专利名称：肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，具体涉及人肝再生增强因 子转染真核细胞的方法，以及含人工转染人肝再生增强因子基因的真核细胞的应用，属于 生物工程的生产方法。
背景技术：
肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)也称肝细胞生长素 (HPO)，1994年被鉴定并从大鼠肝刺激物质(HSS)中纯化得到，主要分布于肝脏、肾脏。ALR 是一种多肽调节因子，由125个氨基酸构成，相对分子量为15kDa，与含还原剂的SDS-PAGE 检测结果一致。而从动物体内提纯的天然ALR，经不含还原剂的SDS-PAGE分析，其分子 量约为30kDa，提示ALR在体内可能存在同源二聚体结构。ALR定位于16号染色体的 pl3. 31-pl3. 32，该基因包括3个外显子和2个内含子。ALR是一种新型的细胞因子，与其他 的亲肝细胞生长因子(如肝细胞生长因子干扰素-11等)在结构上无任何关系，但其编码 区基因与酵母菌核基因(ERV1)有50%的同源性。HALR(人肝再生增强因子)的生物学活 性表现为在受到损伤的肝脏的修复过程中发挥重要的作用，保护肝脏，促进肝细胞再生，此 外ALR还参与多种与氧化还原有关的代谢活动。ALR能刺激肝细胞DNA合成，抑制肝NK细 胞活性，诱导肝线粒体基因表达，参与肝细胞再生，并具有免疫调控作用。目前有关ALR的 研究主要是其生物合成及其蛋白水平利用与开发的研究。基因转染技术是采用一定的方法和途径将外源基因分子，如DNA、RNA等导入感受 态细胞，并表达目的基因，产生特定功能的蛋白质分子。常用的表达系统主要分为两类一 类是采用真核表达载体转染DNA的瞬时表达系统或稳定表达系统；一类是采用病毒载体的 表达系统。病毒载体虽然具有高转染率，能够持续、稳定表达外源基因的特点，但由于病毒 载体需整合到转染细胞的染色体中才能够使外源基因得以表达，因此具有致癌、致畸的危 险，安全性较差。这一缺陷已成为限制病毒载体广泛应用的主要原因。真核表达质粒是一 种核酸，它不同于病原体，在自然状态下没有感染性，以附加体的形式存在于被转染的靶细 胞的胞体内，不被体外培养的细胞吸附，当细胞增殖时独立的表达外源基因。它不需要整合 于转染细胞的染色体内，因而具有安全性高的优点。生物人工肝(bioartificial liver, BAL)指应用生物材料肝细胞(人肝细胞、动 物肝细胞、人肝细胞系、基因转化细胞等)构建体外灌流装置替代衰竭的肝脏进行生物合 成及代谢的体外人工肝支持系统。生物反应器内肝细胞要在生物反应器中大量培养生长、 保持活性并维持足够长的时间是构建生物人工肝的关键，故生物型人工肝细胞的来源及相 关研究是该研究领域的热点问题。因此，提供一种人肝再生增强因子转染真核细胞的方法，构建含人工转染人肝再 生增强因子基因的真核细胞株，具有重要的意义和实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，以及构建的 含人工转染人肝再生增强因子基因的真核细胞株的应用。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案一种人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，其步骤如下构建 pCDNA3. 1 (-)HALR质粒，同时进行IfepG2的培养及筛选；pcDNA3. 1 (-)HALR质粒转染IfepG2 筛选后所得的肝肿瘤细胞系；然后对转染的肝细胞系进行筛选，用有限稀释法挑选生长迅 速的克隆，建立稳定的肝细胞系。一种优选技术方案，其特征在于所述的构建p⑶NA3. 1(_)HALR质粒以后，还要进 行提取纯化。一种优选技术方案，其特征在于所述的构建PCDNA3. 1㈠HALR质粒，包括如下步骤①相应抗生素的LB琼脂平板的制备将含有1. 5%琼脂的LB固体培养基加热融 解，当培养基温度降至40-60°C时，加入相应的抗生素(氨苄青霉素)至终浓度为100mg/l， 将25ml倒入直径为90mm的培养皿中，室温放置至凝固；②取待转化的pcDNA3. 1 (-)HALR质粒1 y 1，无菌水稀释至100 u 1，冰上备用；③将步骤②的稀释质粒加到SO-lOOiU的感受态细胞DH5ci中并混勻，冰浴 20min,随后室温放置lOmin ；④加入400iU LB培养基，37°C，200rpm振荡30min，加入步骤③的液体中，然后取 200 u 1铺在步骤①制备好的含抗生素的LB琼脂平板上；⑤将步骤④的平板置于室温直至液体被吸收；⑥倒置平板，于37°C培养，12-16h后长出单克隆菌落。一种优选技术方案，其特征在于所述的IfepG2的培养，包括如下步骤(1)从液氮中取出IfepG2细胞冻存管、迅速置于37°C水浴使细胞快速融化；(2) lOOOrpm离心冻存管lmin，弃上清冻存液；(3)向冻存管中加入1ml含10% FBS (胎牛血清)的DMEM培养液，轻轻吹打重悬 细胞；(4)将细胞重悬至预装10ml含10%FBS的DMEM培养液的75cm2培养瓶中，置37°C， 5% C02，饱和湿度的培养箱中培养，观察生长状态；(5)传代取对数生长期H印G2细胞，倒掉DMEM培养液，用0. 02 % EDTA 2ml洗2 次；(6)0. 25%胰酶和0. 02% EDTA按1 1比例约2ml消化细胞l_3min，镜下观察细 胞圆缩伪足消失，加入约4ml含10% FBS的DMEM培养液终止消化。(7)轻轻吹打收集细胞，lOOOrpm离心lmin弃上清，以DMEM培养液重悬细胞，根据 细胞密度和实验要求分种细胞。一种优选技术方案，其特征在于所述的IfepG2的筛选，包括如下步骤(1)将H印G2悬液采用有限稀释法稀释至极低的细胞浓度；培养液为MEM培养液 (含10% FBSU00U/ml青霉素、100U/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺等)，将细胞悬液加至96 孔培养板中，平均每孔0. 3ml，在倒置相差显微镜下观察，约1个细胞/孔，再置于37°C，5% C02，饱和湿度的培养箱中培养；；
(2)接种6h后，在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态，反复多次，筛选出几株 生长旺盛的细胞克隆；然后用含80mg/l浓度的利多卡因的上述培养液进行进一步筛选，保 留一株生长旺盛、形态保持良好的细胞系，进行大量培养，再进行胰酶、EDTA消化，传代后作 进一步功能鉴定。一种优选技术方案，其特征在于所述的pcDNA3. 1 (_) HALR质粒转染H印G2筛选后 所得的肝肿瘤细胞系，采用VigoFect转染试剂盒进行转染。一种优选技术方案，其特征在于所述的pcDNA3. 1 (_) HALR质粒转染H印G2筛选后 所得的肝肿瘤细胞系，包括如下步骤(1)取3 ii g的pcDNA3. 1 (-)ALR质粒，加入0. 9 %氯化钠的盐水至300 yl，静置 15min ；(2)3 u 1的VigoFect转染试剂，加入0.9%氯化钠的盐水至300 iil，静置5min ；(3)将稀释后VigoFect试剂缓慢加入步骤①所得质粒溶液中，轻轻混勻，室温静 置 15min ；(4)将步骤(2)和步骤(3)所得溶液分别缓慢加入3ml细胞培养瓶中，37°C、5 % C02饱和湿度孵箱内培养；将稳定传代的HepG2细胞贴壁生长在3ml细胞培养瓶中(37°C、 5% C02、饱和湿度，予含10% FBS的MEM液培养；转染前24h将细胞按1 X 105个/孔浓度接 种于3ml培养瓶中，第二天细胞生长密度达70% ；转染前lh更换新鲜的含FBS培养液；(5) 16_24h后用含10% FBS的新鲜MEM培养基给细胞换液继续培养，24h后观察细 胞的形态和活性变化。一种优选技术方案，其特征在于所述的对转染的肝细胞系进行筛选，为采用 G418进行筛选。一种优选技术方案，其特征在于所述的对转染的肝细胞系进行筛选，包括如下步 骤将转染后的细胞，用含100 u g/L G418的培养液培养2周，然后再采用200 u g/L的G418 的培养液培养2周，最后用300 u g/L G418的培养液培养筛选，2个月后获得高表达ALR的 肝细胞系。真核细胞系包括从HepG2细胞中筛选出来的具有较强利多卡因代谢的肝细胞系 等所有真核细胞。有益效果本发明的优点在于肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration, ALR) 是一种热稳定、可促肝细胞增殖的细胞性因子，在体内肝脏、肾脏等组织广泛存在，本发明 的人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，具有作为生物人工肝构建的开发的巨大潜 力，可利用基因工程技术大量生产，降低成本，应用于生物人工肝研究与临床，这一研究在 国内外生物人工肝研究中未见报道。除此之外，转染的肝细胞还可以促进肝细胞移植中移 植细胞的生长繁殖或有助于组织器官工程技术的发展等。下面通过附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保 护范围的限制。
图 1 是 pcDNA3. 1 (-) HALR 质粒结构图2是pcDNA3. 1㈠HALR质粒的双酶切后的电泳图；图3是转染HALR基因前后细胞生长比较；图4是转染HALR基因细胞浆内荧光图；图5为细胞生长曲线的变化。
具体实施例方式实施例具体实施方法通过构建质粒p⑶NA3. 1 (-)HALR质粒，转染H印G2筛选后所得的肝 肿瘤细胞系，然后用G418进行筛选，用有限稀释法挑选生长迅速的克隆，建立稳定的肝细 胞系，观察肝细胞活力与繁殖量。一、主要试剂的配置1、抗体稀释液0. 1% TBST 10ml+0. 5g脱脂奶粉。2、MEM培养液使用前加入10% FBSU00U/ml青霉素、100U/ml链霉素、2mmol/L谷
氨酰胺等。3、电泳缓冲液-Tris-乙酸(TAE)贮存液(50 X) 242gTris碱+57. lml冰乙酸 +100ml 0. 5mol/LEDTA(pH8. 0)，去离子水定容至1000ml ；用49份去离子水加1份储存液稀 释成工作液(IX)。4,0. 8%琼脂糖凝胶制备称取0. 8g琼脂糖溶解于1XTAE缓冲液100ml中，微波 炉加热使其融化，冷却至55°C时加入溴化乙锭EB至终浓度为0. 5 u g/ml。5、LB (Luria-Bertani)培养基配制900ml去离子水中溶解胰化蛋白胨10g，酵母 提取物5g，氯化钠10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7. 0，用去离子水定 容至1000ml。高压蒸汽灭菌20分钟。6、0. 25%胰酶0. 25g胰蛋白酶粉剂溶于100ml D-Hank，s液中，0. 22 y m滤器过 滤除菌，-20°C保存，经常使用的4°C保存，使用前加热至37°C。7,0. 02% EDTA 0. 02gEDTA 粉剂溶于 100ml D-Hank，s 液中，0. 22 u m 滤器过滤除
菌，经常使用的4°C保存。使用时用lmol/L NaOH调节PH值至8.0。8、鼠抗人ALR单克隆抗体为广州孔祥平教授惠赠。9、荧光素标记羊抗鼠抗体为解放军302医院传染病研究所研制。10、真核转染试剂威格拉斯生物技术有限公司生产的高效真核转染试剂 (vigofect)。二、H印G2的培养及筛选1、HepG2的复苏及培养1)从液氮中取出IfepG2细胞冻存管、迅速置于37°C水浴使细胞迅速融化；2) lOOOrpm离心冻存管lmin，弃上清冻存液；3)向冻存管中加入lml含10% FBS的DMEM培养液，轻轻吹打重悬细胞；4)将细胞重悬至预装10ml含10%FBS的DMEM培养液的75cm2培养瓶中，置37°C， 5% C02，饱和湿度的培养箱中培养，观察生长状态；5)传代取对数生长期H印G2细胞，倒掉DMEM培养液，用0. 02 % EDTA 2ml洗2 次；
6)0. 25%胰酶和0. 02% EDTA按1 1比例约2ml消化细胞l_3min，镜下观察细 胞圆缩伪足消失，加入约4ml含10% FBS的DMEM培养液终止消化；7)轻轻吹打收集细胞，lOOOrpm离心lmin弃上清，以DMEM培养液重悬细胞，根据 细胞密度和实验要求分种细胞。2、IfepG2细胞的筛选(1)将H印G2悬液采用有限稀释法稀释至极低的细胞浓度；培养液为MEM培养液 (含10% FBSUOOU/ml青霉素、100U/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺等)，将细胞悬液加至96 孔培养板中，平均每孔0. 3ml，在倒置相差显微镜下观察，约1个细胞/孔，再置于37°C，5% C02，饱和湿度的培养箱中培养。(2)接种6h后，在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态，反复多次，筛选出几株 生长旺盛的细胞克隆；然后用含80mg/l浓度的利多卡因的上述培养液进行进一步筛选，保 留一株生长旺盛、形态保持良好的细胞系，进行大量培养，再进行胰酶、EDTA消化，传代后作 进一步功能鉴定。三、pcDNA3.1(_)HALR 质粒的鉴定1)质粒的构建pcDNA3. 1 (-)HALR质粒结构如图1所示。2)转化操作步骤①相应抗生素的LB琼脂平板的制备将含有1. 5%琼脂的LB固体培养基加热融 解，当培养基温度降至50°C左右时，加入相应的抗生素(氨苄青霉素)至终浓度为100mg/l 的，将25ml倒入直径为90mm的培养皿中，室温放置至凝固。②取待转化的pcDNA3. 1 (-)HALR质粒1 ii 1，无菌水稀释至100 u 1，冰上备用。③将步骤②的稀释质粒加入到一管感受态细胞DH5 a (约80_100 u 1)中并混勻， 冰浴20min，随后室温放置lOmin。④加入400iU LB培养基，37°C，200rpm振荡30min，加入步骤3的液体中，然后取 200 u 1铺在步骤1制备好的含抗生素的LB琼脂平板上。⑤将步骤4的平板置于室温直至液体被吸收。⑥倒置平板，于37°C培养，12-16h后可长出单克隆菌落。3)质粒的提取纯化(北京博大泰克公司，去内毒素小量质粒提取试剂盒)(1)挑取生长独立、大而圆的单克隆菌落接种到5ml LB培养基中，37°C，200rpm过 夜振荡培养。(2) lOOOOrpm离心lmin收集过夜培养的菌液，弃去上清并吸除剩余的培养液。(3)加入250 ill细胞重悬液(Cell Resuspension Solution)旋涡震荡以充分悬 浮细胞。(4)加入250 u 1细胞裂解液(Cell Lysis Solution)颠倒离心管4次以充分混 合，孵育至细胞悬浮液澄清，孵育时间不要超过5min。(5)加入10 ii 1碱性蛋白酶溶液(Alkaline Protease Solution)颠倒离心管4 次，室温孵育5min。(6)加入350 u 1中和溶液(Neutralization Solution)并迅速颠倒离心管4次以 充分混合。(7)室温将细胞裂解液以14000rpm速度离心lOmin。
(8)对于每一个样品将一个离心柱插入一个2ml收集管中，将7步收集的澄清裂解 液转移至离心柱中。(9)室温以14000rpm速度离心上清液lmin，从收集管中取出离心管并弃去收集管 中的液体，将离心柱重新插入收集管中。(10)加入750 ill已用95%的酒精稀释过的柱洗溶液(Wash Solution)，室温以 14000rpm速度离心lmin，从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体，将离心柱重新插 入收集管中。(11)加入250 ill柱洗溶液重复清洗步骤，室温以14000rpm速度离心2min。(12)将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中，加入100 ill无核酸酶的水以 洗脱质粒DNA，室温14000rpm速度离心lmin。(13)取出离心柱，将纯化所得的质粒DNA放于-20°C保存。测260/280值，测定质粒的浓度。
4)质粒的鉴定
(1)序列测定提取纯化后质粒进行酶切鉴定，鉴定与预期结果相符后将标本送北京华大生物技术公司进行序列测定。
HALR片段的序列分析
ATGCGGACGCAGCAGAAGCGGGACACCAAGTTTAGGGAGGACTGCCCGCCGGATCGCGAGGAACTGGGC
CGCCACAGCTGGGCTGTCCTCCACACCCTGGCCGCCTACTACCCCGACCTGCCCACCCCAGAACAGCAG
CAAGACATGGCCCAGTTCATACATTTATTTTCTAAGTTTTACCCCTGTGAGGAGTGTGCTGAAGACCTA
AGAAAAAGGCTGTGCAGGAACCACCCAGACACCCGCACCCGGGCATGCTTCACACAGTGGCTGTGCCAC
CTGCACAATGAAGTGAACCGCAAGCTGGGCAAGCCTGACTTCGACTGCTCAAAAGTGGATGAGCGCTGG
CGCGACGGCTGGAAGGATGGCTCCTGTGACTAG
序列测定结果和HALR序列完全相符，参见序列表。
(2)双酶切鉴定
去离子水 15 Pi
10 X Buffer L 2 u 1
重组质粒 liU 37°C酶切4h
Ecol I lu 1 0.8%琼脂糖电泳分析鉴定
BamH I 1 u 1
双酶切后的电泳图如图2所示，是pcDNA3. 1㈠HALR质粒的双酶切后的电泳图，
含ALR载体质粒经Ecol 1和BamHl双酶切后的0. 8%琼脂糖电泳照片。图2中1为未酶切 的质粒；2为DNA Marke ；3为Ecol I单酶切；4为Ecol 1和BamHI双酶切。结果说明经双 酶切后，成功从质粒中切除片断约378bp大小的片断，与所需片断相符。四、pcDNA3. 1(-)HALR质粒的转染及肝细胞系的筛选稳定传代的上述筛选出的H印G2细胞贴壁生长在3ml培养瓶中(37°C、5% C02、饱 和湿度)，培养液含10% FBS的DMEM液。按Vigofect转染试剂盒操作要求，转染前24h将细 胞按1 X 105个/孔浓度接种于3ml培养瓶中，第二天细胞生长密度达70 %。转染前lh更换 新鲜的含FBS培养液。转染共分3组，分别是质粒pcDNA3. 1(-)HALR组、空载体pcDNA3. 1(_) 组和空白对照组。
转染按照试剂盒说明操作，具体如下①取3iig的pcDNA3. 1 (-)HALR质粒，加入0. 9 %氯化钠的盐水至300 yl，静置 15min,②取3iil的VigoFect转染试剂，加入0. 9%氯化钠的盐水至300iil，静置5min，③将稀释后VigoFect试剂缓慢加入步骤①所得质粒溶液中，轻轻混勻，室温静置 15min，④将步骤②和步骤③所得溶液分别缓慢加入3ml细胞培养瓶中，空白对照组不加 质粒。37°C、5% 0)2饱和湿度孵箱内培养，⑤16-24h后用含10% FBS的新鲜MEM培养基给细胞换液继续培养，24h后观察细 胞的形态和活性变化。 上述转化后的细胞，用含100、200、3001^/1的6418逐步(含1001^/1 G418 的培养液培养2周，然后再采用200 u g/L的G418的培养液培养2周，最后予300 u g/LG418 的培养液培养)筛选，2个月后获得能较高表达HALR的肝细胞系。图3是转染HALR基因前后细胞生长比较，经筛选克隆后肝细胞系的形态见图3中 左图；转染HALR后肝细胞系的形态见图3中右图。可见肝细胞形态保持稳定，转染HALR质 粒的肝细胞胞浆中颗粒丰富，形态规则，生长旺盛。五、间接免疫荧光检测ALR在真核细胞中的表达(1)首先将明确是能较高表达ALR的肝细胞系培养在玻片培养管中，48h后观测细 胞的形态，如果细胞生长至70-80%，即可取出，放入-20度的丙酮中过夜固定。(2)取出肝细胞玻片，0.9%生理盐水冲洗，加入按1 80浓度的鼠抗人ALR单克 隆抗体，37°C作用30min，然后用O.Olmol/L PH 7. 2的PBS洗两次，lOmin后用吸水纸吸取 或吹风机吹干液体。(3)再滴加入荧光素标记羊抗鼠抗体(二抗)，同上步骤，37°C染色30min，生理盐 水洗2次，甘油或中性树胶封固，再荧光显微镜下观察并照片，如图4所示。图4是转染HALR 基因细胞浆内荧光图，可见细胞胞浆中可见大量发出荧光标志的物质，即为转染的人ALR， 细胞系表达人ALR较强，表明转染成功。六、HALR转染前后肝细胞系的生长与增殖测定①取单层培养的两种肝细胞系(转染前肝细胞系，转染HALR的细胞系)。弃培养 液，D-Hanks液洗2次，消化并收集细胞(方法同传代培养)；②用红细胞计数板计数(台盼蓝染色细胞活度> 90% )后，分别用普通细胞培养 液调整细胞密度为1 x 105个细胞/ml，以每孔200 u 1接种于7个96孔培养板中，每组6孔， 置入37°C、5% C02、饱和湿度孵箱内培养。③每日分别用普通细胞培养液和换液。④于接种后第1-7天每天取出一块培养板用MTT法测细胞的光吸收值(A45CI)。⑤具体方法每孔加5mg/ml MTT溶液20iil，37°C、5% C02、饱和湿度孵箱内继 续孵育4h后，小心吸弃孔内上清液，D-Hanks液轻洗3次，每孔加入二甲亚砜150 yl，振 荡lOmin使沉淀充分溶解后，选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值
(A450)，⑥记录结果，并以时间为横轴、光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线，如图5所示。转染HALR质粒的肝细胞生长较未转染的肝细胞生长旺盛，生长速度明显增快，在细胞培养 前4天尤为突出。第一天转染与未转染HALR质粒的肝细胞的A450值分别为0. 224和0.314。 第二天转染与未转染HALR质粒的肝细胞的A450值分别为0. 318和0. 409。有显著性差别。七、利多卡因转化实验细胞单层培养72小时后，在培养液中加入80mg/L的利多卡因，继续培养肝细胞24 小时，每8小时留取培养液标本用四级杆气质联用仪Trance/DSQII检测利多卡因浓度。利多卡因转化实验结果单层培养肝细胞72h后，在培养液中加入80mg/L的利多 卡因，8小时后利多卡因浓度平均56. 40mg/L, 16小时后浓度平均为31. 26mg/L, 24小时后浓 度平均为9. 26mg/L。采用有限稀释法从人肝细胞系H印G2细胞中筛选出来的肝细胞系，生长比较旺 盛，而且由一定的利多卡因代谢功能，经转染人肝细胞再生增强因子后，再经多浓度G418 筛选，细胞形态、功能保持良好，对其在生物人工肝研究和/或体外人ALR的生产有一定的 现实意义。本发明利用基因工程技术生产肝再生增强因子，然后转染真核细胞，促进真核细 胞的生长繁殖，在作为生物人工肝生物反应器细胞生长促进剂或体内肝细胞移植等领域具 有很大的应用前景。序列表<110>中国人民解放军第三零二医院<120>肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法及应用<130><160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>378<212>DNA<213>HALR片段的核苷酸序列<400>1atgcggacgc agcagaagcg ggacaccaag tttagggagg actgcccgcc ggatcgcgag 60gaactgggcc gccacagctg ggctgtcctc cacaccctgg ccgcctacta ccccgacctg 120cccaccccag aacagcagca agacatggcc cagttcatac atttattttc taagttttac 180ccctgtgagg agtgtgctga agacctaaga aaaaggctgt gcaggaacca cccagacacc 240cgcacccggg catgcttcac acagtggctg tgccacctgc acaatgaagt gaaccgcaag 300ctgggcaagc ctgacttcga ctgctcaaaa gtggatgagc gctggcgcga cggctggaag 360gatggctcct gtgactag 378
权利要求
一种人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，其步骤如下构建pCDNA3.1(-)HALR质粒；进行HepG2的培养及筛选，得肝细胞系；pcDNA3.1(-)HALR质粒转染HepG2筛选后所得的肝细胞系；然后对转染的肝细胞系进行筛选；用有限稀释法挑选生长迅速的克隆，建立稳定的ALR肝细胞系。
2.根据权利要求1所述的人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，其特征在于 所述的构建P⑶NA3. 1 (-)HALR质粒以后，还要进行提取纯化。
3.根据权利要求1所述的人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，其特征在于 所述的构建P⑶NA3. 1 (-) HALR质粒，包括如下步骤①相应抗生素的LB琼脂平板的制备将含有1.5%琼脂的LB固体培养基加热融解，当 培养基温度降至40-60°C时，加入相应的抗生素氨苄青霉素至终浓度为100mg/l，将25ml倒 入直径为90mm的培养皿中，室温放置至凝固；②取待转化的pcDNA3.1(-)HALR质粒1μ 1，无菌水稀释至100 μ 1，冰上备用；③将步骤②的稀释质粒加到80-100μ 1的感受态细胞DH5 α中并混勻，冰浴20min，随 后室温放置IOmin ；④加入400μ 1 LB培养基，37 °C，200rpm振荡30min，加入步骤③的液体中，然后取 200 μ 1铺在步骤①制备好的含抗生素的LB琼脂平板上；⑤将步骤④的平板置于室温直至液体被吸收；⑥倒置平板，于37°C培养，12-16h后长出单克隆菌落。
4.根据权利要求1所述的人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，其特征在于 所述的转染为采用VigoFect转染试剂盒进行转染。
5.根据权利要求1-4任一项所述的人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，其特 征在于所述的转染的具体步骤如下(1)取3μ g的pcDNA3. 1㈠ALR质粒，加入0.9%氯化钠的盐水至300 μ 1,静置15min ；(2)3μ 1的VigoFect转染试剂，加入0. 9%氯化钠的盐水至300 μ 1，静置5min ；(3)将稀释后VigoFect试剂缓慢加入步骤①所得质粒溶液中，轻轻混勻，室温静置 15min ；(4)将步骤(2)和步骤(3)所得溶液分别缓慢加入3ml细胞培养瓶中，37°0、5%0)2饱 和湿度孵箱内培养；将稳定传代的IfepG2细胞贴壁生长在3ml细胞培养瓶中37°C、5% CO2, 饱和湿度，予含10% FBS的MEM液培养；转染前24h将细胞按1 X IO5个/孔浓度接种于3ml 培养瓶中，第二天细胞生长密度达70% ；转染前Ih更换新鲜的含FBS培养液；(5)16-24h后用含10% FBS的新鲜MEM培养基给细胞换液继续培养，24h后观察细胞的 形态和活性变化。
6.根据权利要求1所述的人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，其特征在于 所述的对转染的肝细胞系进行筛选，为采用G418进行筛选。
7.根据权利要求6所述的人肝再生增强因子基因转染真核细胞的方法，其特征在于 所述的采用G418进行筛选的步骤如下将转染后的细胞，用含100μ g/L G418的培养液培 养2周，然后再采用200 μ g/L的G418的培养液培养2周，最后用300μ g/LG418的培养液 培养筛选，2个月后获得高表达ALR的肝细胞系。
8.根据权利要求1所述方法建立的含人工转染人肝再生增强因子基因的真核细胞株在生物人工肝和体外人ALR的生产中的应用
全文摘要
本发明涉及一种人肝再生增强因子转染真核细胞的方法，属于生物工程的生产方法，包括构建pCDNA3.1(-)HALR质粒，进行HepG2的培养及筛选；pcDNA3.1(-)HALR质粒转染HepG2筛选后所得的肝肿瘤细胞系；然后对转染的肝细胞系进行筛选，用有限稀释法挑选生长迅速的克隆，建立稳定的肝细胞系。本发明的人肝再生增强因子转染真核细胞的方法，具有作为生物人工肝构建的开发的巨大潜力，可利用基因工程技术大量生产，降低成本，应用于生物人工肝研究与临床。除此之外，转染的肝细胞还有可能促进肝细胞移植中移植细胞的生长繁殖或有助于组织器官工程技术的发展等。
文档编号C12R1/91GK101845457SQ200910080850
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者刘鸿凌, 游绍莉, 王业东, 王志杰, 胡燕, 貌盼勇, 辛绍杰 申请人:中国人民解放军第三〇二医院