杆菌发酵的豆豉半成品中，30°C静置培养72 h，即为发酵大豆。
[0018]本实施例得到的两步法发酵大豆色泽光亮，豆粒完整度好，拉丝较多，有适口的酸味，无氨味，易于接受(图1)。
[0019]叶酸含量的测量，取适量本实施例方法得到的发酵大豆，加液氮研磨成粉末状，称取I g粉末置于50 mL离心管中，加5 mL 0.01 mol/L磷酸盐保护液和5 mL甲醇，置于摇床上150 rpm，震荡4 h后取出，100°C煮沸5 min，冷却后离心，取上清，将所得的上清液倒入烧杯中后置于70°C水浴15 min，以使甲醇完全挥发，将剩余的5 mL上清液倒入50 mL离心管中，用封口膜封后冷冻浓缩干燥。加I mL蒸馏水漩涡震荡溶解冷冻干燥后的样品，使用0.45 μ m水系膜过滤，过滤后使用HPLC检测，色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18, 5 μπι，4.6X250 μπι;检测波长254 nm ;流速lmL/min ;进样量10 μ L ;柱温30°C ;洗脱条件0~30min, 100%磷酸缓冲液，30-70 min, 50%的甲醇水溶液。经过检测后，未发酵大豆叶酸含量为7.735 μ g/g，经两步法发酵后的发酵大豆叶酸含量为23.003 μ g/g，增加了约3.0倍。
[0020]
实施例2:本富含叶酸的发酵大豆的制备方法，具体内容如下:
(1)将大豆置于水中浸泡14h，滤干水后置于高压灭菌锅内115°C灭菌30 min ；
(2)枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的活化，将冷冻保存于-80°C的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌取出并迅速解冻，按每5 ml培养基中分别接种60 μ L和20 μ L菌液的比例，将浓度均为I X 19 cfu/mL的菌液分别接种至灭菌NB和MRS培养基中培养；枯草芽孢杆菌的培养条件为在200 rpm、40°C振荡培养36 h ;植物乳杆菌的培养条件为35°C静置培养30 h ;
(3)将步骤(2)获得的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌液均按体积百分比2%的比例接种于灭菌NB和MRS培养基中扩大培养；枯草芽孢杆菌的培养条件为在200 rpm、40°C振荡培养36 h ;植物乳杆菌的培养条件为35 °C静置培养30 h ；
(4)将步骤(3)培养后的两种细菌取出置于50mL离心管中6000 rpm、4°C下离心15min后，弃去上清液，得到的菌体用质量百分比浓度0.7%的生理盐水洗脱3次，随后加质量百分比浓度为0.8%的生理盐水重悬菌体，分别获得浓度为17 cfu/mL和10s cfu/mL的生理盐水菌悬液待用；
(5)将步骤(I)中灭菌后的大豆冷却至35°C，取步骤四得到的17cfu/mL枯草芽孢杆菌菌悬液9 mL接种于I kg灭菌后大豆中，37°C静置培养36 h，制成豆豉半成品，待其冷却到25°C，取步骤四得到的10s cfu/mL植物乳杆菌菌悬液9 mL接种于枯草芽孢杆菌发酵的豆豉半成品中，35°C静置培养65 h，即为发酵大豆。
[0021]叶酸含量的测量方法同实施例1，经过检测后，未发酵大豆叶酸含量为7.954 μ g/g，经两步法发酵后的发酵大豆叶酸含量为22.470 μ g/g，增加了约2.8倍。
[0022]实施例3:本富含叶酸的发酵大豆的制备方法，具体内容如下:
(1)将大豆置于水中浸泡16h，滤干水后置于高压灭菌锅内118°C灭菌35 min ；
(2)枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的活化，将冷冻保存于-80°C的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌取出并迅速解冻，按每5 ml培养基中分别接种75 μ L和25 μ L菌液的比例，将浓度均为I X 19 cfu/mL的菌液分别接种至灭菌NB和MRS培养基中培养；枯草芽孢杆菌的培养条件为在180 rpm、38°C振荡培养30 h ;植物乳杆菌的培养条件为30°C静置培养36h ;
(3)将步骤(2)获得的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌液均按体积百分比2%的比例接种于灭菌NB和MRS培养基中扩大培养；枯草芽孢杆菌的培养条件为在180 rpm、38°C振荡培养30 h ;植物乳杆菌的培养条件为30°C静置培养36 h ;
(4)将步骤(3)培养后的两种细菌取出置于50mL离心管中7000 rpm、4°C下离心10min后，弃去上清液，得到的菌体用质量百分比浓度0.9%的生理盐水洗脱3次，随后加质量百分比浓度为0.8%的生理盐水重悬菌体，分别获得浓度为16 cfu/mL和19 cfu/mL的生理盐水菌悬液待用；
(5)将步骤(I)中灭菌后的大豆冷却至30°C，取步骤四得到的16cfu/mL枯草芽孢杆菌菌悬液10 mL接种于Ikg灭菌后大豆中，38°C静置培养30 h，制成豆豉半成品，待其冷却到28°C，取步骤四得到的19 cfu/mL植物乳杆菌菌悬液10 mL接种于枯草芽孢杆菌发酵的豆豉半成品中，37°C静置培养60 h，即为发酵大豆。
[0023]叶酸含量的测量方法同实施例1，经过检测后，未发酵大豆叶酸含量为7.805 μ g/g，经两步法发酵后的发酵大豆叶酸含量为22.582 μ g/g，增加了约2.9倍。
【主权项】
1.一种富含叶酸的发酵大豆的制备方法，其特征在于采用枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌两步法发酵大豆，提高叶酸含量，具体步骤为: 步骤一，将大豆置于水中浸泡12~16 h，滤干水后置于高压灭菌锅内115~121°C灭菌30?40 min ； 步骤二，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的活化，将冷冻保存于-80°C的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌取出并迅速解冻，按每5 ml培养基中分别接种50~75 μ L和20~30 μ L菌液的比例，将浓度均为I X 19 cfu/mL的菌液分别接种至灭菌NB和MRS培养基中培养； 步骤三，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的扩大培养，将步骤二获得的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌液均按体积百分比2%的比例接种于灭菌NB和MRS培养基中扩大培养； 步骤四，将步骤三培养后的两种细菌取出置于5000~7000 rpm、4°C下离心10~20 min后，弃去上清液，得到的菌体用质量百分比浓度0.7-0.9%的生理盐水洗脱2~3次，随后加生理盐水重悬菌体，分别获得浓度为106~10s cfu/mL和10s~109 cfu/mL的生理盐水菌悬液待用； 步骤五，大豆的发酵，将步骤一中灭菌后的大豆冷却至30~40°C，取步骤四得到的16-1O8 cfu/mL枯草芽孢杆菌菌悬液8~10 mL接种于Ikg的大豆中，37~40°C静置培养24~36h，制成豆鼓半成品，待其冷却到25~30°C，取步骤四得到的10s~109 cfu/mL植物乳杆菌菌悬液8~10 mL接种于枯草芽孢杆菌发酵的豆豉半成品中，30~37°C静置培养60~72 h，即为发酵大豆。2.根据权利要求1所述的富含叶酸的发酵大豆的制备方法，其特征在于:步骤二和步骤三中枯草芽孢杆菌的培养条件为在170~200 rpm、37~40°C条件下振荡培养36~48 h。3.根据权利要求1或2所述的富含叶酸的发酵大豆的制备方法，其特征在于:步骤二和步骤三中植物乳杆菌的培养条件为30~37°C静置培养24~36 h。
【专利摘要】本发明公开了一种富含叶酸的发酵大豆的制备方法，该方法采用枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌两步法发酵大豆，先使用枯草芽孢杆菌对大豆进行发酵，其产生的蛋白酶将脱脂乳中的乳蛋白降解为氨基酸或多肽，这为植物乳杆菌生长繁殖提供有利条件，从而提高叶酸产量；本发明方法制得的发酵大豆口感较好，易于接受，其中活性成分高，尤其是富含叶酸，适合孕妇服用。
【IPC分类】A23L1/20, A23L1/29
【公开号】CN105105031
【申请号】CN201510608034
【发明人】柳陈坚, 张海燕, 李晓然
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月23日