专利名称：抗龋齿菌IgY的制备及防龋齿组合物的制作方法
技术领域：
本发明属IgY(鸡卵黄免疫球蛋白)的制备，特别是抗龋齿菌IgY的制备及以IgY和抗菌剂作为有效成份的防止龋齿的组合物。
变链菌被公认为是龋齿主要的致龋菌。目前对变链菌进行被动免疫的措施有两种，一是将单一的或混合的变链菌菌体作抗原，免疫母牛或母鸡，从牛乳或鸡卵黄中提取抗体，进行被动免疫防龋；二是将变链菌菌体中的葡糖基转移酶作为抗原，免疫母牛或母鸡，从牛乳或鸡卵黄中提取抗体，进行被动免疫防龋。但现有的抗体制备技术存在以下问题(1)抗体制备成本过高，特别是用葡糖基转移酶作抗原时，抗原提取困难；(2)抗体的效价较低，现有制备技术抗体效价最高也只有1∶320；(3)鸡卵黄不能得到综合利用。
本发明的目的提出一种抗龋齿菌IgY的制备方法，使抗体的生产成本降低，抗体效价提高，鸡卵能得到综合利用。同时，提供以本发明的IgY和抗菌剂作为有效成份的防止龋齿的组合物。
本发明所述的抗龋齿菌IgY的制备方法如下所述取c型和d型两种变链菌，分别在BHI培养基或TTY培养基中培养2-3天；将培养好的两种变链菌分别进行离心处理，收集菌体，用pH值为6-7、浓度为0.05-0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗菌体4-6次，50-65℃的温度下，加热25-35分钟，进行热处理，得到c型变链菌液和d型变链菌液。
将c型变链菌液和d型变链菌液，按1-2∶1的比例混合，并加入与上述两液体之总量等量的福氏佐剂，用高速匀浆器处理，制得菌体抗原。
c型变链菌液和d型变链菌液的混合比例最好为2∶1。
每次取本发明的变链菌抗原1.0ml(10亿/ml)，对母鸡进行皮下或翅静脉注射，注射三次，每隔二周一次；取免疫蛋，用蛋黄筛取出蛋黄，搅拌均匀，加入4-6倍体积的蒸馏水稀释，调节pH值至4.5-6.5，在3-5℃温度下静置20-30小时，高速离心20-30分钟，取其上清液，经超滤浓缩、除菌和冷冻干燥，即得抗龋齿菌IgY粗提物(粗品)。
将抗龋齿菌IgY粗提物经DEAE-Sephadex A50层析柱层析。用含0.03-0.1MNaCl的磷酸缓冲液进行连续或分段梯度洗脱，自动收集洗脱液；收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，调节蛋白含量为20mg/ml。
将前一步骤所得的蛋白洗脱液再经Sephadex G200凝胶柱层析。用含0.05-0.2M NaCl的磷酸缓冲液进行连续或分段梯度洗脱，自动收集洗脱液；收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗龋齿菌IgY纯品。
DEAE-Sephadex A50层析柱层析洗脱液NaCl磷酸缓冲液所含NaCl的溶度以0.07M为最佳。
Sephadex G200凝胶柱层析洗脱液NaCl磷酸缓冲液所含NaCl的溶度以0.1M为最佳。
本发明选择c型和d型变链菌作为抗原菌体，是基于以下研究结果考虑的。
变链菌按其血清分型，有a、b、c、d、e、f、g、h等血清型，但是对口腔中变链菌的检测表明，c型菌株约占60-90％,d型菌株约占10％，其它几种血清型菌的检出率很低。所以，c型和d型变链菌是引起龋齿的主要血清型菌，选择c型和d型变链菌作抗原菌体，既避免了多种血清型混合菌作抗原时，主要血清型菌效用降低的问题；也避免了当单一血清型菌作抗原时，交叉免疫反应范围偏窄的问题。
另外，研究表明，从口腔变链菌的细胞壁提取出A和B蛋白抗原，其中c型变链菌的细胞壁含有A和B蛋白抗原，b型变链菌仅含有A蛋白抗原，a、d、e、f和g型变链菌则只含B蛋白抗原，所以，以c型菌和d型菌作为抗原，保证了抗体具有很大范围的交叉反应。
本发明采用水稀释法提取IgY，可使蛋黄的其它成份得到综合利用，而且工艺简单，成本低，无环境污染。
IgY SDS-PAGE实验表明，本发明IgY达到了PAGE纯，经分子量测定，IgY分子量为180,000道尔顿。
IgY理化实验结果表明，本发明IgY在65℃条件下，90分钟内仍保持有活性；在pH4.0-11.0的环境中，37℃、8小时后活性无明显变化，但在pH2.0和pH12.0时活性迅速下降，并且很快失活；本发明IgY具有较大的抗渗透压性质，可耐受40％的蔗糖渗透压。
IgY间接血凝抑制实验表明，本发明IgY能有效地抑制变链菌凝聚，其效价高达1∶512；IgY抑制变链菌粘附实验观察表明，本发明的IgY稀释到1∶8，仍具有明显的抑制变链菌粘附作用；动物实验表明，用本发明IgY喂养感染变链菌的大白鼠，能有效地防止龋齿的发生，检测表明菌斑中变链菌数下降了70-80％。
本发明所述的防龋齿组合物是指以本发明IgY和山梨酸钾、苯甲酸钠两种抗菌剂中至少一种作为有效成份的组合物。这种防龋齿组合物，可以是牙膏、口含液、涑口水等口腔用产品，也可以是口香糖、巧克力、雪糕、冰淇淋等食品。本发明IgY的加入量通常为0.05-0.2％，山梨酸钾、苯甲酸钠的加入量通常为0.01-0.02％。
本发明的防龋齿组合物为液体状态时，可将其装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用。
本发明IgY还可与牙齿着色除去剂、预防口臭剂等蛀牙预防剂配合，制成各种防治产品。也可以加入到各种口腔清新剂中，增加口腔清新剂的防龋齿功能。
本发明IgY制备技术生产成本低，抗体效价高，抗渗透压强，对变链菌具有较强的免疫活性，且对变链菌具有很大范围的交叉反应。本发明的防龋齿组合物，具有IgY加量小，使用安全，防治效果好等特点，能有效地防止龋齿的发生。
本发明将通过以下实施例作进一步的描述。
一、抗体的制备。
实施例1。用BHI培养基，在37℃温度条件下，分别静置培养c型和d型变链菌48小时，将培养后的c型和d型变链菌分别用4000rpm离心10分钟，收集菌体；用pH值为6.0、浓度为0.2M的磷酸缓冲生理盐水洗菌体5次，50℃、25分钟加热处理，分别制得c型变链菌液(20亿/ml)和d型变链菌液(20亿/ml)；取c型变链菌液和d型变链菌液，按2∶1的比例混合，得变链菌混合液(20亿/ml)，然后，加入与变链菌混合液等量的福氏佐剂，用高速匀浆器处理，制得变链菌菌体抗原。
每次取菌体抗原1.0ml(10亿/ml)，对美国来亨鸡进行皮下注射，免疫三次，每隔两周一次。
第一次免疫母鸡20天后开始收集鸡蛋，鸡蛋用75％酒精擦洗消毒，用蛋黄筛取出蛋黄，搅拌均匀后，加入5信体积的蒸馏水稀释，调节pH值至6.0,3℃静置24小时，8000rpm离心20分钟，取上清液，经超滤浓缩、除菌和冷冻干燥，制得抗龋齿菌IgY粗提物。
将抗龋齿菌IgY粗提物经DEAE-Sephadex A50层析柱层析。柱床2.5×35cm，加样3.0ml(10mg/ml)，用含0.07M NaCl的0.01M、pH7.0磷酸缓冲液进行洗脱，流速20ml/h，洗脱液按每管5.0ml自动收集；收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性；收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，调节蛋白含量为20mg/ml。继而将该液进一步经Sephadex G200凝胶柱层析。柱床2.0×65cm，加样1.5ml，用含0.1M NaCl的0.01M、pH 7.0磷酸缓冲液进行洗脱，流速8.0ml/h，洗脱液按每管5.0ml自动收集，收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性。收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗龋齿菌IgY纯品。
实施例2。用TTY培养基，在37℃温度条件下，分别静置培养c型和d型变链菌48小时，将培养后的c型和d型变链菌分别用4000rpm离心10分钟，收集菌体；用pH值为6.5、0.15M的磷酸缓冲生理盐水洗菌体5次，60℃、25分钟加热处理，分别制得c型变链菌液(20亿/ml)和d型变链菌液(20亿/ml)；取c型变链菌液和d型变链菌液，等量混合，得变链菌混合液(20亿/ml)，并加入与变链菌混合液总量相等的福氏佐剂，用高速匀浆器处理，制得变链菌菌体抗原。
每次取菌体抗原1.0ml(10亿/ml)，对美国来亨鸡进行翅静脉注射，免疫三次，每隔两周一次。
第一次免疫母鸡20天后开始收集鸡蛋，鸡蛋用75％酒精擦洗消毒，用蛋黄筛取出蛋黄，搅拌均匀后，加入6倍体积的蒸馏水稀释，调节pH值至5.5,4℃静置24小时，8000rpm离心25分钟，取上清液，经超滤浓缩、除菌和冷冻干燥，制得抗龋齿菌IgY粗提物。
将抗龋齿菌IgY粗提物经DEAE-Sephadex A50层析柱层析。柱床2.5×35cm，加样4.0ml(10mg/ml)，用含0.06M NaCl的0.01M、pH7.0磷酸缓冲液进行洗脱，流速20ml/h，洗脱液按每管5.0ml自动收集；收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性，收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，调节蛋白含量为20mg/ml。继而将该液进一步经Sephadex G200凝胶柱层析。柱床2.0×65cm，加样1.5ml，用含0.12M NaCl的0.01m、pH 7.0磷酸缓冲液进行洗脱，流速8.0ml/h，洗脱液按每管5.0ml自动收集，收集各蛋白洗脱峰，并以ELISA检测各蛋白的抗体活性。收集留取有抗体活性的蛋白洗脱液，0.22μ膜过滤除菌，冷冻干燥，即得抗龋齿菌IgY纯品。
二、防龋齿组合物产品的制备。
实施例3。IgY口含液的制备。取本发明IgY 2.0g，山梨酸钾0.15g，苯甲酸钠0.15g，阿斯巴甜0.8g，薄荷脑0.15g，苹果香精0.4ml。将薄荷脑加入100ml的蒸馏水中，60℃溶化；其它固体成份各溶解于450ml的蒸馏水中，然后将各种溶解的液体均匀混合，用蒸馏水定容到1000ml。
实施例4。IgY口香糖的制备。取本发明IgY 2.0g，山梨酸钾0.15g，阿斯巴甜0.8g，薄荷脑0.15g，微囊化苹果香精0.4g，胶基10.0g，羧甲基纤维素5.0g，按总量1千克，再加入基料。
实施例5。IgY牙膏的制备。取本发明IgY 0.1g，山梨酸钾0.015g，苯甲酸钠0.015g，甘油10.0g，山梨糖醇8.0g，羧甲基纤维素2.0g，龙须菜1.3g，月桂基硫酸钠1.8g，薄荷脑0.015g，阿斯巴甜0.015g，草莓香精0.05ml，磷酸钙二水物47.8g。将羧甲基纤维素、龙须菜加入约60ml的蒸馏水中，泡胀溶解，再先后加入其它成份，充分搅拌，使混合均匀，最后加入蒸馏水定容至100ml，搅拌均匀成膏状。
实施例6。IgY护齿膏的制备。取本发明IgY 0.1g，苯甲酸钠0.01g，蜂蜡8.0g，硬脂酸10.0g，甘油单硬脂酸酯2.0g，甘油10.0g，羧甲基纤维素1.0g，薄荷脑0.01g，阿斯巴甜0.05g，蒸馏水68.80ml，草莓香精0.02g。将蜂蜡、硬脂酸、甘油单硬脂酸酯、甘油混合，加热至70℃，混合溶解之液体称之为A液；将羧甲基纤维素溶解于50ml的蒸馏水中，泡胀溶解，再先后加入IgY、薄荷脑、阿斯巴甜、山梨酸钾、草莓香精，充分搅拌，混合均匀，继而加入冷却后的A液，最后加入蒸馏水定容至100ml，搅拌均匀成膏状。
权利要求
1.抗龋齿菌IgY的制备方法，包括变链菌抗原制备、免疫母鸡、IgY的提取等，其特征是取c型和d型变链菌作为抗原菌，用水稀释法、DEAE-SephadexA50层析柱层析法、Sephadex G200凝胶柱层析法提取IgY。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是将c型变链菌与d型变链菌按2∶1的比例混合作为抗原菌。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是水稀法提取IgY粗品时，在搅拌均匀的蛋黄中加入4-6倍的蒸馏水，调节pH值至4.5-6.5，在3-5℃温度下静置20-30小时，高速离心20-30分钟。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是DEAE-Sephadex A50层析柱层析洗脱液NaCl磷酸缓冲液所含NaCl的溶度为0.03-0.1M。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是DEAE-Sephadex A50层析柱层析洗脱液NaCl磷酸缓冲液所含NaCl的溶度为0.07M。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是Sephadex G200凝胶柱层析洗脱液NaCl磷酸缓冲液所含NaCl的溶度为0.05-0.2M。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是Sephadex G200凝胶柱层析洗脱液NaCl磷酸缓冲液所含NaCl的溶度为0.1M。
8.一种抗龋齿菌的组合物，其特征是由抗龋齿菌IgY和山梨酸钾、苯甲酸钠中至少一种抗菌剂为有效成份。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征是IgY的加入量为0.05％以上，山梨酸钾、苯甲酸钠的加入量为0.01-0.02％。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征是IgY的加入量为0.05-0.2％。
11.根据权利要求8所述的组合物，其特征是当组合物为液体时，装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用。
全文摘要
抗龋齿菌IgY的制备及防龋齿组合物,用c型和d型变链菌作为抗原菌,用水稀释法、DEAE－Sephadex A50层析柱层析法、Sephadex G200凝胶柱层析法提取抗体,其生产成本低,抗体效价高,抗渗透压强,对变链菌具有较强的免疫活性和很大范围的交叉反应,本发明提供的以IgY和抗菌剂为有效成份的防龋齿组合物,具有使用安全、防治效果好等特点,能有效地防止龋齿的发生。
文档编号A61P1/02GK1307061SQ00101270
公开日2001年8月8日 申请日期2000年1月25日 优先权日2000年1月25日
发明者杨荣鉴 申请人:雅臣药业集团(远东)有限公司