专利名称：癌症的快速诊断方法
背景技术：
发明领域本发明涉及癌症的快速诊断方法，该方法适用于在无症状期或早期检测个体中是否存在致癌过程。本发明还涉及碳酸酐酶II即肿瘤标记的激活剂化合物，所述肿瘤标记存在于癌症患者的血清中；本发明还涉及治疗癌症的方法，该方法包括用所述癌症诊断方法检测无症状期或早期患者体内的癌症；本发明还涉及完成所述癌症诊断方法的试剂盒。本发明的癌症诊断方法是以癌症患者的血清对纯化的碳酸酐酶II的活性有影响为基础的。发现加入适宜量的癌症患者的血清，可显著提高纯化的碳酸酐酶的活性。另一方面，未发现健康志愿者的血清或者有其它疾病而不是癌症的患者的血清有相似的作用。
相关技术描述碳酸酐酶是一种锌酶，是由Meldrum等在1932年(Meldrum N.U.，Roughton J.W.碳酸酐酶其制备和特性(Carbonic AnhydraseItsPreparation and properties)，J.Physiol.(London)，1933，80，113-142)发现的。该酶位于红细胞和参与保持酸基平衡的生物体的其它细胞中(Maren T.H.碳酸酐酶，生理学综述(Carbonic Anhydrase，Physiological Reviews)1967，47，585-782；Hewett-Emmett D.，Hopkins P.J.，Tashian R.E.，Czelusniak J.碳酸酐酶同功酶的来源和分子进化(Origins and molecular evolution of thecarbonic anhydrase isozymes)，Ann.N.Y.Acad.Sci.1984，429，338-358)。在脊椎动物中发现了8种不同的碳酸酐酶同功酶(命名为I-VIII)，它们有不同的生理功能，与胃酸分泌、水状液和头-脊液形成、胰腺碳酸氢盐分泌、中间产物代谢、钙化等有关。
申请人以前的研究工作表明以常规治疗剂量经口使用碳酸酐酶特异性抑制剂(乙酰唑胺、乙氧苯唑胺、苯并噻唑-2-磺胺)可减少胃酸分泌并可消除溃疡疼痛，同时，用内窥镜检查，发现在很短的时间内使胃十二指肠溃疡愈合(I.Puscas et al.Les inhibiteurs deI’anhydrase carbonique dans le traitement de I’ulceregastrique et duodenal.Archive Francaises des Maiadies deI’Appareil Digestif，Paris，1976，65577-583；I.Puscas用碳酸酐酶抑制剂治疗胃十二指肠溃疡(Treatment of gastroduodenalulcers with carbonic anhydrase inhibitors)，Ann.New YorkAcad.of Sciences，1984，587-591；I.Puscas碳酸酐酶抑制剂用于治疗胃和十二指肠溃疡(Carbonic anhydrase inhibitors inthe treatment of gastric and duodenal ulcers)，inNewPharmacology of Ulcer Disease，S.Szabo，Gy.Mozsik(Editors)Elsevier Publ.House，New York，USA，164-178，1987；I.PuscasFarmacologia Clinica da Ulcera Peptica，InAparelhoDigestivo，Clinicae Cirurgia，Julio Coelho(Ed)MEDSI Publ.House，Rio de Janeiro，The 1st Edition in 1990，The 2nd Editionin 1996，1704-1734；I.PuscasAvaliacao do paciente com doencado estomago e duodeno，InAparelho Digestivo.Clinica eCirurgia，Julio Coelho(Ed.)，MEDSI Publ.House，Rio deJaneiro，Brasil，The 1st Edition in 1990，The 2nd Edition in1996，173-179)。
申请人的进一步研究还表明胃酸分泌的主要刺激剂-组胺、胃分泌素和乙酰胆碱-可直接激活胃粘膜中的碳酸酐酶II和IV(I.Puscas用组胺刺激胃酸分泌的机制新概念(New concepts concerning themechanism of stimulation of gastric acid secretion byhistzmine).VithWorld Congress of Gastroenterology，Madrid，1978，213；I.Puscas用组胺直接激活在人胃粘膜中的碳酸酐酶(Direct activation by histamine of the carbonic anhydrase inthe human gastric mucosa)，Rev.Roum.Biochem.，1979，4317-320)。申请人的研究还证明在红细胞和血管壁中的碳酸酐酶的同功酶I与血管调节过程有关(I.Puscas et al.用一氧化氮抑制碳酸酐酶(Inhibition of carbonic anhydrase by nitric oxide).Arzneimittel-Forschung/Drug Research，1995，8846-848；I.Puscas et al.有血管舒张作用的前列腺素抑制碳酸酐酶，而白三烯B4和C4提高碳酸酐酶活性(Prostaglandins hayingvasodilating effects inhibit carbonic anhydrase whileleukotriens B4and C4incresase carbonic anhydrase activity).Int.J.Cl in.Pharmacol Therapeutics，1995，32，3176-181；I.Puscas et al.硝酸异山梨醇、硝酸甘油和硝普化钠诱导血管舒张，同时抑制红细胞中碳酸酐酶I直至消除(Isosorbide nitrates，nitroglycerine and sodium nitroprusside induce vasodilation，concomitantly inhibiting down to abolishment carbonicanhydrase I in erythrocytes). American Journal ofHypertension，1997，10(1)，124-128)，位于红细胞和分泌细胞中的碳酸酐酶同功酶II可调节生物体内的分泌过程(I.Puscas et al.World Congressof Gastroenterology，Los Angeles，Oct.19941329-32；1366-81；I.Puscas et al.非甾类抗炎药物通过直接作用机制激活碳酸酐酶(Nonsteroidal anti-inflammatorydrugs activate carbonic anhydrase by a direct mechanism ofaction.)J.Pharmacol.Exp.Therap.，USA，1996，277，31146-1148)。
申请人的结果导致提出有关细胞内信号传递新理论的假设pH理论。根据该理论，产生血管和分泌调节的刺激或主要信使可通过两个机制起作用在细胞膜上的特异性受体和直接与膜结合的碳酸酐酶。该酶通过其激活作用或抑制作用可确保有足够的pH用于刺激-受体复合物的形成，以便将信息传递给细胞效应物。通过碳酸酐酶引发的这种pH修饰作用，这种酶可参与生物体及癌症形成过程中的生理和病理过程的调节(I.Puscas et al.碳酸酐酶与有机体生理和病理过程的调节(Carbonic anhydrase and modulation of physiologic andpathologic processes in the organism)I.Puscas-(Editior)，Helicon Publishing House Timisoara，Romania，1994，罗马尼亚文本p.155-205 and 577-585，英文本p.147-197 and 551-559；I.Puscas碳酸酐酶-有机体生理和病理过程的调节物pH理论(Carbonic anhydrase-a modulator of physiologic andpathologic processes in the organismThe pH Theory).第4届碳酸酐酶国际学术会议，1995年7月，University of Oxford，England；I.Puscas碳酸酐酶调节生物体中的生理和病理过程，pH理论(Carbonic anhydrase modulating physiological andpathological processes in organism. The pH theory). TheMedical Novelty(Noutatea Medicala)，Bucharest，Romania，1997，35-15)。
过去几年已经在了解癌症的生物学和生物化学基础方面取得了显著的进展。癌症是一种异常细胞生长失控的疾病，所述异常细胞从最初的解剖部位向其它组织扩散。这种转移过程包括在任何肿瘤细胞产生转移集落前发生的各种细胞过程。如果失控，这种扩散就是癌症致命结果的主要原因。但是，如果能够被早期检测并迅速得到治疗，许多癌症是可以治愈的；其它一些癌症用各种治疗方法可以控制许多年。
申请人的体外和体内研究证实致癌物质降低碳酸酐酶II和过氧化物歧化酶活性，而抗癌物质可提高这些酶的活性。(I.Puscas etal.碳酸酐酶I、II、非甾类抗炎药物与致癌物质之间的关系(Relation between carbonic anhydrase I，CA II，non-steroidalanti-inflammatory drugs and some carcinogenic substances)，消化疾病周刊，San Diego，California，May 1995，0643；I.Puscaset al.胃癌患者与对照的超氧化物歧化酶的值(The values ofsuperoxie dismtase in patients with gastric cancer as comparedto controls)，Digestive Disease Week，San Francisco，California，May 1996，0798；I.Puscas et al.抗癌化疗增加红细胞并提高胃粘膜碳酸酐酶活性(Anticancer chemotherapyincreases red cell and gastric mucosa carbonic anhydraseactivity).体内研究。消化疾病周刊，San Francisco，California，May 1996，0797)。本申请人的其它最新研究-用患不同癌症的患者完成的(组织学和计算机X线体层照相术确定的)-已表明与健康志愿者相比，所有患者的红细胞碳酸酐酶II和超氧化物歧化酶活性都很低(I.Puscas et al.与对照相比，苯并芘和环磷酰胺对胃癌患者中的超氧化物歧化酶和碳酸酐酶活性的影响(The effectof benzpyrene and cyclophosphamide on superoxid dismutase andcarbonic anhydrase activity in gastric carcinoma patients ascompared to controls).The First Forum of Gastroenterology，“Banat-Crisana”，Timisoara，Romania，Oct.1996)。
到目前为止，利用肿瘤标记，在许多情况下早期检测肿瘤并精心监测所述疾病是可行的，所述肿瘤标记是表明肿瘤增殖存在并在血清、血浆或其它体液中可检测到的生物化学指标。已经将肿瘤标记如癌胚抗原(CEA)、肿瘤坏死因子(TNF-α和β)、唾液酸、前列腺特异性抗原(PSA)等用于确定对治疗的反应、确定残余疾病或疾病的复发。直到今天，没有特异性的肿瘤标记；在正常生理学状态或非肿瘤疾病中它们中的大部分的水平都很低。因此，这些标记不能用于癌症的一般性筛选检测。
为了消除肿瘤标记的主要缺陷，本发明涉及建立在无症状阶段筛选癌症的快速方法，或在出现症状阶段确定癌症的快速方法。癌症的所述早期检测方法可以与其他用于肿瘤定位的常规方法一起对癌症进行有效的外科或药物治疗。
申请人现已发现，癌症患者的血清可显著激活纯化的碳酸酐酶II的活性，并且用健康人的血清或患有其他疾病而不是癌症的患者的血清则不产生这种激活作用。基于这些观察结果，本申请人发现，通过检测血清对纯化的碳酸酐酶II的活性的影响可以诊断任何类型癌症，甚至在早期也可进行所述诊断。
发明概述因此，本发明提供了(1)用于癌症诊断的方法，该方法包括(a)将待测个体的稀释的血清样品与纯化的碳酸酐酶II溶液混合，制备第一反应混合物；(b)确定所述第一反应混合物中碳酸酐酶II的活性；(c)确定第二反应混合物中碳酸酐酶II的活性，所述第二反应混合物含有除血清以外的所有第一反应混合物；和(d)评估相对于步骤(c)，步骤(b)中碳酸酐酶II的激活程度；(2)在癌症患者血清中存在的肿瘤标记物，所述肿瘤标记物在lμM或更低的浓度可激活碳酸酐酶；(3)治疗癌症的方法，该方法包括用上述(1)中定义的癌症诊断方法，在无症状阶段或早期检测患者的癌症过程；和(4)用于完成上述(1)的癌症诊断方法的试剂盒，所述试剂盒含有含碳酸酐酶II的组分。
发明详述本发明的癌症诊断方法是一种体外方法，优选的待测个体是人。
在癌症诊断方法的优选实施方案中，稀释的血清含有0.1-50体积％的血清，优选1-10体积％血清。用于稀释血清样品的稀释剂选自水和含水有机溶剂，例如含0.1-50体积％，优选1-15体积％一种或多种有机溶剂的含水混合物，所述稀释剂还可任意地含有缓冲液和/或有机或无机盐。适宜的有机溶剂包括低级醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇，酮，例如丙酮和丁酮，二醇和三醇化合物，例如乙二醇1，3-丙二醇和甘油，和醚如二乙醚，二乙二醇和2-甲氧基乙醇。适宜的缓冲液包括HEPES，DIPSO、TAPSO、TES和MOPS，适宜的有机或无机盐包括硫酸钠和硫酸钾。
在纯化的碳酸酐酶II的溶液中，所述碳酸酐酶II的浓度为0.01nM-0.1mM，优选1.0nM-1.0μM。所述溶液的合适溶剂选自水剂和含水有机溶剂，所述溶剂还可含有缓冲液、无机盐或有机盐，和/或一种或多种指示剂。就有机溶剂、缓冲液、有机和无机盐而言，是指上述稀释的血清样品。适宜的指示剂包括对硝基苯酚、酚红和氮蓝四唑。
根据本发明，优选稀释的血清样品与纯化的碳酸酐酶溶液以100∶1至1∶100的比例混合，优选的比例为10∶1至1∶10，最佳为1∶1。
在优选的实施方案中，第一反应混合物含有0.05-25体积％血清，优选0.5-5体积％血清。应理解，相对于第二反应混合物中的碳酸酐酶II活性，在第一反应混合物中100％或更高的激活作用，表明个体中存在致癌过程，而所述第一反应混合物含有25体积％或较少，优选5体积％或更少的血清(第一反应混合物中的碳酸酐酶II活性至少是第二反应混合物中的两倍)。
在本发明方法进一步优选的实施方案中，稀释的血清是含10体积％血清的水溶液，纯化的碳酸酐酶II溶液是含1.0-10μM碳酸酐酶II的含水缓冲液，第一反应混合物含有稀释的血清样品和纯化的碳酸酐酶II溶液，两者的比例为1∶1。
碳酸酐酶II活性可用一种例如在前文引用的具体文献中描述的已知方法来确定。在本发明方法的一优选实施方案中，用截流法(stop-flow method)(Khalifah R.G.碳酸酐酶的二氧化碳水合活性对天然人同功酶B和C的停-流动力学研究(The carbondioxide hydration activity of carbonic anhydrasestop-flowkinetic studies on the native human isozymes B and C)，J.Biol.Chem.，1971，2462561-2573)确定碳酸酐酶活性。该方法包括测量对二氧化碳水合作用的酶活性。二氧化碳水合作用用以pH改变为基础的比色法确定。测量试剂混合物从其起始的pH7.5降至最终6.5所需的时间。用分光光度计在400nm测量反应，使用动力快速分光光度计HI-TECH SF-51MX(England)，该装置配有一个混合容器和提供试剂的两个注射器系统。通过两个不同的途径确保用反应小杯提供的试剂第一个注射器导入由酶-缓冲液组成的反应混合物(即第一或第二反应混合物)，而第二个注射器导入底物溶液，该底物溶液是含5-50mM，优选15nN二氧化碳的二氧化碳水溶液。试剂进入反应小杯后混合，由此开始反应和监测。接收从混合室发出的由光电倍增管传递的信号，用配有数学协处理器和动力学软件RKBIN IS-1的计算机显示。
也可用其它方法评估碳酸酐酶活性，例如以pH变化为基础的方法(Philpot F.J.et al.A modifiedcolorimetric estimation of carbonic anhdrase，Biochem.J.，1936；302192-94；Kernohan J.K.et.al.The activity ofconcentrated solutions of carbonic anhydrase，Biochem.Biophys Acta，19636731-41；Maren T.H.Carbonic anhydrasechemistry，physiology and inhibition.Physiol.Rev.1967，47595-781；Wilbur K.M.&Anderson N.O.Electrometric andcolorimetric determination of carbonic anhydrase.J.Biol.Chem.1948，176147-153)。所述方法是以H+产生和消耗的测量值为基础，并通过下列步骤完成a)pH指示剂，其中H+产生通过指示剂颜色的变化用肉眼观察或b)pH电极，其中用pH电极测量H+产生和消耗。
以二氧化碳浓度或pCO2变化为基础的方法，该方法以二氧化碳的产生或可逆的CO2-HCO3-反应的消耗为基础，通过a)气体测压技术(Meldrum N.U.，Roughton F.J.W.，J.Physiol，London，1933，80113-142；Roughton F.J.W.et al.，Biochem J.，1946，40319-390)或b)pCO2电极测量(Holland R.A.B.et al.，J.Physiol.，London，1975，2281589-1596；Klocke R.A.，J.Appi.Physiol.，1976，40707-714)。
以反应温度的变化为基础的方法，该方法是以由反应引起的温度的最初快速升高为基础，用配有温差电偶的装置来测量(KernohanJ.C.et al.，J.Physiol.，London，1968，197345-361)。
标记同位素(示踪物)如18O方法(Silverman D.N..MethodsEnzymol.1982，87732-752)。
用13C的核磁共振方法(NMR)(Simonsson I.et al.，Eur.J.Biochem.1979，93409-417)。
松弛法，其中HCO3-CO2溶液平衡突然改变其物理特性，例如其电场、压力或温度，从而改变化学平衡状态(Eigen M.et al.，Z.Physik.Chem.NF，1961，30130-136)。
免疫组织化学方法，该方法是以钴捕获碳酸酐酶产生的二氧化碳为基础，该方法可用于确定体内许多位点上的碳酸酐酶(HanssonH.P.J.碳酸酐酶活性的组织化学证明，Histochemie，1967，11112-128；Lonnerholm G.人肾脏中碳酸酐酶活性的组织化学证明，Acta Physiol.Scand.，1973，88455-468)。
荧光检测法(Shingles R.，Moroney J.V.使用灵敏荧光法测定碳酸酐酶活性，Analytical Biochemistry，1997，252，1190-198)。
使用其它碳酸酐酶评估底物的方法，如对硝基苯乙酸酯法(Schneider F.et al.Uber die Reaktion von Carbonathydrolyasemit p-Nitrophenylacetat，Z.Physiol.Chem.，1963，334279-282)。
如前所述，相对于第二反应混合物中的碳酸酐酶II活性，在第一反应混合物(含有25体积％或更低，优选5体积％或更少的血清)中达到100％或更高的激活值表明存在致癌过程。此外，本申请人发现用早期癌症患者(不考虑癌症的位置)的血清对碳酸酐酶II的激活作用较弱。因此，与更晚阶段中患者血清的激活作用相比，本发明方法还适用于确定患者的癌症阶段(通过比较碳酸酐酶II的激活程度)。然而，在所有早期阶段的情况下，癌症患者的碳酸酐酶II激活作用(含5体积％血清的第一反应混合物)超过100％，而晚期患者血清产生的激活作用达到400％，甚至更高。
本发明方法具有下列优点1.可检测无症状阶段的肿瘤，而用常规方法检测不到早期的肿瘤。
2.用少量血清即可完成。
3.该方法是高度敏感，而且评估方法是可重复的。
4.由于所需的试剂价格低，因此，该方法经济可行。
从有关癌症患者血清对碳酸酐酶II的激活作用的上述结果开始，可鉴定在所述癌症患者血清中引起碳酸酐酶II激活作用的一些相关因子(即肿瘤标记)。因此，已表明肿瘤坏死因子α和β、癌胚抗原、唾液酸和α1抗胰凝乳蛋白酶是碳酸酐酶II的强激活剂。本申请人的研究还证明，与健康志愿者的血清相比，癌症患者的血清胃分泌素水平高出80％。因此，这可能也是碳酸酐酶II的血清内源激活剂。
本发明的肿瘤标记在低于1μM的浓度、甚至1nM或更低，甚至1pM或更低的浓度均可激活碳酸酐酶II。优选的肿瘤标记包括肿瘤坏死因子α和β、癌胚抗原(CEA)、唾液酸、α1抗胰凝乳蛋白酶和sp185Her2癌蛋白。
可将本发明的肿瘤标记用作定量检测激活百分比，具体地说，用于确定癌症阶段的标准溶液。
本发明治疗癌症的方法适用于治疗患者的任何种类的癌症，所述方法包括按上述检测无症状阶段或早期阶段中患者体内的癌症过程。因此，可将本发明癌症诊断的方法与任何类型的治疗方法联用(例如外科或化疗方法)。在癌症过程中早期阶段的检测提高了治愈癌症过程的机会。
完成本发明癌症方法的试剂盒含有含碳酸酐酶II的组合物。所述组合物可以是干燥状态或是溶液。所述组合物的其它组分和碳酸酐酶II在所述组合物中的量参考前文讨论的第一反应混合物中的化合物。
所述试剂盒还含有含缓冲液如缓冲溶液的组合物，含指示剂的组合物，和含一种或多种肿瘤标记的组合物，其中所述缓冲液、指示剂和肿瘤标记是前文所定义的那些。
通过下列非限制性实施例更详细地说明本发明。
实施例试剂-对硝基苯酚-作为颜色指示剂-以0.2mM的浓度使用；pH＝7.5；温度20-25℃＝室温(下文称为r.t.)-HEPES缓冲液以20 mM的浓度使用；pH＝7.5；r.t.
-纯化碳酸酐酶II的储备液(从SIGMA Diesenhofen，Germany得到)以3.44x10-6M；pH＝7.5，r.t.使用-通过将二氧化碳通入双蒸馏水至饱和来获得浓度为15mM的二氧化碳溶液(底物)。
-硫酸钠-浓度为0.1M-用于保持恒定的离子强度。
通过测量存在碳酸酐酶II的条件下，发生二氧化碳水合的时间来完成纯化碳酸酐酶II活性的评估。测量反应开始时(反应混合物的吸收值为3个单位)至反应结束时(反应混合物的吸收值为零)的值。将吸收值描绘在反应曲线中。
反应小杯包含两个注射器，注射器含有注射器1∶1毫升混合物0.8ml缓冲液+指示剂+0.1mlCA II溶液(3.44x10-6M)+0.1毫升水注射器II1毫升二氧化碳溶液(15mM)按上述方法完成试剂的注射和碳酸酐酶活性的测量。用该方法测量的反应时间标为T。用下列公式计算碳酸酐酶活性A=T0-TT--[EU/ml]]]>其中T0表示未催化的反应时间；和T表示催化的反应时间(存在CA II的条件下)根据本发明方法测量存在血清条件下的碳酸酐酶II活性如下进行实施例1从诊断患胃癌的患者中收集5毫升静脉血。用恒温器将血液保持30分钟，然后以4000rpm离心5分钟。离心后，取出2毫升血清，并按如下方法用双蒸馏水制备1/10、1/50和1/100的稀释溶液0.5毫升血清+4.5毫升水，得到1/10的稀释溶液；从1/10的稀释溶液中，取1毫升血清，加入4毫升水，得到1/50的稀释溶液；最后从1/50的稀释溶液中，取1毫升血清+4毫升水，得到1/100的稀释溶液。
第一步是测量未催化的反应时间，即确定0.8毫升缓冲液+指示剂与+二氧化碳溶液之间的反应时间。将用该方法测量的时间标为T0，而且T0为6.5秒。
第二步是测量包括0.1毫升纯化的碳酸酐酶II(3.44x10-6M)+0.8毫升缓冲液+指示剂+0.1毫升水的CO2溶液的反应时间。将用该方法测量的时间标为T，T为3.25秒。
用下列公式得到存在水的条件下，纯化碳酸酐酶II的活性A=T0-TT=6.5s-3.25s3.25s=1.00---[EU/ml]]]>第三步分别加入1/100、1/50和1/10的血清稀释溶液，与在0.8 ml HEPES缓冲液(20mM)+指示剂(对硝基苯酚0.2mM)中的0.1ml纯化碳酸酐酶II的体积比为1∶1。存在二氧化碳的条件下，测量各混合物的反应时间，标为T1、T2、T3。这些值(T1、T2、T3)表示各反应混合物的吸收值降至0的时间间隔。
得到下列值T1＝1.679 s-1/100稀释溶液的；T2＝1.264 s-1/50释溶液的；T3＝0.874 s-1/10释溶液的；按下列方法计算存在血清条件下碳酸酐酶II的活性
按下列方法计算血清稀释溶液的激活百分比
实施例2从诊断为肺癌的患者取5毫升静脉血，并按实施例1的方法处理。第一步T0＝6.40 s第二步T＝3.20 s；A＝1.00[EU/ml]第三步T1＝2.143 s(1/100稀释液)；A1＝1.986[EU/ml]；激活作用98％；T2＝1.449 s(1/50稀释液)；A2＝3.415[EU/ml]；激活作用241％；T3＝1.125 s(1/10稀释液)；A3＝4.686[EU/ml]；激活作用368％.
实施例3从诊断为乳腺癌的患者体内取5毫升静脉血并按实施例1的方法处理。第一步T0＝6.35 s；第二步T＝3.175 s；A＝1.00 [EU/ml]；第三步T1＝2.201 s(1/100稀释液)；A1＝1.885[EU/ml]；激活作用88％；T2＝1.545 s(1/50稀释液)；A2＝3.108[EU/ml]；激活作用211％；T3＝1.170 s(1/10稀释液)；A3＝4.425[EU/ml]；激活作用342％；实施例4从诊断为卵巢癌的患者体内收集5毫升静脉血并按实施例1的方法处理。第一步T0＝6.52 s；第二步T＝3.26 s；A＝1,00 IEU/ml]；第三步T1＝2.330 s(1/100稀释液)；＝A1＝1.798[EU/ml]；激活作用80％；T2＝1.664 s(1/50稀释液)；A2＝2.917[EU/ml]；激活作用192％；T3＝1.338 s(1/10稀释液)；A3＝3.870[EU/ml]；激活作用287％；实施例5从诊断为睾丸癌的患者的体内收集5毫升静脉血并按实施例1的方法处理。第一步T0＝6.24 s；第二步T＝3.12 s；A＝1,00[EU/ml]；第三步T1＝2.155 s(1/100稀释液)；A1＝1.895 [EU/ml]；激活作用90％；T2＝1.553 s(1/50稀释液)；A2＝3.018[EU/ml]；激活作用202％；T3＝1.210 s(1/10稀释液)；A3＝4.156[EU/ml]；激活作用316％；实施例6从诊断为前列腺癌的患者体内收集5毫升静脉血并按实施例1的方法处理。第一步T0＝6.42 s；第二步T＝3.21 s；A＝1,00[EU/ml]；第三步T1＝2.407 s(1/100稀释液)；A1＝1.708[EU/ml]；激活作用71％；T2＝1.798 s(1/50稀释液)；A2＝2.626[EU/ml]；激活作用163％；T3＝1.475 s(1/10稀释液)；A3＝3.418[EU/ml]；激活作用242％；实施例7从诊断为白血病的患者体内收集5毫升静脉血并按实施例1的方法处理。第一步T0＝6.36 s；第二步T＝3.18 s；A＝1,00[EU/ml]；第三步T1＝2.108 s(1/100稀释液)；A1＝2.016 [EU/ml]；激活作用102％；T2＝1.279 s(1/50稀释液)；A2＝3.610[EU/ml]；激活作用261％；T3＝1.046 s(1/10稀释液)；A3＝5.080[EU/ml]；激活作用408％；实施例8从健康志愿者的体内收集5毫升静脉血并按实施例1的方法处理。第一步T0＝6.28 s；第二步T＝3.14 s；A＝1,00[EU/ml]；第三步T1＝3.14 s(1/100稀释液)；A1＝1.00[EU/ml]；激活作用0％；T2＝3.09 s(1/50稀释液)；A2＝1.032[EU/ml]；激活作用3％；T3＝3.06 s(1/10稀释液)；A3＝1.051[EU/ml]；激活作用5％；实施例9用两组患者，按如下方法检测本发明快速诊断癌症的方法组1(N＝2320)患不同类型癌症的患者，所述癌症已经组织学方法确证。
组2(N＝2638)健康志愿者和有其它疾病而不是癌症的患者。
从两组受试者收集静脉血，按照实施例1的方法确定1/100、1/50和1/10血清稀释溶液对纯化碳酸酐酶II的作用。
结果列于下列表中，所述值是血清对纯化碳酸酐酶II激活作用的平均值。
结果表明癌症患者的血清可强烈激活纯化的碳酸酐酶II，而CAII活性不受健康志愿者的血清或非癌症患者的血清的影响。
从上述结果可以清楚地看出，激活作用与血清浓度成正比，即在实施例中，最大激活作用为1/10的稀释溶液(≈第一反应混合物中的5体积％血清)，另一方面，血清稀释度的降低(1/10至1/100≈5体积％至0.5体积％)也降低了血清的激活作用。然而，即使在1/100(≈第一反应混合物中的0.5体积％血清)，激活作用也是明显的。
实用性本发明方法提供了用于快速诊断不同类型癌症的检测方法。
迄今为止，本申请人完成的研究包括3000多名不同阶段不同部位的肿瘤患者，包括咽癌、胃癌、食管癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱尿道癌(vesica urinary cancer)、甲状腺癌、唇癌、白血病、恶性黑素瘤、Hodgkin淋巴瘤等。
本申请人描述了许多碳酸酐酶激活剂和抑制剂，所述试剂可在不同疾病中作为治疗药物施用并能够影响本申请所述的检测方法。由于这一原因，强烈建议在进行所述癌症诊断方法前5天，中断用H2受体拮抗剂进行的治疗，并在进行检测前10天，中断用碳酸酐酶抑制剂(乙酰唑胺、E1，E2，E3前列腺素)或非甾类抗炎药物进行的任何治疗。
本申请人的研究证明本发明的方法可用于诊断所有类型的癌症。
权利要求
1.癌症诊断的方法，该方法包括(a)将待测个体的稀释的血清样品与纯化的碳酸酐酶II溶液混合，制备第一反应混合物；(b)确定所述第一反应混合物中碳酸酐酶II的活性；(c)确定第二反应混合物中碳酸酐酶II的活性，所述第二反应混合物含有除血清以外的所有第一反应混合物；和(d)评估相对于步骤(c)，步骤(b)中碳酸酐酶II的激活程度。
2.权利要求1的方法，其中所述稀释的血清样品含有0.1体积％至50体积％，优选1至10体积％的血清。
3.权利要求1或2的方法，其中所述稀释的血清样品稀释剂选自水和含水有机溶剂，所述稀释剂可任意地含有缓冲液。
4.权利要求1的方法，其中纯化的碳酸酐酶II溶液中的碳酸酐酶II的浓度为0.01 nM至1.0mM，优选1.0nM至1.0μM，其中所述溶液的溶剂选自水和含水有机溶剂，所述溶剂还可含有缓冲液和/或指示剂。
5.权利要求1的方法，其中稀释血清样品与纯化碳酸酐酶溶液以100∶1至1∶100，优选10∶1至1∶10，最佳以1∶1的比例混合。
6.权利要求1的方法，其中所述第一反应混合物含有0.05至25体积％，优选0.1至10体积％，最佳0.5至5体积％的血清。
7.权利要求6的方法，其中含25体积％或更少，优选5体积％或更少血清的第一反应混合物相对于第二反应混合物中的碳酸酐酶II活性有100％或更高的激活作用，表明在个体中存在致癌过程。
8.权利要求1的方法，其中稀释的血清样品是含10体积％血清的含水溶液，纯化的碳酸酐酶II溶液是含1.0至10nM碳酸酐酶II的含水缓冲液，所述第一反应混合物通过将所述稀释的血清样品与所述纯化的碳酸酐酶溶液以1∶1的比例混合来制备。
9.权利要求1或8的方法，其中通过截流动力测量法测量碳酸酐酶II的二氧化碳水合作用来测定所述酶。
10.权利要求9的方法，其中第一和第二反应混合物的开始pH为7.5，其中所述酶活性的确定包括将第一或第二反应混合物与底物溶液混合，所述底物溶液是含5至50mM二氧化碳，优选10至25mM二氧化碳，最佳15mM二氧化碳的含水溶液，然后测量达到最终pH6.5所需的时间。
11.权利要求1的方法适用于检测与癌症阶段无关的，特别是无症状阶段或早期个体中的癌症过程。
12.权利要求1的方法适用于不同阶段不同部位的癌症诊断筛选试验，所述癌症包括咽癌、胃癌、食管癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱尿道癌、甲状腺癌、唇癌、白血病、恶性黑素瘤、Hodgkin淋巴瘤和任何其它形式的癌症。
13.在癌症患者血清中存在的肿瘤标记，所述肿瘤标记在1μM或更低的浓度可激活碳酸酐酶II。
14.权利要求13的肿瘤标记，选自肿瘤坏死因子α和β、癌胚抗原、唾液酸、α1抗胰凝乳蛋白酶和sp 185Her2癌蛋白。
15.治疗癌症的方法，该方法包括通过癌症诊断方法，检测无症状期或早期患者体内的癌症过程，所述癌症诊断方法包括(a)将待测个体的稀释的血清样品与纯化的碳酸酐酶II溶液混合，制备第一反应混合物；(b)确定所述第一反应混合物中碳酸酐酶II的活性；(c)确定第二反应混合物中碳酸酐酶II的活性，所述第二反应混合物含有除血清以外的所有第一反应混合物；和(d)评估相对于步骤(c)，步骤(b)中碳酸酐酶II的激活程度。
16.用于完成权利要求1或15的癌症诊断方法的试剂盒，该试剂盒含有含碳酸酐酶II的组合物。
全文摘要
本发明涉及快速诊断癌症的方法。具体地讲本发明涉及适用于检测无症状期或早期个体中的致癌过程的快速癌症诊断方法。本发明还涉及碳酸酐酶Ⅱ即肿瘤标记的激活化合物,所述肿瘤标记存在于癌症患者的血清中,本发明涉及治疗癌症的方法,该方法包括用所述癌症诊断方法检测无症状期或早期个体中的癌症;并涉及完成所述癌症诊断方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/25GK1256713SQ98805210
公开日2000年6月14日 申请日期1998年3月13日 优先权日1997年3月17日
发明者约安·普斯卡斯, 尤莲娜·卡曼·普斯卡斯, 马瑟拉·克尔陶, 加布里拉·杜慕塔, 迈克尔·贝坎 申请人:约安·普斯卡斯, 尤莲娜·卡曼·普斯卡斯, 马瑟拉·克尔陶, 加布里拉·杜慕塔, 迈克尔·贝坎