和治疗均有十分重要的意义。其中，胰岛素信号传导途径是目前研究较多的一个领域，该途径十分复杂，包括胰岛素受体、胰岛素受体底物等，并和Akt信号传导途径、MAPK信号传导途径、CAP/Cb1信号传导途径等联系在一起。胰岛素受体属于受体酪氨酸激酶，包括IGF-I和IRR。目前至少鉴定了9个胰岛素受体激酶底物，其中包括4个胰岛素受体底物IRS1、IRS2、IRS3和IRS4。胰岛素受体底物(IRS)具有高度同源性，但是作用各异，相互补充。IRS-1基因敲除小鼠表现为出生前和出生后生长迟缓，胰岛素耐受，葡萄糖耐受受损等症状。IRS-2基因敲除小鼠表现为在肝脏等组织胰岛素耐受以及包括脑组织等多个区域生长缺陷，最终发展成II型糖尿病。
鉴定糖尿病易感基因是一项艰巨的工作，目前进展缓慢，随着人类基因组测序工作的结束，很多科学家正应用全基因组扫描技术寻找易感基因。但由于糖尿病是一种多基因疾病，它是基因和基因相互作用以及基因和环境相互作用才诱导糖尿病的发生，某一个基因单独与这种疾病的关联也许不强，所以给定位克隆工作带来很多麻烦。
目前，很多科学家应用差异显示技术分离了许多差异表达的基因和疾病基因。差异显示技术以RT-PCR为基础。以寡聚(dT)为引物逆转录细胞中所有mRNA，通过不同引物对对所得到的cDNA进行PCR扩增，其中含有一种同位素标记dNTP，然后PCR产物在聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，放射自显影后从凝胶上切下回收差异片段，在确定阳性差异片段后，克隆全长基因。差异显示的优点是简单快速，该方法不需要特殊的仪器，操作起来比较简单，能够在较短时间内得到差异显示图谱；重复性高，约90％-95％差异带能被重复；敏感性高，只需2ug总RNA用于逆转录，用4种寡聚(dT)引物和20个AP引物配对PCR反应，从统计学来讲可覆盖98％以上的mRNA。差异显示已大量用于医学方面的研究。Liang等首先将该技术用于肿瘤的研究，并分离了差异表达基因(Science 257967-971，1992)，而Nishio Y等人将该技术应用到糖尿病研究，他们将牛主动脉平滑肌细胞在体外不同血糖浓度培养后，差异显示分离到3个差异表达的cDNA片段(FASEB letter，8103-106，1994)。但是，目前这些研究大多应用体外培养细胞作为研究对象，而细胞在体外培养条件下并不能很好地代表他们在机体内的正常生理状态。本发明人从整体水平而不是在培养的细胞水平开展研究，进行血糖调节相关基因的分离工作，以作为糖尿病治疗的候选基因。本发明人采用SD大鼠，经颈静脉右心房插管术，葡萄糖刺激，差异显示SD大鼠葡萄糖刺激组和非刺激组差异表达的基因。首先得到差异表达的EST，以这些EST为探针筛选大鼠骨骼肌cDNA得到1个全长cDNA，以此为基础进行进一步的研究，发现本发明的新基因是一种新的泛酸激酶基因。
泛酸激酶是CoA合成过程第一步作用的酶，它将泛酸磷酸化，继而迅速将它转化成CoA，CoA是一个很重要的酰基载体，它主要参与三羧酸循环，脂肪酸代谢和各类中间代谢反应，CoA中的一部分4’-PPA在许多酶系统中是一个重要的前体基团，包括酰基载体蛋白，细菌和真核生物的脂肪酸合成酶，及柠檬酸裂解酶。泛酸激酶在哺乳动物体内被认为是CoA合成的限速酶。
泛酸激酶早期研究表明，在分离的灌注心脏中，胰岛素被认为是CoA合成的强烈抑制剂，在糖尿病样的心脏内降低胰岛素浓度或去除抑制剂，将会使CoA的合成增强。同样在禁食或糖尿病的动物体内降低胰岛素的水平也会使得CoA的合成提高。在离体的心脏内，Pank的活性将会随着葡萄糖、丙酮酸、脂肪酸及胰岛素升高而降低。而在肝脏内泛酸激酶的活性将会随着糖原、饥饿、高脂、甲抗和糖尿病时升高。
心肌内，CoA的合成受到途径中的第一步的控制，也就是从泛酸到4’-磷酸泛酸。在离体的心脏内诸如丙酮酸、β-羟丁酸、软脂酸、低量的葡萄糖都会抑制泛酸激酶的反应。胰岛素需要在葡萄糖存在的情况下抑制泛酸激酶的活性。如果没有葡萄糖或者软脂酸代替葡萄糖，胰岛素将不会起作用，这表明胰岛素通过变换碳循环来行使其功能。由于泛酸激酶的催化反应效率受到外源底物的影响，那么在上述底物被利用时，诸如三羧酸循环或糖酵解等中间产物将会增多，因此泛酸激酶是促进糖代谢的。
总之，上述资料显示，泛酸激酶可能是血糖控制的很关键的因子。然而，到目前为止还不知道泛酸激酶基因在糖代谢和胰岛素信号通路中的靶位点。
发明内容
本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码一种参与胰岛素信号传导途径的蛋白质的多核苷酸。本发明的核酸分子是一种新的泛酸激酶基因，其被命名为pank4基因，其来自大鼠，核苷酸序列如SEQID NO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本发明还涉及具有与SEQ ID NO1所述核苷酸序列至少有90％、优选地至少95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，或者在严格条件下与SEQ ID NO1所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述的严格条件是本领域技术人员熟知的，例如参见Sambrook等人所著《分子克隆实验手册》。
本发明还涉及包含本发明的分离的核酸分子的重组载体，包含该重组载体的宿主细胞，以及制造这样的载体和宿主细胞和使用它们经重组技术产生pank4蛋白的方法。本发明也涉及特异于pank4蛋白的抗体。本领域技术人员熟知各种合适的表达载体及宿主细胞，表达载体的非限制性例子例如本发明实施例中使用的真核表达载体pCDNA3.1，原核表达载体pGEX-4T-3(即谷胱甘肽(Gst)载体)等。宿主细胞可以是常规使用的原核宿主细胞、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等，非限制性例子例如本发明实施例中使用的大肠杆菌菌株DH5a，和大肠杆菌菌株BL21(DE3)，L-6TG SD大鼠正常肌母细胞株等。
本发明的pank4基因在血糖刺激后可以高表达，并上调胰岛素受体底物IRS-1的表达，因此本发明的pank4基因及其蛋白可以用作治疗糖尿病的潜在靶点，找到有效降低血糖的基因药物。
图1为含有本发明的pank4基因的表达载体pcDNA3.1-pank4的图谱。
图2为胰岛素受体底物1(IRS-1)的RT-PCR分析的结果。其中1和2分别代表GADPH和IRS1的RT-PCR结果，泳道A和B分别代表来自对照细胞和用pcDNA3.1-pank4转染的细胞的样品。
图3示出IRS-1的Northern印迹分析，其中泳道1和2分别代表来自对照细胞和用pcDNA3.1-pank4转染的细胞的样品。
图4A-4L为pank4组织分布的免疫组化检测结果。
图5为Pank4的细胞定位结果。
图6示出Pank4和Pkm2的体外和体内相互作用。
图7示出Pank4的两个结构域与Pkm2的体内相互作用。
图8示出Pank4和Pkm2的相互作用的激光共聚焦实验结果。
图9示出Pank4可以上调Pkm2活性。
具体实施例方式
本发明的pank4基因是通过将mRNA差异显示技术应用到动物整体水平而获得，受高血糖刺激它的表达升高。NCBI分析，Pank4与人的泛酸激酶的同源性很高。同时，Pank4蛋白内含有两个保守的结构域，分别是KOG2201(33aa-378aa)和KOG4584(448aa-768aa)。
免疫组化的实验，结果表明本发明的，Pank4广泛分布在各组织中(图4)，同时，可以看出，Pank4多分布于一些需要高能或合成旺盛的细胞群中，比如，肾脏、甲状腺的分泌管(图4D、I)，一些正在处于收缩或舒张的骨骼肌和心肌，以及血管平滑肌的某些细胞群中(图4B、G、K)，还有胰腺的胰岛细胞内(图4C)。这些结果表明Pank4与能量产生有关。
通过酵母双杂交实验，发现了一个与Pank4相关的基因，丙酮酸激酶基因(Pkm2)，其一个新的相互作用蛋白，也是在糖酵解中的一个关键酶。在后文所述的实施例中，进一步通过pull-down(Fig6A)、免疫共沉淀实验(Fig6BC)及共定位实验(Fig8A-F)验证了二者的相互作用。从Pank4对Pkm2的活性调节和对IRS-1的影响，Pank4可以用于制备调节血糖浓度的药物。
以下将通过实施例进一步描述本发明。
实施例1 pank4基因的克隆1、制备大鼠血糖自动调节模型雄性SD大鼠10只(购自中国中医研究院实验动物中心，鼠龄3个月，体重200～250克，自由饮水摄食)。分为两组，即实验组和对照组每组分别为5只。各组大鼠均进行颈外静脉一右心房导管插管术，术后给足饲料和水，备用。颈外静脉一右心房导管插管术方法简述如下乙醚麻醉动物，在颈部切开皮肤，剥离，显露颈外静脉，由引针将硅胶管引入颈外静脉腔，退出引针，将硅胶管插入右心房，固定导管，由皮下从背颈部引出硅胶管的另一端，封住导管，缝合切口，动物醒后单独喂养。动物在完全清醒状态下进行实验。实验组大鼠注射含400mmol/L葡萄糖的生理盐水0.4ml，10分钟后再注射0.8ml含400mmol/L葡萄糖的生理盐水。对照组分别注射同量的不含葡萄糖的生理盐水。30分钟后，动物断颈处死，在无菌条件下，每只大鼠取双侧股四头肌共约1g，立即冻存于液氮中。
2.mRNA差异显示分析依照TRIZOL Reagent试剂盒(GiBcoBRL，USA)，分别提取两组动物肌肉组织总RNA。以1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。
利用上述获得的总RNA进行cDNA第一条链的合成，合成按照逆转录试剂盒说明书操作(Superscript TM II RT，BRL)。1μg DNase I处理的总RNA与2μl 10μM锚定引物(1# 5’-CGC GGA TCC TTTTTT TTT TTA-3’；2# 5’-CGC GGA TCC TTT TTT TTT TTG-3’；3#5’-CGC GGA TCC TTT TTT TTT TTC-3’)混合。反应液70℃温育10分钟，然后冰上冷却。加2μl 10×第一链合成反应液，2μl 25mMMgCl2，1μl 10mM dNTP，2μl 0.1M DTT。42℃温育5分。加1μlSuperscript II，反应液于42℃温育50分钟，然后70℃15分钟，冰上冷却。最后加1μl RNaseH 37℃20分钟降解RNA。-20℃储存。
随后进行差异显示PCR，所用随机引物共10条。随机引物参照CloneTech mRNA差异显示试剂盒，自行设计，5’加上EcoR I酶切位点。其中，引物序列为1# 5′-CGG AAT TCT CCA GTT CAG-3′；2#5′-CGG AAT TCC AAG CGA GGT-3′；3# 5′-CGG AAT TCC TTG TAGCCA-3′；4# 5′-CGG AAT TCC TTT CTA GCC-3′；5# 5′-CGG AATTCA CCT TGG ACA-3′；6# 5′CGG AAT TCA TGC TGG GGA 3′；7#5′CGG AAT TCT CGG TCA TAG 3′；8# 5′CGG AAT TCA TGC TGGTAG 3′；9# 5′CGG AAT TCG ATC TGA CTG 3′；10# 5′CGG AATTCA TGC TGT ATG 3′。PCR反应体系中加入20ng上述cDNA和2.5μci[α-32P]Dctp，0.5U Taq plus II聚合酶(Sangon)，1μl 10×PCR反应液，0.5μl 25μM dNTP，1μl 2μM随机引物和锚定引物，4.35μl水使总体积达到10μl。反应条件为一个循环(94℃5分钟，40℃5分钟，72℃5分钟)，两个循环(94℃30秒，40℃40秒，72℃5分钟)然后30个循环(94℃30秒，52℃40秒，72℃2分钟)。短暂离心，收集反应液。
上述PCR产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。对X光曝光，获得mRNA差异显示图谱。
3、差异PCR产物的回收、再扩增、纯化严格确定X-光片与凝胶的相对位置。依据mRNA差异显示谱，以清洁手术刀切取所需凝胶条带。在0.5ml离心管中用100μlddH2O浸泡凝胶，95℃加热20分钟，离心收集。转移上清至另一个离心管，加10μl3M NaAc(pH5.2)、5μl糖原(10mg/ml)，混匀。加450μl无水乙醇，混匀。置-70℃冷冻60分钟，之后12000rpm离心15分钟。弃上清，用4℃75％乙醇洗涤沉淀，风干。用10μlddH2O溶解。将如此获得的PCR产物，保存于-20℃。
接着进行差异PCR产物的再扩增。在0.5ml Eppendorf管中建立如下反应体系回收的PCR产物(10ng/μl)1μl，引物I(序列1# 5’-CGCGGA TCC TTT TTT TTT TTA-3’，或2# 5’-CGC GGA TCC TTT TTTTTT TTG-3’，或3# 5’-CGC GGA TCC TTT TTT TTTTTC-3’)(50pmol/μl)1μl，引物II(序列1# 5′-CGG AAT TCT CCAGTT CAG-3′或2# 5′-CGG AAT TCC AAG CGA GGT-3′，或3#5′-CGG AAT TCC TTG TAG CCA-3′，或4# 5′-CGG AAT TCC TTTCTA GCC-3′，或5# 5′-CGG AAT TCA CCT TGG ACA-3′，或6# 5′CGG AAT TCA TGC TGG GGA 3′，或7# 5′CGG AAT TCT CGG TCATAG 3′，或8# 5′CGG AAT TCA TGC TGG TAG 3′，或9# 5′CGGAAT TCG ATC TGA CTG 3′，或10# 5′CGG AAT TCA TGC TGT ATG3′)(50pmol/μl)1μl，10×PCR反应缓冲液(15mMgCl2)5μl，4×dNTP(各5mM)2μl，Taq聚合酶(1u/μl)2μl，补加去离子水至终体积50μl。94℃变性2分钟后，进行如下循环程序30次94℃变性40秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒。30个循环结束后，72℃继续延伸10分钟，然后将PCR产物用琼脂糖凝胶分离。
4、差异cDNA的狭缝杂交分析对上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳定量。每种产物个取400ng经碱变性处理，用狭缝点膜器(BioRad)点样于Hybond-N尼龙膜上，以β-肌动蛋白分别作为对照。2XSSC漂洗尼龙膜，凉干。用紫外交联方法将PCR产物固定于膜上。
采用上述混合单锚定碱基引物，制备a-32P标记的单链cDNA探针，用于狭缝杂交和放射自显影。首先，将上述尼龙膜置于15ml预杂交液(5×Denhart′s溶液，6×SSC，0.5％SDS)，将鲑精DNA于95℃变性5分钟后加入68℃预杂交液至终浓度为100μg/ml。68℃预杂交2小时。然后加入上述混合cDNA探针，68℃杂交20小时。洗膜条件如下500ml 2×SSC、0.1％SDS室温短暂漂洗尼龙膜5分钟，重复一次；250ml1×SSC、0.1％SDS室温洗膜30分钟，重复一次；250ml 1×SSC、0.1％SDS于65℃洗膜15分钟，重复一次；用滤纸吸干尼龙膜，用富士X-光片压片，于-70℃曝光3-4天。应用Pharmacia GelScan XL(2.1版)凝胶扫描软件包在Pharmacia LKB Ultroscan XL扫描仪上对每一个杂交斑点扫描，以扫描峰的积分值衡量基因序列相对表达量。
6、差异cDNA的克隆和测序以及cDNA文库筛选根据狭缝杂交结果，选择有明显差异的PCR产物进行克隆。首先纯化PCR产物，按照Promega公司WizardTMPCR DNA PurificationSystem试剂盒说明书操作，用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化的效果。然后，用玻璃奶回收法回收纯化后的DNA片段。将所有差异表达片段全部克隆到Promega公司的pGEM-T克隆载体并测序获得EST序列。
将3个上调表达片段和3个下调表达片段均作为探针杂交筛选文库，筛库是根据已知探针序列筛选cDNA克隆的常用方法。
用大鼠正常骨骼肌文库(Rat Skeletal Muscle 5’-STRETCH PLUScDNA Library，RL3003b，ClonTech)进行筛选cDNA全长的工作。6个EST(EST89、EST62、EST119、EST17、EST124、EST76)被标记探针用经典杂交法进行筛选，经过三轮的筛选，分别得到EST89、EST62、EST124、EST76单克隆。用EST89筛库得到的序列经分析后确认为全长编码基因，命名为pank4，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其全长约2.3kb。
实施例2 pank4真核表达载体的构建以上游引物5’-CAT CTC GAG AAA ATG GCG GAG TGC CGG-3’加一个Xho1酶切位点，下游引物5’-CA TGG ATC CTC GGCTGG GAC CTCGTA-3’加入一个BamH I位点，全长pank4基因为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件为94℃变性2分钟，然后进行如下循环程序30次94℃变性40秒，55℃退火60秒，72℃延伸150秒。30个循环结束后，72℃继续延伸10分钟，然后将PCR产物用琼脂糖凝胶分离，用玻璃奶吸附法回收PCR产物。回收的DNA片段经电泳电泳定量，连接至pGEM-T easy载体。用两种酶Xho1和BamH1将pank4基因编码区从pGEM-T easy载体切下来，电泳回收该条带，与同样用XhoI和BamHI双酶切的pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)进行连接。得到的质粒命名为pcDNA3.1-pank4(见图1所示)。
实施例3 pank4能上调IRS-1的表达本例选用CBRH-7919细胞株进行研究，该细胞株是Wistar大鼠用二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌细胞系，得自中国科学院上海细胞生物学研究所中国科学院细胞库。
CBRH-7919细胞分别转染pCDNA3.1-pank4和空表达载体pCDNA3.1对照组。转染后36小时，弃掉培养液、提取RNA、定量RT-PCR。定量RT-PCR以β-肌动蛋白作为对照。分别选取葡萄糖代谢中的几个关键酶，葡萄糖激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶基因、胰岛素受体，胰岛素受体底物1，胰岛素受体底物2，胰岛素受体底物3，胰岛素受体底物4，葡萄糖转运子4，糖原合成酶，乙酰辅酶A羧化酶，GSK1设计引物，进行定量RT-PCR检测。RT-PCR产物经电泳鉴定发现只有胰岛素受体底物1(IRS-1)表达明显差异，如图2所示，用Northern印迹进一步验证RT-PCR结果，如图3所示。
实施例4 pank4基因原核表达载体的构建1、含有编码pank4蛋白的抗原决定簇的序列的原核表达载体的构建根据pank4的序列特点，经软件分析确定pank4蛋白的抗原决定簇序列，将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3(Pharmacia)。为便于构建表达，我们在5’端引物加入一个BamH I酶切位点(5’引物5’-ATC GGA TCC CTC CTA GTC AAC ATT GGC-3’)，在3’端引物加入一个Xho I酶切位点(3’引物5’-TGC TCG AGT CTG TCCAAT GTC ATT GCT-3’)，模板为全长pank4。PCR扩增条件94℃变性2分钟，然后进行如下循环程序30次94℃变性40秒，55℃退火60秒，72℃延伸60秒。30个循环结束后，72℃继续延伸10分钟，然后将PCR产物用琼脂糖凝胶分离，用玻璃奶吸附法回收PCR产物(约300bp)。回收的DNA片段经电泳电泳定量。回收的DNA片段经电泳电泳定量，连接至pGEM-T easy载体(Promega)。用两种酶Xho1和BamH1将此片段从pGEM-T easy载体切下来，电泳回收该条带，与同样用XhoI和BamHI双酶切的pGEX-4T-3原核表达载体(Pharmasia)进行连接。命名为pGEX-4T-3-f2。
2.含有pank4全长基因的原核表达载体的构建设计引物，5’端引物加入一个BamH I酶切位点(5’引物5’-AGGA TCC AAA ATG GCG GAG TGC CGG-3’)，在3’端引物加入一个Xho I酶切位点(3’引物5’-AC TCG AGT TGG GAC CTCGTA CTT GAA-3’)，模板为全长pank4。PCR扩增条件94℃变性2分钟，然后进行如下循环程序30次94℃变性40秒，62℃退火60秒，72℃延伸2分钟。30个循环结束后，72℃继续延伸10分钟，然后将PCR产物用琼脂糖凝胶分离，用玻璃奶吸附法回收PCR产物(约2.3kb)。回收的DNA片段经电泳电泳定量。回收的DNA片段经电泳电泳定量，连接至pGEM-T easy载体。用两种酶Xho1和BamH1将此片段从pGEM-T easy载体切下来，电泳回收该条带，与同样用XhoI和BamHI双酶切的pET-30a(+)原核表达载体(Invitrogen)进行连接。命名为pET-30a(+)-pank4。
实施例5 pank4蛋白抗原决定簇的纯化及抗体的制备将测序后正确的实施例4.1得到的阳性质粒转化大肠杆菌BL21，涂布于含有卡那霉素的LB琼脂板上，37℃培养10-16小时。挑选约5个单菌落接种到含卡那霉素的5ml新鲜LB管中，37℃剧烈摇动培养10-16小时。取上述培养物以1/20的比例接种到两个含卡那霉素的5ml新鲜LB管，37℃剧烈摇动培养30-60分钟，使菌液OD600nm达到0.4-0.6。向上述一个转接管中加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃剧烈摇动培养3-4小时，另一管不诱导作对照。分别用1.5ml离心管收集培养液约1ml，12000rpm，20秒，弃净上清培养基。保存菌体。菌体沉淀以100ul 1×样品缓冲液重悬混匀，于100℃水浴10分钟，SDS-PAGE上样前12000rpm离心2分钟。取10-20ul上样，进行12％SDS-PAGE。按照分子克隆方法制备12％SDS-PAGE分离胶，混匀后，将其灌入制胶板内(Bio-Rad公司的Mini-Cell制胶系统)，室温凝固45分钟。制备5％SDS-PAGE浓缩胶。电泳首先以8V/cm进行，待上样缓冲液进入分离胶后调整为15V/cm，电泳约2小时。待溴酚蓝即将出胶时，停止电泳。0.25％考马斯亮蓝R250染液染胶2小时，脱色至蛋白带型清晰可见，分析蛋白表达结果，将表达量最高的质粒和菌株保存起来以后再用。
重组蛋白的大量表达将鉴定后的阳性菌株挑一个单菌落入100ml新鲜LB培养基(含有卡那霉素)。37℃剧烈摇动，培养过夜。将过夜菌液按照1/10比例接种到一个含有500ml LB培养基中(含卡那霉素)，37℃剧烈摇动，培养1-1.5小时，使菌液的OD600nm达到0.4-0.6。加入终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导表达3-4小时。收集培养液，5000rpm离心10分钟，弃上清，PBS洗菌体沉淀。用PBS按照5ml/g重悬，冰浴下工作，按照参数为工作10s，冷却20s，功率300W的条件，超声波破碎细菌20次。12000rpm离心20分钟，分别取少量上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测，分析蛋白在胞内表达形式。其余于-70℃冻存备用。
重组蛋白的纯化如果表达的蛋白主要存在上清中，直接加入GSH-Sepharose吸附融合蛋白，如果目的蛋白主要在包涵体内，则需要将包涵体溶解后再纯化。GSH-Sepharose 4B基质的处理轻轻摇动装有GSH-Sepharose4B的瓶子(GSH-Sepharose 4B基质保存在乙醇中)，重悬基质。取1.33mlGSH-Sepharose 4B基质转移到合适的离心管。500g离心5分钟，去除上清。加入10ml 4℃预冷的PBS，混匀清洗GSH-Sepharose4B基质，将残留的乙醇洗净，否则会干扰以后的结果。500g离心5分钟，去除上清。加入1ml 1XPBS，用于平衡基质。
GSH-Sepharose 4B柱子纯化蛋白表达蛋白在包涵体内，使用以下方法纯化将菌体重悬于20ml STE(10mM Tris.HCl pH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA)中。加入溶菌酶(10mg/ml)至终浓度100ug/ml，混匀，冰浴15分钟。加入1M DTT及10％Sarkosyl至浓度分别为5mM及1.5％，于振荡器上混合5s。超声波破菌，超声12s，冷却30s，功率300W，超声15次。4℃离心，12000rpm，20分钟。上清加入30％TritonX-100至终浓度为3％，4℃旋转仪上充分混合30分钟。加入200ulGSH-Sepharose 4B，旋转仪上充分混合30分钟。将上液加到聚丙烯柱上，用10X柱体积的PBS洗3次。将树脂转移到1.5ml的离心管，加入200ul GST洗脱缓冲液(50mM Tris.HCl，10mM谷胱甘肽)，室温作用10分钟。1000rpm 4℃离心2分钟，上清即为纯化蛋白。重复洗脱2次，然后，福林-酚法测定蛋白浓度，SDS-PAGE检测蛋白浓度，-70℃冻存待用。
抗体的获得4只2kg重的新西兰大白兔，两只作为实验组，两只为对照。第一次基础免疫1mg抗原(纯化的融合蛋白)，加等体积福氏完全佐剂混合，直至形成均匀油包水状乳液，采用背部皮内，腋下等淋巴密集处皮下多点注射，约20-30点。对照50mM Tris.HCl，与佐剂混合。第二次基础免疫400ug抗原加等体积福氏不完全佐剂混合，同上，多点注射。免疫一周后，从耳缘静脉取血ELISA测定抗体效价。加强免疫300ug抗原加等体积的福氏不完全佐剂混合，多点注射。根据ELISA测定抗体效价的结果，每两周免疫一次，直到抗体效价达到所需滴度(1∶32)。从颈动脉放血，采集的血液于室温斜置30分钟，移到4℃冰箱待血清析出，收集血清后1000rpm离心10分钟，0.5ml/支分装，-70℃保存。Western印迹检测抗体纯度较高。
pET-30a(+)-pank4也按同样方法进行诱导表达。
实施例6 pank4组织分布检测实验利用免疫组化的方法进行pank4分布的定位，动物材料为300克重SD大鼠，对其进行麻醉后用PBS缓冲液灌流，充分去除血液的干扰，迅速取出各器官，在4％多聚甲醛(PBS配)中固定，然后石蜡包埋、切片、脱腊、固定，用3％过氧化氢孵育15分钟，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，用实施例5制得的pank4抗体按1∶200稀释，4℃孵育过夜。次日用PBS洗三次，每次5分钟，滴加通用性二抗(羊抗兔)(北京中山生物技术有限公司)，37℃孵育40分钟，PBS洗三次，每次5分钟，DAB(北京中山生物技术有限公司)显色，蒸馏水冲洗，苏木素染料复染3分钟，脱水，封片。显微镜下观察，10×、20×、40×照相。如图4A-4L所示。图中，A为肝脏，pank4在新分裂的细胞中分布较广。B为骨骼肌组织，pank4在某一簇细胞中分布较多，说明它与收缩有关，从而也说明它也许与能量代谢有关。C为胰腺组织，可明显断定它在胰导的某类细胞中分布广。D为肾脏组织，图中可见pank4在肾小管附近有高分布。E为睾丸，如箭头所指分布于基质。F为肺，如箭头所指分布于基质。G为血管，与骨骼肌组织类似，pank4在某一簇细胞中分布较多。H为小肠，在基底细胞中分布。I为甲状腺，如箭头所指分布于分泌导管。J为大脑，在神经元细胞中分布。K为心肌，与骨骼肌组织类似，pank4在某一簇细胞中分布较多。L为脾，pank4没有明显的特征分布。
实施例7 Pank4在细胞中的定位pEGFP-N1载体(Clonetech公司)含有CMV的启动子和增强子，以Pank4全基因为模板PCR扩增得到Pank4全长克隆到pEGFP-N1，过程如下上游引物为P1(5’-GAA CTC GAG AAA ATG GCG GAGTGC CGG-3’)，含有Xho1酶切位点，下游引物为P2(5’-CAT GGATCC TCG GCT GGG ACC TCG TA-3’)，含有BamH1位点。PCR产物被Xho1-BamH1酶切并连入同样酶切得到的载体pEGFP-N1中。
L-6TG细胞(中科院上海细胞所)培养在RPM1640培养基中(10％热灭活的胎牛血清)，细胞以50％比例接种到覆盖有盖玻片的六孔板上，24小时后待细胞长到80％时，用Lipofectamine2000将质粒pPank4-EGFP-N1转染细胞，pEGFP-N1作为对照，24小时后，于OLYMPUS FV-500共焦激光扫描显微镜观察结果。
HEK293细胞和Hela细胞(购自中科院上海细胞所)培养在MEM培养基中(10％热灭活的胎牛血清)，以pPank4-EGFP-N1转染细胞，pEGFP-N1作为对照，转染方法同上。然后于OLYMPUSFV-500显微镜观察结果。
另外，SD大鼠的骨骼肌细胞以贴块法原代培养于Dulbeccos改良的Eagle培养基(DMEM)(10％热灭活的胎牛血清)37℃，5％CO2。待细胞在盖玻片上形成单层细胞后固定于4％多聚甲醛(在PBS中配制)，0.1％TritonX-100(在PBS中配制)透化后，以3％BSA(在PBS中配制)37℃封闭，37℃标一抗半小时(SD大鼠Pank4蛋白免疫兔子得到的抗体)，PBS洗细胞三次，然后室温标记偶联FITC的山羊抗兔二抗约半小时，固定盖玻片于载玻片上，于OLYMPUSFV-500显微镜观察结果。
质粒pEGFP-Pank4和pEGFP-N1转染到L-6TG、HEK293、HeLa细胞系中的结果发现，绿色荧光蛋白定位于全细胞(图5A、B、C)，而EGFP-Pank4定位于细胞质中(图5E、F、G)。
SD大鼠骨骼肌原代培养的细胞经固定后，以Pank4抗体作为一抗，偶联FITC的羊抗兔抗体作为二抗进行免疫荧光实验，结果表明Pank4蛋白定位于细胞质中(图5D、H)。
实施例8 pank4基因和蛋白的进一步鉴定酵母双杂交实验利用MATCHMAKER Library construction & Screening System(CLONTECH)进行酵母双杂交实验，SD大鼠Pank4基因全长克隆到pGBKT7载体(Clonetech)中上游引物P1(5’-A GAA TTC AAAATG GCG GAG TGC CGG-3’)含有EcoRI位点，下游引物P2(5’-AGGA TCC TGG GAC CTC GTA CTT GAA-3’)含有BamHI位点，PCR产物连入T-vector中，然后用EcoRI-BamH1酶切后连入同样酶切的载体pGBKT7中，重组质粒pPank4-GBKT7转化到酵母菌株Y187中在自激活和毒性检测后，Pank4作为诱饵蛋白与SD大鼠骨骼肌cDNA文库杂交(SD大鼠骨骼肌cDNA文库是cDNA片断以pGADT7-Rec作为载体，并转化到酵母菌株AH109中)，24-26小时后，观察合子形成后，收集酵母菌，并将其铺于trp-，leu-，his-，ade-+50mM 3-AT平板上，30℃培养10天左右，按CLONTECHMATCHMAKER文库构建和筛选试剂盒的方法测定β-半乳糖苷酶的活性，筛选阳性克隆。
Pull-down实验为了进行pull-down实验，分别在Escherichia coli BL21(DE3)中表达GST-Pank4融和蛋白和GST蛋白。GST和GST-Pank4蛋白按GST基因融合系统指导(Amersham Pharmacia Biotech)提供的方法纯化。结合实验中，将0.5μg GST和GST-Pank4蛋白分别结合于20μl以裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0 at 4℃，1mM EDTA，200mM NaCl，10mM 2-巯基乙醇，25μg/ml PMSF，0.7μg/ml pepstatin，1μg/ml leupeptin，2μg/ml aprotinin，0.5％Nonidet P-40)平衡好的谷胱甘肽-SepharoseTM4B珠(Amersham Pharmacia Biotech)上，然后用各1ml裂解缓冲液漂洗3次。
筛选到的酵母阳性克隆的DNA序列(Pkm2)按读码克隆到真核表达载体pCDNA6v5hisB-FIAG(Invitrogen)，HEK293细胞接种到50mm的平板上，重组质粒pCDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2以Lipofectamine2000试剂(Invitrogen，USA)转染到Hek293细胞中，48小时后收集细胞，裂解缓冲液裂解细胞，4℃条件下将细胞裂解物与结合好GST蛋白或GST-Pank4蛋白的谷胱甘肽-SepharoseTM4B珠结合过夜，然后以裂解缓冲液漂洗谷胱甘肽-SepharoseTM4B珠3次，结合好蛋白的珠加入30μl2×SDS缓冲液，以anti-FLAG作为一抗Western印迹检测。
免疫共沉淀实验重组质粒pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2和pcDNA6v5hisB-HA-pank4以Lipofectamine2000试剂(Invitrogen，USA)共转染到Hek293细胞中，48小时后收集细胞，EBC裂解缓冲液(50mM Tris-Cl，pH8.0，120mM NaCl，0.5％Nonidet P-40，5μg/mlleupeptin，10μg/ml aprotinin，50μg/ml PMSF，0.2mM sodiumorthovanadate，100mM NaF)裂解细胞，1,2000rpm离心10分钟，上清加入anti-HA单克隆抗体(Sigma)或anti-FLAG单克隆抗体(Sigma)结合1小时，然后加入Protein G sepharose 4 Fast Flow(Amersham Pharmacia)结合1小时，上清吸去，NETN缓冲液(20mMTris-Cl，pH8.0，1mM EDTA，900mM NaCl，0.5％Nonidet P-40)漂洗sepharose珠5次以上，再用NETN缓冲液(20mM Tris-Cl，pH8.0，1mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Nonidet P-40)漂洗1次，以anti-FLAG MoAB或anti-HA MoAB作为一抗western印迹检测。
将Pank4的KOG2201和KOG4584按氨基酸的顺序克隆到载体pcDNA6v5hisB-HA，与Pkm2进行免疫共沉淀试验，方法如前。
激光共定位实验HEK293和HeLa细胞接种倒带有盖玻片的六孔板上，待细胞长到80％时，脂质体的方法将pEGFP-N1-pank4和thepcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2共转染到两种细胞中，24小时后，细胞4％多聚甲醛(PBS配)，0.1％TritonX-100(PBS配)透化后，3％BSA 37℃封闭30分钟，anti-FLAG MoAB37℃孵育30分钟，PBS漂洗3次，Anti-小鼠IgG(H+L)缀合的荧光素(TRITC，Sigma)室温标记3分钟，绿色荧光和红色免疫荧光通过OLYMPUS FV-500显微镜观察并分析二者表达重叠情况。
将Pank4的KOG2201和KOG4584按氨基酸的顺序克隆到载体pEGFP-N1，与Pkm2进行共定位实验，方法如前。
丙酮酸激酶活性检测L-6TG细胞和HEK293T细胞(购自中科院上海细胞所)以pcDNA6v5hisB-HA-pank4和pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2转染，然后25℃进行丙酮酸激酶的活性检测。首先细胞冰浴，冰预冷的PBS洗两次，裂解缓冲液裂解细胞，然后15000g离心20分钟。上清以BCA法测定蛋白浓度，酶活反应如下50mM Tris-Cl，pH7.6，100mM KCl，5mM MgSO4，2mM ADP(Sigma)，0.2 or 2mM phosphoenolpyruvate(PEP)(Sigma)，0.25mM NADH and 2U乳酸脱氢酶(Sigma)，反应半小时后测定340nm下的光吸收。
结果Pkm2与Pank4相互作用为了寻找与Pank4相互作用的蛋白，以Pank4蛋白作为诱饵蛋白筛选SD大鼠骨骼肌的AD文库，分离出十个阳性克隆，经过在此杂交验证，序列测定，BLAST分析发现它们分别是beta-hydroxysteroiddehydrogenase isomerase type II，Rattus norvegicus calcium channel beta1 subunit，Rattus norvegicus glycogen phosphorylase，Rattus norvegicuspyruvate kinase(Pkm2)，Rattus norvegicus glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase.，但是经上述pull-down实验验证发现只有Pkm2与Pank4直接相互作用。
通过GST pull-down实验验证Pank4是否与Pkm2结合，首先构建表达Pank4-GST融合蛋白和GST蛋白，用重组质粒pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2转HEK293细胞获得细胞裂解产物，与已经结合了GST蛋白和Pank4-GST蛋白的谷胱甘肽sepharose珠结合，被蛋白结合的珠进行western印迹检测，anti-FLAG单克隆抗体作为一抗。结果表明，Pkm2蛋白仅与Pank4-GST蛋白结合，而不与GST蛋白结合(图6A)。
重组质粒HA-Pank4和FLAG-Pkm2及HA-Pank4和FLAG分别共转染HEK293细胞后，获得细胞裂解物，对anti-HA单克隆抗体免疫共沉后的proteinG珠以anti-FLAG MoAb进行western印迹检测，在其对应实验中是对anti-FLAG单克隆抗体免疫共沉后的proteinG珠以anti-HA单克隆抗体进行western印迹检测结果(图6B、C)。
我们利用重组质粒pEGFP-Pank4和pFLAG-Pkm2共转染HEK293和HeLa细胞考察Pank4和Pkm2蛋白的定位，Pank4蛋白可以通过绿色荧光蛋白在HEK293细胞和HeLa细胞中的定位来确定。Pkm2蛋白的定位可以通过anti-FLAG抗体进行免疫荧光来确定(图8A-F)。
KOG2201和KOG4584两个结构域都与Pkm2相互作用KOG2201和KOG4584分别被克隆到载体pcDNA6v5hisB-HA与Pkm2进行免疫共沉淀实验，结果表明，二者均与Pkm2相互作用(图7A、B)。激光共聚焦实验也表明两个结构域分别是与Pkm2共定位的(图8G-Q)。
Pank4能激活Pkm2首先，质粒pcDNA6v5hisB-HA-Pank4和pcDNA6v5hisB-HA转染HEK293T细胞，提取总RNA，进行反转录-PCR反应，从图片9可以看出，在对照组和实验组中Pkm2的表达量没有明显变化。为了分析Pank4是否影响Pkm2的活性，我们将pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2和pcDNA6v5hisB-FLAG-Pank4、KOG2201、KOG4584以及单独的载体pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2和pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm转染HEK293T细胞，进行激酶活性检测，结果表明(图9)，KOG2201结构域对于Pkm2的活性影响很大，可以很大程度上增强Pkm2的活性，这也许是Pank4激活Pkm2的机制所在，但是KOG4584对Pkm2的活性影响不是很明显。
序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>血糖调节相关的新基因、其蛋白产物及其用途<130>I20021195cb<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2322<212>DNA<213>大鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(2322)<223>
<400>1atg gcg gag tgc cgg gcg agt ggc ggc ggg agc ggc ggg gac agt ctg48Met Ala Glu Cys Arg Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Leu1 5 10 15gac aag agc atc acg ctg ccc ccc gac gag atc ttc cga aac ctg gag96Asp Lys Ser Ile Thr Leu Pro Pro Asp Glu Ile Phe Arg Asn Leu Glu20 25 30aac gcc aag cgc ttc gcc att gat ata ggt gga tca ctg acc aag ttg 144Asn Ala Lys Arg Phe Ala Ile Asp Ile Gly Gly Ser Leu Thr Lys Leu35 40 45gca tac tat tcc aca gta cag cac aaa gtg gcc aaa gtg agg tct ttt 192Ala Tyr Tyr Ser Thr Val Gln His Lys Val Ala Lys Val Arg Ser Phe50 55 60gac cac cca gga aag gac gca gaa cag gac cat gag ccg ccc tat gag 240Asp His Pro Gly Lys Asp Ala Glu Gln Asp His Glu Pro Pro Tyr Glu65 70 75 80atc tca gtt cag gag gag atc aca gct cgt ctg cat ttc atc aag ttt 288Ile Ser Val Gln Glu Glu Ile Thr Ala Arg Leu His Phe Ile Lys Phe85 90 95gag aac acc tac atg gaa gcc tgc ctg gac ttt atc aga gac cac ctt 336Glu Asn Thr Tyr Met Glu Ala Cys Leu Asp Phe Ile Arg Asp His Leu100 105 110gtc aac act gag acc aag gtc atc cag gcc aca ggg ggt gga gcc tac 384Val Asn Thr Glu Thr Lys Val Ile Gln Ala Thr Gly Gly Gly Ala Tyr115 120 125aag ttc aag gac ctc atc gag gag aag ctg cgt ctg aag gtg gac aaa 432Lys Phe Lys Asp Leu Ile Glu Glu Lys Leu Arg Leu Lys Val Asp Lys130 135 140gag gat gtg atg acc tgc ttg att aag ggg tgc aac ttc gtg ctg aag 480Glu Asp Val Met Thr Cys Leu Ile Lys Gly Cys Asn Phe Val Leu Lys145 150 155 160
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Arg Leu Lys Gly Pro Pro His Lys Cys Ala Leu Ile Phe Ala Asp Asn610 615 620Ser Gly Ile Asp Ile Ile Leu Gly Val Phe Pro Phe Val Arg Glu Leu625 630 635 640Leu Cys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Ala Cys Asn Ser Gly Pro Ala645 650 655Leu Asn Asp Val Thr Tyr Ser Glu Ser Leu Ile Val Ala Glu Arg Ile660 665 670Ala Ala Met Asp Pro Ile Ile Cys Thr Ala Leu Arg Glu Asp Arg Leu675 680 685Leu Leu Val Gln Thr Gly Ser Ser Pro Pro Cys Leu Asp Leu Ser Arg690 695 700Leu Asp Lys Gly Leu Ala Val Leu Val Arg Glu Arg Gly Ala Asp Leu705 710 715 720Val Val Ile Glu Gly Met Gly Arg Ala Val His Thr Asn Tyr His Ala725 730 735Leu Leu Arg Cys Glu Ser Leu Lys Leu Ala Val Val Lys Asn Ala Trp740 745 750Leu Ala Glu Arg Leu Gly Gly Gln Leu Phe Ser Val Ile Phe Lys Tyr755 760 765Glu Val Pro Ala Glu770
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其包含具有选自如下一组的一种核苷酸序列的多核苷酸，所述的组为(a)编码具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的全长多肽的核苷酸序列；(b)互补于以上(a)的核苷酸序列的核苷酸序列；(c)在严格条件下与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.如权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
3.一种包含权利要求1或2的核酸分子的表达载体。
4.权利要求3的表达载体，其为真核表达载体pcDNA3.1-pank4。
5.由权利要求3的表达载体转化或转染的宿主细胞。
6.一种多肽，其为具有SEQ ID NO2所示的完整氨基酸序列的全长pank4蛋白或其具有生物学活性的片段。
7.抗权利要求6的多肽的抗体。
8.权利要求1或2的核酸分子作为糖尿病治疗的靶点的用途。
9.权利要求1或2的核酸分子或者权利要求6的多肽在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种与血糖调节相关的新基因，命名为pank4，本发明还涉及所述基因编码的蛋白质产物，以及所述基因和蛋白质在血糖调节及糖尿病治疗中的用途。
文档编号A61K38/16GK1530444SQ20031011027
公开日2004年9月22日 申请日期2003年12月29日 优先权日2002年12月27日
发明者李云峰, 常永生, 左瑾, 方福德 申请人:中国医学科学院基础医学研究所