维二糖苷酶（也称为外切葡聚糖酶，外切 纤维二糖水解酶或1，4-β-纤维二糖水解酶）活性，如在酶类别EC3. 2. 1. 91中所定义 的，其通过从链的非还原末端释放纤维二糖而催化纤维素和纤维四糖中1，4-β-D-葡萄糖 苷连接的水解。术语〃纤维二糖水解酶II活性〃的定义是相同的，除了纤维二糖水解酶 II从链的还原末端攻击之外。
[0073] 纤维素酶可包含碳水化合物结合模块（CBM)，其提高酶与含有纤维素的纤维的 结合并增加酶的催化活性部分的效力。CBM被定义为碳水化合物活性酶中连续的氨基酸 序列，其含有具有碳水化合物结合活性的离散折叠（discreetfold)。关于CBMs的其它 信息，参见CAZy因特网服务器（Supra)或Tomme等人（1995)，EnzymaticDegradation ofInsolublePolysaccharides(Saddler和Penner,编辑),Cellulose-binding domains:classificationandproperties，pp.142-163,AmericanChemical Society,Washington。在优选的实施方式中，所述纤维素酶或纤维素降解酶可以是如美国 专利申请号60/941，251 (其在此通过引用而被并入）中所定义的纤维素降解制备物。在 优选的实施方式中，所述纤维素降解制备物包含具有纤维素降解增强活性的多肽（GH61A)， 优选W0 2005/074656中所描述的。所述细胞壁修饰酶还可以是β-葡糖苷酶，例如源 自木霉属（Trichoderma)，曲霉属（Aspergillus)或青霉属（Penicillium)株系的β-葡 糖苷酶，包括美国申请号60/832, 511 (Novozymes)中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融 合蛋白。在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是CBHII，例如太瑞斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是纤维素酶， 例如源自瑞氏木霉（Trichodermareesei)的酶。
[0074] 在一些实施方式中，纤维素降解活性可以源自真菌来源，例如木霉属的菌株，例 如瑞氏木霉菌株；或腐质霉属（Humicola)的菌株，例如特异腐质霉（Humicolainsolens) 菌株。
[0075] 在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是W0 2005/074656中所公开的具有纤维素 降解增强活性的多肽（GH61A);纤维二糖水解酶，例如太瑞斯梭孢壳霉纤维二糖水解酶 II(CEL6A)，β-葡糖苷酶（例如，美国申请号60/832, 511中所公开的融合蛋白）和纤维素 降解酶（例如源自瑞氏木霉的）。
[0076] 在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是W0 2005/074656中公开的具有纤维素降解 增强活性的多肽（GH61A) 葡糖苷酶（例如，美国申请号60/832, 511中公开的融合蛋 白）以及纤维素降解酶（例如，源自瑞氏木霉的）。在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是 商业上可得的产品，例如可从Danisco的美国分支机构Genencor获得的GC220或者可从 NovozymesA/S，丹麦获得的CELLUCLAST? 1. 5L或CELLUZYME?。
[0077] 内切葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 4)催化下列的内切水解：纤维素、纤维素衍生物（例如 羧甲基纤维素和羟乙基纤维素）、地衣多糖中的l，4-i3_D-糖苷连接，混合的β_1，3葡聚 糖（例如谷物β-D-葡聚糖）或木聚葡糖中的β-1，4键，以及含有纤维素部分的其它植 物材料。经认可的名称是内切_1，4-β-D-匍聚糖4-匍聚糖水解酶，但是在本说明书中 使用的是简称内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶活性可以根据Ghose，1987,PureandAppl. Chem. 59:257-268的方法利用羧甲基纤维素（CMC)水解来确定。
[0078] 在一些实施方式中，内切葡聚糖酶可以源自木霉属菌株，例如瑞氏木霉菌株； 腐质霉属菌株，例如特异腐质霉菌株；或者金孢子菌属（Chrysosporium)菌株，优选 Chrysosporiumlucknowense菌株。
[0079] 术语〃纤维二糖水解酶〃指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶（E.C. 3. 2. 1. 91)， 其催化纤维素、纤维素寡糖、或任何含有β-1，4连接的葡萄糖的聚合物中l，4-i3-D-葡萄 糖苷连接的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖。
[0080] 上文中提及的纤维二糖水解酶的实例包括来自瑞氏木霉、特异腐质霉的CBHI和 CBHII;和来自太瑞斯梭孢壳霉纤维二糖水解酶（CELL6A)的CBHII。
[0081]纤维二糖水解酶活性可根据Lever等人，1972,Anal.Biochem. 47:273-279 和vanTilbeurgh等人，1982,FEBSLetters149:152-156;vanTilbeurgh和 Claeyssens, 1985,FEBSLetters187:283-288描述的方法确定。Lever等人的方法适于评 估玉米秸杆中纤维素的水解，而vanTilbeurgh等人的方法适于在荧光二糖衍生物上确定 纤维二糖水解酶活性。
[0082] 术语〃β-葡糖苷酶〃指β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶（E.C. 3. 2. 1. 21)，其催化 末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，伴随β-D-葡萄糖的释放。为了本发明的目的，β_葡糖苷酶活性是根据由Venturi等人，2002,J.BasicMicrobiol. 42:55-66所描述的基 本方法而确定的，除了如本申请中所述采用了不同的条件。一个单位的β-葡糖苷酶活性 被定义为在500°C、pH5,在100mM柠檬酸钠、0. 01 %?Ι?ΕΕΝ? 20中，从作为底物的4mM对 硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷产生1. 0μmole的对硝基苯/分钟。
[0083] 在一些实施方式中β-葡糖苷酶是真菌来源的，例如木霉属，曲霉属或青霉属菌 株。在一些实施方式中β-葡糖苷酶源自瑞氏木霉，例如由bgll基因编码的β-葡糖苷酶 (参见ΕΡ562003)。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶源自米曲霉（Aspergillusoryzae) (根据W0 02/095014,在米曲霉中重组产生的），烟曲霉（Aspergillusfumigatus)(根 据TO02/095014的实施例22在米曲霉中重组产生的）或者黑曲霉（Aspergillusniger) (1981，J.Appl. 3:157-163)。
[0084] 术语"半纤维素降解酶"或"半纤维素酶"，如在本申请中所使用的，指可降解半 纤维素的酶。
[0085] 可使用任何适合用于水解半纤维素（优选水解为阿拉伯糖基木聚寡糖）的半纤维 素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯 酶，葡萄糖醛酸酶，半乳聚糖酶，内切-半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，内切或外切阿拉伯糖 酶，外切半乳聚糖酶，果胶酶，木聚葡糖酶，或者其中两种或更多种的混合物。适合用于 本发明的半纤维素酶的实例包括GrindamylPowerbake930(可从DaniscoA/S,丹麦获得） 或VISC0ZYME?(可从NovozymesA/S，丹麦获得）。在一个实施方式中，所述半纤维素酶是 木聚糖酶。在一个实施方式中，所述木聚糖酶是微生物来源的，例如真菌来源的（例如木霉 属，节毛菌属（Meripilus),腐质霉属，曲霉属，镰刀菌属（Fusarium))或来自细菌（例 如芽孢杆菌（Bacillus))。在一些实施方式中，所述木聚糖酶源自丝状真菌（filamentous fungus),优选源自曲霉属菌株（例如棘孢曲霉（Aspergillusaculeatus));或者腐质霉属 菌株（优选柔毛腐质霉（Humicolalanuginosa))。木聚糖酶可优选地是内切-1，4-β-木 聚糖酶，更优选地是GH10或GH11的内切-1，4-β-木聚糖酶。商业上的木聚糖酶的实 例包括来自DaniscoA/S,丹麦的GrindamylΗ121 或GrindamylPowerbake930 或者来自 NovozymesA/S,丹麦的SHEARZYME?和BIOFEEDWHEAT?。
[0086] 阿拉伯呋喃糖苷酶（EC3. 2. 1. 55)催化a-L-阿拉伯糖苷中末端非还原a-L-阿 拉伯呋喃糖苷残基的水解。半乳聚糖酶（EC3. 2. 1. 89)、阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半 乳糖苷酶催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-D-半乳糖苷连接的内切水解。
[0087] 果胶酶（EC3. 2. 1. 15)催化果胶酸和其它聚半乳糖醛酸中1，4-a-D-半乳糖醛酸 连接的水解。
[0088] 木聚葡糖酶催化木聚葡糖的水解。
[0089] 如本申请中所使用的，术语"木聚糖酶"指能够水解木聚糖或阿拉伯糖基木聚 糖的非末端β-D-吡喃木糖基-I，4_i3-D-吡喃木糖基单元中β_1，4糖基键的酶。其它 的名称包括1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶，1，4-β-木聚糖木聚糖水解酶，β-1，4-木 聚糖木聚糖水解酶，（1-4)_β木聚糖4-木聚糖水解酶，内切-1，4-β-木聚糖酶，内 切-(1-4)-β-木聚糖酶，内切-β-1，4-木聚糖酶，内切-Μ-β-D-木聚糖酶，内 切-1，4-木聚糖酶，木聚糖酶，β-1，4-木聚糖酶，β-木聚糖酶，β-D-木聚糖酶。木聚 糖酶可源自各种生物体，包括植物，真菌（例如，曲霉属、青霉属、Disporotrichum、链孢霉 属（Neurospora)、镰刀菌属、腐质霉属、木霉属的种）或者细菌的种（例如，芽孢杆菌属、气 单胞菌属（Aeromonas)、链霉菌属（Streptomyces)、诺卡氏菌属（Nocardiopsis)、嗜热真菌 属（Thermomyces)的种）（参见，例如TO92/17573、TO92/01793、TO91/19782、TO94/21785)。
[0090] 在本发明的一个方面，本发明的方法中所使用的木聚糖酶是归类为EC3. 2. 1. 8 的酶。官方的名称是内切_1，4_β-木聚糖酶。系统化名称是1，4-β-?-木聚糖木聚糖 水解酶。可使用其它的名称，例如内切-(1_4)-β-木聚糖酶；（1-4)-β-木聚糖4-木聚 糖水解酶；内切-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；β-1，4-木聚糖酶；内切-1，4-木聚糖酶；内 切-β-1，4-木聚糖酶；内切-1，4-β-D-木聚糖酶；1，4-β-木聚糖木聚糖水解酶；β-木 聚糖酶；β-1，4-木聚糖木聚糖水解酶；内切-1，4-β-木聚糖酶；β-D-木聚糖酶。所催化 的反应是木聚糖中1，4-β-D-木糖苷连接的内切水解。
[0091] 在本发明的一个方面，本发明的木聚糖酶是糖苷水解酶（GH)家族11的木聚糖 酶。术语"糖苷水解酶（GH)家族11的"是指所论及的木聚糖酶是或者可以被归类在GH家 族11中。
[0092] 在本发明的一个方面，根据本发明所使用的木聚糖酶是具有如在本申请中所描 述的"木聚糖酶测试"中所测量的木聚糖酶活性的木聚糖酶。
[0093] 根据Cazy(ModO)位点，家族11糖苷水解酶可被如下表征：
[0094] 已知的活性：木聚糖酶（EC3. 2. 1.8)
[0095] 机制：保留
[0096] 催化性亲核物质/碱基：Glu(实验的）
[0097] 催化性质子供体：Glu(实验的）
[0098] 3D结构状态：折叠：β-胶冻卷
[0099]族群（Clan) :GH_C
[0100] 如本申请中使用的，〃族群C〃指享有共同的三维折叠和相同的催化机构 (machinery)的家族组（参见，例如Henrissat，B.和Bairoch，A·，（1996)Biochem. J. , 316, 695-696) 〇
[0101] 如本申请中所使用的，"家族11"指如由Henrissat和Bairoch(1993)Biochem J.，293,781_788(也参见Henrissat和Davies(1997)CurrentOpinioninStructural Biol. 1997,&:637-644)所设立的酶家族。家族11成员的共同特征包括高的遗传同源性，约 20kDa的大小和双重置换（doubledisplacement)催化机制（参见Tenkanen等人，1992 ; Wakarchuk等人，1994)。家族11木聚糖酶的结构包括由β-链和α-螺旋构成的两个大 的β-折叠。
[0102] 家族11木聚糖酶包括下列：黑曲霉XynA,白曲霉（Aspergilluskawachii) XynC,AspergillustubigensisXynA,环状芽抱杆菌(Bacilluscirculans) XynA,BacilluspunzilusXynA,枯草芽抱杆菌XynA,Neocalliniastixpatriciarum XynA,浅青紫链霉菌（Streptomyceslividans)XynB,浅青紫链霉菌XynC,Streptomyces therinoviolaceusXynll,褐色热单抱菌（Thermomonosporafusca)XynA,哈茨木霉 (Trichodermaharzianum)Xyn,瑞氏木霉Xynl，瑞氏木霉Xynll,绿色木霉（Trichoderma viride)Xyn〇
[0103] 在本发明的情境中，"淀粉修饰酶"，指任何催化葡萄糖苷中的α-1，3和/或 α-1，6葡萄糖苷连接的水解的酶。包括在此术语中的是通常根据其所作用的底物而被命 名的糖苷水解酶。在根据本发明的一些实施方式中，所述"淀粉修饰酶"选自乳糖酶，淀粉 酶，支链淀粉酶，异淀粉酶，壳多糖酶，蔗糖酶，麦芽糖酶，神经氨酸酶，转化酶，透明 质酸酶和溶菌酶。
[0104] 在一些实施方式中，所述淀粉修饰酶是淀粉脱支酶。
[0105] 在本发明的一个方面，根据本发明所使用的淀粉修饰酶是具有如本申请中所描 述的"淀粉脱支活性测试"中所测量的淀粉脱支活性的酶。
[0106] 淀粉脱支酶包括支链淀粉酶（EC3. 2. 1. 41)和异淀粉酶（EC3. 2. 1. 68)。它们水解 支链淀粉，β-有限糊精和支链淀粉（pullulans)中的a-l，6_D-葡萄糖苷分支连接。可 通过异淀粉酶不能够攻击支链淀粉以及通过对于a-有限糊精有限的作用而将异淀粉酶 与支链淀粉酶（EC3. 2. 1. 41)相区别。
[0107] 〃淀粉酶〃意指包括任何淀粉酶，例如芽孢杆菌属的种（例如地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌（B.subtilis))的葡糖淀粉酶，a-淀粉酶，β-淀 粉酶和野生型a-淀粉酶。"淀粉酶"应该特别是指能够催化淀粉降解的酶。淀粉酶 是裂解淀粉中a-D-(I- 4)0-糖苷连接的水解酶。通常，a-淀粉酶（EC3.2. 1. 1 ; (a-D-(I- 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶）被定义为以随机的方式裂解淀粉分子内的 a-D-(I-4)0-糖苷连接的内切-作用性酶。相反地，外切-作用性淀粉分解酶，例如 β-淀粉酶（EC3. 2. 1. 2 ;a-D-(I- 4)-葡聚糖麦芽糖水解酶）以及一些产物特异性淀 粉酶（比如麦芽糖生成性a-淀粉酶（EC3. 2. 1. 133))从底物的非还原末端裂解淀粉分 子，β-淀粉酶、a-葡糖苷酶（EC3. 2. 1. 20 ;a-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶）、葡糖淀粉酶 (EC3. 2. 1. 3 ;a-D-(I- 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶）、和产物特异性淀粉酶可以由淀粉产生 葡萄糖。
[0108] 〃a-淀粉酶变体"，"a-淀粉酶变体多肽〃和〃变体酶〃指通过置换成熟a-淀 粉酶蛋白氨基末端的氨基酸残基而经修饰的a-淀粉酶蛋白。如本申请中所使用的，"亲 本酶〃、〃亲本序列〃、〃亲本多肽〃、〃野生型a-淀粉酶蛋白〃和〃亲本多肽〃应指所述 a-淀粉酶变体多肽所源自的酶和多肽。亲本酶可以是野生型的酶或之前经重组工程化的 a-淀粉酶。所述a-淀粉酶变体还可包括在a-淀粉酶亲本多肽的信号序列中或a-淀 粉酶亲本多肽的其它位置的突变。因此，所述a-淀粉酶多肽可以是经重组工程化的酶。
[0109] 在本发明的一个方面，根据本发明所使用的a-淀粉酶是具有如在本申请中所描 述的"a-淀粉酶测试"中所测量的a-淀粉酶活性的a-淀粉酶。
[0110] 在本发明的一个方面，根据本发明所使用的淀粉酶是具有如在本申请中所描 述的"β-淀粉酶测试"中所测量的β-淀粉酶活性的β-淀粉酶。
[0111] 术语"支链淀粉酶"指特定种类的葡聚糖酶，其是降解支链淀粉的淀粉分解内切 酶。其例如是由克雷伯杆菌（Klebsiella)属的革兰氏阴性细菌作为细胞外、细胞表面-锚 定的脂蛋白而产生的。然而，革兰氏阳性细菌产生支链淀粉酶作为分泌的蛋白。I型支链 淀粉酶特异性地攻击α-1，6连接，而II型支链淀粉酶还能够水解α-1，4连接。它也 由一些其它的细菌和古细菌产生。在生物技术中，支链淀粉酶被用作去污剂。支链淀粉 酶（EC3. 2. 1. 41)也已知为支链淀粉-6-葡聚糖水解酶（脱支酶）。支链淀粉被认为是由 α -1，6-葡萄糖苷键连接的麦芽三糖单元的链。支链淀粉酶将水解裂解支链淀粉（α-葡聚 多糖）。
[0112] 术语〃转葡萄糖基酶〃指具有转葡糖苷酶活性的任何酶，例如转葡糖苷酶。术语 〃转葡糖苷酶〃指将1，4-a-D-葡聚糖中的a-D-葡糖基残基转移至葡萄糖的伯羟基基团 的酶，为游离的或是在1，4-a-D-葡聚糖中结合的。本申请中所描述的转葡糖苷酶具有作 为EC2. 4. 1. 24 (根据IUBMB酶命名）而被描述的活性。本申请中所描述的转葡糖苷酶的 系统化名称是1，4_a-D-匍聚糖：1，4_a-D-匍聚糖（D_匍萄糖）6_a-D-匍糖基转移酶。 在某些出版物中，此酶可被称作α-葡糖苷酶。
[0113] 如上文所述，转葡糖苷酶通常具有被定义为EC2. 4. 1. 24 (根据IUBMB酶命名） 的活性，所述活性将某些葡聚糖中的葡糖基残基转移至葡萄糖的伯羟基基团。在一些实 施方式中，所述酶还可具有通过剪掉糖侧链或裂解内部的键来破坏多糖主链从而降解天 然树胶多糖（例如，黄原胶，和含有半乳甘露聚糖的多糖（例如瓜尔豆胶或利马豆胶）） 的活性。任何适合的转葡糖苷酶可用于本发明中（参见例如，Pazur等人，Carbohydr. Res. 1986149:137-47;andNakamura等人，J.Biotechnol.，53:75-84, 1997)。在一 些实施方式中，本发明中所用的转葡糖苷酶是商业上可得的（例如，包括但不限于从 Megazyme,Wicklow,愛尔兰或DaniscoUSInc.，Genencor分支，PaloAlto,CA所获得 的酶）。在一些实施方式中，所述酶是在瑞氏木霉细胞中产生的黑曲霉转葡糖苷酶。在 一些其它的实施方式中，所述转葡糖苷酶是野生型真菌转葡糖苷酶（例如，包括但不限于 具有在ncbi的βΜΒΑΝΚ?数据库中以如下登录号被保有的氨基酸序列的真菌转葡糖苷 酶：D45356(GID:2645159 ;黑曲霉），BAD06006. 1(GID:4031328 ;泡盛曲霉（Aspergillusaw amori))，BAA08125. 1{GI0:\054565 ;米曲霉），XPJ)0I210809. 1(GID:115492363 ;土曲霉 (Aspergillusterreus))，XP_001271891. 1(GID:121707620;棒曲霉（Aspergillusclava tus))，XPJ)01266999. 1(GID:119500484;费氏新萨托（Neosartoryafischeri))，XP75181 1.1(GID:70993928;烟曲霉（Aspergillusfumigatus))，XP_659621.1(GID:67523121; 构巢曲霉（Aspergi