具有视黄醇脱氢酶活性并与视黄醇结合蛋白受体相关的分离的蛋白的制作方法

专利名称：具有视黄醇脱氢酶活性并与视黄醇结合蛋白受体相关的分离的蛋白的制作方法
相关申请本申请是申请日为1996年10月11日的系列号08/729,594的部分继续申请，而08/729,594号申请是申请日为1995年11月22日的系列号08/562,114的部分继续申请，而08/562,114号申请是申请日为1995年1月20日的系列号08/375,962的部分继续申请，而08/375,962号申请是申请日为1994年6月10日的系列号08/258,418的部分继续申请。所有这些申请在此提及供参考。
本发明的领域本发明涉及具有视黄醇脱氢酶活性，诸如9-顺式、11-顺式或13顺式视黄醇脱氢酶活性、或者反式视黄醇脱氢酶活性的蛋白，它与在例如视网膜色素上皮(RPE)中表达的原生质视黄醇结合蛋白(RBP)的膜受体的特异部分形成复合物。更具体地，本发明涉及具有顺式视黄醇脱氢酶活性，诸如9-顺式或11-顺式视黄醇脱氢酶活性的蛋白，它与RBP结合膜蛋白如RPE细胞中发现的63kDa RBP结合膜蛋白形成复合物。本发明还涉及这些蛋白的分离，以及编码p32的核酸分子或者该编码序列的互补链，还涉及这些材料的各种应用。
本发明的背景类维生素A(维生素A的衍生物)在各种生物过程中具有着重要的生理功能。在胚胎生长和发育中，以及在成年组织的生长和分化中，类维生素A作为激素参与调节多种细胞类型中的基因表达。参见Lied等，遗传学趋势，17427-433(1992)。据信，这些作用是通过两类核配体调控的转录因子介导的视黄酸受体(RARs)和类维生素AX受体(RXRs)，Benbrook等，自然，333669-672(1988)；Brand等，自然，332850-853(1988)；Giguere等，自然，345224-229(1990)；Mangelsdorf等，基因发育，6329-344(1992)；Petkovich等，自然330440-450(1987)；和Zelent等，自然339714-717(1989)。
除了在细胞生长和分化中的激素功能，类维生素A还涉及视觉过程，以视黄醛的立体异构体11-顺式视黄醛作为视色素的载色体。见，例如，Bridges，类维生素A，第2卷，125-176页，Academic Press，Orlando，Florida，(1984)。
在正常的生理条件下，大多数的细胞，包括视觉细胞和非视觉细胞，获取全反式视黄醇作为其类维生素A主要的来源。尽管在不同的组织中发生不同的代谢事件，但已经知道的是具有一个普遍的细胞外视黄醇的转运机制。特别是，在胞浆内，视黄醇通过原生质视黄醇结合蛋白(RBP)来转运。见Goodman等，类维生素A，第2卷，41-88页，Academic Press，Orlando，Florida，(1984)。活化的视黄醇的衍生物，例如，非视觉组织中的视黄酸和大多数视觉组织中的11-顺式视黄醛再以特殊的机制通过细胞转换而产生。迄今为止，任何此类机制都没能完全在分子水平上得到确定，只是通过酶学活性确定了几种相关的酶。见Lion等，生物化学和生物物理学学报，384283-292(1975)；Zimmermann等，实验眼科研究，21325-332(1976)和Posch等，生物化学，306224-6230(1991)。
极化的视网膜色素上皮细胞(RPE)是唯一涉及类维生素A摄取的细胞，因为全反式视黄醇通过两种不同的机制进入这些细胞中。从RBP中积存的视黄醇通过基底外侧原生质膜吸收，而全反式视黄醇，据推测随着视色素的漂白，从间质视黄醇结合蛋白(IRBP)中被吸收，可以通过顶部原生质膜进入。见Bok等，实验眼科研究，22395-402(1976)；Alder等，生物化学和生物物理研究通讯，1081601-1608(1982)；Lai等，自然，298848-849(1982)；和Inu等，视觉研究，221457-1468(1982)。
视黄醇从RBP到细胞中的转移尚不完全清楚。在一些细胞类型中，包括RPE，已经鉴定出了RBP特异的膜受体，它与受体介导的视黄醇吸收机制相一致。例如，相关于两种机制中的第一种，分离的视黄醇结合蛋白受体，编码这些受体的核酸分子和与这些受体结合的抗体已有报道，见Bavik等，生物化学杂志，26614978-14985(1991)；Bavik等，生物化学杂志，26723035-23042(1992)；Bavik等，生物化学杂志，267205405-20546(1992)；和U.S.申请系列号083,539和国际出版WO 93/23538，各文献在此提及可参考。还可参见，Heller，生物化学杂志，2503613-3619(1975)；和Bok等，实验眼科研究，22395-402(1976)。
从人RPE顶部摄入用于再生11-顺式视黄醛的视黄醇还缺少很好的鉴定。不考虑全反式视黄醇的来源，11-顺式视黄醛的合成和顶部分泌看来是RPE中积存视黄醇的主要途径。目前尚不知道原生质膜的视黄醇从底部和顶部途径的细胞摄入是否具有相似的机制。已有的数据表明，RBP的功能性受体只在RPE细胞的底部原生质膜中表达。Bok等，实验眼科研究，22395-402(1976)。
已知的还有色素RPE，它表达63k Da的蛋白(p63)。该分子量和其他的分子量，除非另有说明，都是根据SDS-PAGE测定的。通过化学交联还显示，该蛋白可能是一个寡聚蛋白复合物的一部分，具有作为RPEs中的原生质视黄醇结合蛋白的膜受体的功能，或者是RPE细胞中类维生素A吸收机制的一种组份。见Bavik等，生物化学杂志，26623035-23042(1992)，和U.S.申请系列号083,539和PCT申请WO 93/23538。p63蛋白已经被分离出，且相应的cDNA也已经被克隆。见Bavik等，生物化学杂志，26720540-20546(1993)。与视黄醇结合蛋白相结合的同源分子已经在其他组织如肝中得到鉴定。但是，这些参考文献中都没有提及具有本发明的特性的蛋白的存在。
本发明的概述根据本发明，公开了具有视黄醇脱氢酶活性的、经SDS-PAGE确定的分子量约30至36kD的蛋白。这些蛋白与RBP膜受体的先前描述的成分，诸如上述的p63分子，形成寡聚蛋白复合物。本发明还公开了编码这些蛋白的核酸分子。序列分析表明这些蛋白属于短链醇脱氢酶家族，并表现出顺式视黄醇脱氢酶活性，如9或11-顺式视黄醇活性，此种酶在辅助因子NAD+的存在下，催化9和/或11-顺式视黄醇向相应的视黄醛的立体特异转化。此外，还公开了其他的短链醇脱氢酶家族的成员，它们具有全反式视黄醇脱氢酶活性。
正如下文中所表现的，这些蛋白具有重要的用途。例如，由于其膜结合视黄醇脱氢酶活性，可以催化顺式视黄醇向顺式视黄醛的转化，这是RPE细胞中类维生素A代谢的一个主要代谢步骤，因而，能够导致无色素沉着的视网膜炎的类维生素A的积存和代谢直接或间接地取决于这些蛋白的存在，和/或这些蛋白的活化或抑制。由于这些蛋白还被发现是短链醇脱氢酶超家族的成员，因而，许多已知的醇脱氢酶抑制剂(和活化剂)都可以用于开发视黄醇吸收和视黄醇代谢的活性试验以及作为诊断材料。
本发明的另一部分是编码该蛋白哺乳动物形式的核酸分子，诸如人、牛、和鼠的形式。本发明的另一部分是基于本文所述的核苷酸序列的探针。
本发明的这些和其他的方面在下文的详细讨论中配合相应的附图有更为完全的讨论。
附图的简要描述

图1A显示了来自RPE膜的放射性标记的蛋白和抗p63的mAbA52的免疫沉淀的SDS-PAGE分析。
图1B显示了来自RPE膜的蛋白通过mAb A52免疫亲和柱的结合和洗脱的SDS-PAGE分析，以及在该免疫亲和柱的洗脱组分中本发明的蛋白的存在。
图2A显示了琼脂糖凝胶电泳上的利用同是来自肽321的OM1和OM3寡核苷酸混合物进行的PCR扩增出的61bp片段，肽321导自胰蛋白酶消化蛋白而得到的部分确定的氨基酸序列。
图2B显示了琼脂糖凝胶电泳上的利用分别来自肽p323和p321的OM2和OM3寡核苷酸混合物进行的PCR扩增出的330bp片段，肽p323和p321分别是胰蛋白酶消化图2B的蛋白而得到的部分确定的氨基酸序列。
图3显示了pλ321的核苷酸序列和图2A和图2B的蛋白导出的氨基酸序列，以及胰蛋白酶消化的蛋白分离出的肽中部分确定的氨基酸序列。
图4显示了该蛋白与属于短链醇脱氢酶家族的一些相关蛋白之间的氨基酸序列的排列比较。
图5显示了对该蛋白的氨基酸序列的分析。
图6显示了体外合成的p32与膜的相互作用。
图7显示了该蛋白的编码DNA的相应的转录产物的限制性表达。
图8A显示了该蛋白在转染细胞中的表达，用以进一步的11-顺式视黄醇脱氢酶活性的酶学活性分析。
图8B显示了在NAD+存在下，以11-顺式视黄醛的形成而表示的11-顺式视黄醇脱氢酶活性的表达。
图8C显示了在辅助因子NADP存在下不具有11-顺式视黄醇脱氢酶活性。
图8D显示了不表达该蛋白而缺少氧化11-顺式视黄醇成为11-顺式视黄醛的能力的对照细胞。
图9显示了人11-顺式视黄醇脱氢酶基因的结构。
优选的实施方案的详细讨论已经知道的是原生质视黄醇结合蛋白(RBP)可以化学交联于视网膜色素上皮膜(RPE)的63kDa蛋白(p63)受体的高分子量复合物，形成RBP-RPE受体复合物，其洗脱特性类似于分子量大约为Mr150,000和450,000大小的球蛋白。见Bavik等，生物化学杂志，26614978-14985(1991)；Bavik等，生物化学杂志，26723035-23042(1992)。只限于在RPE中表达的与RBP结合相关的蛋白，已经鉴定为63kDa的蛋白(p63)。通过产生可以结合RBP-RPE受体复合物和p63的该63kDa的单克隆抗体A52(mAb52)，并进行免疫亲和层析分析，大部分p63以单体形式被洗脱，该蛋白有显著一部分被发现位于相应于较高分子量的位置。这表明p63以与其他蛋白成分形成寡聚蛋白复合物的形式而存在。见Bavik等，生物化学杂志，26614978-14985(1991)；Bavik等，生物化学杂志，26723035-23042(1992)。因此，进行了下列的步骤，研究这类寡聚蛋白的分子特征，以及p63是否与其他的对RPE特异的蛋白形成复合物。结果表明一个32kDa的膜相关蛋白，下文中记作p32，与p63形成复合物。实施例1参照Bavik等，生物化学杂志，26614978-14985(1991)中所述，分离牛RPE细胞并制备膜组份。以1mg总膜蛋白/ml缓冲液的比例，将RPE膜蛋白溶于含有1％的3-[(3-胆氨-丙基-)二甲基氨-]-1-丙烷磺酸(CHAPS)的磷酸盐缓冲液(PBS)(20mM磷酸钠，pH7.2，含有150mM NaCl)中。100,000g超速离心1小时去除残余物质。然后，将500μl的溶解的膜的样品于经含有1％CHAPS的PBS平衡的Sepharose 6柱。柱子的流速为0.2ml/min，组分收集体积为500μl。将相应于球蛋白分子量150,000至450,000的组分洗脱液用Na125I按照周知的氯胺-T程序标记。未掺入的125I在巴斯德管中经SephadexG-25凝胶过滤去除。
放射性标记的蛋白液体然后用含有1％CHAPS和1％的牛血清白蛋白的PBS稀释，再利用针对p63的mAb A52(5μg每次温育)或者利用两个针对p63的多克隆兔抗血清(3μg血清每次温育)，见Bavik等，生物化学杂志，26723035-23042(1992)，进行免疫沉淀。利用非相关的mAb和免疫前的兔血清进行的平行温育来监测非特异的免疫沉淀。将50μl 50％的蛋白A-Sepharose液体加入到温育物中温育30分钟。然后，按照Blobel等，细胞生物学杂志，67835-851(1975)所述，用含有1％CHAPS的PBS小心洗涤，洗脱物备用于SDS-PAGE分析。
参看图1A，SDS-PAGE凝胶的放射性自显影显示了两种试剂均与p63的反应，其中非相关的mAb和免疫前的兔血清不沉淀p63。在含有免疫沉淀的p63的各泳道中，富含Mr32,000的蛋白。由于针对p63的mAb A52和兔抗血清都对p63高度特异(见，例如，Bavik等，生物化学杂志，26723035-23042(1992))，因此，可以得出结论，Mr32,000的蛋白(p32)在上述的分析中通过与p63结合而共沉淀。该分析还鉴定出一个Mr50,000-52,000的双带与p32和p63一起沉淀。实施例2然后进行了鉴定p32的实验。可以利用上述的p32与p63特异反应的性质。因此，将去污剂溶解的RPE膜蛋白通过含有mAb A52的亲和层析柱。参看图1B，b道，结合的蛋白在高pH被含有CHAPS的缓冲液洗脱，洗脱组分的SDS-PAGE分析和考马斯染色表明p63在该免疫亲合柱上被特异保留并洗脱下来。进而，可以看到从A52柱洗脱液中的相应于p32的弱染色带。如图1B所示，对溶解的RPE膜和从A52柱洗脱组分蛋白曲线的比较表明，p32未能充分在上面保留。但是，在A52柱洗脱组分中存在p32，而在含有非相关Ig的柱子的洗脱组分中不存在p32，这表明了p32与p63的特异性反应。该结果与前面的免疫沉淀的数据相一致，表明p32与p63相复合，由于复合物的形成而被保留在免疫亲和柱上。
鉴定出p32作为在RPE膜中与p63相复合的一种成分之后，p32蛋白本身通过溶解的RPE膜经A52免疫亲和柱，洗脱组分进行SDS-PAGE而得到分离，如实施例3中所述。实施例3将RPE膜溶解于上述的含有1％CHAPS的PBS中，然后与Bio-Rad的poly prep柱的结合于CNBr活化的Sepharose 4B珠(Pharmacia)的mAb A52 Ig于4℃循环温育。2小时温育后，沉降珠，用5个柱体积的含有1％CHAPS的PBS快速洗涤柱子。然后用50mM含有1％CHAPS的三乙醇胺缓冲液(pH11.2)洗脱结合的蛋白。洗脱液的pH用含有1％CHAPS的1M Tris-HCl缓冲液快速调节至8.0。将洗脱组分用于SDS-PAGE，分离的蛋白通过考马斯兰染色来观察。发现了相应于p32的条带(SDS-PAGE，32kDa)。
为了确定p32部分氨基酸序列的一级结构，先将上述的考马斯染色的相应于大约2-5μg 32kDa蛋白的条带切割出，然后冷冻干燥凝胶块，对分离的蛋白进行分析。在含有修饰的胰蛋白酶的缓冲液中重新水化并温育，产生各种肽以抽提和分析。优选的程序如下列的实施例4中所述。实施例4将含有实施例2中的p32蛋白考马斯染色条带切下，按照Rosenfeld等，分析生物化学，15173-179(1992)所述并稍加修改进行处理。凝胶块用100μl含有50％乙腈的0.2M重碳酸铵缓冲液于30℃洗涤两次，每次30分钟。然后在氮气下完全干燥。将凝胶块用5μl含有0.02％Tween20和0.5μg的修饰的胰蛋白酶的0.2M重碳酸铵缓冲液重新水化。胰蛋白酶从在1mM HCl中制备的母液中加入。加入5μl的0.2M重碳酸铵缓冲液继续重新水化直到凝胶块水化为原来的大小。然后将重新水化的凝胶块于30℃温育过夜。加入三氟乙酸(TFA)至终浓度1％来抑制蛋白酶的活性。回收上清并与150μl的两种含0.1％TFA的60％乙腈制备的抽提物相结合。减少有机相并将消化物在SMART系统上上样于反相mRPC C2/C18 SC2.1/10柱子，进行HPLC。样品用含有0.065％TFA的乙腈梯度洗脱，通过自动峰收集选项收集含有不连续的肽的组份。选出5种鉴定的肽通过配备有120A型PTH分析仪的ABI 470A测序仪(AppliedBiosystems Inc.Foster City，CA)进行氨基酸序列分析。结果如下列的表1所示。
表1从胰蛋白酶消化的p32中分离的5种肽的氨基酸序列P321L-V-E-A-V-L-A-E-V-L-P-K-P-A-Q-T-V-A(SEQ ID NO1)(D)a(W) (Y)P322Y-S-P-G-W-D-A-K(SEQ ID NO2)P323T-P-V-T-N-L-E-T-L-E-D-T-L-Q-A(SEQ ID NO3)P324D-V-A-P-F-G-V(SEQ ID NO4)P325L-H-T-T-L-L-D-V-T-D-P-Q-S-I(SEQ ID NO5)a)圆括号中给出的氨基酸残基是从相同位置的cDNA序列所推导出的残基。
蛋白SEQ ID NOS1-5可以单独使用或者通过周知的方法联合半抗原使用。
接着，为了确定p32的完整的一级结构，根据表1中p321和p323测序的肽的氨基酸序列，合成了4种简并性寡核苷酸混合物，OM1-OM4，如下列表2中所示。该步骤如实施例5所述。实施例5通过周知的技术合成了衍生自肽p321和p323的4种简并性寡核苷酸混合物。两个有义混合物(OM1和OM3)衍生自p321的1-5位和p323的2-6位N末端氨基酸。反义混合物(OM2和OM4)衍生自p321的12-17位和p323的10-15位的氨基酸。所有的核苷酸混合物都合成带有4bp的5’延伸部分以及一个EcoRI位点以利于进一步的PCR产物的克隆。寡核苷酸混合物的序列如下列表2所示，EcoRI位点以下划线标出。含有所有4种碱基的位点用N标记。
表2OM1ACGTGAATTCTN GTN GA(A，G)GCN GT(SEQ ID NO6)OM2ACGTGAATTCAC NGT(T，C)TG NGC NGG(T，C)TT(SEQ ID NO7)OM3ACGTGAATTCCCN GTN ACN AA(T，C)(C，T)T(SEQ ID NO8)OM4ACGTGAATTCGC(T，C)TG NA(A，G)NGT(A，G)TC(T，C)TC(SEQ IDNO9)通过标准的程序，将来自反转录RPE mRNA的单链“互补”cDNA和上述的简并核苷酸混合物的4种组合用于多聚酶链反应(PCR)。扩增步骤之后，将PCR反应产物的样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。该步骤如下列实施例6所述。实施例6为了进行PCR扩增，利用鸟骨髓瘤病毒反转录酶经标准程序合成第一条链cDNA。利用来自分离的RPE细胞的20μg的总RNA，以寡聚(dT)15为引物进行反应。将相当于2μg总RNA的溶液用于接下来的每个PCR反应中。在100μl的反应体积内用终浓度为0.5μM的寡核苷酸混合物进行PCR反应。使用Taq多聚酶。经过30个循环(95℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟)，将反应液在含有5μg/ml的溴化乙锭的4％GTG琼脂糖凝胶上分析。
如图2A所示，利用同是衍生自肽p321的寡核苷酸混合物OM1和OM2的扩增获得了61bp的扩增片段。利用混合物OM3-OM4和OM1-OM4的扩增无法产生任何产物。最后，如图2B所示，利用混合物OM3-OM2的扩增获得了330bp的片段。
随后对61bp和330bp片段的序列分析确定扩增出的cDNA序列相应于前面氨基酸序列分析产生的肽。由扩增的PCR片段推导的氨基酸序列与肽p321产生的氨基酸序列之间的差别表明，获得了适合于分离编码p32的全长的cDNA克隆的特异探针。
为了分离全长的cDNA克隆，用330bp片段作为探针对RPE特异的λZAP-IIcDNA文库进行筛选。从大约200000个克隆中分离出5个独立的λ克隆，并通过体内缺失将其进行亚克隆。cDNA克隆pλ321含有最长的插入，(大约1.1kb)，选其用于进一步的研究。
除了用于制备文库连接位点之外，带有1104bp长度插入的pλ321的双链进行了全部测序，该步骤如下列的实施例7所述。实施例7将利用OM1-OM2(61bp)和OM3-OM2(330bp)的扩增产物以EcoRI消化，凝胶纯化并克隆入经EcoRI酶切的pBS载体上。用32P标记的330bp片段筛选RPE特异的λZAP-IIcDNA文库，如Bavik等，生物化学杂志，26720540-20546(1993)中所述，在此提及可参考。分离出5个阳性λ克隆，并按照制备商的说明通过体内缺失将插入子亚克隆入pBluscript中。克隆pλ321含有1.1kb的插入，利用T3，T7或通用引物或内部引物对双链以Sequenase进行了完全测序。
pλ321的核苷酸序列和推导的p32氨基酸序列如图3所示(SEQID NO10)。左侧为核苷酸的计数，右侧为氨基酸残基的计数。氨基酸1是起始甲硫氨酸(Met)。
如图3所示，1.1kbp的插入含有一个长的开放阅读框，编码318个氨基酸残基，其计算出的分子量为35,041D。第一个甲硫氨酸残基按照Kozak标准处于转录起始的序列位置，而看来是起始密码。见Kozak，细胞，44283-292(1986)。对此项推论的映证是，体外翻译pλ321转录合成的mRNA而产生一个Mr32,000的蛋白(SDS-PAGE分析)所，如下所述，而在上游的35bp的5’非翻译区中的同阅读框中不存在终止密码。还如图3所示，100bp的3’非翻译区以一个推定的多聚腺苷串结尾，而且在上游序列中鉴定出一个polyA信号(bp 1104-1110)。
推导的pλ321的氨基酸序列和这5个所得的胰蛋白酶肽的氨基酸序列(表1)在62个可比较的残基中只有3个不同。这3个不同都发现在p321中，而第二个cDNA克隆(pλ324)的该区域的核苷酸序列与pλ321的是相同的。这表明肽p321的氨基酸序列确定可能有误，虽然也不能排除该差异是由于p32不同的等位基因的存在。这些数据表明pλ321含有完整的p32的编码区。
再有，参看图3，在推导的氨基酸序列的第160-162位点，可以发现N-连接的糖基化(氨基酸残基N-I-T)的共有位点。
此外，还可以发现，p32表现出与短链醇脱氢酶的序列相似性。参看图4，从Swissprot蛋白数据库中的搜索表明p32与几种以前被测序的蛋白结构相关。它与一个线粒体基质脱氢酶，D-β-羟基丁酸脱氢酶(BDH)，Churchill等，生物化学，313793-3799(1992)，相关性最为接近，而与另外两种蛋白，来自大肠杆菌的3-氧酰[酰基载体蛋白]还原酶(Rawlings等，生物化学杂志，2675751-5754(1992)和人雌二醇-17-β-脱氢酶(Peltoketo等，FEBS通信，23973-77(1988)和Leu等，分子内分泌学，31301-1309(1989))相关性较小但很显著。所有这些相关蛋白都是短链醇脱氢酶超家族的成员。该蛋白超家族含有大约50个不同的蛋白(Persson等，欧洲生物化学杂志，200537-593(1991))。p32与BDH的全序列同源性大约39％。与大肠杆菌还原酶和雌二醇-17-β-脱氢酶的同源性水平较低(分别为31％和33％)。
优化多重排列比较鉴定出p32和最为接近的相关蛋白所共有的几个保守区域(表4中的方框部分)。第一个区域涉及第63-69位残基(按图4中的计数)，该保守性基序G-X-X-X-G-X-G据信是辅助因子NAD，NADP或其还原形式的结合位点。另一个保守区域发现于第148-153位残基间(共有序列为L-V-N-N-A-G)，但该基序还未有功能性特征与之联系起来。基序Y-X-X-X-K，被认为失活性位点，是短链醇脱氢酶中最为高度保守的基序，它存在于p32的第175-179位残基，见Persson等，欧洲生物化学杂志，200537-593(1991)。这些相似性表明p32显示出功能性短链醇脱氢酶的多种特征。
如图5所示，p32的氨基酸序列的亲水性分析给出了几个疏水性区段，这表明p32是一个膜相关的蛋白。前18个氨基酸是疏水性的，该区域具有典型的信号序列特征。但是信号肽酶切割的共有位点不能确定。见Bon Heijne，核酸研究，144683-4690(1986)。第130-150位残基间的氨基酸是疏水性的，在该蛋白的C末端附近有一个相对长的疏水性区段。因而，p32显示出多个可能是跨膜片段的疏水性区域。考虑到上述的与短链醇脱氢酶的同源性，很可能p32中部的疏水性区域(第130-150位残基)不是用作膜上的锚锭。而N末端和C末端的区域才是可能的膜上锚锭结构域。
为了确定p32与膜的作用形式，利用从线性pλ321转录的mRNA经网状细胞溶解系统进行体外翻译，合成p32。该步骤如下列实施例8所述实施例8通过体外翻译表达p32体外转录的编码p32的mRNA是利用T7 RNA多聚酶由线性的pλ321合成的。按照制备商提供的说明，利用核酸酶处理的兔网状细胞溶解物进行体外翻译反应。每个反应中包括50ng的mRNA，加入或者不加入狗胰腺微粒体。为了分离膜插入的p32，4℃下12,000g离心10分钟收集微粒体。将微粒体用PBS小心悬浮并再次离心。
如图6所示，在狗胰腺微粒体存在下的翻译表现出p32基本是数量上膜相关的并且在SDS-PAGE上以Mr32,000的类型迁移。在不存在膜受体下的翻译类似地也产生一个Mr32,000的蛋白。这些数据表明N末端疏水性序列作用为一个信号序列但不被信号肽酶所去除，这一点支持了先前的发现，即不能在推导的一级序列中确定出信号肽酶切割的共有位点。
通过Northern印迹分析，利用从牛RPE、肝、肾、肾上腺、肺、睾丸、脑和肌肉中分离的总RNA分析了p32的组织表达。该步骤如下列的实施例9所述。实施例9Northern印迹分析将从几种组织中分离的20μg总RNA在变性条件下于1％的琼脂糖上电泳，并转移到Hybond-N尼龙膜上。将滤膜与32P标记的编码p32的全长cDNA在严格条件下杂交。关于总RNA的分离，杂交条件和洗涤步骤的详细方法，与Bavik等，生物化学杂志，267205405-20546(1993)先前所述的相一致。
高度严格条件下与作为探针的pλ321的1.1kb插入子的杂交表明，只在RPE中才有相应于p32的转录物的丰富表达，而在其他几种组织中其没有可检测出表达水平。主要转录物的大小为1.4kb，但其他低水平转录物在RPE和其他组织中，经延长曝光滤膜之后都可以看到。实施例10在COS细胞中p32的表达和重组p32性质的酶学分析首先利用真核表达载体在COS细胞中表达p32，然后将转染细胞和对照细胞的微粒体组分进行免疫印迹分析，以确定p32以所需的水平表达，如下具体地，将pλ321的EcoRI-插入子克隆入EcoRI消化的真核表达载体pSG5上。见Green等，核酸研究，1639(1988)。COS细胞保存在含有10％胎牛血清、2mM谷氨酸盐和抗生素的Dulbecco最低基本培养基中。将细胞接种于60mm的培养皿中(4×105个细胞/皿)并利用DEAE右旋糖以5μg质粒/皿转染。对照细胞用其母本载体转染。以10％DMSO处理2分钟后，将细胞温育72-96小时，然后用橡胶刷刮皿收集，再低速离心收集细胞。收集的细胞沉淀再用低渗缓冲液(10mM TrisHCl，pH7.5，含有1mM苯基-甲磺酰基-氟化物)重新悬浮，置于冰上20分钟，然后用Dounce匀浆器匀浆。离心(3000g)15分钟去除未破碎的细胞和碎片。通过100,000g超速离心1小时进一步收集微粒体；膜沉淀储存于-80℃以备进一步分析。
用带有GST的融合蛋白形式表达的p32(氨基酸残基19-318)注射兔，产生p32的抗血清。利用细菌表达载体pGEX 2T，根据供应商的建议方法(Pharmacia)，诱导GST融合蛋白并纯化。每只兔子皮下接受注射Freunds完全佐剂乳化的75μg的融合蛋白。第二周对兔子以Freunds完全佐剂乳化的50μg的融合蛋白进行加强免疫。一周后收集血液。将免疫兔的血清通过含有固定在CNBr活化的Sepharose珠的GST融合蛋白的柱子。用含有0.5M NaCl的0.1M的柠檬酸缓冲液(pH3.0)洗脱结合的Ig。为了除去融合蛋白的GST部分的Ig，类似地将Ig与GST结合的Sepharose树脂一起温育，而使用未结合的Ig组分。对于过量表达的蛋白的免疫印迹分析，以1μg/ml的浓度使用Ig。免疫印迹步骤的详细方法在Bavik等，生物化学杂志，26723035-23042(1992)中有详细的描述，在此提及可以参考。
如图8A所示，上述的步骤获得了在以重组表达载体转染的细胞中表达，而不在假转染的对照细胞中表达的p32。
接着，按照研究在RPE细胞中微粒体组分中11-顺式视黄醇脱氢酶活性的方法，类似地确定COS细胞中表达的p32的酶学特性。见Saari等，分析生物化学，21328-13226(1993)。
具体地，通过将来自上述的转染细胞以及来自缺少p32的对照细胞的微粒体组分，与各种组合的不同的立体异构体物质，如11-顺式视黄醇或者全反式视黄醇一起，在辅助因子NAD+或者NADP的存在下，一起温育，从而对p32的酶学活性进行分析。
为了制备这种物质，用硼氢化钠从11-顺式视黄醛合成11-顺式视黄醇，如Heller等，生物化学杂志，2486308-6316(1973)中所述，并在氮气下储存于-80℃。HPLC分析确定11-顺式视黄醛到11-顺式视黄醇的定量还原，类维生素A的所有操作都应在柔和的光线条件下完成。
为了检测转染细胞中p32的活性，将温育时的11-顺式视黄醇和全反式视黄醇(购自Sigma Chemical Co.)降至100μM。在每个温育反应中使用来自表达p32的COS细胞的或者来自对照细胞的20μg总膜蛋白，于37℃在存在或者不存在NAD+或者NADP下，温育30分钟。然后将反应混合物用n-乙烷抽提，取有机相并在氮气下干燥。干燥的有机相再单独溶解于乙醇中，而水相在正相氧化硅HPLC柱子上，以1ml/min流速用含有4％的二氧杂环乙烷的n-乙烷进行层析。流出液在330nm监测。在此条件下，11-顺式视黄醛和11-顺式视黄醇分别在第7分钟和第25分钟被洗脱，而全反式视黄醛和全反式视黄醇分别在第8分钟和第23分钟被洗脱。
如图8B所示，上述的HPLC分析表明，来自含有p32的转染细胞的组分表达11-顺式视黄醇脱氢酶蛋白，其在NAD+的存在下具有活性，这可以由11-顺式视黄醛的形成而说明。层析中的第二个峰是全反式视黄醛；但是，与11-顺式视黄醛在不存在细胞膜的情况下的对照温育表明，在所用测试方法中，大量的11-顺式视黄醛异构形成了全反式视黄醛。这表明全反式视黄醛的出现是由于它是在所用的温育过程和抽提步骤中产生的，而不是酶学反应的产物。而且，全反式视黄醇与含有p32的细胞的温育确定了该酶的立体特异性，因为没有检测出显著的全反式视黄醛的形成。
如图8C所示，p32在辅助因子NADP的存在下没有酶学活性。
在图8D中，不表达p32的对照细胞的试验表明，11-顺式视黄醇不氧化成11-顺式视黄醛。
因此，上述的结论表明，p32是一个立体特异性的11-顺式视黄醇脱氢酶，它以NAD+作为其辅助因子。在进一步的实施方案中，还证明了p32分子还具有9-顺式视黄醇脱氢酶活性。实施例11按照上文所述的利用牛的材料进行的工作，还进行了分离和克隆人序列的实验。
从商业供应商处(如，Clontech)购得人眼的cDNAλgt11文库。以上述的牛cDNA，如SEQ ID NO10，作为探针。通过随机引物用32[P]dCTP标记此cDNA至高比活性(约109cpm/μgDNA)。
将标记的牛cDNA用于探查人cDNA文库。条件如下在6×SSC，0.5％Denhardt溶液，25％甲酰胺，和100μg/ml鲑精DNA中于68℃杂交，然后用2×SSC，0.5％SDS，于65℃洗涤4次，每次30分钟，最后用2×SSC于42℃洗涤30分钟。
当发现阳性cDNA时，按照制备商的说明将插入子(例如，cDNA)切离并克隆到商业可得的载体pBluscript上。然后通过周知的方法确定该插入子的序列。SEQ ID NO14给出了1128个核苷酸的序列。其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO15所示。实施例12再进一步的实验中，利用上述实施例11所述的信息研究并分析牛的神经视网膜和鼠的10天胚胎。使用鼠胚胎，除了它是因为该系统是研究发育生物学的常用系统之外，还因为视黄醇脱氢酶在发育中极为活跃。该模型可以推导至人的发育。
利用周知的方法，从牛神经视网膜或者从鼠10天胚胎中分离RNA(5-10μg)。将RNA与4μl 5×AMVRT缓冲液，以及来自5mM母液的4μl dNTP，2μl寡聚dT(18mer，终浓度10μM)，0.5μlRNase抑制剂，鸟骨髓瘤病毒反转录酶(10U)一起混合。终体积为20μl。将所得的混合液于42℃温育30分钟，然后置于冰上待用。
然后进行PCR。在PCR中，使用2μl的cDNA。根据推导的上述牛cDNA的氨基酸序列设计引物。下列标出了保守的氨基酸序列A)Cys Asp Ser Gly Phe GlyB)Pro Gly Trp Asp AlaC)Glu Ala Phe Ser AspD)His Pro Arg Thr“A”相当于SEQ ID NO12的第36-41位氨基酸。“B”相当于该序列中的第283-287位氨基酸。“C”位于第183-187位，而“D”位于第267-279位。本文所用的“保守的”是指在推导序列和Chai等，生物化学杂志2703900-3904(1995)中所述的肝RDH序列，以及Simon等，生物化学杂志2701107-1112(1995)中所述的序列之间的保守性。各文献在此提及可参考。
制备简并性寡聚体。在第一套PCR实验中，用基于A和B的简并性寡聚体作为引物，即5′-A C G T G A A T T C T G Y G A Y T C N G G N W T Y G G-3′(SEQ ID NO16)5′-A C G T G A A T T C T T N G C R T C C C A N C C-3′(SEQ ID NO17)分别作为正向和反向引物。将引物与2μl上述的cDNA相混合。条件为94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，和72℃延伸1分钟。这作为一个循环，进行25个循环。
第一个PCR之后，将5μl的PCR样品与基于“C”和“D”的引物相混合，即5′-A C G T G A A T T C G A R G C N T T Y T C N G A-3′(SEQ ID NO18)5′-A C G T G A A T T C C G N G T N C K N G G R T G-3′分别作为正向和反向引物。条件除了退火温度为55℃之外，与第一套实验完全相同。
将反应产物在含有溴化乙锭的1.5％的琼脂糖凝胶上分析。推定扩增产物大约长度为300bp。因此，任何300bp的可见条带可以确定该PCR方法能产生适当大小的产物。重复该实验，利用1.0％的低熔点琼脂糖凝胶，从中洗脱PCR产物。将分离的产物利用相同的方法再次扩增，并克隆入质粒(TA克隆试剂盒，Invitrogen)。利用标准的方法从转化子中制备质粒DNA，然后通过EcoRI限制性酶解分析。利用载体特异性引物，对于任何300bp的插入子进行进一步的分析。PCR产物在SEQ ID NO20-23中给出，其推导的氨基酸序列在SEQ IDNO24-27中给出。SEQ ID NO20和24相应于牛的序列，而所有其它的序列相应于鼠的序列。这些核苷酸序列中，第一个碱基(“C”)是实验中人为的，是由于限制性内切酶切割所产生的。因此，从第二个核苷酸碱基开始来确定出推导的氨基酸序列。而且，应注意的是，并不含有正常下应当包含在5’和3’末端的简并性寡聚体的相应序列。实施例13利用SEQ ID NO21中所述的PCR产物进行进一步的探查实验。
利用随机标记的SEQ ID NO21，对鼠的8.5天的cDNA文库(在λ gt10中)进行筛选。杂交在6×SSC，0.5％SDS，0.5％Denhardt溶液，50％甲酰胺，于42℃与100μg/ml鲑精DNA进行，然后用2×SSC，0.5％SDS，于50℃洗涤30分钟。确定出阳性cDNA并克隆入pBluescript中并测序。核苷酸序列和推导的氨基酸序列如SEQ IDNO28和29所示。实施例14接着上述的工作，将人cDNA用于探查人基因组文库。如上所述通过PCR制备探针并随机标记。用于PCR的引物衍生自SEQ IDNO14的cDNA，如下所示正向引物5′-G C T T C G G G C G C T G T A G T A-3′(SEQ ID NO30)反向引物5′ -A A A A C A A T C T C T T G C T G G A A-3′(SEQ IDNO31)经过95℃变性，然后55℃退火，和72℃延伸进行PCR。使用2-5U的Taq多聚酶和0.2μM的两种引物。进行30个循环。
分离出1056bp的扩增片段，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，并克隆入PCR载体中(从Invitrogen商业购得)。利用该探针对购自Stratagene的在λFXII中的人基因组文库进行筛选。在6×SSC，0.5％SDS，0.5％Denhardt溶液，50％甲酰胺，于42℃与100μg/ml鲑精DNA一起进行过夜杂交，然后用1×SSC，0.1％SDS，于50℃洗涤一次，最后用0.5×SSC，0.1％SDS，于65℃洗涤。每次洗涤30分钟。分离出几种阳性嗜菌斑，利用Sambrook等在“分子克隆，实验室手册”(第2版，1989)中所述的甘油分步梯度法，再次筛选并制备λDNA。
分离的基因组克隆通过下列的PCR反应获得的分析片段来测序，每个反应使用100mg的基因组λ克隆。为了进行PCR，在两个记作“一”和“二”的PCR反应中，使用SEQ ID NO11所示cDNA序列衍生的不同的引物。
具体地，在PCR反应一中所用的引物为SEQ ID NO30，同上(正向引物)和5′-C T C A G G C T G T C A G A G A A G G C C T-3′(SEQ ID NO32)(反向引物)在PCR反应二中所用的引物为5′-G A C G A T T T C C A G C G G G T G C-3′(SEQ ID NO33)(正向引物)和SEQ ID NO31，同上(反向引物)经过95℃变性，然后55℃退火，和72℃延伸进行PCR。使用2-5U的Taq多聚酶和0.2μM的两种引物。进行30个循环。反应一和二的扩增片段分别为2.2kb和2.5kb。将各个片段克隆入从Invitrogen商业购得的PCR载体中。
利用载体特异的引物或内部引物进行克隆片段的序列分析，可确定出外显子内含子的边界。
图9中给出了该基因的结构。实施例15进行了确定该基因在染色体上位置的研究。
为了完成此工作，从人白细胞、中国仓鼠、鼠肝细胞、和仓鼠/人和小鼠/人杂交细胞系中分离了高分子量DNA。这些杂交细胞系各自含有一个人的染色体和鼠的基因组。
将分离的DNA用Hind III消化，通过电泳在琼脂糖凝胶上分离，然后转移至尼龙滤膜上。然后用同上所述的标记的人cDNA探针对其进行杂交。
利用本领域所知道的技术，从白细胞培养物中制备染色体载片。将来自3个基因组克隆的λDNA混合并通过缺口转译用生物素酰化的16-dUTP标记。按照制备商的说明，用氟代-红-dUTP标记针对人第12条染色体着丝粒的特异探针(得自ATCC，登录号D12Z1)。探针的预退火，载片的预处理，杂交条件，信号扩增，和检测，都按照周知的技术进行。用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)对染色体复染色，通过荧光显微镜来观察。
对所有数据的分析表明，编码人的p32的基因跨度超过4kb，分为4个编码外显子，长度为156至342个碱基对。另外，在5’非翻译区发现了一个外显子，而该最后一个外显子的长度未能确定。内含子的大小范围从250个碱基至1.9kb。图9给出了它们的示意图。
对外显子/内含子边界的研究表明所有剪切供体和受体位点都遵循已知的规范的GT/AG法则。起始密码子和保守的辅助因子结合位点由第2个外显子编码，而其带有恒定的酪氨酸残基的活性位点由第3个外显子所编码。该基因定位于染色体12q13-14。实施例16利用SEQ ID NOS21和22中给出的核酸分子，对实施例12中的工作进行了扩展。
使用了商业购得的鼠进行了多种组织的Northern杂交。特别是，以标准的方法用32P标记SEQ ID NOS21和22中给出的核酸分子。然后，通过标准的Northern印迹步骤，将这些标记的探针用于确定鼠组织样品中转录产物的相对表达水平。使用50％甲酰胺，6×SSC，0.5％SDS，2×Denhardt溶液，100μg/ml鲑精DNA和1×106cpm/ml标记探针，于42℃对印迹进行过夜杂交。然后用2×SSC，0.1％SDS，室温下洗涤两次，每次30分钟，再用0.1×SSC，0.1％SDS，于50℃洗涤20分钟。使用增感屏和Kodak胶片，将印迹在-70℃下过夜曝光。通过目测观察获得的1.4kb转录产物的表达情况如下所示探针组织SEQ ID NOS21SEQ ID NO22心脏 - -脑 - ++脾- -肺- -肝+++++ +++++骨骼肌- -肾+++ +++睾丸 - -实施例17考虑到实施例16中的结果，在本实施例中所述的实验中使用了鼠肝。通过标准的方法，在λZAP中制备鼠肝cDNA文库。利用实施例16中所述的探针筛选文库。特别是，按照制备商的说明将文库铺板并制备滤膜。在50％甲酰胺，6×SSC，0.5％SDS，2×Denhardt溶液，100μg/ml鲑精DNA中，于42℃进行预杂交。然后将滤膜用1×106cpm/ml的杂交溶液进行杂交。过夜杂交后，将滤膜用含有0.1％SDS的2×SSC洗涤两次(52℃下，每次30分钟)。然后，同上所述将滤膜曝光。对任何阳性克隆再筛选两次，直到板上所有的嗜菌斑都呈阳性。利用标准的方法，通过体内切离将几个阳性克隆的插入子亚克隆入质粒pBluescript SK(+)中。将得到的几个克隆进行排序。
当用SEQ ID NO21作为探针时，鉴定出3个不同的cDNA。它们在本文中的SEQ ID NOS32，33和34中给出。当用SEQ ID NO22作为探针时，在上述的一个质粒中发现了一个全长克隆，即SEQ IDNO35。从中推导的氨基酸序列分别在SEQ ID NOS36-39中给出。由于它们与已知的全反式作用的RDHs同源，相应于SEQ IDNOS36-38的蛋白可能具有全反式活性。
实施例18相应于SEQ ID NO35的插入子据发现长度约为1.2kb。实际的序列(1146个核苷酸)与此估计相接近。该克隆用于下列的实验中。
用周知的方法(使用BamHI内切酶)将含有SEQ ID NO35的质粒线性化。然后用标准的方法合成相应于SEQ ID NO35的mRNA。以50ng/每个反应的量，将获得的mRNA在35S存在下，用于如前面实施例中所述的体外翻译系统中。离心沉淀微粒体，然后用于SDS-PAGE分析。
在相应于SEQ ID NO35的mRNA引导下，在体外翻译的产物中发现了一条大约34kDa的条带。非引导微粒体系统未发现这条带。这些结果表明SEQ ID NO35编码的蛋白是一个具有SDS-PAGE确定的分子量大约34kDa的膜相关蛋白。
SEQ ID NO35推导的氨基酸序列，即，SEQ ID NO39的亲水性曲线，与已知的膜相关的11-顺式视黄醇脱氢酶的几乎相同。随后为了确定该蛋白的特性进行了进一步的研究。实施例19为了从真核系统中产生蛋白，利用已知的方法，将上述的SEQ IDNO35质粒的1.5kb的EcoRI片段亚克隆入一个杆状病毒表达载体中。然后将该载体用已知的方法转染Spodoptera frugiperda(“SF9”)细胞。经几轮扩增使得重组杆状病毒扩增，然后用于新鲜的Sf9细胞。另外利用含有非相关基因的重组病毒载体，其表达产物没有视黄醇活性，进行了平行实验。
然后对表达的蛋白测验其酶活性。简单地说，将来自感染细胞的相当于25μg总膜蛋白的膜，在含有100μM9-顺式视黄醇或全反式视黄醇的磷酸缓冲液中温育。温育物的终体积为200μl。还加入了辅助因子NAD+或辅助因子NADP至终浓度为200μM。将混合物于37℃温育20分钟，然后加入碱性乙醇。将混合物用2.0ml的n-乙烷抽提。将有机相去除并在氮气中干燥。用乙醇溶解干燥物，并用C18柱，以乙腈/水(85∶15v/v)为流动相进行反相HPLC分析。以1.0ml/min流速洗脱，洗脱液在350nm监测。
在NAD+存在时，9-顺式视黄醛是一种洗脱产物。在NADP存在时9-顺式视黄醛为背景水平，这与模拟感染细胞中的水平相当。模拟感染细胞也显现出一些9-顺式视黄醛，这提示存在内原性的，但尚未被纯化和鉴定的9-顺式RDH。表达SEQ ID NO35编码的蛋白的细胞氧化9-顺式视黄醇的效率比模拟感染细胞高8-10倍。
在本文中描述的一些实验中，还发现了该蛋白的11-顺式RDH活性和13-顺式RDH活性。实施例20随后进行了一系列的实验，以研究早期鼠胚胎中SEQ ID NO35的表达。
按照上述同样的方法，从9，11，13和15天的鼠胚胎中获取转录产物。以上述相同的条件，但通过两步程序，进行RT-PCR。
在进行的第一步反应中使用5′-TAGCTGGTATCATCGGGCCCA-3′(SEQ ID NO40)，和5′-AGAAACCAGGCAGCACTGG-3′(SEQ ID NO41)，而CRABPI转录产物的扩增使用5′-CACGTGGAGATCCGCCAG-3′(SEQ ID NO42)，和5′-ACGTGGATCCCCGCCTTCATTCCGAACA-3′(SEQ ID NO43)而甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的扩增使用5′-GGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′(SEQ ID NO44)，和5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3′(SEQ ID NO45)取等分后再扩增。在第二次扩增中，将SEQ ID NO41用5′-GCTGGTCACCTTCGTTAGTTC-3′(SEQ ID NO46)替代。在1.5％的琼脂糖凝胶上分析扩增条带，通过溴化乙锭来观察。SEQ ID NO35编码的RDH的特征条带为420bp，而CARBPI的特征条带为210bp，GAPDG的为190bp。结果表明转录产物在鼠的大部分妊娠期中都存在。
因此，如上所述，本发明提供了一种方法，用以分离和鉴定与膜结合的视黄醇脱氢酶，诸如全顺式和全反式视黄醇脱氢酶，它们可能与视黄醇结合蛋白诸如RPE细胞的p63相关，并具有SDS-PAGE确定出的大约30至36kDa的分子量。这些酶具有9，11，和13-顺式视黄醇脱氢酶活性，并可能具有由此而来的其他的特性。这些蛋白的一级结构表明它们具有功能性短链醇脱氢酶的重要特征，包括推定的辅助因子结合位点和与催化机制相关的基本残基，即几乎恒定的酪氨酸，包括序列基序Y-X-X-X-K(Persson等，欧洲生物化学杂志，200537-593(1991))。在有限的组织表达和RPE中蛋白的丰富性，如p32，表明这些蛋白可能只执行针对RPE的功能。这种可能性，以及它们可以与p63形成复合物的事实，而p63在以前已经表明是RPE细胞中类维生素A吸收机制中的一种成分(Bavik等，生物化学杂志，26723035-23042(1992))，表明这些蛋白的底物是类维生素A。短链醇脱氢酶家族成员的广泛的组织表达提示这些分子具有其他的功能。
在RPE细胞中类维生素A代谢的主要的代谢步骤是转化11-顺式视黄醇成为11-顺式视黄醛。根据本文上述的结果所表明的这些蛋白在RPE中的表达，以及这些蛋白特定的生化特性，进一步的研究确定了这些蛋白实际上是9-和11-顺式视黄醇脱氢酶，它们是可以催化这种反应的酶。
因此，本发明的一个方面是能够生产重组9-和11-顺式视黄醇脱氢酶。该重组酶可以比通过标准的生化方法所得到的酶，以较高的水平和较纯的形式产生9-和11-顺式视黄醛。因此在这个范围内可以使用本发明的分离的核酸分子，包括SEQ ID NO35以及能够在严格的条件下与SEQ ID NO10杂交的核酸分子。术语“严格的条件”是指在6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt溶液，和100μg/ml鲑精DNA中，于68C进行杂交，并最终以0.5-1×SSC于50℃进行洗涤。本文所用的该术语还指至少与上述的一样严格的任何一套参数。正如所周知的，可以通过改变一个参数降低其严格性而改变另一个参数提高其严格性，从而获得相同严格的条件。因此，任何满足上述的杂交标准的核酸分子都将被视作编码相关的顺式视黄醇脱氢酶。该酶可以在体外系统中生产，如上文所述的，或者通过转染或转化真核或原核细胞系生产，诸如带有本发明的核酸分子的CHO和COS细胞、Spodoptera frugiperda或细菌菌株如E.coli或酵母菌株S.cervisiae。在一个优选的实施方案中，该核酸分子含于一个表达载体中，有效地相连于一个启动子。优选的是互补DNA，或者“cDNA”，但基因组DNA和mRNA也可使用。
对于发生在非视觉组织中的类维生素A代谢，将视黄醇脱氢酶鉴定为短链醇脱氢酶家族的成员是很重要的。研究表明从全反式视黄醇产生全反式视黄酸是经过两个步骤进行的(Posch等，生物化学，306224-6230(1991))。首先，通过膜结合的视黄醇脱氢酶，视黄醇被氧化为视黄醛。第二步，视黄醛再被氧化为视黄酸。因此，发生在非视觉细胞中的视黄醇到视黄醛的氧化，类似于视觉循环中从11-顺式视黄醇合成11-顺式视黄醛时所进行的反应。根据这些相似性，可以推出由全反式视黄醇形成全反式视黄醛是通过一个结构上与本发明的视黄醇脱氢酶相似的酶而完成的。这些发现与目前所持的观点相对比是令人惊讶的，通常据信此代谢步骤是通过中链醇脱氢酶家族的成员完成的。见Duester，醇类临床实验研究，15568-572(1991)；Yang等，类临床实验研究，17496(1993)和Zgombic-Knight等，生物化学杂志2696790-6795(1994)。因此本发明所给出的对顺式视黄醇脱氢酶的鉴定和结构鉴定，还提供了意想不到的途径，用以分离鉴定非视觉组织中与视黄醇代谢相关的相似的脱氢酶。
本发明的蛋白及其编码的核酸分子和其他方面，还可以用于许多其他的重要应用。例如，已经表明，p32是一个寡聚蛋白复合物的一部分，该复合物具有作为RPE细胞中RBP的膜受体的功能，为它编码的核酸分子可以用于表型/基因型诊断分析，从而确定可能导致无色素沉着的视网膜炎的类维生素A的积存。
此外，正如所示的，本发明的蛋白至少具有9和11-顺式视黄醇脱氢酶活性，可以催化9和11-顺式视黄醇向9和11-顺式视黄醛的转变，而后者是在RPE细胞中由膜结合的脱氢酶完成的类维生素A代谢中的一个主要代谢步骤。因此，类维生素A的积存可能直接地或间接地由于一种或多种此类蛋白的存在和/或它的激活或者抑制，例如，与RBP受体p63，比如但不仅仅是RPE的p63，成分的复合物的形成。
在其他应用中，可以测试基于本发明的蛋白的9和11-顺式视黄醇脱氢酶活性而治疗各种疾病的潜在的类维生素A药物的效用，这类药物可反向作用于酶，因而确定不同药物中的哪种对酶的活性具有限制作用或没有反向作用。
类维生素A的各类已知功能还提示，各类其他的类维生素A相关的病理学条件也可以通过测试涉及特定的视黄醇结合蛋白的p63/顺式视黄醇脱氢酶受体复合物的水平来诊断。可以利用本领域所知道的技术，如免疫试验等等，以确定复合物的水平是太高还是太低一即是否与正常水平相异。
另外，根据复合于类维生素A的p63组分的顺式-RDHs在RPE中的吸收机制，它们还可以用于一定的治疗范围中，正如所周知的，可溶性受体可以用于防止一个蛋白与其膜结合受体的结合。可以通过施用一定量的足以抑制视黄醇结合蛋白的可溶性受体复合物或者抗体，或其他针对该白蛋白的相关分子，即，顺式视黄醇脱氢酶的抑制剂，从而对一个具有视黄醇结合蛋白水平增高特征的患者进行治疗。本发明其他的方面对于本领域的熟练技术人员来说是很清楚的，无需在此重复。
在另一个应用中，可以产生针对这些蛋白的单克隆或者多克隆抗体，它们尤其可以通过抗体与体液或组织样品的结合分析，用于检测具有异常水平的视黄醇结合蛋白受体特征的病理情况。本发明蛋白的抗体的生产可以通过，例如利用Bavik等，生物化学杂志，267205405-20546(1993)中所述的方法来完成，从而产生p63的抗体，包括mAbA52。
本文所用的术语和表达是用于描述而非限制的目的，这些术语和表达的使用并非意在排除所表述的特性或部分特性的任何等同物，应当认识到的是，各种修改都可能处于本发明的范围之内。
序列表(1)一般信息(i)申请人Eriksson，Ulf；Simon，Andras；Romert，Anna(ii)发明名称具有顺式视黄醇脱氢酶活性的分离的蛋白质(iii)序列数量46(iv)通讯地址(A)收信人Felfe & Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市纽约(D)国家美国(E)邮政编码10022(v)计算机阅读格式(A)介质类型软盘，3.5英寸，144kb储存量(B)计算机IBM(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordperfect(vi)当前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号08/729,594(B)申请日1996年10月11日(vii)在先申请资料(A)申请号08/562,114(B)申请日1995年11月22日(vii)在先申请资料(A)申请号08/375,962
(B)申请日1995年1月20日(vii)在先申请资料(A)申请号08/258,418(B)申请日期1994年6月10日(viii)律师/代理人资料(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)注册号30,946(C)文档号LUD 5517(ix)电信信息(A)电话(212)688-9200(B)电传(212)838-3884(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1Leu Val Glu Ala Val Leu Ala Glu Val Leu Pro Lys Pro Ala Gln Thr5 10 15Val Ala(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Tyr Ser Pro Gly Trp Asp Ala Lys5(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO3Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Thr Leu Glu Asp Thr Leu Gln Ala5 10 15(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Val Ala Pro Phe Gly Val5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO5
Leu His Thr Thr Leu Leu Asp Val Thr Asp Pro Gln Ser Ile5 10(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO6ACGTGAATTC TNGTNGARGC NGT 23(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO7ACGTGAATTC ACNGTYTGNG CNGGYTT 27(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO8ACGTGAATTC CCNGTNACNA AYYT 24(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO9ACGTGAATTC GCYTGNARNG TRTCYTC27(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度1122个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词p32；11-顺式视黄醇脱氢酶(xi)序列描述SEQ ID NO10AGCTTTCCCC TGAGGAGGTC ACCTGGGCTC CAGCC ATG TGG CTG CCT CTG CAG 53Met Trp Leu Pro Leu Leu5TGC CTG CTG CTG GGT GTC TTG CTC TGG GCA GCA CTG TGG TTG CTC AGG 101Leu Gly Val Leu Leu Trp Ala Ala Leu Trp Leu Leu Arg Asp Arg Gln10 15 20GAC CGG CCA GCC AGC GAT GCC TTT ATC TTC ATC ACC GGC TGT GAC TCG 149Cys Leu Pro Ala Ser Asp Ala Phe Ile Phe Ile Thr Gly Cys Asp Ser25 30 35GGC 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(C)链性双链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(ix)特征(A)名称/关键词PCR克隆207(xi)序列描述SEQ ID NO21CTCCCTCAGG AGGGGGCTCT CCTACTTTGG GGTGAAGGTG GCTATTATAG AGCCTGGCTT 60CTTCCTGACC GGTGTGACCA GTAGTGCCAG ATTATGCTCA AATACCCAGA TGCTGTGGGA 120CCAGACCAGC TCAGAAATCA GGGAGATCTA TGGCGAGAAG TACCTGGCAT CCTATCTGAA 180AAGGCTAAAC GAATTGGACA AGAGGTGCAA CAAGGACCTG TCTTTGGTGA CTGACTGCAT 240GGAGCATGCT CTGACTGCCT GC262(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度265个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(ix)特征(A)名称/关键词PCR克隆200(xi)序列描述SEQ ID NO22CAGCCTGAGG CGGGACATGG CTCCGTTCGG AGTACAAGTC TCCATTGTGG AGCCTGGCTT 60CTTTCGAACC CCTGTGACCA ACCTGGAGAG TCTGGAGAGC ACCCTGAAGG CTTGTTGGGC 120CCGGCTACCT CCAGCTATAC AGGCCCACTA CGGGGAGGCC TTCCTCGATA CTCATCTTCG 180AGTACAGCGC CGCATCATGA ACCTGATCTG TGACCCAGAA CTAACGAAGG TGACCAGCTG 240CCTGGAGCAT GCCCTGACTG CTCGC265(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征
(A)长度265个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(ix)特征(A)名称/关键词PCR克隆215(xi)序列描述SEQ ID NO23CAGCCTGAGG CGAGATGTGG CTCCTTTTGG GGTACGGGTC TCTATCGTGG AACCTGGCTT 60CTTCCGAACC CCTGTGACAA ACCTGGAAAC TTTGGAGGGC ACCCTGCAGG CCTGCTGGGC 120ACGGCTGCCT CCAGCCACAC AGGCCCTCTA TGGGGAGGCC TTCCTCACCA AATACCTGAG 180AGTGCAGCAA CGTATCATGA ACATGATCTG TGATCCGGAC CTGGCCAAGG TGAGCAGGTG 240CCTGGAGCAT GCCCTAACTG CCCGT 265(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度87个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词PCR克隆194(xi)序列描述SEQ ID NO24Ser Leu Arg Arg Glu Leu Ser Tyr Phe Gly Val Lys Val Ala Met Ile5 10 15Glu Pro Gly Tyr Phe Val Thr Asn Met Thr Gln Asp Glu Gly Phe Ile20 25 30Gly Tyr Leu Gln Ala Leu Trp Asn Arg Ala Ser Pro Glu Leu Lys Glu35 40 45Leu Tyr Gly Glu Asn Phe Pro Ala Asp Phe Leu Lys Thr Leu Ser Leu50 55 60Leu Lys Pro Arg Trp Thr Gln Asn Leu Ser Leu Val Thr Asp Cys Met65 70 75 80Glu His Ala Leu Thr Ala Cys85(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度87个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词PCR克隆207(xi)序列描述SEQ ID NO25Ser Leu Arg Arg Gly Leu Ser Tyr Phe Gly Val Lys Val Ala Ile Ile5 10 15Glu Pro Gly Phe Phe Leu Thr Gly Val Thr Ser Ser Ala Arg Leu Cys20 25 30Ser Asn Thr Gln Met Leu Trp Asp Gln Thr Ser Ser Glu Ile Arg Glu35 40 45Ile Tyr Gly Glu Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Arg Leu Asn Glu50 55 60Leu Asp Lys Arg Cys Asn Lys Asp Leu Ser Leu Val Thr Asp Cys Met65 70 75 80Glu His Ala Leu Thr Ala Cys85(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度88个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词PCR克隆200(xi)序列描述SEQ ID NO26Ser Leu Arg Arg Asp Met Ala Pro Phe Gly Val Gln Val Ser Ile Val5 10 15Glu Pro Gly Phe Phe Arg Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Ser Leu Glu20 25 30Ser Thr Leu Lys Ala Cys Trp Ala Arg Leu Pro Pro Ala Ile Gln Ala35 40 45His Tyr Gly Glu Ala Phe Leu Asp Thr His Leu Arg Val Gln Arg Arg50 55 60Ile Met Asn Leu Ile Cys Asp Pro Glu Leu Thr Lys Val Thr Ser Cys65 70 75 80Leu Glu His Ala Leu Thr Ala Arg85(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度88个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词PCR克隆215(xi)序列描述SEQ ID NO27Ser Leu Arg Arg Asp Val Ala Pro Phe Gly Val Arg Val Ser Ile Val5 10 15Glu Pro Gly Phe Phe Arg Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Thr Leu Glu20 25 30Gly Thr Leu Gln Ala Cys Trp Ala Arg Leu Pro Pro Ala Thr Gln Ala35 40 45Leu Tyr Gly Glu Ala Phe Leu Thr Lys Tyr Leu Arg Val Gln Gln Arg50 55 60Ile Met Asn Met Ile Cys Asp Pro Asp Leu Ala Lys Val Ser Arg Cys65 70 75 80Leu Glu His Ala Leu Thr Ala Arg85(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度563个碱基对
(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(ix)特征(A)名称/关键词克隆ME207(xi)序列描述SEQ ID NO28GAGGCGTTCT CGGACTCCCT CAGGAGGGGG CTCTCCTACT TTGGGGTGAA GGTGGCTATT 60ATAGAGCCTG GCTTCTTCCT GACCGGTGTG ACCAGTAGTG CCAGATTATG CTCAAATACC 120CAGATGCTGT GGGACCAGAC CAGCTCAGAA ATCAGGGAGA TCTATGGCGA GAAGTACCTG 180GCATCCTATC TGAAAAGGCT AAACGAATTG GACAAGAGGT GCAACAAGGA CCTGTCTTTG 240GTGACTGACT GCATGGAGCA TGCTCTGACT GCCTGCCACC CTCGCACGCG ATACTCAGCT 300GGCTGGGATG CTAAGCTCTT CTACCTCCCC TTGAGCTACC TGCCTACCTT TCTTGTGGAT 360GCCCTTCTCT ATTGGACTTC CCTGAAGCCT GAGAAAGCCC TCTGACGTGT TCACCTATGT 420GCATACCTGG GGAGATGTAG GTAGAGTTTG AGAGAGAGAA TATTTAGGGG AAATTTGGAG 480GGTTGAGGGA GGGAGTTTAT TACTCTGGGG TTCAGTCAAC ACACTTCATC TCATTAATTC 540TCCTATGACA CTACTGAATA CTG563(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度134个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/关键词ME克隆207(xi)序列描述SEQ ID NO29Glu Ala Phe Ser Asp Ser Leu Arg Arg Gly Leu Ser Tyr Phe Gly Val5 10 15Lys Val Ala Ile Ile Glu Pro Gly Phe Phe Leu Thr Gly Val Thr Ser20 25 30Ser Ala Arg Leu Cys Ser Asn Thr Gln Met Leu Trp Asp Gln Thr Ser35 40 45Ser Glu Ile Arg Glu Ile Tyr Gly Glu Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu50 55 60Lys Arg Leu Asn Glu Leu Asp Lys Arg Cys Asn Lys Asp Leu Ser Leu65 70 75 80Val Thr Asp Cys Met Glu His Ala Leu Thr Ala Cys His Pro Arg Thr85 90 95Arg Tyr Ser Ala Gly Trp Asp Ala Lys Leu Phe Tyr Leu Pro Leu Ser100 105 110Tyr Leu Pro Thr Phe Leu Val Asp Ala Leu Leu Tyr Trp Thr Ser Leu115 120 125Lys Pro Glu Lys Ala Leu130(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(ix)特征(A)名称/关键词正向引物(xi)序列描述SEQ ID NO30GCTTCGGGCG CTGTAGTA 18(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子类型核酸(ix)特征(A)名称/关键词反向引物(xi)序列描述SEQ ID NO31AAAACAATCT CTTGCTGGAA 20(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度1613个碱基对(B)类型核酸
(C)链性双链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO32CATCCATACT GGTCAGAGGA ACATGATAGA AACCTGACAT TCTCAGTGCC TATACCTTCC 60TGTGTAAGCA GCGGCCAGGC TCATTTTGAC ACAGAATATC TCTCTCTGCT TGACTTCTAC120AAACCATGTG GCTCTACCTG GTTGCACTGG TGGGCCTGTG GACGCTCCTG CGCTTCTTCA180GGGAGAGGCA GGTNGTGAGC CATCTCCAAG ACAAGTATGT CTTCATCACG GGCTGTGACT240CTGGCTTTGG GAACCTTCTG GCCAGACAAC TGGACAGGAG AGGCATGAGG GTGCTAGCTG300CATGTCTGAC GGAGAAGGGA GCTGAGCAGC TGAGGAACAA GACATCTGAC AGGCTGGAGA360CAGTGATCCT GGATGTCACC AAGACAGAGA GTATTGTGGC AGCCACTCAG TGGGTGAAGG420AGCGTGTTGG GAACAGAGGA CTCTGGGGCC TGGTCAACAA TGCTGGCATC TGTGTCTTTG480CTATCAATGA GTGGCTGAAA AAAGAGGACT TTGCAAATAT ACTGGATGTG AACCTGTTGG540GCATGATCGA GGTGACTCTG AGCATGCTGC CCTTAGTGAG GAAGGCGAGG GGCCGTGTGT600TCAACATCTC CAGCTCCATG GGTCGAGTGT CTTTGTGTGG TGGTGGTTAC TGCATCTCCA660AGTATGGTGT AGAGGCCTTC TCAGACTCCC TCAGGAGGGA GATCTCCTAT TTTGGGGTGA720AGGTGGCTAT CATAGAGCCT GGCGGGTTCA GGACTAATGT CTCCAACTAC GAGAGGCTAT780CACACAGCAT AGAGAAGCTG TGGGACCAGA CATCCTCGGA GGTCAAGGAG GTCTATGACA840AGAATTTTCT GGACTCCTAT ATCAAAGCAA TACAGTCATT GACAGACACA TGCTCAGATG900ACCTGTCTGT GGTAACTGAC TGCATGGAGC ACGCTCTGAC TGCCTGTCAC CCTCGCACAA960GATACTCAGC TGGCTGGGAT GCCAAGCTCT TCTACCTACC CTTGAGCTAC ATGCCCACCT 1020TCCTGGTAGA TGCCATGTTG TACTGGAGCT CTGTAAAGCC TGCCCAAGCC CTGTGAATCT 1080GCACGTGTGT GCAGACTTGT GGCGGGTGGA GGGAGATAAT GGCACAGGGC ATGTGGTTCT 1140TGAGACTCAT TAAAACAATT CAGCTTCCAT ACTACTCAGA ACCAGTAAAG TTCAGGGGAA 1200AGAGGCAGTA AAGTTCTGCC AAGGGGGAGT GATACAAAGG GGCTGGCAAT ATCCTGTGAA 1260CTTAGCTTCT TGGGGCTTCA TCTTGGCCTA TTGTGAGAAT CCACAGGACT GCAGAGATTG 1320TAAACACCTA GGATGAGCTT TGCCTCTNNC CTTCCTCATG ATGTCCATGG GCCTGGCCAT 1380CATGGAAGAT CGAAAGAATC CACTTCACAA TCACCTTTTT CCATGGTGTC AGGAGGGAGG 1440GCCCCCACCC GCACTCCACA TCCTAATCGG CTTTAGGAGG TGGTTTTGCT GGTGGGATAG 1500AATCTTGCTA AGATAAACAA CAACAACAAT TTTTATTTGT CTCAAAACCA TGGTTTTTCT 1560TTGGATTCCT TTCATTTCAG AATAAAAGTT GAAAAGATAA AAAAAAAAAA AAA 1613(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度1384个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO33CTTTTTTTTT TTTTTTTTTG ACACAGAGTA TCTCTCTCTC TGCTTGACTT CTACAAGCCA 60TGTGGCTCTA CCTGGTGGCA CTGGTGGGCC TGTGGACGCT TCTGCGCTTC TTCAGGGTGA120GGCAGGTGGT GAGCCATCTC CAAGACAAAT ATGTCTTCAT CACGGGCTGT GACTCTGGCT180TTGGGACCCT GCTGGCCAGA CAGCTGGACA GGAGAGGCAT GAGGGTGCTG GCTGCATGTC240TGACGGAGAA GGGAGCCGAG GAGCTGAGGA ACAAGACATC TGACAGGCTG GAGACAGTGA300TCCTGGATGT CACCAAGACA GAGAGTATTG TGACAGCCAC TCAGTGGGTG AAGGAGCATG360TTGGGAACAG AGGACTCTGG GGCCTGGTCA ACAACGCTGG CATCTCCACC CCCTCGGGTC420CCAACGAGTG GATGAAAAAG CAGGACTTTG CACATGTACT GGATGTGAAC CTGTTGGGCA480TGATCGAGGT GACTCTGAGC ATGCTGCCTT TAGTGAGGAA GGCGAGGGGT CGTGTGGTCA540ACGTCTCCAG TGTCATGGGT CGAGTGTCTC TCTTTGGTGG TGGTTACTGC ATCTCTAAGT600ATGGTGTAGA GGCCTTCTCA GACTCCCTCA GGAGGGAGCT CCGCTACTTT GGGGTGAAGG660TGGCTATTAT AGAGCCTGGC TTCTTCCTGA CCGGTGTGAC CAGTAGTGCC AGATTATGCT720CAAATACCCA GATGCTGTGG GACCAGACCA GCTCAGAAAT CAGGGAGATC TATGGCGAGA780AGTACCTGGC ATCCTATCTG AAAAGGCTAA ACAAATTGGA CAAGAGGTGC AACAAGGACC840TGTCTGGGGT GACTGACTGC ATGGAGCATG CTCTGACTGC CTGTCACCCT CGTACCCGAT900ACTCAGCTGG CTGGGATGCT AAGCTCTTCT ACCTCCCCTT GAGCTACCTG CCCACCTTTC960TTGTGGATGC CCTTCTCTAC TGGACTTCCC TGAGGCCTGA AAAAGCCCTC TGAAAGTATT 1020CACCTATGTG CATACCTGGG GAGATGTAGG TAGAGTTTGA GAGAGAGAAT ATTTAGGGGA 1080AATTAGGAGA GTTGGGGGGG GATTTTATTA CTCTGGGGTT CAGTCAATAC ACTTCATCTT 1140GTTAATTCTC CTATGACACT ACTCAAGACT GATGATGACC AAAGAAATAG GCAAAGAATT 1200CTGCCAAGGG ATTCAGTTAC AAAAGAGCTG GCTGATGCCC AGATTATGAG CATCATGGCT 1260ACCATGAAGG TCCACACAGA TGAGGAGGCT GGGACAAGTT TGTGCCAAAG CACTCTCCTG 1320TGGTCCTCCT CTGCAGGAAA TGTACATGCC CTGGCTAGTT TAAACCCCTA TGCAAGATGG 1380AATT1384(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)长度1240个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO34CTTCTCTCTC TCTCTCTCTC TCTCTCCTCT TCTACAAACC ATGTGGCTCT ACATGGTGGC 60GCTACTGGGC CTGTGGATGC TCCTGCGCTT TTTTAGAGAG AGGCAAGTGG TGGACCATCT120TCAAGACAAG TATGTCTTCA TCACAGGCTG TGGCTCTGGC TTTGGGAACC TGCTGGCCAG180ACAGCTGGAC AGGAGAGGCA TGAGAGTGTT GGCTGCATGT CGGAAGGAGG AGGGAGCCGA240GGAGCTGAGG AGAAAGACAT CAGAAAGGCT GGAGACAGTG ATCCTGGATG TCACCAAGAC300AGAGAATATT GTGGCAGCCA CTCAGTGGGT GAAGGAGCGT GTTGGGAACA GAGGACTCTG360GGGCCTGGTC AACAACGCTG GCATCTCCGT CCCCTCGGGT CCCAACGAGT GGATGAAAAA420ACAGGACTTT GCAAGTGTAC TGGATGTGAA CCTGTTGGGC TTGATCGAGG TGACTCTGAG480CATGCTGCCC TTAGTGAGGA AGGCGAGGGG CCGTGTGGTC AACGTCTCCA GCATCTTGGG540CAGAGTGTCA CTTGGTGGTA GTGGTGGTTA CTGCATCTCC AAGTATGGTA TAGAGGCCTT600CTCAGACTCC CTTAGGAGGG ACGTCCGCTA CTTTGGGGTG AAGGTGGCTA TTATAGAGCC660TGGCTTCTTC CTGACTGGTA TGGCCAGTAG TGCCAGATTA TGCTCAAATA TCCAGATGCT720GTGGGACCAG ACCAGCTCAG AAATGCGGGA GATCTATGGA GAGAAATACC TGGCATCCTA780TCTGAAAAAC CTAAACGAAT TGGACCAGAG GTGCAACAAG GACCTGTCTG TGGTGACTGA840CTGCATGGAG CACGCTCTGA CTGCCTGTCA CCCTCGCACG AGATACTCAG CTGGCTGGGA900TGCTAAGCTC TTCTTCACCC CCTTGAGCTA CCTGCCCACC TTTCTTGTGG ATGCTCTTCT960ATACTGGACT TCTCCAAAAC CTGACAAAGC CCTGTGAAAG CTAGATCCTT TTGTGTTGTT 1020GGGTCAATGG AAGTGCTGTG TGAGGGTGCA GANNCTCAGG AGGAGGAAGA TTCCTGTTCT 1080CAGCCCACAT GTGCTGTGCA TAGGTGCCTG GCTTTTTCTT CCTCTGTATA ACATGGGGGA 1140CATGGGACCA CAGGAATCTG CTATGCTTAA ATGATCATTA CCATTGTTGG TGAAAGAAAA 1200AAAACGACCT CCCCTGTCTC GGGTTAAAAA AAAAAAAAAA 1240(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)长度1146个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO35CGCTTGAGAG CTTTCCCCAG AGGCTGCCCT CAGCAGGGCA TCTCATCCCA TCATGTGGCT 60GCCTCTGCTT CTGGGTGCCT TGCTGTGGGC AGTGCTGTGG TTGCTCAGAG ACCGGCAGAG120CCTGCCGGCC AGTGATGCTT TCATCTTCAT CACTGGCTGT GACTCTGGCT TTGGGCGCCT180CCTGGCACTG CAACTTGACC AGAAGGGCTT CCAAGTCCTG GCCGGCTGCC TGACCCCCTC240TGGAGCAGAA GACCTGCAGC AGATGGCCTC CTCCCGCCTC CACACAACAC TACTGGATAT300CACTGATCCC CAGAATGTCC AGCAAGTTGC CAAGTGGGTG AAGACACGTG TTGGAGAAAC360TGGACTTTTT GGTCTGGTGA ATAACGCTGG CGTAGCTGGT ATCATCGGGC CCACACCATG420GCTAACACAG GATGATTTCC AGAGAGTACT GAGTGTGAAC ACACTGGGGC CCATCGGTGT480CACCCTTGCC CTGCTGCCCC TGCTACAGCA GGCCAGGGGT CGGGTGGTCA ACATCACCAG540TGTCTTGGGC CGCATAGCAG CCAATGGCGG GGGCTACTGT GTCTCCAAGT TTGGCCTGGA600GGCCTTCTCT GACAGCCTGA GGCGGGACAT GGCTCCGTTC GGAGTACAAG TCTCCATTGT660GGAGCCTGGC TTCTTTCGAA CCCCTGTGAC CAACCTGGAG AGTCTGGAGA GCACCCTGAA720GGCTTGTTGG GCCCGGCTAC CTCCAGCTAT ACAGGCCCAC TACGGGGAAG CCTTCCTCGA780TACTTATCTT CGAGTACAGC GCCGCATCAT GAACCTGATC TGTGACCCAG AACTAACGAA840GGTGACCAGC TGCCTGGAGC ATGCCCTGAC TGCTCGCCAC CCCCGAACAC GCTACAGCCC900AGGCTGGGAT GCCAAGCTGC TCTGGCTGCC TGCCTCCTAC CTTCCAGCCA GGGTGGTGGA960TGCTGTGCTC ACCTGGATCC TTCCCCGGCC CGCCCAGTCA GTCTCCTGAT TCCAGCTTTA 1020CAGCAAGAGG CTGATTTTGA AAAGCAAGGC ATCTATTTCT GTGTCTACCC AGTGCTGCCT 1080GGTTTCTGAT ACCAATTAGG CTCTCAATAA ATATGTATTG CTTTAAAAAA AAAAAAAAAA 1140AAAAAG 1146(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)长度316个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO36Met Trp Leu Tyr Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Trp Thr Leu Leu Arg5 10 15Phe Phe Arg Glu Arg Gln Val Val Ser His Leu Gln Asp Lys Tyr Val20 25 30Phe Ile Thr Gly Cys Asp Ser Gly Phe Gly Asn Leu Leu Ala Arg GLn35 40 45Leu Asp Arg Arg Gly Met Arg Val Leu Ala Ala Cys Leu Thr Glu Lys50 55 60Gly Ala Glu Gln Leu Arg Asn Lys Thr Ser Asp Arg Leu Glu Thr Val65 70 75 80Ile Leu Asp Val Thr Lys Thr Glu Ser Ile Val Ala Ala Thr Gln Trp85 90 95Val Lys Glu Arg Val Gly Asn Arg Gly Leu Trp Gly Leu Val Asn Asn100 105 110Ala Gly Ile Cys Val Phe Ala Ile Asn Glu Trp Leu Lys Lys Glu Asp115 120 125Phe Ala Asn Ile Leu Asp Val Asn Leu Leu Gly Met Ile Glu Val Thr130 135 140Leu Ser Met Leu Pro Leu Val Arg Lys Ala Arg Gly Arg Val Phe Asn145 150 155 160Ile Ser Ser Ser Met Gly Arg Val Ser Leu Cys Gly Gly Gly Tyr Cys165 170 175Ile Ser Lys Tyr Gly Val Glu Ala Phe Ser Asp Ser Leu Arg Arg Glu180 185 190Ile Ser Tyr Phe Gly Val Lys Val Ala Ile Ile Glu Pro Gly Gly Phe195 200 205Arg Thr Asn Val Ser Asn Tyr Glu Arg Leu Ser His Ser Ile Glu Lys210 215 220Leu Trp Asp Gln Thr Ser Ser Glu Val Lys Glu Val Tyr Asp Lys Asn225 230 235 240Phe Leu Asp Ser Tyr Ile Lys Ala Ile Gln Ser Leu Thr Asp Thr Cys245 250 255Ser Asp Asp Leu Ser Val Val Thr Asp Cys Met Glu His Ala Leu Thr
260 265 270Ala Cys His Pro Arg Thr Arg Tyr Ser Ala Gly Trp Asp Ala Lys Leu275 280 285Phe Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Met Pro Thr Phe Leu Val Asp Ala Met290 295 300Leu Tyr Trp Ser Ser Val Lys Pro Ala Gln Ala Leu305 310 315(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)长度317个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO37Met Trp Leu Tyr Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Trp Thr Leu Leu Arg5 10 15Phe Phe Arg Val Arg Gln Val Val Ser His Leu Gln Asp Lys Tyr Val20 25 30Phe Ile Thr Gly Cys Asp Ser Gly Phe Gly Thr Leu Leu Ala Arg Gln35 40 45Leu Asp Arg Arg Gly Met Arg Val Leu Ala Ala Cys Leu Thr Glu Lys50 55 60Gly Ala Glu Glu Leu Arg Asn Lys Thr Ser Asp Arg Leu Glu Thr Val65 70 75 80Ile Leu Asp Val Thr Lys Thr Glu Ser Ile Val Thr Ala Thr Gln Trp85 90 95Val Lys Glu His Val Gly Asn Arg Gly Leu Trp Gly Leu Val Asn Asn100 105 110Ala Gly Ile Ser Thr Pro Ser Gly Pro Asn Glu Trp Met Lys Lys Gln115 120 125Asp Phe Ala His Val Leu Asp Val Asn Leu Leu Gly Met Ile Glu Val130 135 140Thr Leu Ser Met Leu Pro Leu Val Arg Lys Ala Arg Gly Arg Val Val145 150 155 160Asn Val Ser Ser Val Met Gly Arg Val Ser Leu Phe Gly Gly Gly Tyrl65 170 175Cys Ile Ser Lys Tyr Gly Val Glu Ala Phe Ser Asp Ser Leu Arg Arg180 185 190Glu Leu Arg Tyr Phe Gly Val Lys Val Ala Ile Ile Glu Pro Gly Phe195 200 205Phe Leu Thr Gly Val Thr Ser Ser Ala Arg Leu Cys Ser Asn Thr Gln210 215 220Met Leu Trp Asp Gln Thr Ser Ser Glu Ile Arg Glu Ile Tyr Gly Glu225 230 235 240Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Arg Leu Asn Lys Leu Asp Lys Arg245 250 255Cys Asn Lys Asp Leu Ser Gly Val Thr Asp Cys Met Glu His Ala Leu260 265 270Thr Ala Cys His Pro Arg Thr Arg Tyr Ser Ala Gly Trp Asp Ala Lys275 280 285Leu Phe Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Leu Pro Thr Phe Leu Val Asp Ala290 295 300Leu Leu Tyr Trp Thr Ser Leu Arg Pro Glu Lys Ala Leu305 310 315(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)长度318个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO38Met Trp Leu Tyr Met Val Ala Leu Leu Gly Leu Trp Met Leu Leu Arg5 10 15Phe Phe Arg Glu Arg Gln Val Val Asp His Leu Gln Asp Lys Tyr Val20 25 30Phe Ile Thr Gly Cys Gly Ser Gly Phe Gly Asn Leu Leu Ala Arg Gln35 40 45Leu Asp Arg Arg Gly Met Arg Val Leu Ala Ala Cys Arg Lys Glu Glu50 55 60Gly Ala Glu Glu Leu Arg Arg Lys Thr Ser Glu Arg Leu Glu Thr Val65 70 75 80Ile Leu Asp Val Thr Lys Thr Glu Asn Ile Val Ala Ala Thr Gln Trp85 90 95Val Lys Glu Arg Val Gly Asn Arg Gly Leu Trp Gly Leu Val Asn Asn100 105 110Ala Gly Ile Ser Val Pro Ser Gly Pro Asn Glu Trp Met Lys Lys Gln115 120 125Asp Phe Ala Ser Val Leu Asp Val Asn Leu Leu Gly Leu Ile Glu Val130 135 140Thr Leu Ser Met Leu Pro Leu Val Arg Lys Ala Arg Gly Arg Val Val145 150 155 160Asn Val Ser Ser Ile Leu Gly Arg Val Ser Leu Gly Gly Ser Gly Gly165 170 175Tyr Cys Ile Ser Lys Tyr Gly Ile Glu Ala Phe Ser Asp Ser Leu Arg180 185 190Arg Asp Val Arg Tyr Phe Gly Val Lys Val Ala Ile Ile Glu Pro Gly195 200 205Phe Phe Leu Thr Gly Met Ala Ser Ser Ala Arg Leu Cys Ser Asn Ile210 215 220Gln Met Leu Trp Asp Gln Thr Ser Ser Glu Met Arg Glu Ile Tyr Gly225 230 235 240Glu Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Asn Leu Asn Glu Leu Asp Gln245 250 255Arg Cys Asn Lys Asp Leu Ser Val Val Thr Asp Cys Met Glu His Ala260 265 270Leu Thr Ala Cys His Pro Arg Thr Arg Tyr Ser Ala Gly Trp Asp Ala275 280 285Lys Leu Phe Phe Thr Pro Leu Ser Tyr Leu Pro Thr Phe Leu Val Asp290 295 300Ala Leu Leu Tyr Trp Thr Ser Pro Lys Pro Asp Lys Ala Leu305 310 315(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)长度318个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO39Met Trp Leu Pro Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Trp Ala Val Leu Trp5 10 15Leu Leu Arg Asp Arg Gln Ser Leu Pro Ala Ser Asp Ala Phe Ile Phe20 25 30Ile Thr Gly Cys Asp Ser Gly Phe Gly Arg Leu Leu Ala Leu Gln Leu35 40 45Asp Gln Lys Gly Phe Gln Val Leu Ala Gly Cys Leu Thr Pro Ser Gly50 55 60Ala Glu Asp Leu Gln Gln Met Ala Ser Ser Arg Leu His Thr Thr Leu65 70 75 80Leu Asp Ile Thr Asp Pro Gln Asn Val Gln Gln Val Ala Lys Trp Val85 90 95Lys Thr Arg Val Gly Glu Thr Gly Leu Phe Gly Leu Val Asn Asn Ala100 105 110Gly Val Ala Gly Ile Ile Gly Pro Thr Pro Trp Leu Thr Gln Asp Asp115 120 125Phe Gln Arg Val Leu Ser Val Asn Thr Leu Gly Pro Ile Gly Val Thr130 135 140Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Gln Gln Ala Arg Gly Arg Val Val Asn145 150 155 160Ile Thr Ser Val Leu Gly Arg Ile Ala Ala Asn Gly Gly Gly Tyr Cys165 170 175Val Ser Lys Phe Gly Leu Glu Ala Phe Ser Asp Ser Leu Arg Arg Asp180 185 190Met Ala Pro Phe Gly Val Gln Val Ser Ile Val Glu Pro Gly Phe Phe195 200 205Arg Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Ser Leu Glu Ser Thr Leu Lys Ala210 215 220Cys Trp Ala Arg Leu Pro Pro Ala Ile Gln Ala His Tyr Gly Glu Ala225 230 235 240Phe Leu Asp Thr Tyr Leu Arg Val Gln Arg Arg Ile Met Asn Leu Ile245 250 255Cys Asp Pro Glu Leu Thr Lys Val Thr Ser Cys Leu Glu His Ala Leu260 265 270Thr Ala Arg His Pro Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Gly Trp Asp Ala Lys275 280 285Leu Leu Trp Leu Pro Ala Ser Tyr Leu Pro Ala Arg Val Val Asp Ala290 295 300Val Leu Thr Trp Ile Leu Pro Arg Pro Ala Gln Ser Val Ser305 310 315(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO40TAGCTGGTAT CATCGGGCCC A 21(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO41AGAAACCAGG CAGCACTGG19(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO42CACGTGGAGA TCCGCCAG 18(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO43ACGTGGATCC CCGCCTTCAT TCCCGAACA 29(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO44TGGTATCGTG GAAGGACTCA TGAC 24(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO45ATGCCAGTGA GCTTCCCGTT CAGA 24(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO46GCTGGTCACC TTCGTTAGTT C 2权利要求
1.具有9和11-顺式视黄醇脱氢酶活性中的至少一种活性的、经SDS-PAGE确定的分子量为大约30kD至大约36kD的分离的蛋白质。
2.如权利要求1所述的分离的蛋白质，其还具有13-顺式视黄醇脱氢酶活性。
3.如权利要求1所述的分离的蛋白质，其具有9-顺式和11-顺式视黄醇脱氢酶活性。
4.如权利要求3所述的分离的蛋白质，其还具有13-顺式视黄醇脱氢酶活性。
5.如权利要求1所述的分离的蛋白质，其具有SEQ ID NO39所示的氨基酸序列的蛋白。
6.如权利要求1所述的分离的蛋白质，其中所说的蛋白质是哺乳动物的蛋白质。
7.如权利要求6所述的分离的蛋白质，其中所说的蛋白质是牛蛋白质。
8.如权利要求6所述的分离的蛋白质，其中所说的蛋白质是人蛋白质。
9.制备顺式视黄醛的方法，包括在适合于顺式视黄醛形成的条件下，将顺式视黄醇与权利要求1所述的分离的蛋白质相接触。
10.制备顺式视黄醇脱氢酶的特异抗体的方法，包括给一个非人的动物注射权利要求1所述的分离的蛋白质，并分离出由所说的非人的动物对所说的分离的蛋白质应答而产生的任何抗体。
11.具有选自SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，和SEQ IDNO38中的氨基酸的分离的蛋白质。
12.权利要求1所述蛋白质的分离的拮抗剂。
13.权利要求1所述蛋白质的分离的兴奋剂。
14.权利要求11所述蛋白质的分离的拮抗剂。
15.权利要求11所述蛋白质的分离的兴奋剂。
全文摘要
本文公开了经SDS－PAGE确定的分子量从大约30kD至大约36kD的、分离的膜相关蛋白。该蛋白具有顺式视黄醇脱氢酶活性,诸如9、11或13－顺式视黄醇脱氢酶活性,或者在多个位置上的顺式活性。本文还公开了其他的反式视黄醇脱氢酶。本文还公开了编码这些蛋白的核酸分子。
文档编号C12N1/21GK1271364SQ9880953
公开日2000年10月25日 申请日期1998年9月21日 优先权日1997年9月26日
发明者乌尔夫·埃里克松, 安德拉斯·西蒙, 安娜·罗默特 申请人:路德维格癌症研究所