一种发酵豆粕、菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鱼类饲料添加剂，特别涉及一种发酵豆柏的制备方法、制备发酵豆柏 所用菌株及制备肉食性鱼类饲料添加剂的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 养殖鱼类对蛋白质的营养需求量约为其饲料干重的35% -55%，比鸟类及哺乳类 高150% -300%，而鱼粉是水产饲料工业中最主要的蛋白质来源。肉食性鱼类，肉质细嫩、 鲜美，营养价值高，但是对鱼粉的需求量大。近年来，随着集约化养殖的迅猛发展，鱼粉的需 求量急剧上升，鱼粉价格的不断上扬，严重阻碍了水产养殖业的发展。因此，开发新型蛋白 源，降低饲料成本，成为人们亟待解决的课题。
[0003] 肉食性鱼类对植物蛋白利用率很低，因其必需氨基酸含量较低且缺乏某种或某几 种必需氨基酸，含有多种抗营养因子以及适口性差等缺点会影响水产动物对植物蛋白源的 摄取、消化和吸收，严重的还会危害动物的健康和生长发育。而微生物发酵能绿色环保高 效地解决许多问题。因此，有关发酵豆柏的研宄也很多：吴胜华等人采用枯草芽孢杆菌、蜡 样芽孢杆菌、植物乳酸菌及酵母菌对普通豆柏进行二元混菌固态发酵，试验结果表明：豆 柏经过混菌发酵后小肽含量显著提高，当采用枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌（KC-RS)组合， 接种量4%，料水比I :1. 2,通气量60g/mL，发酵温度40°C时，发酵产品中的小肽含量可达 12. 01%，凝集素，植酸的含量明显降低，抗胰蛋白酶因子完全消除。蔡国林、杨旭等人研宄 某些微生物菌种对豆柏进行发酵后对豆柏的营养价值的影响中看出，经过有益微生物菌种 发酵的豆柏与未发酵的豆柏相比，豆柏中的粗蛋白含量从46. 2%能够提高到49. 7%，同时 他们研宄发酵豆柏饲喂动物的实验中也证明，实验组猪的日增重与对照组相比，日增重增 加了 7. 6%，同时料水比和下痢率也都显著下降，这样发酵豆柏的饲喂价值和品质都有显著 提高。Twibell和Wilson的研宄也表明：随着饲料中大豆蛋白添加量的提高，鱼类的摄食 率逐渐下降。罗智等在石斑鱼配合饲料中用发酵豆柏部分替代白鱼粉后发现，在饲料中添 加14%发酵豆柏，对石斑鱼的生长和鱼体组成不会造成显著影响。冷向军等证实，发酵豆柏 可取代凡纳滨对虾、南美白对虾饲料中鱼粉用量的20 %，而不会对虾体增重率、虾体肌肉组 成产生显著影响。因此，寻求一种蛋白含量更高、抗营养因子含量少而且有利于水产动物特 别是肉食性鱼类摄食及消化吸收的高效廉价蛋白至关重要。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种高蛋白含量的发酵豆柏的制备方法，用于制备发酵豆柏的 新菌株一泡盛曲霉（Aspergillus awamori strain)42,以及发酵豆柏在制备肉食性鱼类饲 料中的应用，用于解决植物蛋白源在替代鱼粉过程中的蛋白含量低、蛋白利用率低，抗营养 因子含量过高，适口性差等问题，以弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种发酵豆柏，所述发酵豆柏按如下方法制备：（1)将豆柏浸泡在营 养液制成发酵基质（通常25°C浸泡15min);所述营养液终浓度组成为：K2HP04 l-8g/L、 NaCl l-6g/L、（NH4)2SO4 2-6g/L、葡萄糖 l-7g/L，溶剂为水；
[0007] (2)将泡盛曲霉（优选泡盛曲霉42)经扩大培养后的孢子接种至发酵基质中，在 温度20~50°C、湿度85-100%条件下发酵培养30-60h，取出培养物干燥（优选50-55°C干 燥），粉碎（优选过80目筛），获得发酵豆柏。
[0008] 进一步，优选步骤（1)中营养液的体积用量以豆柏重量计为0. 5-0. 7ml/g。
[0009] 进一步，优选步骤（1)中营养液终浓度组成为：K2HP04 l-4g/L、NaCl l-2g/L、 (NH4)2SO4 2-5g/L、葡萄糖 l-3g/L，溶剂为水，最优选K2HPO4 2g/L、NaCl 2g/L、（NH4)2SO4 2g/ L、葡萄糖2g/L，溶剂为水。
[0010] 进一步，优选步骤（2)泡盛曲霉孢子接种前先将发酵基质在100°C条件下灭菌 10_30minD
[0011] 进一步，步骤（2)中所述泡盛曲霉扩大培养方法为：将泡盛曲霉接种至PDA培养 基，在28°C培养3天，获得斜面菌体；将斜面菌体接种至种子培养基，在25-30°C培养2-3 天，获得扩大培养后的泡盛曲霉孢子；所述种子培养基终浓度组成为：麸皮l〇〇〇g/L、豆柏 200g/L，溶剂为水，pH自然；PDA培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15-20g/ L，溶剂为自来水，pH自然。
[0012] 进一步，步骤（2)泡盛曲霉孢子按如下方法接种：将扩大培养后的泡盛曲霉孢子 用无菌水冲洗，收集泡盛曲霉孢子，将泡盛曲霉孢子用无菌水配制成孢子悬液，按照每千克 豆柏干重接种I. 5g-5g孢子湿重的比例，将孢子悬液接种至发酵基质中。
[0013] 进一步，优选步骤（2)中发酵培养是在温度25~30°C、湿度90-100%条件下发酵 培养 30-50h。
[0014] 本发明所述泡盛曲霉为泡盛曲霉strain42 (Aspergillus awamori strain42)，所 述泡盛曲霉strain42保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2015155， 保藏日期为2015年3月24日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072,泡盛曲霉 strain42 的 18S DNA 序列为 SEQ ID NO. 1 所示。
[0015] 本发明还提供一种所述发酵豆柏在制备肉食性鱼类饲料添加剂中的应用。
[0016] 进一步，优选所述发酵豆柏在肉食性鱼类饲料中的质量添加量为30% -60%。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株一泡盛 曲霉（Aspergillus awamori)42,利用泡盛曲霉42高效发酵豆柏制备含高蛋白的发酵豆柏 及该发酵豆柏用于饲料添加剂的应用；本发明制备的发酵豆柏蛋白含量高，含的小分子物 质如游离氨基酸、小肽含量高，抗营养因子含量少，有发酵香味，适口性好的特点。发酵豆柏 粗蛋白提高至60. 5-61. 7 %，小肽含量由3. 9-4. 3 %提高至18. 6-19. 8 %，大豆胰蛋白酶抑 制因子含量降低了 90%，氨基酸含量也有所提高。本发明制备的发酵豆柏替代鱼粉来制备 肉食性鱼类饲料添加，特别是用于制备大菱鲆饲料，结果表明：本发明制备的含高蛋白的发 酵豆柏在大菱鲆饲料中能有效替代全鱼粉饲料中45%的鱼粉蛋白；不影响大菱鲆的存活、 末体重、特定生长率、肝体比，脏体比和肥满度；不影响大菱鲆常规鱼体体成分组成，达到了 降低饲料价格、节约养殖成本的目的，为水产养殖的可持续发展提供了理论依据。 (四）【附图说明】
[0018] 图1为不同发酵时间对发酵豆柏总蛋白含量的影响。
[0019] 图2为不同营养因子对发酵豆柏总蛋白含量的影响。
[0020] 图3为泡盛曲霉42的18S DNA序列。 (五）【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0022] 本发明实施例所用豆柏购自青岛七好生物科技有限公司。本发明所用泡盛曲霉 42经种子培养基培养后检测的各项酶活为：纤维素酶活10097 μ/g (pH = 5. 5)，木聚糖酶活 286000 μ/g (pH = 4. 8)，蛋白酶酶活 11229 μ/g (pH = 3.0)。
[0023] 实施例1泡盛曲霉的扩大培养
[0024] 将泡盛曲霉42接种至PDA培养基，在25-30°C培养2-3天，获得