专利名称：造血祖细胞长时培养的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明概括地是涉及造血细胞，更具体地是涉及体外造血细胞长时培养的方法和设备，以及将外源基因材料引入造血源细胞中的方法。本发明的背景循环血细胞，如红血球，白血球，血小板，淋巴细胞，是可识别前体是终末分化产物。在胚胎生命中，造血细胞出现在整个网状内皮系统中。在正常成人中，可识别前体的终末分化仅出现在骨骼中轴骨髓腔中，延伸到最接近的股骨和肱骨中。而这些前体细胞是从称作祖细胞的不成熟细胞起源的，通过它们在半-固态介质中，如甲基纤维素，培养1-3周发育成成熟血细胞邻近集落测定。
有关造血祖细胞的分离和提纯已有报道(参阅美国专利第5,061,620号)，但这种方法还不允许这种细胞的长时培养并保持它们的生存能力和多能性。
对鼠科动物骨髓中鼠科造血系统的研究已对鼠科系统有了详细的了解。此外，将逆转录基因转移到培养的鼠骨髓细胞中已成为可能。虽然转移逆转录基因到培养的鼠骨髓细胞中已成为可能，但基因转移到人类骨髓细胞中的效率一直令人失望，这反映出了人类长时骨髓培养一直受到骨髓细胞寿命，及更重要的保持造血祖细胞长时存活和多能性能力的事实限制。
最初发现人类骨髓培养物具有有限的造血潜能，产生减少量的造血祖细胞和成熟血细胞，细胞产出停止六到八周。对原始系统随后的修正只产生了很小的改进。这很大程度是由于造血祖细胞对环境影响及在体内发现的重要生长因子(造血细胞生长因子和细胞因子)的依赖。除了这些因素，细胞表面分子和胞外基质的相互作用对于造血祖细胞的存活和扩增是很重要的。以前提高造血祖细胞体外扩增和分化的尝试，是检测各种底物中细胞因子的效用，包括预种的基质和纤维结合蛋白。在培养环境中加入外源生长因子，特别是IL-3(白介素-3)和GM-CSG(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，可能会导致特异种类细胞的选择性扩增。这些发现显示，在造血祖细胞培养物中加入外源生长因子，致使原造血祖细胞的分化，从而耗尽了不成熟造血祖细胞量，会不利地影响原造血祖细胞的多能性。
其他方法是使用照射过的骨髓基质来种造血祖细胞，已显示出在长时培养原始细胞(LTCICs)中保持了这些细胞，并通过逆转录病毒载体增加造血祖细胞和LTCICs的转导。然而，这样产生了非自身骨髓移植免疫反应和感染的风险问题。纤维结合蛋白，一种细胞基质组分，在加强逆转录病毒转导时，减小了感染和免疫调节反应风险。然而，仅使用纤维结合蛋白对保持体外原造血祖细胞是不够的。
骨髓的三维微环境在保持造血干细胞生存能力和多能性方面起作用的假说，导致对模拟这种拓扑结构的研究。三维聚合物设备(如尼龙网)已显示出支持造血祖细胞的存活，扩增和多种类分化，但需要存在生长因子。这些因子可以外源加入，或通过与祖细胞共同培养的分泌基质细胞提供，或可通过加入基质细胞调节培养基。
骨髓移植的造血祖细胞扩增是人类长时骨髓培养物潜在的应用。人类自身和同种异体骨髓移植是目前用作治疗如白血病，淋巴瘤和其他危害生命疾病的方法。然而，对于这些方法，必须移出大量供体骨髓以保证有充足细胞输注。
提供造血祖细胞扩增的方法降低了对大量捐献骨髓的需要，使获取少量的捐献骨髓，然后在输注到受体之前体外扩增祖细胞的量成为可能。同样，已了解到少量的造血祖细胞在血流中循环。如果这些细胞可以选取并扩增，那么就有可能从外周血液中来获取移植所需量的造血祖细胞而减小对骨髓捐献的需要。
造血祖细胞扩增作为化疗的辅助治疗也是很有用的，并且是人类长时骨髓培养物另一种应用。多数化疗试剂通过杀死所有细胞完成细胞分裂起作用。骨髓是身体内最丰富的组织，因此，常常是化疗药物最开始损害的器官。结果是在化疗期间血细胞的产生迅速被破坏，在患者重新进行化疗治疗之前必须中止化疗以使造血系统补充血细胞供给。
提供造血祖细胞扩增成功的方法会大大促进产生大量进一步分化的特异种类前体细胞，从而提供大量分化的造血细胞，其具有很多用途，包括输血。
基因治疗在医学中是成长很快的领域，具有巨大的临床潜能。一般，基因治疗被定义为为了修正先天的基因错误，将外源基因引入到患者的细胞中。对基因治疗的研究在体外几种类型的细胞中和对动物的研究中已经进行了多年，最近一些临床试验已经开始。
人类造血系统是基因治疗的理想选择，因为对于治疗，造血干细胞容易接近(骨髓或外周血液收获)，并且它们被认为具有无限的自身更新能力(承担一生治疗)，再输注，能扩增及再生骨髓。不幸的是，基因转移到干细胞中的已达到的治疗水平还没有在人类中实施。对于成功的人类基因治疗一直提出的问题是，能够将所需的治疗基因插入到所选取的细胞中，以对患者有益的量。至今，有效地将外源基因引入到人类造血干细胞中的方法还是受到限制的。
这就存在一种在体外长时培养条件下，有益地影响造血祖细胞生存能力和多能性的需要。
存在一种提供大量分化的造血细胞的需要。
还存在一种提高外源基因材料转移到造血祖细胞中的效率的需要。
本发明的一个目的是提供，当保持造血祖细胞自身更新和多能性特性时，延伸造血酐细胞的体外生存能力的方法和设备。
本发明的另一个目的是提供，控制产生大量祖细胞特异种类和它们更多分化造血细胞的方法和设备。
本发明还有一个目的是提供，将基因转移和转导到造血源细胞中，具体地是到造血祖细胞中的改进方法。
本发明的这些和其他目的将在下面作更详细的描述。本发明的概述本发明，一个重要方面涉及培养造血祖细胞的改进方法，改进方法能，如增加一定量的造血祖细胞培养的时间。这样，本发明的一个方面是改进造血祖细胞培养物的保存。另一个方面是增加能从造血祖细胞样品中获得的子代的量。本发明还有一个方面是增加能从造血祖细胞样品中获得分化子代血细胞的量。
令人惊异地，依据本发明，发现造血祖细胞在没有外源生长试剂的情况下能培养延伸的一段时间，从而增加了造血祖细胞的供给并抑制了培养期间的祖细胞的损失和/或分化诱导。这样，在没有加入造血细胞生长因子，接种基质细胞或基质细胞调节培养基的情况下，本发明允许体外造血祖细胞培养物保存多5周，甚至多6，7或8周。这仅仅是通过在多孔固体支架中培养造血祖细胞完成的。
依据本发明的一个方面，提供一种用于造血祖细胞体外培养物的方法。将一定量的造血祖细胞引入到有相互连接的孔的多孔、固体基质中，孔大小足够允许细胞在整个基质中生长。在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基，和促进造血细胞分化的外源造血细胞生长因子(血清除外)的环境中，细胞在基质上和内培养。多孔基质可以是一种开放式细胞多孔基质，含开放空间百分比至少50％，较好地含至少75％。在一个具体实施中，多孔固体基质的孔由相互连接的韧带界定，韧带中心点直径平均小于150μm。
较好地，多孔固体基质是含碳材料的金属覆盖的网状开放细胞泡沫，金属涂层是从下列基团中选取的包括钽，钛，铂，(包括铂基团的其他金属)铌，铪，钨和它们的组合物。在较好的具体实施中，多孔固体基质是金属覆盖或未覆盖的，基质用下列生物试剂覆盖的，包括胶原质，纤维结合蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎症因子，粘多糖，vitrogen，它们的抗体和片段，这些因子的功能等同物，和它们的组合物。最好的金属涂层是覆盖有生物试剂的钽。在某些具体实施中，含种植造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质用凝胶状试剂充满占据基质的孔。
本发明较好的具体实施是固体的，单一宏观结构，即不是玻珠或填充玻珠的。它们还包括非生物可降解材料。
在其他具体实施中，在引入步骤前，从血液产品中获取造血祖细胞。较好的血液产品是未分级的骨髓。在其他具体实施中，方法进一步包括收获造血细胞的步骤。较好地，在第一培养阶段后的第一次收获和在至少另一次培养阶段后的至少另一次收获。然后将收获细胞在至少一种从下列基团中选取的外源加入试剂中培养，包括促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，接种基质细胞，和基质细胞调节培养基。
依据前述的任何具体实施，本发明的方法可以包括，在所说的第一培养步骤中，培养细胞是在不含造血祖细胞存活和增殖因子如白介素3，6和11，干细胞配体和FLT-3配体的环境中。如上面所提及的，发明者惊异地发现，在没有加入任何通常在在先技术中加入以预防造血祖细胞在几周内死亡的试剂的情况下，造血祖细胞能生长延伸的一段时间。本发明的另一个具体实施的第一培养步骤是在不含任何外源加入的造血祖细胞生长因子，除了血清的环境中实施的。
依据本发明可以认识到，现在培养造血祖细胞6，7或8周，并在这段时间内收获造血祖细胞，随后曝露在含促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子培养条件中是可能的。在这段时间中培养和收获是本发明不受约束的方面。
依据本发明的另一个方面，提供了一种造血祖细胞体外培养物产生造血源的分化细胞的方法。在第一培养步骤中，第一量的造血祖细胞在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基和促进造血细胞保持，扩增和/或分化的外源加入的造血细胞生长因子，除了血清的环境中，在一些条件下，培养一段时间以增加培养造血祖细胞的量，与所说的第一量相比，或增加造血祖细胞的功能，从而产生第二量的造血祖细胞。然后，在第二培养步骤中，至少部分第二量的培养造血祖细胞在含至少一种从下列基团中选取的试剂的环境中培养，以制备造血源的分化细胞，试剂包括促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，接种基质细胞和基质细胞调节培养基。在一个具体实施中，环境中不含促进造血祖细胞存活和增殖的造血细胞生长因子，包括白介素3，6和11，干细胞配体和FLT-3配体。在另一个具体实施中，第一培养步骤的环境是不含任何造血细胞生长因子，除了由于在营养培养基中加入而存在的血清。在本发明的这个方面，方法进一步包括第二培养步骤，是多个第二培养步骤，每个包括仅培养部分第二量的造血祖细胞。方法还包括在第一和第二培养步骤之间的收获步骤，其中收获步骤包括收获在培养前的至少部分第二量和在第二培养步骤中的至少部分第二量。收获步骤还可以是以时间间隔的多个收获步骤，在这种情况下，第二培养步骤可以是多个第二培养步骤，每个有一个收获步骤。较好的造血祖细胞源和较好的多孔固体基质如上所述。
依据本发明的另一个方面，提供了造血祖细胞体外培养物产生造血源分化细胞的方法。在第一培养步骤中，造血祖细胞在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基和促进分化的外源加入的造血细胞生长因子，除了血清的环境中培养，以产生培养的造血祖细胞。间歇地收获部分培养的造血祖细胞，以产生多个间歇收获的部分培养造血细胞。然后，在多个第二培养步骤中，多个间歇培养收获部分在包括至少一种从下列基团中选取的试剂的环境中培养，以产生造血源的分化细胞，试剂包括促进分化的造血细胞生长因子，接种基质细胞和基质细胞调节培养基。在一个具体实施中，第一培养步骤的环境不含促进造血祖细胞存活和增殖的造血细胞生长因子，如白介素3，6和11，干细胞配体和FLT-3配体。在另一个具体实施中，第一培养步骤的环境不含任何造血细胞生长因子，除了由于在营养培养基中加入而存在的血清。在本发明的这个方面，较好的造血祖细胞源和较好的多孔固体基质如上所述。
依据本发明的另一个方面，提供了将外源基因材料转导入造血源细胞中的方法。造血细胞在有相互连接的孔，孔的大小足以允许细胞在整个基质中生长的多孔固体基质中培养。在基质内和上用外源基因材料原位转导细胞。令人惊异地发现，当用在基质上培养的细胞实施时，基因材料的转移效率出乎意料地增加了。较好的多孔固体基质各种具体实施的特性如上所述。同样，在这个具体实施中，造血细胞可以是造血祖细胞，并且细胞，不论是否是祖细胞，可在不含促进分化的因子，促进存活和增殖的因子，任何无论什么造血细胞生长因子，接种基质细胞或基质细胞调节培养基的环境中培养。
依据本发明的另一个方面，提供了培养细胞的装置。装置包括含有相互连接的孔，孔的大小允许细胞在整个基质中生长的多孔固体基质的第一细胞培养箱。装置还包括第二细胞培养箱。管道提供第一和第二细胞培养箱之间的流体交流。收集箱位于第一和第二细胞培养箱之间，收集箱中断了第一和第二细胞培养箱之间通过管道的流体交流。在收集箱一边的第一入口阀是提供从第一培养箱进入收集箱中的流体。在收集箱的另一边的出口阀提供从收集箱到第二培养箱中的流体。最后，收集箱有一个第二入口阀来引入所需的流体到收集箱中，而不是从第一培养箱中来的流体，这样流体可以间歇地从第一培养箱中移出，提供到第二培养箱中，第一培养箱不会被第二培养箱中的流体污染。
依据本发明的另一个方面，提供了培养细胞的其他装置。这种装置包括含有相互连接的孔，孔的大小足以允许细胞在整个基质中生长的多孔固体基质的第一细胞培养箱。提供了将培养介质引入到第一培养箱中的在第一培养箱上的入口阀。还提供了第二细胞培养箱，第一和第二细胞培养箱通过管道彼此进行流体交流。提供在管道上的阀来控制第一和第二细胞培养箱之间的流体流动。
在任何一个前述装置中，可以提供含有相互连接的孔，孔的大小足以允许细胞在整个基质中生长的多孔固体基质的第二细胞培养箱。提供各种具体实施，其中多孔固体基质具有如上所述的一个或多个较好的特性。此外，各种细胞培养箱可有多个口和管道，以进行细胞培养箱内物料的取样，增加运送多种试剂到一个或另一个细胞培养箱内，及控制和允许通过任何一个或两个细胞培养箱的介质的连续流动。
在本发明的另一个方面中，提供了固体多孔基质，其中造血祖细胞，有或没有其子代，附着在固体多孔基质上。在一些具体实施中，基质细胞也可附着在基质上。多孔基质可以是一种含至少50％开放空间百分比的开放式细胞多孔基质，较好的是至少75％。在一个具体实施中，多孔基质的孔由相互连接的韧带界定，韧带中心点直径平均小于150μm。较好地，多孔固体基质是含碳材料的金属覆盖的网状开放细胞泡沫，金属涂层是从下列基团中选取的包括钽，钛，铂，(包括铂基团的其他金属)铌，铪，钨和它们的组合物。在较好的具体实施中，无论多孔固体基质是否有金属覆盖，基质都用从下列基团中选取的生物试剂覆盖，包括胶原质，纤维结合蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎症因子，粘多糖，vitrogen，它们的抗体和片段，这些因子的功能等同物，和它们的组合物。最好的金属涂层是覆盖有生物试剂的钽。在某些具体实施中，含种植造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质用凝胶状试剂充满占据基质的孔。
依据本发明的另一个方面，提供了造血祖细胞保持，扩增和/或分化的方法。这种方法涉及将含预种造血祖细胞和造血祖细胞子代的固体基质种植在受试体上。多孔基质含相互连接的孔，孔的大小足以允许细胞在整个基质中生长，多孔基质是含开放空间百分比至少50％的开放式多孔基质，较好的是75％。提供了各种具体实施，其中多孔基质具有如上所述的一种或多种较好特性。在某些其他具体实施中，多孔基质进一步包括附着在基质上的造血祖细胞和它们的子代，通过将一定量的造血祖细胞体外引入到多孔固体基质中，并在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基，及促进造血细胞保持，扩增和/或分化的外源加入的造血细胞生长因子，除了血清的环境中培养造血祖细胞。在另一个具体实施中，含种植造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质用凝胶状试剂充满占据基质的孔。
在任何前述具体实施中涉及造血细胞保持，扩增和/或分化使用造血细胞生长因子，所使用的造血细胞生长因子是从下列基团中选取的包括白介素3，白介素6，白介素7，白介素11，白介素12，干细胞因子，FLK-2配体，FLT-2配体，Epo，Tpo，GMCSF，GCSF，致癌蛋白M，和MCSF。
本发明的这些和其他方面在下面作更详细的描述。附图简要说明
图1是依据本发明的细胞培养装置的示意表示。
图2是1周时细胞泡沫和对比系统中CD34+HPCs的存活和扩增状况。
图3是3周和6周时细胞泡沫和对比系统中CD34+HPCs的存活和扩增状况。
图4是从细胞泡沫和对比培养物中分离的HSCs的CFU能力。
图5是1，3和6周时在细胞泡沫和补充细胞因子的BMS培养物中CD45+细胞的量。
图6是1，3和6周时在细胞泡沫和补充组合细胞因子的BMS中CD45+细胞的量。
图7是在纳克(顶部)和皮克(底部)浓度下，3周和6周时，在细胞泡沫中产出的CD45+34+细胞与BMS和塑料对比培养物中产出的相比的倍数差异。
图8表示从细胞泡沫和补充细胞因子的塑料培养物中分离细胞的总集落活性。
图9是在纳克浓度补充物试验中，3周和6周时，在细胞泡沫培养物中的总集落活性与塑料对比培养物中的相比的倍数差异。本发明的详细叙述本发明一个方面涉及在没有外源生长试剂的情况下在多孔固体基质中培养造血祖细胞。
多孔，固体基质是一种带有“类海绵”的形成相互连接网的连续孔的三维结构。基质可以是硬的或是有弹性的，它提供了细胞在上面生长的支架。它的孔是相互连接的，提供了连续网状通道延伸到整个基质，并允许营养物到处流动。较好的基质是含开放空间百分比至少50％，较好的是75％的开放式细胞泡沫基质。这样，较好地，开放空间占据基质的大部分。这可以认为最大化了细胞的迁移，细胞-细胞接触，细胞生长和接近营养物的空间。较好地，多孔基质由韧带网状基质构成，韧带中心点直径小于150μm，较好地小于60μm，这样细胞可以寄居在上面或与部分韧带相互作用。较好地，孔平均直径是约300μm，象松质骨。适当的基质可采用多种不同的方法获得。这样的方法包括溶剂浇铸或聚合物提取，多种材料的轨迹蚀刻，聚合物发泡，羟鳞灰石的有机骨架复制工艺，和其他此领域中普通技术人员熟知的方法。使用的材料可以是自然的或是合成的，包括生物材料如蛋白质，透明质酸，合成聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮，聚甲基甲基丙烯酸酯，甲基纤维素，聚苯乙烯，聚丙烯，聚氨基甲酸乙酯，陶如磷酸三钙，铝酸钙，羟鳞灰石和陶加强的或覆盖的聚合物。如果支架的起始材料不是金属的，可给三维基质使用金属涂层。金属涂层给基质提供进一步的结构支持和/或细胞生长和附着属性。用作涂层的较好的金属包括钽，钛，铂和在相同元素组中的金属如铂，铌，铪，钨和它们的合金组合物。金属覆盖方法包括如CVD法(化学蒸汽沉积法)。较好的基质，本文称作细胞泡沫，在美国专利第5,282,861号中有详细描述，该文献通过在此引述而合并于本篇。更具体地，较好的基质是网状开放式细胞底物，由质轻的，坚硬的含碳材料泡沫构成，具有由相互连接的网界定的开放空间，其中所说的泡沫材料有相互连接的连续通道，和沉积在网状开放细胞底物上金属材料的薄膜，覆盖了几乎全部相互连接的网，形成复合多孔生物适用材料，产生与自然松质骨相似的多孔微型结构。
另外，这样的基质可以用能促进培养造血细胞细胞附着的生物试剂覆盖，致使改进迁移，生长和增殖。并且，当这些基质用在造血祖细胞的体内保持，扩增和/分化时(即当基质和细胞种植在受试体时，参考下面所讨论的)，促进血管生成的生物试剂(血管化作用)和预防/减小炎症的生物试剂也可使用作基质的涂层。较好的生物试剂包括胶原质，纤维结合蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎症因子，粘多糖，vitrogen，它们的抗体和片段，这些因子的功能等同物，和它们的组合物。
血管生成因子包括血小板衍生生长因子(PDGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，基础成纤维细胞生长因子(bFGF)，bFGF-2，leptins，纤溶酶原激活物(tPA，uPA)，angiopoietins，脂蛋白A，转化生长因子-β，缓激肽，血管生成寡糖(如透明酸盐，硫酸类肝素)，凝血栓蛋白，肝细胞生长因子(也称作分散因子)，CXC趋化因子受体家族的成员。
抗炎症因子包括甾族和非甾族的化合物。实例包括烯氯苯乙酸(Alclofenac)、阿氯米松(Alclometasone Dipropionate)、阿孕奈德(Algestone Acetonide)、α-淀粉酶(Alpha Amylase)、安西法尔(Amcinafal)、安西非特(Amcinafide)、氨芬酸钠(Amfenac Sodium)、氢氯化氨普立糖(AmipriloseHydrochloride)、Anakinra、阿尼罗酸(Anirolac)、阿尼扎芬(Anitrazafen)、阿扎丙宗(Apazone)、巴柳氮钠(BalsalazideDisodium)、1-苄基吲唑-3氧乙酸(Bendazac)、苯嘌丙酸(Benoxaprofen)、盐酸苄达明(Benzydamine Hydrochloride)、菠罗蛋白酶(Bromelains)、溴四唑呱啶(Bropermole)、布地缩松(Budesonide)、卡唑洛芬(Carprofen)、环洛芬(Cicloprofe)、噌戊唑酮(Cintazone)、氯噻托酸(Cliprofen)、丙酸倍氯他索(Clobetasol Propionate)、丁氯倍氟松(Clobetasone Butyrate)、氯苯吡咯酸(Clopirac)、氯硫卡松丙酸酯(CloticasonePropionate)、醋酸三氟米松(Cormethasone Acetate)、去痒可的松(Cortodoxone)、去氟可特(Deflazacort)、丙酮缩羟强的松龙(Desonide)、去羟米松(Desoximetasone)、地塞米松-二丙酸倍氯松(Dexamethasone Dipropionate)、双氯芬酸钾(Diclofenac Potassium)、双氯灭酸钠(Diclofenac Sodium)、双醋二氟松(Diflorasone Diacetate)、二氟米酮钠(DiflumidoneSodium)、二氟苯水杨酸(Diflunisal)、醋酸丁酸二氟强的松龙(Difluprednate)、酞嗪并酞嗪二酮(Diftalone)、二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide)、丙酮缩四氢去炎松(Drocinonide)、甲地松(Endrysone)、恩莫单抗(Enlimomab)、依诺利康钠(EnolicamSodium)、嘧哔唑(Epirizole)、依托度酸(Etodolac)、依托芬那酯(Etofenamate)、联苯乙酸(Felbinac)、1-苯基-5-氨基四唑(Fenamole)、苯布芬(Fenbufen)、二氯苯氧苯乙酸(Fenclofenac)、氯环苯乙酸(Fenclorac)、苯吲柳酸(Fendosal)、苯吡恶二酮(Fenpipalone)、芬替酸(Fentiazac)、氟苯哌酮(Flazalone)、氟恶米松(Fluazacort)、氟灭酸(Flufenamic Acid)、氟咪唑(Flumizole)、醋酸9-去氟肤轻松(Flunisolide Acetate)、氟胺烟酸(Flunixin)、氟胺烟酸葡胺(Flunixin Meglumine)、氟考丁酯(Fluocortin Butyl)、氟甲孕松醋酸酯(FluorometholoneAcetate)、苯氟喹酮(Fluquazone)、氟联苯丙酸(Flurbiprofen)、炔氟联苯(Fluretofen)、丙酸氟地松(Fluticasone Propionate)、苯呋丙酸(Furaprofen)、痒芴丁酮酸(Furobufen)、氯氟舒松(Halcinonide)、Halobetasol Propionatc、双醋溴氟龙(Halopredone Acetate)、异丁苯乙酸(Ibufenac)、拔怒风(Ibuprofen)、布洛芬铝(Ibuprofen Aluminum)、皮考布洛芬(Ibuprofen Piconol)、伊洛达普(Ilonidap)、吲哚美辛(Indomethacin)、吲哚美辛钠(Indomethacin Sodium)、吲哚布洛芬(Indoprofen)、双甲氧苯吲哚(Indoxole)、吲四唑(Intrazole)、9-氟强的松龙-21-醋酸酯(Isoflupredone Acetate)、氧卓乙酸(Isoxepac)、伊索昔康(Isoxicam)、优布芬(Ketoprofen)、氢氯化洛非咪唑(Lofemizole Hydrochloride)、氯诺昔康(Lornoxicam)、Loteprednol(氯替泼诺)Etabonate、抗炎酸钠(MeclofenamateSodium)、甲氧胺苯酸(Meclofenamic Acid)、Meclorisone(甲氯松)Dibutyrate、甲苄氨茴酸(Mefenamic Acid)、美沙拉秦(Mesalazine)、甲氯恶唑酮(Meseclazone)、Methylprednisolone(甲泼尼龙)Suleptanate、吗尼氟酯(Morniflumate)、萘丁美酮(Nabumetone)、消毒灵(Naproxen)、萘普生钠(Naproxen Sodium)、甲基萘丙醇(Naproxol)、腈胺唑酮(Nimazone)、奥柳氧钠(Olsalazine Sodium)、铜锌过氧化物歧化酶(Orgotein)、苯夫丙酸(Orpanoxin)、苯恶丙酸(Oxaprozin)、羟保松(Oxyphenbutazone)、氢氧化瑞尼托林(Paranyline Hydrochloride)、木聚硫钠(Pentosan PolysulfateSodium)、Phenbutazone Sodium Glycerate、甲苯吡啶酮(Pirfenidone)、吡氧噻嗪(Piroxicam)、Piroxicam(吡罗昔康)Cinnamate、Piroxicam(吡罗昔康)Olamine(乙醇胺)、吡洛芬(Pirprofen)、强的松龙-奋乃静(Prednazate)、普立非酮(Prifelone)、丙哚乙酸(Prodolic Acid)、普罗喹宗(Proquazone)、胺丙恶二唑(Proxazole)、枸橼酸胺丙恶二唑(Proxazole Citrate)、双甲丙酰龙(Rimexolone)、氯马扎利(Romazarit)、水杨酸胆碱硫酸镁(Salcolex)、Salnacedin、萨利萨尔(Salsalate)、血根氯铵(Sanguinarium Chloride)、氯唑恶酮(Seclazone)、苯吲丝氨酸(Sermetacin)、羟甲噻胺嗪(Sudoxicam)、硫茚酸(Sulindac)、噻丙吩(Suprofen)、他美辛(Talmetacin)、2-间三氟甲基苯胺基烟酸酞酯(Talniflumate)、醋柳酞酯(Talosalate)、替布费龙(Tebufelone)、替尼达普(Tenidap)、替尼达普钠(Tenidap Sodium)、替诺昔康(Tenoxicam)、氧喹苯胺(Tesicam)、苄叉异喹酮(Tesimide)、四氢甲吲胺(Tetrydamine)、噻庚乙酸(Tiopinac)、替可的松-匹氨青霉素(Tixocortol Pivalate)、托耳米丁(Tolmetin)、托麦汀钠(Tolmetin Sodium)、三氯氟松(Triclonide)、三氟氨酯(Triflumidate)、叠氮吲酸(Zidometacin)、佐美酸钠(ZomepiracSodium)。
在本发明的某些具体实施中，含种植造血祖细胞(有或没有它们的子代)的多孔固体基质，用凝胶状试剂充满占据基质的孔。“种植”意指造血祖细胞，有或没有它们的子代，在用凝胶状试剂充满(或渗透)之前，基本上同时，或之后种植。如，细胞可以与凝胶状试剂混合，并在试剂充满基质的同时种植。在一些具体实施中，造血祖细胞，有或没有它们的子代，预种植在多孔基质上。依据本发明，一定量的细胞体外引入到多孔固体基质中，在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基和促进造血细胞保持，扩增和/或分化，除了血清的外源加入的造血细胞生长因子的环境中培养。
用凝胶状试剂“充满”的作用是将细胞包含在基质内，并帮助保持和/或加强对基质的附着。“凝胶状”试剂可以是一种初始能保持液态，在使用它进入到基质中后，在基质原位凝胶化。这样的凝胶化作用可以多种不同的方式发生，包括改变试剂温度，用能量源照射试剂(如光)等等。试剂能以从液态到半固态(凝胶状)到固态连续统一体存在。试剂的最终状态和凝胶化作用常常取决于所使用的具体的“凝胶状”试剂和其具体属性。较好的“凝胶状”试剂的特点在于其结构的多孔性，允许生长介质的营养物到达整个基质的细胞。“凝胶状”试剂示例包括纤维质多糖(如纤维素，半纤维素，甲基纤维素，等等)，琼脂，琼脂糖，清蛋白，海藻粘液素，粘液素，粘液，胶原质，葡糖胺聚糖，和蛋白聚糖(包括其硫酸盐形式)。在某些具体实施中，凝胶状试剂可以完全充满基质，在一些具体实施中部分充注，在另一些具体实施中最小量充注，仅作为基质外表面的涂层。充满的程度很大程度取决于所选“凝胶状”试剂的物理特性。在较好的具体实施中，“凝胶状”试剂是甲基纤维素，并且是完全充满的。
依据本发明的方法培养的细胞是造血祖细胞。本文所用的“造血祖细胞”是指有能力自身更新并分化成更成熟血细胞(本文也称“子代”)的不成熟血细胞，包括粒细胞(如前髓细胞，嗜中性粒细胞，嗜曙红细胞，嗜碱细胞)，红细胞(如网状细胞，红细胞)，凝血细胞(如成巨核细胞，产生巨核细胞的血小板，血小板)，单核细胞(如单核细胞，巨噬细胞)。此领域中已知这样的细胞可以包括或不包括CD34+细胞。CD34+细胞是存在于下面描述的“血液产品”中的不成熟细胞，表达CD34细胞表面标记，并认为其包括上述带有“祖细胞”属性的亚群细胞。
造血祖细胞可从血液产品中获得。使用在本发明中的“血液产品”是从身体或含造血源细胞的身体器官中获取的产品。这样的来源包括未分级的骨髓，脐带，外周血液，肝，胸腺，淋巴和脾。对此领域中的普通技术人员显而易见的是，所有前述粗制或未分级的血液产品可以用多种方法来丰富具有“造血祖细胞”特性的细胞。如，血液产品可以从更分化的子代中耗尽，更成熟，分化的细胞可通过其表达的细胞表面分子再次选取。或者，血液产品可通过选择CD34+细胞分级。如前面所提及的，此领域中认为CD34+细胞包括能自身更新并具多能性的亚群细胞。这样的选择可使用如，购买的磁性-CD34玻珠(Dynal，Lake Success，纽约)来实施。未分级的血液产品可从供体直接获得或从深低温保存中恢复得到。
使用在下面更详细描述的培养条件，使得依据本发明来保存造血祖细胞，以及刺激造血祖细胞量和/或集落形成单元潜能的扩增成为可能。一旦扩增的细胞，如，可以返回到身体中补充，补足患者的造血祖细胞群。这一点对于如，个体进行化疗后会适合。还有某些造血祖细胞量减少的基因条件，本发明的方法也可使用在这些情况中。
也可能获取依据本发明制备的增加量的造血祖细胞，用促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子刺激它们，在体外产生更成熟的血细胞。这样扩增的血细胞群也可如上所述应用在体内，或如此领域中的普通技术人员所公认的可作试验应用。这样的分化细胞包括上述的，以及T细胞，血浆细胞，红细胞，巨核细胞，嗜碱细胞，分叶核白细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜曙红细胞，血小板。
在本发明较好的具体实施中，造血祖细胞连续培养延伸的一段时间，以一定时间间隔或间歇地收获等分的培养细胞。“收获造血细胞”是指从基质上移出或分离细胞。这可以使用多种方法实施，如酶解，离心分离，电分离，或通过筛，或本发明中所推荐的，通过使用细胞接种的介质冲洗细胞。细胞可以进一步收集分离。“收获步骤以一定时间间隔”或“间歇地收获细胞”意指，收获部分细胞，留下另一部分细胞在构建的介质中继续培养，保持源细胞连续来源和它们的特性。收获“至少部分”意指收获亚群或全部。这样，正如本领域中普通技术人员所将理解的那样，本发明可用来扩增造血祖细胞的量，扩增的那些细胞的收获部分经处理以发育甚至更大量的分化细胞。
在依据本发明的所有培养方法中，除了另外提供的，使用的介质是传统用来培养细胞的介质。实例包括RPMI，DMEM。ISCOVES等。一般这些介质用人类或动物血浆或血清补充。这样的血浆或血清可以包含少量的造血细胞生长因子。然而，依据本发明使用的介质，可以与在先有技术中传统使用的介质不同。具体地，已经令人惊异地发现，在没有需要加入任何外源生长试剂(除了可能含在血浆和血清中的，下文中“血清”)，没有用基质细胞接种培养环境，没有使用基质细胞调节培养基的情况下，造血祖细胞能在上面描述的基质上培养延伸的一段时间。本发明之前，认为为了培养造血祖细胞至少一种前述的试剂是必需的。
与本发明有关的重要的生长试剂是造血细胞生长因子。造血细胞生长因子，意指影响造血细胞存活，增殖或分化的因子。只影响存活和增殖的，认为不促进分化的生长试剂包括白介素3，6和11，干细胞配体和FLT-3配体。促进分化的造血细胞生长因子包括集落刺激因子如GMCSR，GCSF，MCSF，Tpo，Epo，致癌因子M，除了IT3，6和11的白介素。前述因子对此领域中的普通技术人员是熟知的。大多数可以购得。它们可以通过提纯，通过重组方法获得，或能衍生或合成。
在本发明的一个方面中，造血祖细胞在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基和促进造血细胞分化的外源加入造血细胞生长因子，除了血清的环境中培养。“接种”基质细胞，意指细胞培养箱中不含已引入到箱内作为促进造血祖细胞存活，增殖或分化的接种物的基质细胞，但不包括自然含在分离的血液产品中的基质细胞。
本文所用的“基质细胞”包括纤维原细胞和间叶细胞，有或没有其他细胞和因子，可以在造血祖细胞之前或基本上同时种植，因此构建有利造血祖细胞随后的附着和生长条件。纤维原细胞可以通过活体组织检查从组织或器官中获得，包括胚胎纤维原细胞。这些纤维原细胞和间叶细胞可以用编码如一种上述造血细胞生长因子的外源DNA转染。
“基质细胞调节培养基”是指前述基质细胞已接种的培养基。温育实施足够长的时间以使基质细胞分泌因子到培养基中。这样的“基质细胞调节培养基”能用来补充造血祖细胞培养物促进它们的增殖和/或分化。
这样，当细胞在没有任何前述试剂存在的情况下培养时，本文是指细胞在没有加入这种试剂的情况下培养，除了在血清中，普通营养物介质中或分离的、未分级的或分级的血液产品可能存在的，其中含有造血祖细胞。
较好地，造血细胞培养物出现在增加这种细胞的量和这种细胞的集落形成潜能的条件下。使用条件是指此领域中已知的条件组合(如温度，二氧化碳和氧气含量，营养介质等)。增加细胞量充分的时间可由此领域中技术人员容易地确定，并能根据细胞种植的原始量的不同而变化。如，介质变色可以作为融合的指示。另外，更确切地，不同体积的血液产品可在相同的条件下培养，经规定的时间间隔收获细胞并计数，这样产生“对比曲线”，这些“对比曲线”可用来评估在后来情况中的细胞量。
同样地确定集落形成潜能的条件。集落形成潜能是细胞形成子代的能力。对它的检测对此领域中普通技术人员是熟知的，包括在半固体中种植细胞，用生长因子处理，计数集落的量。
依据本发明的另一个方面，提供了一种体内保持，扩增和/分化造血祖细胞的方法。方法包括将含预种植造血祖细胞和造血祖细胞子代的多孔固体基质植入受试体中。与本发明基质相同的基质植入在此领域中是熟知的(Stackpool GJ，等人，组合整形外科协会会议，1995年11月6-8日，圣迭戈，加利福尼亚，摘要手册p.45；Turner，等人生物材料科学21届年会，3月18-22圣弗朗西斯科，加利福尼亚，摘要手册p.45)。这样的基质是生物相容的(即无免疫反应性-无排斥)，能植入或移植到受试体多种不同的组织中。这些方法在很多方面是有用的，包括对造血祖细胞在体内，在受试体多种不同的组织中，或在不同受试体中保持，扩增和/或分化的研究。
如本文所用的，受试体是人类，非人类灵长类，牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫或啮齿类动物。人类造血祖细胞和人类受试体是特别重要的具体实施。如上所述，当本发明的基质用作这种体内植入研究时，促进血管生成(血管化作用)和/或预防/减少炎症的生物试剂也可用作基质的涂层。较好的生物试剂如上所述。如上所述，依据本发明在植入受试体之前，造血祖细胞预种植在多孔固体基质上并在体外培养。依据本发明，一定量的细胞体外引入到多孔固体基质中，在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基，和促进造血细胞保持，扩增和/或分化的外源加入造血细胞生长因子，除了血清的环境中培养。然后实施植入。
本发明还包括预料之外的发现了，如果转导发生在造血祖细胞在如上所述的固体多孔基质上和内时，造血祖细胞能够高效转导。如本文所用的“造血细胞转导”是指将外源基因材料转移到造血源细胞中的过程。术语“转导”，“转染”和“转化”在本篇全文中可相互交换使用，指将外源基因材料转移到细胞中的过程。如本文所用的，“外源基因材料”是指引入到造血祖细胞中的核酸或寡聚核苷酸，自然的或合成的。外源基因材料可以是自然存在于细胞中的基因复制，或可以不是在细胞中自然发现的。一般至少部分自然出现的基因在启动子的可操作控制下放置在载体构建中。
将核酸引入到细胞中可采用多种技术。这样的技术包括核酸-CaPO4沉淀物的转染，与DEAE有关的核酸的转染，用逆转录病毒转染包括有意义的核酸，脂质体调节转染，等等。对于某些应用，较好的是对具体细胞选取靶核酸。在这这情况中，依据本发明运送核酸到细胞中的载体(如逆转录病毒，或其他病毒；脂质体)可有靶分子附着在其上。如，对靶细胞上表面膜蛋白特异的抗体或靶细胞上受体的配体能结合在或掺入到核酸运送载体中。如，使用脂质体运送本发明的核酸，与表面膜蛋白结合的与胞吞作用有关的蛋白质可掺入到脂质体组成中用来靶中和/或促进吸收。这样的蛋白质包括对具体细胞种类tropic的蛋白质和片段。在循环中进行内化作用的蛋白质的抗体，靶胞内定位和加强胞内半衰期的蛋白质，等等。聚合物运送系统也已经成功地使用在将核酸运送到细胞中，如此领域中的技术人员已知的。这样的系统甚至允许口服运送核酸。
在本发明中，将外源基因材料引入到细胞中较好的方法是通过使用复制缺损逆转录病毒在基质上原位转导细胞。复制缺损逆转录病毒能指导所有病毒颗粒的合成，但不能制备感染颗粒。因此，这些基因改变的逆转录病毒载体可用来高效转导培养细胞中的基因，特别可用于本发明的方法中。逆转录病毒已经广泛地用来将基因材料转移到细胞中。此领域中提供了制备复制缺损逆转录病毒的标准方法(包括将外源基因材料掺入到质粒中，用质粒转染包装细胞系，通过包装细胞系制备重组逆转录病毒，从组织培养介质中收集病毒颗粒，用病毒颗粒感染靶细胞)。
使用逆转录病毒的主要优点在于病毒有效地插入编码治疗试剂的基因单拷贝到宿主细胞基因组中，从而使得外源基因材料被传递到细胞的子代上，当细胞分裂时。此外，已报道在LTR区域的基因启动子序列可加强插入编码序列在多种细胞类型中的表达。使用逆转录病毒表达载体的主要不利之处在于(1)插入突变形成，即将治疗基因插入到靶细胞基因组不想要的位置中，如导致不规范的细胞生长；(2)靶细胞需要按照由载体携带的要融合到靶基因组中的治疗基因扩增。尽管有这些显著的限制性，如果转导效率高和/或适合转导的靶细胞的量很大，那么通过逆转录病毒运送治疗上有效量的治疗基因是很有效的。
另一种用作造血细胞转化表达载体的候选病毒是腺病毒，一种双链DNA病毒。和逆转录病毒一样，腺病毒基因组适合用作基因转导的表达载体，即通过移出控制制备病毒自身的遗传信息。因为腺病毒通常在染色体外起作用，腺病毒的重组不会有插入突变形成理论上的问题。在另一方面，靶造血细胞的腺病毒转化作用不会产生稳定的转导。然而，最近已有报道某些腺病毒序列对载体序列具有染色体内融合特异性，这样就可以产生外源基因材料稳定的转导。
这样，本领域中的技术人员将能够明白的是，有很多适合的载体适用来将外源基因材料转移到造血细胞中。符合基因替换治疗的具体条件来选取适当载体运送治疗试剂，以及优化将所选取的表达载体插入到细胞中的条件，在此领域的无需过分试验的普通技术范围内。启动子特别具有启动转录所需的特异核酸序列。任意地，外源基因材料进一步包括获得所需基因转录活性必需的其他序列(即加强子)。适用的“加强子”是简单的任何非翻译DNA序列，在编码序列附近起作用，以改变启动子限定的基础转录水平。较好地，外源基因材料快速地从启动子下游引入到造血细胞中，这样启动子和编码序列有效地结合以便使编码序列转录。较好的逆转录病毒表达载体包括外源启动子元件以控制插入外源基因的转录。这样的外源启动子包括组成型和诱导型启动子。
自然产生的组成型启动子控制重要细胞功能的表达。这样，由组成型启动子控制的基因在细胞生长所有条件下表达。组成型启动子示例包括下列编码某些组成型或“持家”功能的基因的启动子次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，二氢叶酸还原酶(DHFR)(Scharfmamm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884626-4630(1991))，腺苷脱氨酶，磷酸甘油激酶(PGK)，丙酮酸激酶，磷酸甘油变位酶，肌动蛋白启动子[Lai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610006-10010(1989)]，和其他此领域中技术人员已知的组成型启动子。此外，许多病毒启动子在真核细胞中起组成型作用。这些包括SV40早期和晚期启动子；Moloney白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复序列(LTRs)；单纯疱疹病毒的胸苷激酶，连同其他启动子。因此，任何上面参考的组成型启动子都能用来控制异源基因插入的转录。
在诱导型启动子控制下的基因，仅在或很大程度地在诱导试剂(如在某些金属离子存在的情况下，在金属硫蛋白启动子控制下的转录会大大增加)存在的情况下表达。诱导型启动子包括当诱导因子被结合时刺激转录的效应元件(REs)。如有血清因子，类固醇荷尔蒙，视黄酸和环AMP的REs。可选取含特别RE的启动子以获得诱导型效应，在一些情况中，RE本身可以附着在不同的启动子上，从而对重组基因有诱导性。这样，通过选择适当的启动子(组合型或诱导型；强或弱)，在基因修饰造血细胞中控制治疗试剂的表达水平和存在是可能的。考虑上面公开的因子和患者的临床状况，选取和优化运送治疗上有效量的具体治疗试剂的因子，认为是在此领域的无需过分试验的普通技术范围内。
除了至少一种启动子和至少一种编码治疗试剂的异源核酸，表达载体较好地包括选择基因，如新霉素抗性基因，以促进选择已用表达载体转染或转导的造血细胞。另外，造血细胞能用两种或多种表达载体转染，至少一种含编码治疗试剂基因的载体，其他载体含选择基因。选取适当的启动子，加强子，选择基因和/或单序列，认为是在此领域的无需过分试验的普通技术范围内。
对在分离的造血细胞中表达特异基因产品的具体表达载体的选取和优化是通过获取基因，较好地用一种或多种适当的控制区域(如启动子，插入序列)；制备包括基因插入的载体的载体构建；在体外用载体构建转染或转导培养的造血细胞；确定是否基因产品存在于培养的细胞中来实施的。
表1由RAC批准的人类基因治疗方案1990-1994
前述(表1)，仅表示依据本发明的方法能运送的基因实例。对这些基因适用的启动子，加强子，载体等在与前述试验有关的文献中刊出。通常，有用的基因替代或补充功能，包括编码丢失酶如已使用在临床试验中治疗ADA缺失的腺苷脱氨酶(ADA)，和辅因子如胰岛素和凝固因子VII的基因。影响调节的基团可以单独服用或与补充或替代特异功能的基因一起服用。如编码抑制特种蛋白质-编码基因表达的蛋白质的基因可以服用。本发明对运送刺激免疫反应的基因特别有用，包括编码病毒抗原，肿瘤抗原，细胞因子(如肿瘤坏死因子)和细胞因子诱导物(内毒素)的基因。
本发明还提供了实施本发明的多种装置。较好的装置在图2中演示。图1中所演示具体实施的主要组成是一对细胞培养箱，一个培养箱用来在促进祖细胞存活，增殖，但不促进祖细胞分化的环境中连续培养造血祖细胞。其他细胞培养箱(可以是一个或多个第二细胞培养箱)用来间歇地接收在第一细胞培养箱中培养的部分细胞，在含促进造血祖细胞分化的生长因子的环境中培养。
参照图1，演示了第一细胞培养箱10，第二细胞培养箱12。细胞培养箱10，12的壁面由箱的内边界定。连接管道16提供了第一和第二细胞培养箱之间的流体交流。连接管道可以是第一和第二细胞培养箱之间的任何流体管道，尽管在所述的具体实施中，连接管道16包括多个阀和连接箱，下面作更详细的描述。第一和第二细胞培养箱10，12的每一个含多孔固体基质18，如上面所述。多孔固体基质18由基质载体20支持，使基质18离开壁面14提供了空间22使得介质在整个基质18中循环。较好地有限制流体围绕基质流动的密封，迫使流体流过基质。
第一细胞培养箱10提供有与介质进料管道26沟通的入口24，用作向第一细胞培养箱提供介质。入口24或介质进料管道26可提供有阀(未显示)，用作控制介质进入第一细胞培养箱。
第一细胞培养箱有关闭第一细胞培养箱的顶28。顶28可以用密封的方式与第一细胞培养箱的壁面14接合或，如在某些传统的细胞培养装置中的以允许气体交换的方式与第一细胞培养箱的壁面14接合。在所述的具体实施中，顶密封地与壁面接合。取样口30在顶28中并与取样管道32沟通，使得物料加入到第一细胞培养箱中或从中移出。较好地，如有关的第二细胞培养箱所示，下面作更详细的描述，可提供第二管道(增加管道)，取样管道用作从细胞培养箱中移出物料而增加管道用作将物料加入到细胞培养箱中。取样口30和/或取样管道32可提供有阀(未显示)，用作隔离第一细胞培养箱的内环境不受外环境的影响。
第一细胞培养箱还有一个出口34与管道16沟通。
第二细胞培养箱12，其中相同的数字表示相同的部分，第二细胞培养箱有壁面14，含由基质载体20支持的多孔沟固体基质18。第二细胞培养箱的顶28与第二细胞培养箱的壁面14密封接合。顶包括取样口30和与取样口30沟通的取样管道32，用作从第二细胞培养箱中获取样品物料。第二细胞培养箱12的顶28还包括出口34与出料管道36沟通，较好地，通过介质进料管道26进入，通过介质出料管道36离开，介质可以连续地在整个系统循环。第二细胞培养箱12还包括增加管道38，用作向第二细胞培养箱提供物料，较好地是向第二细胞培养箱提供诱导分化的造血细胞生长因子。
连接管道16，如上所述可以是任何管道，较好地在第一细胞培养箱10和第二细胞培养箱12之间有至少一个阀在这条管道上，在第一和第二细胞培养箱之间的介质流动可以中断。在所描述的具体实施中，连接管道16包括第一部分40离开第一细胞培养箱，终止在流体交流的收集箱42。连接管道的第二部分44提供从收集箱42到第二细胞培养箱12的流体交流。第一部分40由第一部分阀46中断，连接管道16的第二部分44可由第二部分阀48中断。
收集箱还与带有冲洗管道阀52的冲洗管道50进行流体交流。
在本发明操作装置的一个具体实施中，将在入口24和出口34的阀(未显示)，第一部分阀46，第二部分阀48，和第二细胞培养箱的出口34的出口阀(未显示)打开。将第一和第二细胞培养箱10，12的取样口30的阀，在第二细胞培养箱与增加管道38沟通口的阀(未显示)关闭，以及冲洗管道阀52关闭。这样，如果需要，可以连续地通过第一细胞培养箱，通过收集箱，通过第二细胞培养箱灌注介质。可以很容易地认识到，进入第一细胞培养箱的介质可以通过关闭阀48和打开阀52，避免与第二细胞培养箱接触。同样，通过打开与第二细胞培养箱沟通口上的阀，通过增加管道38，其可以仅向第二细胞培养箱提供介质，第二细胞培养箱可以接收与第一细胞培养箱接收介质不同的介质，可以增加从第一细胞培养箱中接收的介质或可以增加从冲洗管道50接收的介质。除了如上所述为本发明的第一培养步骤和第二培养步骤提供不同的介质需求，本装置还通过所示的管道排列提供箱与箱之间细胞转移。在这个具体实施中，对第一细胞培养箱使用轻柔的脉冲流体，足以从第一培养箱的多孔固体基质中移出造血祖细胞。然后这些细胞被流体运动从第一细胞培养箱带到收集箱中。如果需要，可以提供收集箱一种在箱内临时保持细胞的方式，如提供可移动的膜，过滤器等，尽管这样的结构不是操作本发明的装置所需的。一旦细胞在收集箱42内，阀46就能关闭。接着，阀52可以打开，由于流体压力细胞可从收集箱42冲到第二细胞培养箱12中。在这种方式中，由于关闭了阀46，所以保证了已加入到第二细胞培养箱中的造血细胞生长因子不回流到第一细胞培养箱，第一细胞培养箱被不想要的物料污染。然而，仅仅产生介质连续流动的压力可能就足以预防回流，关闭阀46可能是不必要的。对装置的进行许多修改对此领域中的普通技术人员是显而易见的。装置重要的方面是提供了两个细胞培养箱及它们之间的流体交流机理，和阀的布置等。第一细胞培养箱不能被加入向下流动到第二细胞培养箱中的不想要的物料污染。实例试验程序长时培养从人类骨髓中得到CD34+造血祖细胞(Poietic技术)，使用磁性抗-人类CD34+玻珠分离(Dynal，Lake Success，NY)，并使用抗-个体基因型抗体从玻珠中分离(分离玻珠，Dynal)。
所有培养条件用2×105个细胞种植，以保证有足够的细胞进行所有分析，特别是来自对比培养物的。当初步数据显示CD34+细胞在细胞泡沫中会存活很好时，可以预见不存在细胞因子的培养会使在对比培养物中细胞量减少。对于设计试验来说，估计最多75％的细胞(1.5×105个细胞)可能损失，每个反应器留下5×104个细胞，足够的细胞实施流动细胞计数，多能集落测试和LTCIC(长时培养原始细胞)分析。培养物作两份以提供每个培养时间点的并列的对比物。这样，每个培养时间点使用两个反应器，每个种植2×105个CD34+细胞。
在1ml介质中的2×105个CD34+细胞种植在覆盖骨髓基质细胞(塑料/BMS)的塑料培养皿上，覆盖纤维结合蛋白的塑料培养皿(塑料/FN)，或在细胞泡沫中。原骨髓基质细胞生长2-3周分离不均匀附着，短期测试中能支持HSCs的细胞类纤维原细胞群。所有培养物含1ml Myelocult培养基(干细胞技术，温哥华，加拿大)，一种作长时HPI培养的培养基。没有外源细胞因子加入到培养基中。如上述1，1.5，3和6周培养后，随着每周培养基变化，从所有培养条件/反应器收获所有细胞(附着的和未附着的)，计数，表面抗原染色。回收附着细胞是因为，一些原HPCs或HPC亚种可表现出附着属性，会使它们不能通过简单的冲洗或离心的方式收获。未附着细胞可通过简单的离心方式收获，用台式离心机在1500rpm(约250×G)离心10分钟。附着细胞用非胰岛素分离溶液(细胞分离溶液，Sigma，St.Louis，MO)收获，以最小化对表面染色特性的改变。为了从细胞泡沫中回收附着细胞，将单元浸没在PBS中冲洗两遍，浸透在过量细胞分离溶液中用瞬时涡流处理，37℃温育20分钟，在1500rmp离心10分钟。未附着细胞用轻柔冲洗从塑料/基质和塑料/FN系统中回收；附着细胞如上述用细胞分离溶液分离。用于表面显型确定的抗体包括抗-CD34(Qbend10，免疫技术)，抗-CD38(OKT10，ATCC，Bethesda，MD)和抗-CD45(BectonDickinson)抗体以评估祖细胞分布。细胞的流动细胞计数分析使用多-参数FACScan流动细胞计数分析法。适当的对比物包括匹配的同种型抗体以建立正和负的四分体，以及适当的单色染色剂以建立补偿。对每个样品，至少收集10,000list mode事件。集落形成测试为了确定是否培养在细胞泡沫中的HPCs不超过6周保持制备脊髓细胞和红细胞集落的能力，实施了传统的甲基纤维素测试。如上所述从细胞泡沫，塑料/BMS或塑料/FN培养物中分离出的等量细胞，加上含细胞因子(IL-3 20ng/ml；GMCSF 30ng/ml；促红细胞生成素3IU/ml；干细胞因子50ng/ml；所有干细胞技术，温哥华)的1×104/ml到3ml的甲基纤维素培养基加0.5ml的DMEM(2％FCS，10IU/ml青霉素，10μg/ml链霉素，1mM L-谷氨酸)。将1.5ml的这种混合物加到有刻痕的培养皿中，使用注射器和平整针以避免起泡。对每种条件进行双份测试。然后将两个双份培养皿置于含5％二氧化碳，37℃温育箱中10-21天。10-21天后，通过手工计数确定集落数。14-21天后积聚20个或更多个细胞评定正集落。红细胞集落在14-21天后用金-棕色素评定，表现血色素，而骨髓细胞集落通过它们明显的透明外观来确认。重复计数。T细胞淋巴细胞增殖培养的HPCs培养T-细胞淋巴细胞增殖的能力在体外T细胞分化测试中可测得，其中将从细胞泡沫或其他培养物中分离的细胞种植在胸腺基质组织上，由CD4和CD8单正性和CD4CD8双正性抗体染色评定产生成熟T细胞的能力。T细胞分化测试采用置于24个培养皿中的原胸腺基质细胞床来支持造血祖细胞分化成胸腺细胞和T细胞(参阅美国专利5,677,139，其全文通过在此引述而收入本篇)。在这个测试中，胸腺单层培养物是由一个月(third trimester)或新生的恒河猴胸腺组织制备的，通过切碎组织，然后用胶原酶和DNA酶消化成单细胞悬浮液。胸腺基质细胞悬浮液，可使用新鲜的或是深低温保存的样品，置于24个培养皿中。两天后，移去未附着的细胞，附着细胞层剧烈冲洗以移去任何松散细胞。培养6天后，分离的培养细胞加入到单层中。10-14天后，培养物作存在未成熟双正淋巴细胞(CD3+CD4+CD8+)，和成熟单正淋巴细胞(CD3+CD4+CD8-或CD3+CD4-CD8+)评定。在所有试验的类似试验中，含未分级的骨髓和CD34+细胞的双份对比物，都没有在细胞泡沫中培养过，在如上所述的试验中进行集落形成潜能和T淋巴细胞增殖评定。集落总数表示在细胞泡沫，塑料或骨髓基质培养物中存在的，在存在细胞因子的情况下保持能产生分化的红细胞或骨髓细胞集落的干细胞相对量。LTCIC测试和LTCIC转导作为细胞泡沫支持细胞长时再集群潜能能力的一种指示，实施修正的LTCIC测试。LTCIC是相对静止的细胞，表现出在骨髓基质培养物中延长的存活特性，在这段时间它们逐渐获得体外产生红细胞和骨髓细胞集落所需的显型。这个研究的重要目的是确定使用细胞泡沫支持LTCIC体外逆转录病毒转导。这些细胞是相对静止的，这样很难有效地转导。加强转导可通过延长时间实施细胞泡沫中细胞的双周转导方便获得。细胞泡沫培养物如上所述，用2×105个细胞接种，用高滴定度逆转录病毒上清液(从ATTC获取的PG13LN，在ACS柱体中生长的，滴定度1×106CFU/ml)一周两次实施半体积培养基交换。PG13LM载体按如下制备将逆转录病毒产生细胞种系接种在表面积不超过1800cm2的柱体中，细胞种系是从循环组织培养基中通过分子量极限值10,000kd的半渗透膜分离的。介质通过蠕动泵在毛细血管外空间的连续循环作用优化了气体和营养物的交换，致使逆转录病毒载体的产量显著增加。使用生物反应器制备的逆转录病毒载体上清液的末点稀释滴定度的平均增加与组织培养烧瓶相比是10-20倍，在有些实例中记录的有100倍的增加。在连续灌注柱体中制备的逆转录病毒载体上清液的感染性滴定度可通过在COS细胞上的噬斑形成试验确定。
除了逆转录病毒培养基的交换，其他培养基与LTCIC培养基交换每周实施一次。传统LTCIC培养物使用制备的骨髓基质作为对比物，并如类似细胞泡沫培养和转导相同的一段时间。还尝试在覆盖有纤维结合蛋白的塑料培养皿上培养LTCIC。所有培养体积是相同的。接着在每个设备中进行转导，实施甲基纤维素CFU测试。在每个设备中进行转导的全部细胞重新悬浮在3ml的甲基纤维素培养基中，加入细胞因子IL-3(20ng/ml)，干细胞因子(50ng/ml)，促红细胞生成素(3IU/ml)和GMCSF(30ng/ml)，甲基纤维素测试的所有部分重新置于存在或不存在新霉素类似物G418(400-800μg/ml)的35mm培养皿中。两周后，使用上述标准评定集落。集落计数表示最初6周培养阶段后LTCIC的存活状况。有G418和没有G418相比的存活状况表示，在最初培养阶段已经转导的LTCICs的存活状况。这些细胞的存在是作为长时再集群细胞，LTCICs的存活状况的衡量，和它们在细胞泡沫中与塑料/BMS和塑料/FN中的相对转导水平的衡量。很重要的是在细胞泡沫中细胞最初培养6周定义了测量LICIC的传统极限值。这样，在细胞泡沫中培养3或6周，接着在骨髓基质中培养6周，LTCIC测试延伸了LTCICs的传统定义。
实例1实施延伸培养存活研究，检测在没有补充细胞因子存在情况下CD34+HPC细胞在1，3或6周时的量。培养在纤维结合蛋白覆盖的细胞泡沫中实施，并与在骨髓基质中和纤维结合蛋白覆盖的塑料培养皿中培养的相比，与类似对比培养物相比，在细胞泡沫中没有细胞因子补充培养的CD34+HPCs表现出加强的存活状况和显著的丰富度。在对比系统中HPCs的损失支持了没有外源细胞因子时它们不能支持HPCs的记录。塑料培养皿培养物用与BMS相同方式实施。相反地，在细胞泡沫中1周时CD34+细胞计数比所分析的其他系统高2.5-3倍，比进入量增加了80-110％。3周和6周时，在细胞泡沫中测得的CD34+细胞是对比物中的6到10倍。细胞量的增加是可再生的，并且在不存在细胞因子的情况下。此外，还能计数未成熟细胞群(显型CD34+CD38-)，在3周和6周时与骨髓基质培养物相比，在细胞泡沫中富含未成熟细胞群；结果在图3中演示(第一柱表示3周，第二柱表示6周)。
实例2此外，评估从多周细胞因子培养物中分离的细胞群的多能性。使用的试验是传统的甲基纤维素集落形成试验，来评估骨髓细胞和红细胞集落形成细胞，和公布的淋巴细胞形成试验，来评估T细胞前体活性。可以观察到，从细胞泡沫培养物中分离的HPCs保持的红细胞(RBC)和白细胞(WBC)集落形成能力，比类似对比培养物中大很多。评估所有培养物中的CFU-GM和BFU-E；骨髓∶红细胞比率约为2∶1。3周时，细胞泡沫培养物产出比对比培养物多至31倍的集落，比进入量增加16倍(参阅图4)。6周时，在BMS和和塑料纤维结合蛋白培养物中HPCs损失了几乎全部的集落形成能力。细胞泡沫中的HPCs显示出比对比分离细胞大1000倍的产生集落的能力(参阅图4)。
实例3在体外T细胞分化试验中，测定培养的HPCs培养T细胞淋巴细胞生成能力。细胞泡沫和对比培养物3周和6周培养终止后，用原胚胎胸腺基质与组合附着/未附着组分的等份进行共培养。通过测定CD4和CD8的单正性和CD4CD8双正性抗体染色，评估产生成熟T细胞的能力。当在3周和6周从细胞泡沫和对比培养物中收获细胞，并置于T细胞试验中时，只有从细胞泡沫中回收的细胞在两个时间点产生T细胞子代。从FN/塑料中回收的细胞没有产生T细胞子代。BMS培养物中回收的细胞在3周时产生了T细胞子代，但在6周时没有产生。从细胞泡沫培养物中获取的子代包括CD4+CD8+胸腺细胞和CD4+和CD8-单正细胞，大部分胸腺细胞表达CD3，有效T细胞发育的其他指示。至今，没有体外培养系统已显示能有效并再生地支持包括T细胞子代的HPC群的保持。由于对多能性的检测一般受到骨髓细胞和红细胞集落产生的限制，所以评估T细胞子代大大加强了对在细胞泡沫中长时培养的细胞真实性质的评估。如数据所演示的，细胞泡沫与对比物相比，较大程度支持T细胞祖细胞存活。重要的是，细胞泡沫提供了体外保持多能HPCs的有效长时培养系统。
实例4还进行检测细胞泡沫支持LTCICs存活的能力，LTCIC是可以代表宿主重建极需的更多未成熟造血祖细胞。这些研究使用LTCICs(从培养物中获取的较长存活祖细胞，长至14周)，将其置于传统的含照射过的BMS细胞的LTCIC板上。可以发现，从纤维结合蛋白覆盖的细胞泡沫中分离的HPCs保持LTCIC最初3周培养期(培养共9周)。细胞泡沫比BMS培养物产出多17.5倍的LTCICs。没有纤维结合蛋白覆盖的细胞泡沫比BMS培养物产出增加4倍的LTCIC活性。这些数据说明细胞泡沫与对比系统相比，较大程度保持LTCIC活性。这提供了另一个证据说明细胞泡沫对培养HPCs是有利的，因为长时存活细胞被认为是原造血祖细胞含量的重要指示。六周培养，接着6周LTCIC试验和2周集落试验，塑料培养物的细胞没有产生LTCICs。同样地，BMS培养物损失了所有存活的ECHCPs。然而，细胞泡沫培养物产出了令人鼓舞的LTCIC量，产出平均是BMS产出量36倍的LTCICs。与BMS培养物(p＝0.05，n＝6)产生的0.5+/-0.7 LTCICs每104个细胞相比，细胞泡沫产生18+/-11LTCICs每104个细胞。纤维结合蛋白覆盖的细胞泡沫单元比未覆盖的细胞泡沫单元增加对ECPHC的保存约2倍。未覆盖单元产生8+/-11LTCICs每104个细胞，比BMS培养物增加16倍。与3周的时间点相比，在细胞泡沫中6周时间点保持约一半量的LTCICs。这说明静止培养物具有有限的保持长时培养物细胞的能力，或对更多未成熟，长存活细胞的选择正在进行。很有必要指出在11和14周保持LTCICs的量代表了HPCs培养中显著的突破。已有报道，在保持长存活细胞和包括细胞亚群的原HPCs之间是有相关性的，细胞亚群可能是自身更新或长时宿主重建的重要原因。如预先数据显示的，在细胞泡沫中经长时培养的细胞仍保持多能性，还显示细胞泡沫系统可能代表了提供最适骨髓移植和脱落宿主再集群所需的原干细胞的一种可实施的技术。
实例5此外，检测集落形成HPCs的转导，在PG13LN逆转录病毒载体中使用新霉素抗性基因3天。在细胞泡沫中的集落形成祖细胞的转导比BMS和塑料系统至少多40-50％的有效性。同样地，使用细胞泡沫的LTCICs的转导效率提高了约40-50％。LTCICs在细胞泡沫或BMS中培养6周。在存在或不存在新霉素类似物的情况下，从BMS获取的细胞不能产生集落。相反，在G418+和G418-的试验中都可获得集落，说明在细胞泡沫中，在存在逆转录病毒的情况下LTCICs活性被保存了，LTCICs转导能在细胞泡沫中的这些细胞上实施，效率50％。
实例6通过在细胞泡沫上培养造血细胞(包括CD34+细胞和未成熟CD34+CD38-细胞)，检测低含量细胞因子补充对长时HPCs存活和多能性的影响。可以发现，补充远低于先有技术中所使用量的细胞因子产生改进的造血细胞量，及集落形成活性和未成熟祖细胞的保持和扩增。这一点与此领域中显示的研究内容，即高含量的细胞因子可能改变长数据HPCs的存活和多能性相反。因此，能在细胞泡沫上培养的HPCs中使用皮克和纳克量的细胞因子提供了一个机会，第一次在不改变它们的多能性/功能的情况下扩增HPCs。如对此领域中普通技术人员是显然的，本发明能使用纳克/ml和皮克/ml浓度范围的特种细胞因子获得HPCs量和功能方面的可再生的，实际的增加。
这种没有预料到的性能在先与技术中其他二维和三维系统中是不可能的。
下面描述的研究使用下列浓度的细胞因子<
注组合细胞因子使用每种浓度为所示浓度的组成细胞因子。
在本文描述的试验中，平均45,000个CD45+HPCs细胞接种在培养系统中，在细胞泡沫或骨髓基质(BMS)和塑料培养皿代表系统中，在存在所说的细胞因子的情况下培养一，三，或六周，然后在集落形成试验中评估细胞量和多能性。所有培养至少实施四份。特别重点放在CD45+，CD45+CD34+和CD45+CD34+CD38-细胞的产出上，细胞总量意义不大，因为BMS培养物中预种植了大量的基质细胞，混乱了总量细胞分析。细胞收获，包括从每个培养皿获得的未附着和和附着部分，用荧光共轭单克隆抗体对CD45(装在CD45+造血细胞上并从分析中排除基质细胞)和CD34和CD38祖细胞表面分子染色。
在检测纳克和皮克浓度的单一细胞因子，对在细胞泡沫中HPC存活影响与在骨髓基质(BMS)中相比的研究中，IL-3和IL-6在三周时显示最大的细胞扩增，接种在六周时降低，而SCF和FLK2从三周到六周显示连续的扩增。全部四种细胞因子在至少一个时间点产生比进入细胞泡沫设备中显著增加的细胞量，但在BMS中只有IL-3是如此(图5，顶纳克浓度，底皮克浓度)。皮克浓度显示从一周到六周CD45+细胞量的连续增加(图5)。含三种细胞因子的组合物(IL-3+IL-6和SCF或FLK)每种产生细胞量的增加与单一细胞因子相同(图6，顶纳克浓度，底皮克浓度)。研究比较细胞泡沫和塑料培养皿培养物中，从CD45+细胞计数中也获得同样的发现。
CD45+34+和CD45+CD34+CD38-细胞量在细胞泡沫中也比在BMS中的量大(图7，顶纳克浓度，底皮克浓度)。在三周和六周时，细胞泡沫中和BMS培养物中，细胞量与单一细胞因子-浓度-时间数据点的32种可能对比中，在25个中(78％)观察到在细胞泡沫中CD45+34+和CD45+CD34+CD38-细胞量较大。在三周和六周时，细胞泡沫中和BMS培养物中，细胞量与组合细胞因子-浓度-时间数据点的16种可能对比中，在16个中(100％)观察到在细胞泡沫中CD45+34+和CD45+CD34+CD38-细胞量较大(参阅图7典型CD45+34+模式)。统计显著的值在图7中用星号标出，其比较了在细胞泡沫和BMS之间细胞量倍数差异(及塑料；参考下面)。在1.00线上面的条图表示与对比物相比在相比泡沫中获得的增量倍数；在1.00线下面的条图表示与相比泡沫相比在对比物中获得的增量倍数。为了便利以对数显示刻度。星号表示统计上显著的值。CD45+34+38-细胞的倍数差异模式与本文所示的CD45+34+细胞的倍数差异模式相同。
在比较细胞泡沫和塑料培养物中获得与上面相同的结果。在三周和六周时，细胞量与单一细胞因子-浓度-时间数据点的24种可能对比中，在21个中(88％)观察到在细胞泡沫中CD45+34+和CD45+CD34+CD38-细胞量较大。在组合细胞因子培养物数据点的16种可能中，在15个中细胞泡沫产出细胞比塑料培养物多(94％，图7)。这样，在总共数据点88种可能中，细胞泡沫培养物产出量较大的为77个(88％)。
总之，这些数据支持这样的结论，细胞因子的浓度在远低于传统系统中能使用的、并已被以前的研究者常规使用的浓度时，能有效地使用在细胞泡沫中增加HPCs的量。通常，细胞因子的浓度在0.1-0.5ng/ml之间促进HPCs的保持，而细胞因子的浓度大于约0.5ng/ml时促进HPCs的分化。
在这些条件下培养的细胞的功能，通过使用甲基纤维素CFU试验评估体外集落形成能力来测定。比较细胞泡沫和塑料培养物中，除了加入IL-3，集落活性在细胞泡沫中统一比塑料培养物中的大，范围在约3到36倍大(图8)。总CFU活性通过每10,000个进入细胞的集落计数乘以在三周和六周培养物中获得祖细胞总量的比例系数而获得。对比培养物不加细胞因子。这样，细胞泡沫在产出细胞量和集落活性上都比塑料培养物大。还有一点很有趣，纳克浓度的细胞因子补充致使从三周到六周的总集落活性降低(除了SCF在细胞泡沫培养物中)，说明细胞因子增加对HPC功能的影响是时间相关的。使用组合细胞因子的皮克浓度补充物试验中，CFU活性的下降不明显，集落活性从三周到六周保持大约一致。而且，在某些情况中，皮克含量的组合细胞因子比纳克含量补充物产生较高的集落活性。如，皮克含量的组合1(IL-3/IL-6/SCF)补充物产生总集落量比纳克含量的组合1(IL-3/IL-6/SCF)在类似时间点产生量高3-6倍。
对细胞泡沫和塑料培养物间总集落活性倍数差异分析显示，通常细胞泡沫也产出较高的总集落活性。除了组合2(IL-3/IL-6/FLK2)在六周时间点，在纳克浓度细胞因子补充试验中，全部统计不同集落值都是细胞泡沫的大(图9)。在1.00线上面的条图表示与细胞泡沫相比在对比物中获得的增量倍数。以对数显示刻度。星号表示统计上显著的值。皮克浓度补充物试验与纳克浓度相似。比较相比泡沫和BMS培养物得出相似的结果。
总之，上面描述的试验表明选择使用特种细胞因子可以致使集落形成活性扩增如通过标准体外试验所测得的。
所有本文公开的参考文献的内容都通过在此引述而全文合并于本篇。
权利要求
1.一种造血祖细胞的体外培养方法，包括引入一定量的造血祖细胞到含相互连接的孔的多孔的固体基质中，孔的大小足以允许所说的细胞在整个基质中生长，和在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基，和外源加入的促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，除了血清的环境中培养所说的细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中环境不含白介素3，6和11，干细胞配体和FLT/FLK生长因子。
3.根据权利要求1的方法，其中环境不含造血细胞生长因子。
4.根据权利要求1的方法进一步包括在所说的引入步骤前，从血液产品中获取造血祖细胞。
5.根据权利要求4的方法，其中所说的血液产品是未分级的骨髓。
6.根据权利要求2的方法，其中造血祖细胞在一些条件下培养足够长的时间以增加造血祖细胞的量，与引入到所说的多孔固体基质中的量相比。
7.根据权利要求1的方法进一步包括在所说的培养步骤之后，收获造血细胞。
8.根据权利要求7的方法，其中所说的收获步骤包括第一培养步骤之后的第一收获步骤和至少一个其他培养步骤之后的至少一个其他收获步骤。
9.根据权利要求7的方法进一步包括在从下列基团中选取的至少一种外源加入试剂中培养所说的收获的造血细胞促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，接种基质细胞和基质细胞调节培养基。
10.根据权利要求8的方法进一步包括在存在外源加入试剂的情况下，培养从所说第一收获获取的造血细胞。在存在外源加入试剂的情况下，培养从所说至少一个其他收获获取的造血细胞。其中所说的外源加入试剂是从下列基团中选取的包括促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，接种基质细胞和基质细胞调节培养基。
11.根据权利要求1-10的方法，其中多孔固体基是开放式细胞多孔基质，具有开放空间至少75％。
12.根据权利要求11的方法，其中多孔固体基质的孔是由相互连接的韧带界定的，韧带中心点直径平均小于150μm。
13.根据权利要求12的方法，其中多孔固体基质是含碳材料的金属覆盖的网状开放式细胞泡沫。
14.根据权利要求13的方法，其中金属是从下列基团中选取的钽，钛，铂，铌，铪，钨和它们的组合物，其中所说金属是由下列生物试剂覆盖的，包括胶原质，纤维结合蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎症因子，粘多糖，vitrogen，它们的抗体和片段，和它们的组合物。
15.根据权利要求14的方法，其中金属是钽。
16.根据权利要求1-10的方法，其中含种植的造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质用凝胶状试剂充满占据基质的孔。
17.一种体外培养造血祖细胞产生造血源分化细胞的方法，包括在第一培养步骤，在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基，和外源加入的促进造血细胞分化的造血细胞生长因子，除了血清的环境中培养第一量的造血祖细胞，在一些条件下培养足够长的时间以增加造血祖细胞的量或集落形成单位潜能，与所说的第一量相比，从而产生第二量的造血祖细胞，然后在第二培养步骤中，在包括至少一种从下列基团中选取的试剂的环境中促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，接种基质细胞，基质细胞调节培养基，培养至少部分第二量的造血祖细胞以产生造血源分化细胞。
18.根据权利要求17的方法，其中所说的第一培养步骤的环境不含白介素3，6和11，干细胞配体和FLT/FLK配体生长因子。
19.根据权利要求17的方法，其中环境不含造血细胞生长因子。
20.根据权利要求1 7的方法，其中第二培养步骤是多个第二培养步骤，每个包括培养仅部分所说的第二量的造血祖细胞。
21.根据权利要求17的方法进一步包括在所说的第一和第二培养步骤之间的收获步骤，其中收获步骤包括在第二培养步骤中培养至少部分第二量之前收获至少部分第二量。
22.根据权利要求21的方法，其中所说的收获步骤包括以时间间隔的多个收获步骤，其中所说的第二培养步骤包括多个第二培养步骤，每个有一个所说的收获步骤。
23.根据权利要求17的方法，其中所说造血祖细胞是从血液产品中获取的。
24.根据权利要求23的方法，其中所说的血液产品是未分级的骨髓。
25.根据权利要求17-24的方法，其中所说的第一培养步骤包括在含开放空间至少75％的开放式细胞多孔基质中培养所说的造血祖细胞。
26.根据权利要求25的方法，其中多孔固体基质的孔是由相互连接的韧带界定的，韧带中心点直径平均小于150μm。
27.根据权利要求26的方法，其中多孔固体基质是含碳材料的金属覆盖的网状开放式细胞泡沫。
28.根据权利要求27的方法，其中金属是从下列基团中选取的钽，钛，铂，铌，铪，钨和它们的组合物，其中所说金属是由下列生物试剂覆盖的，包括胶原质，纤维结合蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎症因子，粘多糖，vitrogen，它们的抗体和片段，和它们的组合物。
29.根据权利要求28的方法，其中金属是钽。
30.根据权利要求17-24的方法，其中含种植的造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质用凝胶状试剂充满占据基质的孔。
31.一种体外培养造血祖细胞产生造血源分化细胞的方法，包括在第一培养步骤，在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基，和外源加入的促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，除了血清的环境中培养第一量的造血祖细胞，产生培养的造血祖细胞，间歇收获仅部分所说的培养的造血祖细胞，以产生多个间歇收获的部分培养的造血细胞；在多个第二培养步骤中，培养多个间歇收获的部分，第二培养步骤在包括至少一种从下列基团中选取的试剂的环境中实施促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，接种基质细胞，基质细胞调节培养基，以产生造血源分化细胞。
32.根据权利要求31的方法，其中所说的第一培养步骤的环境不含白介素3，6和11，干细胞配体和FLT/FLK配体生长因子。
33.根据权利要求31的方法，其中环境不含造血细胞生长因子。
34.根据权利要求31的方法，其中第一培养步骤包括在含开放空间百分比至少75％的开放式细胞多孔固体基质中培养造血祖细胞，其中收获步骤包括在足够的冲力下向基质使用流体，以从基质中移出所说的部分。
35.根据权利要求31的方法，其中基质是含碳材料的金属覆盖的网状泡沫，其中造血祖细胞是从未分级的骨髓中获取。
36.根据权利要求35的方法，其中金属是从下列基团中选取的钽，钛，铂，铌，铪，钨和它们的组合物，其中所说金属是由下列生物试剂覆盖的，包括胶原质，纤维结合蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎症因子，粘多糖，vitrogen，它们的抗体和片段，和它们的组合物。
37.根据权利要求31-36的方法，其中含种植的造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质用凝胶状试剂充满占据基质的孔。
38.一种将外源基因材料转导到造血源细胞中的方法，包括在含开放空间百分比至少75％的多孔固体基质中培养造血细胞，孔的大小足以允许所说的细胞在整个基质中生长，用外源基因材料在基质上原位转导所说的细胞。
39.根据权利要求38的方法，其中多孔固体基质的孔是由相互连接的韧带界定的，韧带中心点直径平均小于150μm。
40.根据权利要求38的方法，其中基质是含碳材料的网状开放式细胞泡沫。
41.根据权利要求40的方法，其中金属是从下列基团中选取的钽，钛，铂，铌，铪，钨和它们的组合物，其中所说金属是由下列生物试剂覆盖的，包括胶原质，纤维结合蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎症因子，粘多糖，vitrogen，它们的抗体和片段，和它们的组合物。
42.根据权利要求38-41的方法，其中培养的造血源细胞是从未分级的骨髓中获取的。
43.根据权利要求42的方法，其中造血细胞在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基和外源加入的促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，除了血清的环境中培养。
44.根据权利要求43的方法，其中环境不含白介素3，6和11，干细胞配体和FLT/FLK配体生长因子。
45.根据权利要求43的方法，其中环境不含造血细胞生长因子。
46.根据权利要求38-41的方法，其中含种植的造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质用凝胶状试剂充满占据基质的孔。
47.一种培养细胞的装置，其包括第一细胞培养箱含多孔固体基质，基质含相互连接的孔，孔的大小足以允许细胞在整个基质中生长，第二细胞培养箱，提供第一和第二细胞培养箱之间流体交流的管道，在第一和第二细胞培养箱之间的收集箱，收集箱中断第一和第二细胞培养箱之间通过所说的管道的流体交流，收集箱的第一入口阀提供，从第一细胞培养箱通过管道到所说的收集箱中接收的流体，所说的收集箱的出口阀提供，从所说的收集箱通过管道到所说的第二细胞培养箱中接收的流体，所说的收集箱的第二入口用作引入所需的流体到所说的收集箱中，而不是从所说的第一细胞培养箱来的流体，这样在没有从第二培养箱流体污染第一培养箱的情况下，流体可能间歇地从第一细胞培养箱移出，提供给第二细胞培养箱。
48.一种培养细胞的装置，其包括第一细胞培养箱含多孔固体基质，基质含相互连接的孔，孔的大小足以允许细胞在整个基质中生长，入口阀引入营养培养基到所说的第一培养箱中，第二细胞培养箱，管道提供第一和第二细胞培养箱之间的流体交流，阀用作控制第一和第二细胞培养箱之间通过管道流体的流动，出口阀用作将介质从第二细胞培养箱中移出。
49.根据权利要求47或48的装置进一步包括包含在第二细胞培养箱中的多孔固体基质，其中多孔固体基质含相互连接的孔，孔的大小足以允许细胞在整个基质中生长。
50.根据权利要求49的装置，其中多孔固体基质的孔是由相互连接的韧带界定的，韧带中心点直径平均小于150μm。
51.根据权利要求49的装置，其中多孔固体基质是含开放空间百分比至少75％的开放式细胞多孔基质。
52.根据权利要求49的装置，其中多孔固体基质是含碳材料的网状开放式细胞泡沫。
53.一种造血祖细胞的体外保持、扩增和/或分化的方法，包括将含预种植造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质植入受试体内，其中多孔固体基质是含至少75％开放空间的开放式细胞多孔基质。
54.根据权利要求53的方法进一步包括含预种植造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质，步骤有体外引入一定量的造血祖细胞到多孔固体基质中；在不含接种基质细胞，基质细胞调节培养基和外源加入的促进造血细胞保持，扩增和/或分化的造血细胞生长因子，除了血清的环境中培养造血祖细胞。
55.根据权利要求54的方法，其中多孔固体基质的孔是由相互连接的韧带界定的，韧带中心点直径平均小于150μm。
56.根据权利要求55的方法，其中多孔固体基质是含碳材料的金属覆盖的网状开放式细胞泡沫。
57.根据权利要求56的方法，其中金属是从下列基团中选取的钽，钛，铂，铌，铪，钨和它们的组合物，其中所说金属是由下列生物试剂覆盖的，包括胶原质，纤维结合蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白，血管生成因子，抗炎症因子，粘多糖，vitrogen，它们的抗体和片段，和它们的组合物。
58.根据权利要求57的方法，其中金属是钽。
59.根据权利要求53-58的方法，其中含种植的造血祖细胞和它们子代的多孔固体基质用凝胶状试剂充满占据基质的孔。
全文摘要
本发明涉及在没有加入外源性造血细胞生长因子的情况下,长时体外培养造血祖细胞的方法和设备,引入外源基因材料到造血源细胞中的改进方法,及实施这些方法的装置。造血祖细胞在三维多孔生物材料上培养。三维多孔生物材料加强造血祖细胞的存活并扩增祖细胞的量和/或功能,在没有外源生长因子的情况下保持祖细胞多能性。此外,三维多孔生物材料支持在这种环境中培养的细胞的高水平转导。
文档编号C12M3/04GK1272878SQ98809535
公开日2000年11月8日 申请日期1998年9月25日 优先权日1997年9月25日
发明者马克·J·佩克特, 迈克·罗森兹维格, 理查德·B·卡普兰 申请人:基质细胞有限责任公司