专利名称：乳酸杆菌在减少龋齿和细菌引发龋齿中的用途的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及一种用于筛选非致病性的抗-生龋齿菌株的方法，以及使用该菌株治疗和预防因口腔细菌例如变异链球菌及其他可引发龋齿的病原体而引发龋齿的产品和方法。
相关技术描述人和其他哺乳动物口腔中含有许多不同种类的细菌，包括大量不同种类的乳杆菌。龋齿是一种细菌引发的疾病。1890年，Miller在″Chemico-Parasitic Theory″提出了这样的观点龋齿是由从消化的碳水化合物产酸的口腔细菌引起的，这些酸溶解了牙齿的hydroxyhepatite。后来在限菌大鼠中得到证实，例如，正常的口腔细菌群落，主要包括变异链球菌群，另外乳杆菌群也包括在内。这些驻留于口腔中的″产酸″菌种与龋齿的产生及发病相关(LocscheWJ，Microbiolog Rev.，198650353-380)。在所述的变异链球菌菌群中共有7个菌种，其中变异链球菌(血清型c、e、f)占全部人分离株的90％(Linder L.，Oral Mikrobiologi 1996，ISBN91-7205-037-3)。大量证据表明龋齿的发生需要在牙斑内有相当高比例的变异链球菌。这些细菌可以很好地附着在牙齿表面，能够从糖中产生比其他细菌类型更多量的酸，与其他细菌相比在酸性环境中更易存活，并能从蔗糖中生产出胞外多糖。当菌斑中变异链球菌的比例高(2-10％)时，患者处于患龋齿的高危险中。当该比例低(小于0.1％)时，该患者的患病危险则较低。因为它们比其他细菌更耐酸，因此牙斑中的酸性条件有利于变异链球菌的存活和增殖。两种其他的细菌还与龋齿发展深入至牙本质有关。有几种乳杆菌，和粘放线菌。这些细菌也是高度产酸的，在酸性条件下存活的很好。
乳杆菌在龋齿中所起作用已经得到证实(Smith et al.，Microbios 10577-85，2001)。实际上，除测算变异链球菌的量之外，还使用不同的选择培养基或其他技术测算唾液中乳杆菌的量，已经多年来用作“龋齿试验”，试图鉴定龋齿的高危险群体。因此，乳杆菌菌株，来自人牙斑的一些分离株，是高致龋齿原性的(Fitzgerald et al.，J.Dent.Res.60919-926，1981。
要将一种细菌定为是形成龋齿的主要病原体，需要同时具备下列必要特征中的几种(Linder，1996)能够在牙表面粘附并定居；能够在牙齿的限定表面上大量蓄积；能够从食物内的碳水化合物快速产酸；以及能够在牙斑的低pH条件下继续平稳地产酸。
饮食中的蔗糖改变噬斑的深度和化学性质。变异链球菌和其它的噬斑细菌使用单糖成分(葡萄糖和果糖)和蔗糖二糖键的能量，装配胞外多糖。这些明显增加了噬斑深度，并且还改变了其从液体到凝体胞外间隙的化学性质。所述凝体限制了一些离子的运动。厚的凝体-噬斑得以发展了一种抗牙表面的酸性环境，避免其受到唾液的缓冲。未与蔗糖接触过的噬斑较薄并且更缓冲。因此，蔗糖比例高的饮食能够增加龋齿的危险。厚的噬斑发生于凹点和裂缝，以及在口腔卫生差的住院病人中，牙龈缘附近部位。
考虑到该疾病原理，显然预防和治疗龋齿需要阻止变异链球菌发挥作用，例如通过将改变饮食作为减少细菌底物的方法，加强牙齿的表面结构或者减少变异链球菌的数目。因此，已经测试过的处理方法包括努力改变微生物群落，使用药剂例如牙齿洗必泰和牙齿氟化物；通过饮食变化，减少饮食中蔗糖的含量，代之以变异链球菌更难代谢的甜味剂，例如山梨糖醇、阿斯巴甜、木糖醇；降低吃的频率，通过饮食选择；增加氟化物，具体而言为每日刷牙过程中的应用；以及增加唾液流动，在为提高流动猛烈咀嚼过程中使用机械刺激，通过改变减少流动的药物，或者通过使用增加流动的药物。
已经使用不同的方法评估预防龋齿，例如，一种组合物使用一种特异性针对变异链球菌的噬菌体生成的水解酶(Fischetti等人的美国专利No.6,399,098)。另外，已经通过基因工程手段对一乳杆菌菌株进行修饰，使得其表面生成一种能够中和有害链球菌的抗体，(Hammarstrom L.于July 2002出版Nature Biotechnology)，但是这种基因工程修饰生物体的方法面临未知的安全许可问题。
此外，一株鼠李糖乳杆菌(菌株GG)已经被提升作为减少表兄链球菌(Streptococcus sabrinus)和变异链球菌的常用方法(Nase等人，Caries Res.35412-420，2001)。进一步的工作表明使用该细菌作为发酵牛奶引子不会影响牛奶中抗人生龋细菌抗体的滴度(Wei等人，Oral Microbio.& Immunol.179-15，2002)。鼠李糖乳杆菌GG在许多方面不同于路氏乳杆菌，包括发酵特征和分离来源。已经发现具有抗牙斑形成抑制活性的其他微生物包括肠球菌、嗜酸性乳杆菌V20和乳酸乳杆菌1370(美国专利No.6,036,952)。为了抑制变异链球菌，已经开展了使用所谓″竞争性排斥″概念的其他工作。例如，路氏乳杆菌菌株ATCC55730已显示能够抑制变异链球菌(Nikawa H.等人，News release by Hiroshima University July11，2002)。日本市场出售的一种名为LS1的块状制品(日本FrenteLtd.生产)，其中含有唾液乳杆菌菌株(LS1)，据称能够抑制变异链球菌。
多种乳杆菌菌株，包括路氏乳杆菌在内，已经用于益生素制剂。路氏乳杆菌是动物胃肠道天然生成习居菌中的一种，通常发现于肠道，偶尔发现于健康动物的生殖道、乳汁和口中，包括人在内。已知具有抗菌活性。参见，例如，美国专利Nos.5,439,678，5,458,875，5,534,253，5,837,238和5,849,289。当路氏乳杆菌细胞生长在有甘油存在的厌氧条件时，他们产生被称为无蛋白菌质(B-羟基-丙醛)的抗菌物质。
除了常见有机酸外还报道了其他抗菌物质例如″reutericyclin(新品种的乳酸杆菌)″(Holtzel，A.等人Angewandte ChemieInternational Edition 39，2766-2768，2000)和″PCA(焦谷氨酸)″(Yang，Z.Dissertation，Univ.of Helsinki，March 2000)。另外，众所周知，乳杆菌，包括路氏乳杆菌在内，能够通过局部竞争养分及其他新陈代谢相互作用抑制其他生物体。另外，免疫调节和抗炎的活性也与路氏乳杆菌有关。路氏乳杆菌的粘蛋白结合蛋白已经被分离并描述。参见，例如，美国专利No.6,100,388。
报道称乳杆菌菌株能够附着于各种细胞系和宿主粘液。推测认为这一点对于益生素活性具有重要意义，源自于病原菌中毒力因子的原理，最近十年中已经发现了其中众多系列的这类相互作用(Klemm，P.and Schembri，M.A.(2000)Bacterial adhesinsfunction andstructure.Int.J.Med.Microbiol.290，27-35)。
尽管此前已知路氏乳杆菌的有效抗菌活性，已知路氏乳杆菌的一些结合特性例如粘蛋白结合特性，，还已知路氏乳杆菌菌株ATCC55730和乳杆菌GG ATCC 53103的变异链球菌抑制作用，但是此前并不知道乳杆菌菌株由于抑制作用和结合活性，相互间在减少口腔中变异链球菌数目从而减少龋齿能力上的差异，也不知道这类菌株可以筛选。
因此，本发明的一个目的是提供较好的乳杆菌菌株，这些菌株能够通过抗菌活性以及与口腔粘蛋白及牙斑的良好结合特性减少口腔中变异链球菌的数目，从而预防、减少或治疗龋齿。本发明的另一目的是提供含有所述菌株的产品，包括用于向人施用预防或治疗变异链球菌相关龋齿的药剂。
其他目的和优点更明显地体现于下列公开内容及所附权利要求。
发明概述本发明包括乳杆菌菌株，这些菌株能够通过抗菌活性以及与口腔粘蛋白及牙斑的良好结合特性减少口腔中变异链球菌的数目，从而预防、减少或治疗龋齿；由所述菌株得到的产品，包括用于向人施用预防或治疗龋齿的药剂；以及制备这些产品的方法。
其他目的和优点更明显地体现于下列公开内容及所附权利要求。
发明及优选实施方案详细说明本发明提供一种用于抑制龋齿细菌生长及活性的产品，其中含有至少一种乳杆菌菌株，该菌株具有良好的抗变异链球菌活性以及与口腔粘蛋白及牙斑的良好结合特性，从而预防、减少或治疗龋齿。所述菌株包括路氏乳杆菌CF2-7F(2003年1月29日保藏于ATTC，指定时将保藏号加入本申请中)及路氏乳杆菌MF2-3(2003年1月29日保藏于ATTC，指定时将保藏号加入本申请中)。
除了能减少口腔中变异链球菌数目外，本发明中乳杆菌菌株选择的其他标准是菌株结合宿主粘蛋白的能力。实际上，现已经查明乳杆菌确实粘附于粘膜表面及其成分。乳杆菌与粘液粘附的试验表明许多菌株显然不具有体外结合粘液物质的能力。由于这些非-结合剂中的许多分离自粘膜表面，因此可以认定生长环境能够影响细菌的粘附特性。
在本申请使用的筛选方法中，现已查明所述粘附特性通过在细菌培养基中加入粘蛋白部分模拟了肠道环境。因此，如实施例中所述，本发明的方法包括1)评定链球菌菌株的变异链球菌抑制作用；以及2)评定乳杆菌的粘蛋白结合作用。
本发明所述产品可以是置于口中预防或治疗龋齿或者以营养和保健为目的的任意一种产品，例如食品，牙齿治疗用品例如嗽口水或其他特定保健用品，口香糖，等。特别适用于本发明的食品包括例如酸奶酪，和浆汁，饮料等等。可用于本发明的牙齿治疗用品包括牙膏、液体牙齿清洁剂、嗽口水、抗口臭制品，等。
本发明产品发挥作用所需的乳杆菌细胞浓度取决于食物类型及摄入食物的量(或者非食物牙齿治疗用品在口中存放时间)，但是通常优选每克产品中含约106～107个CFU(集落形成单位)或更多。约1010～1011CFU的量是能够实现的，可用于提高效力且不会影响产品的感官特性(它的味道或气味)。当所述产品是酸奶酪或其他乳酸发酵制品时，用于制备所述产品的乳酸发酵菌株优选为这一特定目的的常规培养物，本发明所述的抗致龋细菌可以在所述产品发酵前或后加入，加入水平为每毫升酸奶酪中约106～107CFU或更多，如上所述。
优选本发明所述产品不含有其他抗菌成分，至少没有任何抑制或杀死所选用乳杆菌菌株或干扰其抗生龋活性的物质。
所述乳杆菌菌株可以是混合入成分中，或捏合入所述产品内或包被于表面上的添加物，通过本领域制备该类型产品的已知技术。如果本发明选择的食物或其他产品需要加热，那么所述乳杆菌菌株应该在加热后添加。一旦所述选择乳杆菌细胞进入所述产品，那么就优选该产品不要在60～70℃或更高温度下加热较长的时间。
参照下列实施例可以更加清楚地理解本发明，这些实施例不是对本发明的限制。
实施例菌株的筛选方法本发明使用的乳杆菌菌株的筛选可以通过下列两步法完成a)评估乳杆菌菌株对变异链球菌的抑制作用测量抑制作用使用的菌株的一个实例是变异链球菌ATCC25175(获自American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)。将所述分离株培养于添加了0.5％酵母抽提物(Difco)(TSBY)的胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤(Difco，Detroit，USA)。指数生长期通过1000xg离心收集所述细胞，用PBS洗涤两次，重悬于同种缓冲液。所述细胞悬液进行低强度超声波处理分散细菌团块。
将测试乳杆菌菌株培养于脑-心脏浸出液肉汤(Difco)，指数生长期通过1000xg离心收集，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.8)洗涤两次，然后重悬于同种缓冲液。
在一种柠檬色光程的1.0ml透明小容器中测量所述细菌悬液的光密度，调节悬液至终浓度为1.0×108CFU(菌落形成单位)/ml。
所述抑制试验操作如下，将变异链球菌悬液和乳杆菌悬液按100～0、75～25、50～50和25～75的比例混合于灭菌离心管(总体积为100μl)，补加BHI肉汤至10ml，涡旋混合10秒，然后于37℃轻微振摇的条件下孵育90分钟。作为对照，将变异链球菌悬液与等体积PBS混合于对照管(无乳杆菌)。然后每一悬液通过1000xg离心洗涤，用PBS洗涤两次，铺板于MS琼脂测定变异链球菌的CFU量。用下列公式得出变异链球菌的存活％。
所述试验应该用最小量的一式三份样本进行。对得到的全部数字数据进行统计学分析。
b)评估乳杆菌的粘蛋白结合效应将来自猪胃粘蛋白(Sigma，St.Louis，MO，USA)以0.1mg/ml悬于pH 9.7的碳酸盐缓冲液。吸取所述溶液200μl加入微量滴定孔，置于37℃包被约3小时。室温下加入200μl PBS 1％Tween20封闭孔约1小时，用PBS 0.5％Tween20(PBST)洗涤三次。将乳杆菌评估株在为模仿体内生长条件添加0.01％猪胃粘蛋白(Sigma，M1778)的MRS肉汤中37℃下培养过夜，然后洗涤并重悬于PBST。用BeckmanDU650分光光度计测量600nm处菌体细胞的光密度(OD)，调节OD至0.5。向每一孔中加入100pl细菌悬液，4℃下孵育过夜。用PBST冲洗孔，用倒置显微镜测定结合情况。倒掉缓冲液，待孔变干后，用ELISA平板阅读仪测量OD405。按0-3给结合结果打分，0分为无任何结合，3为与粘蛋白强结合。
根据试验，选择在抑制变异链球菌和结合粘蛋白两个方面都表现出最佳结果的乳杆菌菌株。
实施例2菌株的筛选1.路氏乳杆菌SD2112(ATCC 55730)2.路氏乳杆菌DSM 20016(DSM 20016)3.路氏乳杆菌MM2-3(ATCC PTA-4659)4.路氏乳杆菌CF2-7F(ATTC保藏号有待指定后加入本申请)5.路氏乳杆菌MF2-3(ATTC保藏号有待指定后加入本申请)6.路氏乳杆菌MP14-C(生命大地女神有限公司的培养物收集，RaleighNC，USA)7.路氏乳杆菌MF52-1F(生命大地女神有限公司的培养物收集，Raleigh NC，USA)8.唾液乳杆菌LS1(分离自Frente Ltd.Japan生产的LS1片剂)9.鼠李糖乳杆菌GG(ATCC 53103)。
该试验中，使用本发明所述抑制变异链球菌及粘附粘蛋白的选择标准选择上列乳杆菌菌株进行评估。使用实施例1中给出的方法。选择那些菌株是最适合菌株是根据变异链球菌抑制效应及所述乳杆菌与粘蛋白的粘附情况决定的。
表1乳杆菌菌株对变异链球菌的抑制以及根据所述试验得出的粘附分值。(0＝无任何结合，3＝强结合，S＝被选取)
实施例验证所选乳杆菌菌株的效力对添加实施例2所列乳杆菌菌株发酵牛奶(试验酸奶酪)和安慰剂发酵牛奶(安慰剂酸奶酪)对口腔中变异链球菌量的影响进行研究。所述的试验酸奶酪为
-试验酸奶酪1.用路氏乳杆菌SD2112发酵的-试验酸奶酪2..用路氏乳杆菌DSM 20016发酵的-试验酸奶酪3..用路氏乳杆菌MM2-3发酵的-试验酸奶酪4..用路氏乳杆菌CF2-7F发酵的-试验酸奶酪5..用路氏乳杆菌MF2-3发酵的-试验酸奶酪6..用路氏乳杆菌MF14-C发酵的-试验酸奶酪7..用路氏乳杆菌MF52-1F发酵的-试验酸奶酪8..用唾液乳杆菌LS1发酵的-试验酸奶酪9..用鼠李糖乳杆菌GG发酵的-试验酸奶酪10安慰剂，参见下文选200位健康女性受试者(年龄；20±2岁)分为10组。所有受试者都无任何活跃的龋齿病变、牙龈炎或牙周病的症状。第一组受试者每日中午时段(12:00～13:00)吃一杯(95g)安慰剂酸奶酪，共持续2周，然后在另两周时间内中午时段吃一杯试验酸奶酪no.1。第二组受试者每日中午时段(12:00～13:00)吃一杯(95g)安慰剂酸奶酪，共持续2周，然后在另两周时间内每天中午时段吃一杯试验酸奶酪no.2。依此类推前9组均如此。试验组10在这两个两周时间段内都吃安慰剂酸奶酪。每一种酸奶酪吃之前和之后，均测定口腔中变异链球菌的含量水平，如下所述。在15:00～16:00时将大约5ml未经刺激的全唾液收集在置于冰上的容器内。然后通过常规活菌计数方法测定变异链球菌口腔带菌量。安慰剂酸奶酪由德氏乳杆菌和噬热链球菌组成，这两种细菌广泛地用于发酵牛奶制品中，将所述安慰剂酸奶酪在80℃下加热10分钟杀死微生物，制成试验酸奶酪no.10。在整个试验过程中受试者和调查者都不知道那种酸奶酪中含有那种试验生物。在干预之前的一周内及整个干预过程中禁止使用其他含乳杆菌或其他药物乳酸杆菌的产品。对得到的全部数字数据进行统计学分析。
表2乳杆菌菌株体内抑制变异链球菌的结果，数据表示为log(口腔中链球菌的CFU)
实施例4含有所选菌株产品的制备该实施例中，为了向常规酸奶酪中加入路氏乳杆菌CF2-7F(ATTC保藏号有待指定后加入本申请)，使用上述变异链球菌抑制及粘蛋白结合的方法筛选该菌株。培养该路氏乳杆菌菌株并冻干，使用乳品工业中培养乳杆菌常规方法。然后事先将该培养物加入发酵奶，使用常规酸奶酪培养物，按107CFU/克酸奶酪的水平，然后让人食用后作为防止龋齿的方法。
尽管本申请中已经给出了代表性的实施方案，本领域技术人员显然知道可以进行改动而不脱离本发明的实质或范围。
权利要求
1.一种路氏乳杆菌菌株CF2-7F(ATTC保藏号待提供)生物学纯培养物。
2.一种路氏乳杆菌菌株MF2-3(ATTC保藏号待提供)生物学纯培养物。
3.一种路氏乳杆菌生物学纯培养物，该乳杆菌能够减少口腔中变异链球菌的数目用于预防或治疗哺乳动物龋齿并且使用抑制活性的选择检定能与口腔粘蛋白很好地结合。
4.一种用于抑制龋齿细菌生长的产品，其中含有至少一种路氏乳杆菌菌株，该菌株具有抗致龋细菌的抑制活性且与能口腔粘蛋白很好地结合。
5.根据权利要求4所述产品，其中所述的至少一种菌株选自由路氏乳杆菌菌株CF2-7F(ATTC保藏号有待提供)和路氏乳杆菌菌株MF2-3(ATTC保藏号有待提供)组成的组。
6.根据权利要求4所述产品，其中所述产品是食品。
7.根据权利要求6所述产品，其中所述食品选自由酸奶酪、果冻、布丁、口香糖、糖果、巧克力、饼干、曲奇饼、乳酪、果汁和茶叶组成的组。
8.根据权利要求6所述产品，其中所述食品是含奶产品。
9.根据权利要求8所述产品，其中所述食品是酸奶酪。
10.根据权利要求4所述产品，其中所述产品是牙齿治疗用品。
11.根据权利要求10所述产品，其中所述产品是漱口剂。
12.一种用于制备抗-生龋产品的方法，该方法包括向所述产品中添加至少一种路氏乳杆菌菌株，该菌株具有抗致龋细菌的抑制活性且能与口腔粘蛋白很好地结合。
13.根据权利要求12所述方法，其中所述的至少一种菌株选自由路氏乳杆菌菌株CF2-7F(ATTC保藏号有待提供)和路氏乳杆菌菌株MF2-3(ATTC保藏号有待提供)组成的组。
14.根据权利要求12所述方法，其中所述产品是食品。
15.根据权利要求14所述方法，其中所述食品选自由酸奶酪、果冻、布丁、口香糖、糖果、巧克力、饼干、曲奇饼、乳酪、果汁和茶叶组成的组。
16.根据权利要求14所述方法，其中所述食品是含奶产品。
17.根据权利要求16所述方法，其中所述食品是酸奶酪。
18.根据权利要求12所述产品，其中所述产品是牙齿治疗用品。
19.根据权利要求18所述产品，其中所述产品是漱口剂。
全文摘要
本发明提供了乳杆菌菌株，这些菌株能够通过抑制活性以及与口腔粘蛋白及牙斑的良好结合特性减少口腔中变异链球菌的数目，从而预防、减少或治疗龋齿，本发明还提供了含有所述菌株的产品，包括用于向人施用预防或治疗龋齿的药剂。
文档编号A23L1/03GK1860219SQ200480002489
公开日2006年11月8日 申请日期2004年1月27日 优先权日2003年1月29日
发明者埃蒙·康诺利, 布·莫尔斯泰姆 申请人:生命大地女神有限公司