专利名称：制备HMG－CoA还原酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及制备抑制羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶(以下简称HMG-CoA还原酶)和具有降低血清胆固醇水平等活性的化合物的方法。
背景技术：
已知由通式(VI-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子或碱金属)[以下称为化合物(VI-a)]和由通式(VI-b)表示的化合物(VI-a)的内酯形式
可抑制HMG-CoA还原酶并具有降低血清胆固醇水平等的活性(抗生素杂志(The Journal of Antibiotics)，29，1346，(1976))。
已知一些微生物具有将由通式(V-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子或碱金属)[以下称为化合物(V-a)]和由通式(V-b)表示的化合物(V-a)的内酯形式
转化为化合物(VI-a)和化合物(VI-b)的能力。这些微生物包括属于犁头霉属、小克银汉霉属、Syncephalasporum或链霉属(特开昭57-50894号公报)；属于放射毛霉属、卷霉属、球托霉属、被孢霉属、毛霉属、须霉属、Rhyzopus、共头霉属、接霉属、密孔菌属、丝核霉属或诺卡氏菌属[抗生素杂志，36，887，1983]；属于无枝酸菌属、糖多孢菌属、拟无枝酸菌属或糖丝菌属(特开平7-184670号公报)和属于马杜拉放线菌属(WO96/40863)。
上述微生物属于放线菌纲或丝状真菌。目前，尚未知有象本发明的微生物那样属于细菌且具有分别将化合物(V-a)或化合物(V-b)转化为化合物(VI-a)或化合物(VI-b)能力的微生物。放线菌纲微生物和丝状真菌的缺点在于其生长速度比细菌慢，因此获得足以用于反应的细胞的时间更长。此外，在发酵罐中控制放线菌纲微生物和丝状真菌的培养也存在问题。由于放线菌纲微生物和丝状真菌通过延伸菌丝生长，随着它们在发酵罐中的生长，培养液的粘度增加。这常常引起供氧不足，造成培养液不均一，从而降低反应效率。为解决氧不足和保持培养液的均一性，必须增加发酵罐的搅拌速度；然而菌丝体容易受到高速搅拌产生的剪切的损害，这会降低微生物的活性[发酵工业基础，169-190页，P.F.Stansbury，A.Whitakaer，学会出版中心(1988)].放线菌纲微生物和丝状真菌培养涉及上述问题。另一方面，细菌培养不形成菌丝体，由于培养液粘度几乎不会上升而易于培养，很少观察到通气不足以及培养液缺乏均一性。
重组DNA技术中，在如大肠杆菌等细菌中的基因表达为常规操作。然而，通常难于有效表达放线菌纲微生物和丝状真菌的基因，因为其编码氨基酸的密码子与如大肠杆菌的细菌大不相同。
仅有有限的材料如载体和启动子可在放线菌纲微生物中有效表达基因。因此，为了高水平表达基因并为了更有效的反应，期望利用可使用多种载体、启动子等的细菌。在细菌中可高水平的方便地表达任何细菌基因。
发明公开本发明的一个目的在于提供一种制备抑制羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶(以下简称HMG-CoA还原酶)和具有降低血清胆固醇水平等活性的化合物的方法。
本发明涉及一种制备由通式(II-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属；R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(II-a)]或由通式(II-b)表示的化合物(II-a)的内酯形式
(其中R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(II-b)]的方法，其包括将由通式(I-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属；R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(I-a)]或由通式(I-b)表示的化合物(I-a)的内酯形式
(其中R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(I-b)]在反应液中经一种酶源作用，该酶来源于芽孢杆菌属的微生物且能将化合物(I-a)或化合物(I-b)转化为化合物(II-a)或化合物(II-b)，从而在反应混合物中形成化合物(II-a)或化合物(II-b)；且从反应混合物中回收化合物(II-a)或化合物(II-b)。
烷基的例子包括具有1-10个碳原子，优选1-6个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基和癸基及其各种支链的异构体。
芳基的例子包括苯基和萘基等。
取代的烷基取代基的例子包括卤素、羟基、氨基、烷氧基和芳基等。
取代的芳基取代基的例子包括卤素、羟基、氨基、烷基和烷氧基等。
烷氧基的烷基部分具有与如上述定义的烷基相同的定义。
碱金属是指锂、钠、钾、铷、铯、钫。
任何酶的只要来源于属于芽孢杆菌属的微生物且分别能将化合物(I-a)或化合物(I-b)转化为化合物(II-a)或化合物(II-b)均可用于本发明。用于本发明的酶的来源包括属于芽孢杆菌属的且具有将化合物(I-a)或化合物(I-b)转化为化合物(II-a)或化合物(II-b)的活性的微生物、所述微生物的细胞或培养物、其处理物以及从所述微生物中提取的酶。
属于芽孢杆菌属的且具有将化合物(I-a)或化合物(I-b)转化为化合物(II-a)或化合物(II-b)的活性的微生物有侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、栗褐芽孢杆菌(Bacills badius)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、浸麻芽孢杆菌(Bacills macerans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
其更具体的例子有侧孢芽孢杆菌ATCC 4517、栗褐芽孢杆菌ATCC14574、短芽孢杆菌NRRL B-8029、芽孢杆菌属PV-6、芽孢杆菌属PV-7、蜂房芽孢杆菌ATCC 6344、环状芽孢杆菌NTCT-2610、浸麻芽孢杆菌NCIB-9368、巨大芽孢杆菌ATCC10778、巨大芽孢杆菌ATCC11562、巨大芽孢杆菌ATCC 13402、巨大芽孢杆菌ATCC 15177、巨大芽孢杆菌ATCC 15450、巨大芽孢杆菌ATCC 19213、巨大芽孢杆菌IAM 1032、短小芽孢杆菌FERM BP-2064和枯草芽孢杆菌ATCC 6051等。
上述微生物的次代培养物、突变体或衍生物以及通过重组DNA技术制备的重组体也可使用。芽孢杆菌属PV-6、芽孢杆菌属PV-7是由本发明人从土壤中分离，其微生物学性质如下所述。
PV-6菌株(A)形态学特征1.细胞形态杆状体积0.8-1.2×2.0-4.0μm2.细胞多形性未见3.运动性未见4.孢子形成未见(B)培养特征当于肉汤琼脂平板培养基上和于肉汤液体培养基中培养时的培养特征如下。
1.于肉汤琼脂平板培养基上培养(培养1-2天)1)生长茂盛2)颜色奶油色3)光泽无4)扩散性色素阴性2.于肉汤液体培养基中培养(培养1-2天)1)表面上生长无2)浑浊阳性3.肉汤明胶培养基中穿刺培养1)生长茂盛2)明胶液化阳性4.石蕊-牛奶反应1)反应碱性2)凝集阴性3)液化阴性
(C)生理学性质1.革兰氏染色阳性或阴性2.硝酸盐还原阴性3.脱硝化反应阳性4.MR试验阴性5.VP试验阴性6.吲哚生成阴性7.硫化氢生成阳性8.淀粉水解阴性9.利用柠檬酸阳性10.利用无机氮源1)硝酸盐阴性2)铵盐阳性11.色素产生无12.脲酶阳性13.氧化酶阴性14.过氧化氢酶阳性15.生长范围1)pH6-9(最适pH约7)2)温度6-40℃(最适温度约30℃)16.关于氧气需氧17.O-F试验氧化作用18.产酸(有氧条件)+产生 -不产生1)L-阿拉伯糖-2)D-木糖-3)D-葡萄糖+4)D-甘露糖-5)D-果糖+
6)D-半乳糖-7)麦芽糖-8)蔗糖-9)乳糖-10)海藻糖-11)D-山梨醇-12)D-甘露醇+13)肌醇-14)甘油+15)淀粉-(D)化学分类学性质1.DNA碱基组成(G+C mol％)39.12.细胞脂类主要醌类MK-7主要脂肪酸反异-C15∶0，异-C15∶03.细胞壁肽聚糖二氨基酸组成内消旋-二氨基庚二酸该菌株为需氧型非移动的革兰氏阳性或阴性杆菌，可形成内孢子。该菌株过氧化氢酶活性阳性，氧化酶活性阴性，脲酶活性阳性，可利用葡萄糖形成酸。该菌株可在10℃生长，但不能在50℃或更高温度下生长。该菌株具有如下化学分类学性质主要醌类型为甲基萘醌-7；主要脂肪酸为反异-C15∶0，异-C15∶0；细胞壁肽聚糖二氨基酸组成为内消旋-二氨基庚二酸；DNA的GC含量为39.1mol％。
参照伯杰氏系统细菌分类手册第2卷(1986)中的描述基于上述微生物学性质对该菌株进行分类学研究，籍此，推定该菌株为芽孢杆菌属的细菌。此外，通过相邻连接法(neighbor joining method)，利用芽孢杆菌属微生物的碱基序列并利用其相关菌属的碱基序列为参照序列对16S rRNA的碱基序列进行分子系谱分析。结果如
图1所示，通过成簇分析该菌株被分入芽孢杆菌属。因此，鉴定该菌株为属于芽孢杆菌属的细菌，命名为芽孢杆菌属的种PV-6菌株。
PV-7菌株(A)形态学特征1.细胞形态杆状体积1.0-2.0×2.0-3.0μm2.细胞多形性未见3.运动性未见4.孢子形成可见(B)培养特征当于肉汤琼脂平板培养基上和于肉汤液体培养基中培养时的培养特征如下。
1.于肉汤琼脂平板培养基上培养(培养1-2天)1)生长茂盛2)颜色象牙色3)光泽无4)色素扩散阴性2.于肉汤液体培养基中培养(培养1-2天)1)表面上生长可见2)浑浊阳性3.肉汤明胶培养基中穿刺培养1)生长茂盛2)明胶液化阳性4.石蕊-牛奶反应1)反应碱性2)凝集阴性3)液化阴性(C)生理学性质1.革兰氏染色阳性或阴性2.硝酸盐还原于琥珀酸培养基上为阳性3.脱硝化反应阴性
4.MR试验阴性5.VP试验阴性6.吲哚生成阴性7.硫化氢生成未定(可疑)8.淀粉水解阴性9.利用柠檬酸阳性10.利用无机氮源1)硝酸盐阳性2)铵盐阳性11.色素产生无12.脲酶阳性13.氧化酶阴性14.过氧化氢酶阳性15.生长范围1)pH6-10(最适pH约7)2)温度11-47℃(最适温度约30℃)16.关于氧气需氧17.O-F试验氧化作用18.产酸(有氧条件)+产生-不产生w微弱产生1)L-阿拉伯糖+2)D-木糖w3)D-葡萄糖+4)D-甘露糖w5)D-果糖w6)D-半乳糖-7)麦芽糖w8)蔗糖+9)乳糖-
10)海藻糖w11)D-山梨醇+12)D-甘露醇+13)肌醇w14)甘油+15)淀粉w(D)化学分类学性质1.DNA碱基组成(G+C mol％)37.92.细胞脂类主要醌类MK-7主要脂肪酸反异-C15∶0，反异-C17∶03.细胞壁肽聚糖二氨基酸组成内消旋-二氨基庚二酸该菌株为需氧型非移动的革兰氏阳性或阴性杆菌，可形成内孢子。该菌株过氧化氢酶活性阳性，氧化酶活性阴性，脲酶活性阳性，可利用葡萄糖形成酸。该菌株可在11℃生长，但不能在47℃或更高温度下生长。该菌株具有如下化学分类学性质主要醌类型为甲基萘醌-7；主要脂肪酸为反异-C15∶0和反异-C17∶0；细胞壁肽聚糖二氨基酸组成为内消旋-二氨基庚二酸；DNA的GC含量为37.9mol％。参照伯杰氏系统细菌分类手册第2卷(1986)中的描述基于上述微生物学性质对该菌株进行分类学研究，籍此，推定该菌株为芽孢杆菌属的细菌。
此外，通过相邻连接法(neighbor joining method)，利用芽孢杆菌属微生物的碱基序列并利用其相关菌属的碱基序列为参照序列对16S rRNA的碱基序列进行分子系谱分析。结果如图1所示，通过成簇分析该菌株被分入芽孢杆菌属。因此，鉴定该菌株为属于芽孢杆菌属的细菌，称为芽孢杆菌属的种PV-7株。
芽孢杆菌属的种PV-6株和芽孢杆菌属的种PV-7株已于1997年7月30日保藏于日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305-0046)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所。保藏号分别为FERM BP-6029，FERM BP-6030。
作为用于培养本发明的微生物的培养基，合成培养基或天然培养基均可使用，只要其中含有可被本发明的微生物同化的碳源、氮源、无机盐等，且所述微生物可在其中有效培养。培养基中的碳源的例子包括葡萄糖、果糖、甘油、麦芽糖、淀粉、蔗糖、有机酸如乙酸和柠檬酸以及糖蜜等。
氮源的例子包括氨、无机酸或有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、硝酸铵和磷酸铵、蛋白胨、肉膏提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粉、Pharmamedia、鱼粉、多种发酵的细胞及其消化物。
无机物的例子包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、硫酸铜和碳酸钙。
如需要，可加入如硫胺素和生物素等的维生素、如谷氨酸和天冬氨酸等的氨基酸、如腺嘌呤和鸟嘌呤等的核酸相关物质等。
优选在有氧条件下培养本发明的微生物，例如，通过在通气下振荡培养或搅拌培养。在通气下搅拌培养时，优选加入足够量的消泡剂以防止形成泡沫。一般于20-40℃，优选28-34℃下培养8-120小时。培养期间，培养基的pH保持在6.0-10.0，优选为6.0-7.0。用无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨水等调节pH。
上述微生物、所述微生物的培养物或菌体、其处理产物以及从所述微生物中提取的酶均可用作本发明的酶的来源。处理产物的例子包括用多种方法(如干燥、冷冻干燥、用表面活性剂处理、酶法处理、超声处理、机械研磨和用溶剂处理)处理的菌体，蛋白质分级分离的菌体，固定化菌体和固定化经处理的菌体。
为了将化合物(I-a)或化合物(I-b)转化为化合物(II-a)或化合物(II-b)，可事先在培养微生物的培养基中加入化合物(I-a)或化合物(I-b)；或可在培养过程中加入化合物(I-a)或化合物(I-b)。另外，可将化合物(I-a)或化合物(I-b)经受通过在反应液中培养微生物获得的酶源的作用。
当将化合物(I-a)或化合物(I-b)加入培养微生物的培养基时，以0.1-3mg/ml的量，优选的0.2-1mg/ml的量于培养初始时或培养过程中加入化合物(I-a)或化合物(I-b)。期望在化合物(I-a)或化合物(I-b)溶于水或有机溶剂如甲醇或乙醇后加入培养基。
当将化合物(I-a)或化合物(I-b)经受通过在反应液中培养微生物获得的酶源的处理时，所用的酶的量取决于所述酶源的比活性等。例如，当使用微生物培养物或菌体或其处理物作为酶源时，相对于1mg化合物(I-a)或化合物(I-b)，以5-1000mg/mg，优选10-400mg/mg的量加入酶源。优选在反应液中于20-40℃下，特别是28-34℃进行反应。反应时间取决于所用酶源的比活性和用量等，通常为2-150小时，优选为72-120小时。
反应液可以是水、含水介质、有机溶剂或水(或含水介质)与有机溶剂的混合物。含水介质包括缓冲液，如磷酸盐缓冲液、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-乙烷磺酸)缓冲液和Tris[三(羟甲基)氨基甲烷]盐酸缓冲液。对于有机溶剂，可使用任何不抑制反应的有机溶剂，其例子有丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇和丁醇等。有机溶剂或水(或含水介质)与有机溶剂的混合物优选的用于例如使用化合物(I-b)的情况中。
当化合物(I-a)或化合物(I-b)加入反应液中时，首先将化合物(I-a)或化合物(I-b)溶于可溶化合物(I-a)或化合物(I-b)的水、含水介质、有机溶剂或水(或含水介质)与有机溶剂的混合物中，然后加入反应液。可使用任何不抑制反应的有机溶剂，其例子有丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇和丁醇等。
通过如下述的内酯环开环反应可容易地分别将化合物(I-b)和化合物(II-b)转化为化合物(I-a)和化合物(II-a)。通过如下述的内酯形成反应可容易地分别将化合物(I-a)和化合物(II-a)转化为化合物(I-b)和化合物(II-b)。
例如，可通过将化合物(I-b)或化合物(II-b)溶于含水介质，并向其中加入酸或碱进行内酯环开环反应。含水介质的例子包括水和含有不抑制反应的盐的含水溶液，如磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。所述含水溶液可含有浓度不会抑制反应的有机溶剂如甲醇、乙醇或乙酸乙酯。酸的例子包括乙酸、盐酸和硫酸。碱的例子包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨。
例如，可通过将化合物(I-a)和化合物(II-a)溶于非水溶剂中，并向其中加入酸或碱催化剂进行内酯形成反应。对于非水溶剂，可采用任何基本上不含有水且可溶化合物(I-a)和化合物(II-a)的有机溶剂。溶剂的例子包括二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯等。对于催化剂，可使用催化内酯化反应且不对底物和产物有任何除内酯化反应之外的反应的任何催化剂。催化剂的例子包括三氟乙酸和对甲苯磺酸。对于反应温度无特定限制，但是反应优选在0-100℃，更优选在20-80℃下进行。
本发明中，可通过如下步骤获得化合物(II-a)(1)将化合物(I-a)经受上述酶源的处理；(2)通过上述内酯环开环反应首先将化合物(I-b)转化为化合物(I-a)，然后将化合物(I-a)经受上述酶源的处理；或(3)首先，将化合物(I-b)经受上述酶源的处理形成化合物(II-b)，然后进行上述内酯环开环反应。
类似地，可通过如下步骤获得化合物(II-b)(1)将化合物(I-b)经受上述酶源的处理；(2)通过上述内酯形成反应首先将化合物(I-a)转化为化合物(I-b)，然后将化合物(I-b)经受上述酶源的处理；或(3)首先，将化合物(I-a)经受上述酶源的处理形成化合物(II-a)，然后进行上述内酯形成反应。
可通过有机合成化学中常规使用的方法从反应液中回收化合物(II-a)和化合物(II-b)，如用有机溶剂萃取、结晶、薄层层析和高效液相色谱等。
为了测定由本发明获得的化合物(II-a)和化合物(II-b)，可采用任何能检测或测定化合物(II-a)和化合物(II-b)的方法。例如，可采用13C-NMR谱、1H-NMR谱、质谱和高效液相色谱(HPLC)等。
对于化合物(I-a)、化合物(I-b)、化合物(II-a)和化合物(II-b)可有立体异构体如光学异构体。所有可能的异构体包括这些异构体及其混合物均在本发明的范围之内。
优选的化合物(I-a)为由式(III-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属；R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(III-a)]，更优选的化合物为由通式(V-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属)[以下称为化合物(V-a)]，特别优选的化合物是由通式(VII-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属)[以下称为化合物(VII-a)]。
优选的化合物(I-b)为由式(III-b)表示的化合物
(其中R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(III-b)]，更优选的化合物为由通式(V-b)表示的化合物
，特别优选的化合物是由通式(VII-b)表示的化合物
。
优选的化合物(II-a)为由式(IV-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属；R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(IV-a)]，更优选的化合物为由通式(VI-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属)[以下称为化合物(IV-a)]，特别优选的化合物是由通式(VIII-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属)[以下称为化合物(VIII-a)]。
优选的化合物(II-b)为由式(IV-b)表示的化合物
(其中R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(IV-b)]，更优选的化合物为由通式(VI-b)表示的化合物
，特别优选的化合物是由通式(VIII-b)表示的化合物
。
附图简要描述图1.显示基于16S rRNA碱基序列，通过相邻连接法对芽孢杆菌属的种PV6株和芽孢杆菌属的种PV7株的分子谱系分析结果。
本发明的实施例如下。实施本发明的最佳方式实施例1100mg化合物(VII-B)(Sigma公司)溶于9.5ml的甲醇中，向其中加入0.5ml的1N氢氧化钠，然后室温下振荡1小时。所得混合物浓缩至干燥，加入5ml去离子水。通过加入约0.1ml的1N盐酸将所得溶液调至pH6.5-7.5，向其中加入4.9ml的去离子水得到10ml化合物(VII-a-1)的溶液[其中R1为钠的化合物(VII-a)]，终浓度为10mg/ml。
侧孢芽孢杆菌ATCC 4517、栗褐芽孢杆菌ATCC14574、短芽孢杆菌NRRL B-8029、芽孢杆菌属PV-6和芽孢杆菌属PV-7各一种涂布在琼脂培养基上[1％蛋白胨(极东制药工业)，0.7％肉膏提取物(极东制药工业)，0.3％NaCl(Nacalai Tesque公司)和2％bacto琼脂(DifcoLaboratories Inc.)；用1N氢氧化钠调至pH7.2]，30℃培养24小时。各种生长于琼脂培养基上的菌株取一环接种至含有3ml C培养基的A-spitz管中，C培养基中含有2％葡萄糖(Nacalai Tesque，Inc.)，1％肉膏提取物(极东制药工业)，1％酵母提取物(东方酵母有限公司)和0.1％蛋白胨(极东制药工业)，调整pH至7.5，随后于30℃振荡培养24小时。然后，将所得培养物0.06ml接种入15ml的A-spitz管中(16.5×115mm，Iuchi Weieido)，其中含有3ml已调至pH7.5的C培养基。然后30℃振荡培养。培养开始后24小时，将上述化合物(VII-a-1)加至A-spitz管中，终浓度为0.2mg/ml。加入化合物(VII-a-1)后第24和72小时分别向培养液中加入终浓度为1％的葡萄糖。反应总共进行120小时。
反应结束后，用乙酸(Nacalai Tesque，Inc.)调整反应混合物至pH4。向1ml所得混合物中加入2ml乙酸乙酯(Nacalai Tesque，Inc.)，随后振荡1小时。接着用离心机(日立工机，05P-21)3000转/分离心5分钟，获得乙酸乙酯层为上清液。利用离心蒸发器(Tommy精工，CC-101)从上清液中除去溶剂后，残余物溶于1ml甲醇中。部分甲醇溶液经HPLC分析(柱Inertsil ODS-2(5μm，4×250mm，GL Sciences)，柱温60℃，流动相乙腈∶水∶磷酸＝55∶45∶0.05，流速0.9ml/分钟，检测波长237nm)。结果，由保留时间证实形成了化合物(VIII-a-1)[其中R1为钠的化合物(VIII-a)]。在上述条件下，化合物(VII-a)的保留时间为2.36分钟，而化合物(VIII-a-1)为6.51分钟。在实验中所用的所有菌株均观察到相应于化合物(VIII-a-1)的峰。例如，用短芽孢杆菌NRRL B-8029获得的反应产物的峰出现在2.36分钟和6.47分钟。
用下列菌株获得的化合物(VIII-a-1)的量分别为侧孢芽孢杆菌ATCC 4517，16.8mg/l；栗褐芽孢杆菌ATCC14574，10.3mg/l；短芽孢杆菌NRRL B-8029，1.4mg/l；芽孢杆菌属PV-6，7.3mg/l；和芽孢杆菌属PV-7，42.0mg/l。实施例2芽孢杆菌属PV-7涂布在与实施例1所用的相同琼脂培养基上，30℃培养24小时。生长于琼脂培养基上的菌株取一环接种至各含有3mlC培养基(已调整pH至7.5)的两只15ml A-spitz管中(16.5×115mm，井内盛荣堂)，随后于30℃振荡培养24小时。然后，将所得培养物0.06ml接种入60只15ml的A-spitz管中，其中每只中含有已调至pH7.5的C培养基3ml。然后30℃振荡培养。培养开始后24小时，以与实施例1中相同的方式将化合物(VII-a-1)加至每一管中，终浓度为0.4mg/ml。培养开始后第24和第72小时分别向培养液中加入终浓度为1％的葡萄糖。培养总共进行120小时。培养结束后，4℃下将培养物3000转/分离心10分钟分离上清液。用乙酸将所得上清液调至pH4.0，加入360ml乙酸乙酯层，随后30℃振荡1小时。静置所得混合物，分离上清液。向所得上清液中加入90ml去离子水，30℃振荡30分钟。再次得到上清液，向其中加入90ml氯化钠饱和水溶液。30℃振荡30分钟后分离上清液。
向所得上清液中加入4.5克无水硫酸钠，所得混合物室温下静置15分钟，脱水，减压下浓缩至干燥。残余物溶于5ml去离子水中，用氢氧化钠调节所得溶液至pH9.0，然后通过HP-20柱(100ml，35×100mm，三菱化学公司)。用300ml去离子水洗柱后，用120ml 45％的丙酮水溶液进行洗脱。分级收集洗脱液，并经HPLC分析[分析柱InertsilODS-2(5μm，4×250mm，GL Sciences)，柱温60℃，流动相乙腈∶水∶磷酸＝55∶45∶0.05，流速0.9ml/分钟，检测波长237nm]，收集含有化合物(VIII-a-1)的级分。减压下除去乙腈后，用乙酸调整级分至pH4.0，向其中加入360ml乙酸乙酯，随后30℃振荡1小时。静置所得混合物，分离上清液。向所得上清液中加入90ml去离子水，30℃振荡30分钟。再次得到上清液，向其中加入90ml饱和氯化钠水溶液。30℃振荡30分钟后分离上清液。
向所得上清液中加入4.5克无水硫酸钠，所得混合物室温下静置15分钟，脱水，减压下浓缩至干燥。残余物溶于二氯甲烷中，加入1％三氟乙酸用于内酯化。反应混合物用制备型HPLC纯化[柱DevelosilODS-HG-5(20×250mm，野村化学)，柱温40℃，溶剂55％甲醇，流速20ml/分钟，检测波长237nm]，得到5.1mg化合物(VIII-b)。
获得的化合物(VIII-b)的质谱和1H-NMR谱结果如下。质谱用质谱仪(JEOL有限公司，JMS-HX/HX110A)进行测量，且使用m-硝基苄基醇为阳性模式中的基质。结果，在m/z 407处观察到假分子离子峰([M+H]+)，这与由化合物(VIII-b)的分子量(406)和结构预期的值相一致。1H-NMR谱用波谱仪(JEOL有限公司，JNM-α400)并在400MHz于氘代氯仿中使用TMS作为内标进行测量。结果如下。所得谱数据与化合物(VIII-b)的已知值一致[三共研究所年报，37，147(1985)]。
δppm(CDCl3)6.01(1H，d，J＝9.5Hz)，5.89(1H，dd，J＝9.5，5.9Hz)，5.58(1H，m)，5.41(1H，m)，4.60(1H，dddd，J＝10.6，7.3，5.4，2.8Hz)，4.40(1H，m)，4.38(1H，m)，2.74(1H，dd，J＝17.6，5.1Hz)，2.61(1H，ddd，J＝17.6，3.7，1.5Hz)，2.59(1H，dddd，J＝13.1，6.0，4.8，1.5Hz)，2.40(1H，m)，2.36(1H，m)，2.34(1H，m)，1.95(1H，dddd，J＝14.4，3.7，2.9，1.7Hz)，1.86(1H，dddd，J＝12.5，12.3，7.3，4.3Hz)，1.69(1H，m)，1.68(1H，m)，1.64(1H，m).1.57(1H，m)，1.5～1.4(2H，m)，1.43(1H，m)，1.30(1H，m)，1.12(3H，d，J＝6.8Hz)，0.91(3H，d，J＝7.1Hz)，0.89(3H，t，J＝7.4Hz)实施例3用如实施例1的方法获得化合物(VII-a-1)[其中R1为钠的化合物(VII-a)]。
蜂房芽孢杆菌ATCC 6344、环状芽孢杆菌NTCT-2610、浸麻芽孢杆菌NCIB-9368、巨大芽孢杆菌ATCC 10778、巨大芽孢杆菌ATCC 11562、巨大芽孢杆菌ATCC 13402、巨大芽孢杆菌ATCC 15177、巨大芽孢杆菌15450、巨大芽孢杆菌ATCC 19213、巨大芽孢杆菌IAM1032、短小芽孢杆菌FERM BP-2064和枯草芽孢杆菌ATCC 6051各一种涂布在琼脂培养基上[1％蛋白胨(极东制药工业)，0.7％肉膏提取物(Kyokuto药物工业有限公司)，0.3％NaCl(Nacalai Tesque公司)和2％bacto琼脂(Difco Laboratories Inc.)；用1N氢氧化钠调至pH7.2]，30℃培养24小时。各种生长于琼脂培养基上的菌株取一环接种至含有3mlLBG培养基的试管(13×165mm)中，LBG培养基中含有2％葡萄糖(NacalaiTesque，Inc.)，1％细菌胰蛋白胨(Difco Laboratories.Inc.)，0.5％酵母提取物(Difco Laboratories Inc.)和0.5％NaCl(Nacalai Tesque公司)，调整pH至7.4，随后于30℃振荡培养24小时。然后，将所得培养物0.2ml接种入含有10ml LBGCa培养基的试管(21×200mm)中，LBGCa培养基中含有2％葡萄糖(Nacalai Tesque，Inc.)，1％细菌胰蛋白胨(Difco Laboratories Inc.)，0.5％酵母提取物(DifcoLaboratories Inc.)和0.5％NaCl(Nacalai Tesque公司)，以及0.5％碳酸钙(国产化学)，调整pH至7.4。然后30℃振荡培养。培养开始后24小时，将1ml培养液加入13ml的聚丙烯管中(SARSTEDT有限公司，由Asist有限公司进口，编号60 540S)，将化合物(VII-a-1)和葡萄糖加至管中，终浓度分别为0.2mg/ml和1％，然后反应48小时。
反应结束后，用乙酸(Nacalai Tesque，Inc.)调整反应混合物至pH4。向1ml所得混合物中加入2ml乙酸乙酯(Nacalai Tesque，Inc.)，随后振荡1小时。接着用离心机(日立工机，05P-21)3000转/分离心5分钟，获得乙酸乙酯层为上清液。利用离心蒸发器(Tommy精工，CC-101)从上清液中除去溶剂后，残余物溶于1ml甲醇中。部分甲醇溶液经HPLC分析(柱Inertsil ODS-2(5μm，4×250mm，GL Sciences)，柱温60℃，流动相乙腈∶水∶磷酸＝55∶45∶0.05，流速0.9ml/分钟，检测波长237nm)。结果，由保留时间证实形成了化合物(VIII-a-1)[其中R1为钠的化合物(VIII-a-1)]。
用下列菌株获得的化合物(VIII-a-1)的量分别为蜂房芽孢杆菌ATCC 6344，0.18mg/l；环状芽孢杆菌NTCT-2610，0.18mg/l；浸麻芽孢杆菌NCIB-9368，0.32mg/l；巨大芽孢杆菌ATCC 10778，8.4mg/l；巨大芽孢杆菌ATCC 11562，0.31mg/l；巨大芽孢杆菌ATCC 13402，1.30mg/l；巨大芽孢杆菌ATCC 15177，1.60mg/l；巨大芽孢杆菌15450，0.58mg/l；巨大芽孢杆菌ATCC 19213，0.16mg/l；巨大芽孢杆菌IAM1032，9.20mg/l；短小芽孢杆菌FERM BP-2064，0.17mg/l；和枯草芽孢杆菌ATCC 6051，1.11mg/l。实施例4侧孢芽孢杆菌ATCC4517涂布在与实施例1所用的相同琼脂培养基上，30℃培养24小时。生长于琼脂培养基上的菌株取一环接种至各含有3mlC培养基(已调整pH至7.5)的两只15ml A-spitz管中(16.5×115mm，井内盛荣堂)，随后于30℃振荡培养24小时。然后，将所得培养物0.06ml接种入60只15ml的A-spitz管中，其中每只中含有已调至pH7.5的C培养基3ml。然后30℃振荡培养。培养开始后24小时，以与实施例1中相同的方式将化合物(VII-a-1)加至每一管中，终浓度为0.4mg/ml。培养开始后第24和第72小时分别向培养液中加入终浓度为1％的葡萄糖。振荡培养总共进行120小时。培养结束后，4℃下将培养物3000转/分离心10分钟。用1N盐酸将所得上清液调至pH3.0，加入360ml乙酸乙酯，随后混合物30℃振荡1小时。静置所得混合物，分离上清液。这一步骤重复3次。向所得上清液中加入90ml去离子水，随后振荡。再次得到上清液，向其中加入90ml饱和氯化钠水溶液。振荡后分离上清液。
向所得上清液中加入4.5克无水硫酸钠，混合物室温下静置15分钟，脱水，减压下浓缩至干燥。残余物溶于5ml去离子水中，用氢氧化钠调节所得溶液至pH9.0，然后通过HP-20柱(50ml，20×100mm，三菱化学公司)。用150ml去离子水洗柱后，用分别为20％、30％和40％的丙酮水溶液各100ml进行洗脱。分级收集洗脱液，并经HPLC分析[分析柱Inertsil ODS-2(5μm，4×250mm，GL Sciences)，柱温60℃，流动相乙腈∶水∶磷酸＝55∶45∶0.05，流速0.9ml/分钟，检测波长237mm]，基于保留时间收集含有化合物(VIII-a-1)的级分。减压下除去乙腈后，用1N盐酸调整级分至pH3.0，向其中加入360ml乙酸乙酯，随后振荡。静置所得混合物，分离上清液。向所得上清液中加入90ml去离子水，然后振荡。再次得到上清液，向其中加入90ml饱和氯化钠水溶液。振荡后分离上清液。
向所得上清液中加入4.5克无水硫酸钠，所得混合物室温下静置15分钟，脱水，减压下浓缩至干燥。残余物溶于二氯甲烷中，加入1％三氟乙酸用于内酯化作用。反应混合物用制备型TLC纯化[硅胶板编号1.05744(200×200mm，0.5mm厚)，MERCK有限公司，展开剂乙酸乙酯，显色剂12.55磷钼酸和1％硫酸铈/硫酸溶液]，得到0.8mg化合物(VIII-b)。获得的化合物(VIII-b)的质谱分析和1H-NMR分析结果如下。质谱用质谱仪(JEOL有限公司，JMS-HX/HX110A)进行测量，且使用m-硝基苄基醇为阳性模式中的基质。结果，在m/z 407处观察到假分子离子峰([M+H]+)，这与由化合物(VIII-b)的分子量(406)和结构预期的值相一致。
此外，用高分辨率FAB MS测定，在m/z 407.2440处观察到假分子离子峰([M+H]+)与由该化合物的分子式(C23H34O6)预期的计算值(m/z 407.2440C23H34O6)在允许的测量误差范围内相一致。1H-NMR谱用核磁共振波谱仪(JEOL有限公司，JNM-LA300)并在300MHz于氘代氯仿中使用氯仿(δ7.26ppm)作为内标进行测量。结果如下。所得谱数据于化合物(VIII-b)的已知值一致[三共研究所年报，37，147(1985)]。
δppm(CDCl3)6.00(1H，d，J＝9.7Hz)，5.90(1H.dd，J＝9.7，5.7Hz).5.58(1H，m)，5.41(1H，m)，4.61(1H，dddd，J＝10.9，7.8，5.1，2.9Hz)，4.45-4.35(1H，m)，4.38(1H，dq，J＝5.0，3.9Hz)，2.73(1H，dd，J＝17.6，5.0Hz)，2.62(1H，ddd，J＝17.6，3.9，1.7Hz)，2.59(1H，dddd，J＝13.5，6.6，4.8，1.6Hz)，2.45-2.35(1H，m)，2.36(1H，sex，J＝6.9Hz)，2.40-2.30(1H，m)，1.95(1H，dddd，J＝14.4，3.9，2.9，1.7Hz)，1.90-1.80(1H，m)，1.75-1.60(1H，m)，1.68(1H，ddd，J＝14.4，10.9，3.9Hz)，1.65(1H，dqu，J＝13.6，7.5Hz)，1.65-1.50(1H，m)，1.43(1H，dqu，J＝13.6，7Hz)，1.50-1.35(2H，m)，1.35-1.25(1H，m)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz)，0.91(3H，d，J＝7.0Hz)，0.89(3H，t，J＝7.4Hz)工业应用本发明提供了一种用于制备抑制HMG-CoA还原酶和具有降低血清胆固醇水平等活性的化合物的有效方法。
权利要求
1.一种用于制备由通式(II-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属；R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(II-a)]或由通式(II-b)表示的化合物(II-a)的内酯形式
(其中R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(II-b)]的方法，其特征在于将由通式(I-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属；R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(I-a)]或由通式(I-b)表示的化合物(I-a)的内酯形式
(其中R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(I-b)]在反应液中经一种酶源作用，该酶来源于芽孢杆菌属的微生物且能将化合物(I-a)或化合物(I-b)转化为化合物(II-a)或化合物(II-b)，从而在反应混合物中形成化合物(II-a)或化合物(II-b)；且从反应混合物中回收化合物(II-a)或化合物(II-b)。
2.根据权利要求1的方法，其中化合物(I-a)为由式(III-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属；R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(III-a)]，化合物(I-b)为由式(III-b)表示的化合物
(其中R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(III-b)]，化合物(II-a)为由式(IV-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属；R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(IV-a)]，且化合物(II-b)为由式(IV-b)表示的化合物
(其中R2代表取代或未取代的烷基或芳基)[以下称为化合物(IV-b)]。
3.根据权利要求1的方法，其中化合物(I-a)为由通式(V-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属)[以下称为化合物(V-a)]，化合物(I-b)为由通式(V-b)表示的化合物
[以下称为化合物(V-b)]，化合物(II-a)是由通式(VI-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属)[以下称为化合物(VI-a)]，化合物(II-b)是由通式(VI-b)表示的化合物
[以下称为化合物(VII-b)]。
4.根据权利要求1的方法，其中化合物(I-a)为由通式(VII-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属)[以下称为化合物(VII-a)]，化合物(I-b)为由通式(VII-b)表示的化合物
[以下称为化合物(VII-b)]，化合物(II-a)是由通式(VIII-a)表示的化合物
(其中R1代表氢原子，取代或未取代的烷基，或碱金属)[以下称为化合物(VIII-a)]，化合物(II-b)是由通式(VIII-b)表示的化合物
[以下称为化合物(VIII-b)]。
5.根据权利要求1的方法，其中所述酶源是具有将化合物(I-a)或化合物(I-b)转化为化合物(II-a)或化合物(II-b)的活性的微生物、所述微生物的菌体或培养物、其处理物以及从所述微生物中提取的酶。
6.根据权利要求2的方法，其中所述酶源是具有将化合物(III-a)或化合物(III-b)转化为化合物(IV-a)或化合物(IV-b)的活性的微生物、所述微生物的菌体或培养物、其处理物以及从所述微生物中提取的酶。
7.根据权利要求3的方法，其中所述酶源是具有将化合物(V-a)或化合物(V-b)转化为化合物(VI-a)或化合物(VI-b)的活性的微生物、所述微生物的菌体或培养物、其处理物以及从所述微生物中提取的酶。
8.根据权利要求4的方法，其中所述酶源是具有将化合物(VII-a)或化合物(VII-b)转化为化合物(VIII-a)或化合物(VIII-b)的活性的微生物、所述微生物的菌体或培养物、其处理物以及从所述微生物中提取的酶。
9.根据权利要求1、2、3或4的方法，其中所述微生物属于侧孢芽孢杆菌、栗褐芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜂房芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
10.根据权利要求1、2、3或4的方法，其中所述属于芽孢杆菌属微生物，为侧孢芽孢杆菌ATCC 4517、栗褐芽孢杆菌ATCC14574、短芽孢杆菌NRRL B-8029、蜂房芽孢杆菌ATCC 6344、环状芽孢杆菌NTCT-2610、浸麻芽孢杆菌NCIB-9368、巨大芽孢杆菌ATCC10778、巨大芽孢杆菌ATCC11562、巨大芽孢杆菌ATCC 13402、巨大芽孢杆菌ATCC15177、巨大芽孢杆菌ATCC 15450、巨大芽孢杆菌ATCC 19213、巨大芽孢杆菌IAM 1032、短小芽孢杆菌FERM BP-2064或枯草芽孢杆菌ATCC6051。
11.根据权利要求1、2、3或4的方法，其中所述属于芽孢杆菌属微生物，为芽孢杆菌属的种PV-6株(FERM BP-6029)或芽孢杆菌属的种PV-7株(FERM BP-6030)。
12.芽孢杆菌属的种PV-6株(FERM BP-6029)。
13.芽孢杆菌属的种PV-7株(FERM BP-6030)。
全文摘要
公开了一种用于制备由通式(Ⅱ－a)表示的化合物(其中R
文档编号C12P7/62GK1265705SQ98807900
公开日2000年9月6日 申请日期1998年7月30日 优先权日1997年8月7日
发明者高野裕, 长谷川胜, 森英郎, 安藤胜彦, 落合惠子, 本山裕章, 尾崎明夫 申请人:协和发酵工业株式会社