一种富含叶酸的发酵大豆的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于功能性食品技术领域，具体涉及一种富含叶酸的发酵大豆的制备方法。
【背景技术】
[0002]叶酸是维持生物体正常生命活动所必需的一类微量元素，可携带甲基、亚甲基、次甲基、甲酰基和羟甲基等一碳单位，作为辅酶参与核酸的合成与修复，是细胞分裂、分化的重要物质。叶酸在体内一经吸收后，部分贮存于肝脏中，其余的转变为具有活性的辅酶参与机体的一碳转移，包括同型半胱氨酸的再甲基化；嘌呤和嘧啶合成；构成含铁血红蛋白；使二碳氨基酸与三碳氨基酸发生相互转换；使乙醇胺转化为N-甲基烟酰胺；除氨基酸间的相互转换外，叶酸还参与甲基化合物如肾上腺素、胆碱、肌酸的合成。再则叶酸中所含的一酸还可以形成大量游离碳离子，是形成神经末梢和构成传递神经冲动的重要化学原料物质，从而保证人体神经系统的正常发育，因此它在快速的细胞分裂和生长过程(如孕期、婴儿发育)中尤为重要，叶酸不足就会导致各种先天性缺陷及后天性疾病。
[0003]叶酸一般通过两种生产方式获得，一种是来源于植物以及微生物的叶酸，称之为天然叶酸(folate)，而另外一种方式便是人工合成，称之为合成叶酸(folic acid)。市售叶酸补充剂和叶酸强化食品中的叶酸都属于合成叶酸。合成叶酸从开始大量使用以来一直都备受各种争议。经检测发现，食物中的叶酸主要以蝶酰多谷氨酸的形式存在，而合成叶酸则为蝶酰单谷氨酸，蝶酰单谷氨酸的利用率比天然叶酸的蝶酰多谷氨酸形式要高，但很容易造成摄入过量，而且最主要的是长期服用合成叶酸后，机体的需求量增加，剂量增加的结果就是使肝脏的负担加重。与合成叶酸相比，天然叶酸更为安全，其优点在于即使在肠道PH值改变时也能被很好的吸收利用，而且它的生物利用率并不会受到代谢缺陷的影响。
[0004]大部分绿色蔬菜和动物内脏中均有叶酸存在，但叶酸的化学性质极不稳定，在烹饪过程中损失量大，所以叶酸缺乏症患者在各国普遍存在；然而从植物中提取天然叶酸，存在生产过程复杂，损失量大，提取效率低等问题，因此市售叶酸生产大多不采用这种方式。由此可以考虑选取高产叶酸的乳杆菌作为叶酸发酵菌株。
[0005]大豆是营养丰富且氨基酸平衡的植物蛋白食物，其活性物质包括大豆异黄酮、大豆低聚糖、大豆多肽和豆豉纤溶酶。大豆异黄酮是一类多酚化合物的总称，具有类雌激素作用，并且具有抗肿瘤，预防骨质疏松，预防心血管疾病和提高免疫力等作用，发酵使大豆异黄酮的糖苷键断裂，可以激活其活性。大豆低聚糖又称之为功能性低聚糖，是指大豆中所含可溶性碳水化合物的总称，进入肠道后可被双歧杆菌利用，促进双歧杆菌的增殖，同时双歧杆菌又能生成一些短链脂肪酸和抗菌素，以达到抑制肠道内病原菌的作用。大豆多肽又称之为肽基大豆蛋白水解物，具有比传统大豆蛋白更优异的功能，它易消化吸收因此能迅速的给机体补充能量，同时过敏性低，还能降血压、降血脂、抗氧化、调节胰岛素、促进脂肪代谢等，并且大豆多肽能促进乳酸菌中的双歧杆菌、霉菌及酵母等微生物的生长。豆豉纤溶酶是豆豉在发酵过程中产生的一种丝氨酸离解酶，通过激活体内的纤溶酶原增加内源性纤溶酶的活性，来防治血栓性疾病，它的溶栓能力强，分子量小，可通过消化道直接吸收。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于利用枯草芽孢杆菌水解脱脂乳中的蛋白质生成多肽或者氨基酸，再利用植物乳杆菌产生富含叶酸的发酵大豆。
[0007]本发明的目的在于提供一种不添加任何食品添加剂的高产叶酸发酵大豆的制备方法，通过该发酵方法可以获得叶酸产量高、口感与风味倶佳，具有超长保质期的益生发酵大豆。该方法利用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌制备富含叶酸的发酵大豆。
[0008]具体步骤如下:
步骤一，将大豆置于水中浸泡12~16 h，滤干水后置于高压灭菌锅内115~121°C灭菌30?40 min ；
步骤二，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的活化，将冷冻保存于-80°C的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌取出并迅速解冻，按每5 ml培养基中分别接种50~75 μ L和20~30 μ L菌液的比例，将浓度均为I X 19 cfu/mL的菌液分别接种至灭菌NB和MRS培养基中培养；
枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的扩大培养，将步骤二获得的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌液均按体积百分比2%的比例接种于灭菌NB和MRS培养基中扩大培养；
步骤四，将步骤三培养后的两种细菌取出置于5000~7000 rpm、4°C下离心10~20 min后，弃去上清液，得到的菌体用质量百分比浓度0.7-0.9%的生理盐水洗脱2~3次，随后加生理盐水重悬菌体，分别获得浓度为106~10s cfu/mL和10s~109 cfu/mL的生理盐水菌悬液待用；
步骤五，大豆的发酵，将步骤一中灭菌后的大豆冷却至30~40°C，取步骤四得到的
16-1O8 cfu/mL枯草芽孢杆菌菌悬液8~10 mL接种于Ikg灭菌后大豆中，37~40°C静置培养24-36 h，制成豆豉半成品，待其冷却到25~30°C，取步骤四得到的10s~109 cfu/mL植物乳杆菌菌悬液8~10 mL接种于枯草芽孢杆菌发酵的豆豉半成品中，30~37°C静置培养60~72 h，即为发酵大豆。
[0009]所述步骤二和步骤三中枯草芽孢杆菌的培养条件为在170~200 rpm、37~40°C条件下振荡培养36~48 ho
[0010]所述步骤二和步骤三中植物乳杆菌的培养条件为30~37°C静置培养24~36 h。
[0011]所述步骤四中枯草芽孢杆菌菌悬液和植物乳杆菌菌悬液均为用质量百分比浓度为0.7-0.9%的生理盐水制得。
[0012]本发明先使用枯草芽孢杆菌对大豆进行发酵，其产生的蛋白酶将脱脂乳中的乳蛋白降解为氨基酸或多肽，这为植物乳杆菌生长繁殖提供有利条件，从而提高叶酸产量。
[0013]本发明中所述枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌为常规市售菌种。
[0014]本发明的优点和技术效果如下:这种发酵大豆口感较好，易于接受，其中活性成分高，尤其是富含叶酸，适合孕妇服用。
【附图说明】
[0015]图1本发明方法发酵后大豆形态图。
【具体实施方式】
[0016]下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容。
[0017]实施例1:本富含叶酸的发酵大豆的制备方法，具体内容如下:
(1)将大豆置于水中浸泡12h，滤干水后置于高压灭菌锅内121°C灭菌40 min ；
(2)枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的活化，将冷冻保存于-80°C的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌取出并迅速解冻，按每5 ml培养基中分别接种50 μ L和30 μ L菌液的比例，将浓度均为I X 19 cfu/mL的菌液分别接种至灭菌NB和MRS培养基中培养；枯草芽孢杆菌的培养条件为在170 rpm、37°C振荡培养48 h ;植物乳杆菌的培养条件为37 °C静置培养36 h ;
(3)将步骤(2)获得的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌液均按体积百分比2%的比例接种于灭菌NB和MRS培养基中扩大培养；枯草芽孢杆菌的培养条件为在170 rpm、37°C振荡培养48 h ;植物乳杆菌的培养条件为37 °C静置培养36 h ；
(4)将步骤(3)培养后的两种细菌取出置于50mL离心管中5000rpm、4°C下离心20 min后，弃去上清液，得到的菌体用质量百分比浓度0.85%的生理盐水洗脱2次，随后加质量百分比浓度为0.7%的生理盐水重悬菌体，分别获得浓度为10s cfu/mL和19 cfu/mL的生理盐水菌悬液待用；
(5)将步骤(I)中灭菌后的大豆冷却至40°C，取步骤四得到的10scfu/mL枯草芽孢杆菌菌悬液8 mL接种于I kg灭菌后大豆中，40°C静置培养24 h，制成豆豉半成品，待其冷却到30°C，取步骤四得到的19 cfu/mL植物乳杆菌菌悬液8 mL接种于枯草芽孢