专利名称：新的人促神经营养因子及其编码序列, 及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经学和基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人源蛋白及其核苷酸编码序列。更具体地说，本发明涉及一种新的促神经生长因子-人SHMUN01及其cDNA序列。本发明还涉及这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。本发明还涉及含人SHMUN01的药物组合物。
近10年来，脑与神经科学领域飞速发展，其中有关神经损伤修复及抗衰老的课题更是该领域的研究热点，并且带动神经生物学、临床解剖学、创伤外科学等前沿学科的发展。在该领域的任何研究进展，无论是对于实验室的基础理论研究；抑或是对于医院临床应用，都有着重要的意义。
目前，对于神经科千百万罹患老年性痴呆、外周神经退行性病变、截瘫、外伤后神经损伤等疾病的病人而言，可以接受的有效治疗方法极为有限。其中，就常规使用的药物而言，譬如用于营养神经的维生素B12，以及地巴唑、激素类和神经节苷脂等，无论是品种还是效果都非常有限。
虽经过多年研究，但是目前已知的、具有促进神经生长作用的蛋白主要仅包括神经营养因子(TNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子3和4(NT-3和NT-4)等。因此，人们对神经发育生长和修复过程中所涉及的因子和多肽还知之甚少，迫切需要找到与神经发育、营养及损伤修复等有关的各种因子和/或多肽，以便设计和制造出造福于人类的药物。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码一种新的促神经生长因子，本发明的促神经生长因子成员被命名为人SHMUN01。
本发明的另一个目的是提供一种新的人源的促神经生长因子，该蛋白被命名为人SHMUN01蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种生产所述的新的人SHMUN01多肽的方法。
本发明还提供了这种含人SHMUN01的药物组合物，以及人SHMUN01核酸序列和多肽的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的人SHMUN01蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的第四方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种产生具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人SHMUN01蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人SHMUN01蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人SHMUN01蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人SHMUN01蛋白活性的多肽。
在本发明的第六方面，提供了与上述的人SHMUN01多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-828个核苷酸。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在SHMUN01蛋白的方法，它包括将样品与SHMUN01蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在SHMUN01蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与人SHMUN01异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的人SHMUN01蛋白、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；以及药学上可接受的载体。此外，该药物组合物还含有安全有效量的选自下组的成分神经营养因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3、和神经营养因子4。
在本发明的第十方面，提供了一种本发明人SHMUN01蛋白的用途，它被用于制备治疗神经生长缺陷或神经损伤病症的药物。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
在本发明中，术语“SHMUN01蛋白”、“SHMUN01多肽”或“促神经营养因子SHMUN01”可互换使用，都指具有人促神经营养因子SHMUN01氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。这些术语包括含有或不含起始甲硫氨酸的人促神经营养因子SHMUN01。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人SHMUN01蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中1-828位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框1-828位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中1-828位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-828位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-828位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人SHMUN01相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人SHMUN01蛋白或多肽”指具有人SHMUN01蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人SHMUN01相同功能的、SEQID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人SHMUN01蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人SHMUN01 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人SHMUN01多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人SHMUN01多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人SHMUN01多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人SHMUN01多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人SHMUN01蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人SHMUN01多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人SHMUN01保守性变异多肽”指与SEQ ID No.P的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还包括人SHMUN01多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人SHMUN01的表达。
本发明还包括一种可用作探针或引物的核酸分子，该分子通常具有人SHMUN01多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人SHMUN01的核酸分子。
本发明还包括检测人SHMUN01核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人SHMUN01多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人SHMUN01 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人SHMUN01基因产物或片段。较佳地，指那些能与人SHMUN01基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人SHMUN01蛋白的分子，也包括那些并不影响人SHMUN01蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人SHMUN01基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人SHMUN01基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人SHMUN01或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人SHMUN01功能的抗体以及不影响人SHMUN01功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人SHMUN01基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人SHMUN01基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人SHMUN01核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与SHMUN01蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于神经生长缺陷或障碍方面的治疗，或者用于促进受损神经细胞的修复。在使用本发明SHMUN01蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如神经营养因子(TNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子3和4(NT-3和NT-4)等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明SHMUN01多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的SHMUN01蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还涉及定量和定位检测人SHMUN01蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人SHMUN01蛋白水平，可以用作解释人SHMUN01蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断SHMUN01蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在SHMUN01蛋白的方法是利用SHMUN01蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与SHMUN01蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在SHMUN01蛋白。
人SHMUN01蛋白的多聚核苷酸可用于SHMUN01蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，SHMUN01蛋白的多聚核苷酸可用于检测SHMUN01蛋白的表达与否或在疾病状态下SHMUN01蛋白的异常表达。如SHMUN01 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断SHMUN01蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用SHMUN01蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测SHMUN01蛋白的转录产物。
检测SHMUN01基因的突变也可用于诊断SHMUN01蛋白相关的疾病。SHMUN01蛋白突变的形式包括与正常野生型SHMUN01 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
在本发明一个实施例中，本发明人根据本人以前发现的大鼠tropic1808的核苷酸序列(中国专利申请No.99113473.7,1999年02月11日申请，该文献在此引用作为参考)，设计特异性引物(SEQ ID No.3和4)，以胎儿肌肉组织的mRNA为模板，通过RT-PCR扩增后得到了人SHMUN01编码序列，其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为828个碱基，其开放读框位于1-828位，编码全长为275个氨基酸的SHMUN01蛋白(SEQ ID NO:2)。经瞬时表达，测定了表达产物对大鼠背根神经节的影响，发现本发明的新的人源蛋白有明显的促神经生长作用。
本发明所提供的新的SHMUN01多肽和编码序列，为进一步研究SHMUN01在生物体内的功能以及由该类基因引起的疾病提供了基础，并为将来的疾病治疗提供了新的前景。
本发明的人SHMUN01除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人SHMUN01还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。
针对本发明SHMUN01的抗体，用于筛选与SHMUN01同源的蛋白，或者用于亲和纯化相关蛋白。
此外，本发明SHMUN01核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人SHMUN01的表达水平或者抑制人SHMUN01的过度表达。本发明的SHMUN01蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人SHMUN01缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
由于本发明的人SHMUN01具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性极低或甚至没有)。
在附图中，
图1为本发明的含有pcDNA3-人SHMUN01表达载体的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清培养基中联合培养的照片。
图2是含有空载pcDNA3的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清培养基中联合培养的照片。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人源肌肉组织cDNA的制备以正常引产胎儿的肌肉组织为材料，以GIBCO-BRL公司的TRIzol(Cat.#15596-026)试剂提取总RNA后，应用该公司的Superscriptpreamplification(Cat.#10928-018)试剂盒，以寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸为引物，在42摄氏度下反应一小时，完成逆转录反应，合成得到cDNA。
实施例2SHMUN01编码核苷酸序列的获得人工合成寡核苷酸引物，即为5′-TAAAG CTTAT GAATT TGGCT CAAATCGC-3′(SEQ ID NO.3)和5′-GCGGA ATTCT TACGA TAGCA GCAAT GTC-3′(SEQ ID NO.4)，分别作为上下游引物。
以人源肌肉组织的cDNA为模板，使用GENE公司的Taq DNA聚合酶(5U/μl,Cat.#GT-TAQ251)，进行PCR扩增。每100μl反应体系中包括逆转录反应产物10μl，上下游寡核苷酸引物各100pmol，及10mmol/L Tris-Hcl(pH8.3,20℃),1.5mmol/L MgCl2,50mmol/L KCl,2mmol/L dNTP,20μg/ml BSA,2.5单位TaqDNA聚合酶，再覆盖100μl液体石蜡。在PERKIN ELMER/CETUS公司的DNAThermal Cycler480上94℃变性1min,55℃退火1min及72℃延伸3min，共进行30个循环，最后在72℃保温10min。取5μl反应产物在1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，紫外灯下观察鉴定。结果，获得含有完整SHMUN01结构基因的DNA片段，长度为845bp(该864bp的扩增产物的序列就是SHMUN01编码序列加上两侧的酶切位点的序列TAAAGCTT和GAATTCCGC,)，且上游携带HindⅢ酶切位点，下游携带EcoRⅠ酶切位点。
经将如上获得的PCR扩增片段进行测序，结果证实扩增产物除去两端酶切位点之外的序列，与SEQ ID No.1中第1-828位的序列相一致。
实施例3SHMUN01编码产物在真核表达系统CHO细胞株中的表达将实施例2中的获得的含有SHMUN01的编码序列的cDNA，经HindⅢ+EcoRⅠ双酶切，克隆入经同样酶切的Invitrogen公司表达载体pcDNA3(Cat.#V790-20)中，经酶切及DNA测序证实插入片段大小及方向正确无误后，转染CHO细胞，进行瞬时表达。
实施例4SHMUN01编码产物在原核表达系统中的表达和表达产物的纯化将实施例2中的获得的含有SHMUN01的编码序列的cDNA，经HindⅢ+EcoRⅠ双酶切，克隆入经同样酶切的Novagen公司表达载体pET21a(Cat.#70763-3)中，经酶切及DNA测序证实插入片段大小及方向正确无误后，转化BL21宿主菌。含表达质粒的BL21过夜菌50ml加到1ml新鲜的LB培养液中，37摄氏度培养2小时，加入IPTG到终浓度为0.4mM诱导表达4小时后收集菌体。含表达产物的菌体以PBS悬浮，经超声波破碎，收集的上清液经过DEAE Sepharose Fast Flow(PharmaciaBiotech Cat.#17-0709-10)离子交换柱和Superdex200(Pharmacia Biotech Cat#17-1043-10)分子筛柱，纯化得到SHMUN01蛋白。
用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。
实施例5重组表达产物的活性检测首先分离新生SD大鼠的背根神经节。按常规准备不含有血清的DMEM基础培养液，经0.22μm滤膜过滤，保存于4℃。另取少量于37℃孵育2天，观察有无污染。用鼠尾胶包被96孔培养板，回收多余的胶。37℃,5％CO2培养箱孵育过夜。用基础培养液洗涤上述培养板3-4次，于超净台自然风干备用。选用新生SD大鼠(出生24-48hr内)，取材前在75％乙醇中浸泡10min。于无菌条件下，将鼠断头处死，用无菌脱脂棉充分吸净血液。用眼科剪自鼠背部正中剪开皮肤，将棘突两侧的肌肉及软组织仔细剥离、剔除。仔细剪开椎管，尽量剪短并修齐椎弓，小心剥离脊髓，暴露位于两侧椎间孔中的背根神经节。轻柔取出背根神经节，置于装有基础培养液的无菌平皿中，小心去除其它组织，用基础培养液尽量冲洗干净。将上述背根神经节置于已经处理的培养板中。
活性检测时，分别将含有pcDNA3-SHMUN01表达载体的CHO细胞和只含有空载pcDNA3的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清基础培养基中联合培养。将培养板置于5％CO2、37℃培养箱中孵育24-48hr。在显微镜下观察培养后的背根神经节，观察是否有明显神经突起生长。
参见附图，图1为含有pcDNA3-SHMUN01表达载体的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清培养基中联合培养的照片，图中可检查到有许多神经纤维自神经节中心、呈放射状向外生长，这说明本发明的SHMUN01具有明显的促神经生长作用。而图2中只含有空载pcDNA3的CHO细胞与新生SD大鼠背根神经节在无血清培养基中联合培养则无类似效应。因此，本发明的人SHMUN01是一种新的促神经生长因子，具有明显的促神经生长效应，并在神经发育与再生过程中起着促进神经生长的重要作用。
实施例6药物组合物冷冻干燥制品取纯化的SHMUN01蛋白1mg，神经生长因子(NGF)1mg,5％氢氧化钠适量，注射用水加至1000ml。
在无菌操作室内称取SHMUN01蛋白和NGF，置于适当无菌容器中，加无菌注射用水至950ml，搅拌溶解，加5％氢氧化钠溶液调节pH至6.3-6.7范围内，补加灭菌水至1000ml，然后加配制量的0.02％活性炭，搅拌5-10分钟，用无菌抽滤漏斗过滤，分装于2ml安瓶中，低温冷冻干燥约24小时后无菌熔封即得。
实施例7SHMUN01蛋白的抗体制备将实施例4中获得的SHMUN01蛋白作为抗原，配成1mg/ml溶液，与完全佐剂以体积1∶1充分混合，每只Bal b/c小鼠于腹腔注射100μl，此为第一次免疫动物。此后每隔三周，以不完全佐剂替代完全佐剂免疫一次，共进行四次免疫。免疫动物完成后，处死小鼠取血，收集血清，经HiTrap Protein A Column(pharmacia BiotechCat.#17-0402-03)纯化，以酶标法测定抗体的滴度。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人上海医学生命科学研究中心有限公司(ⅱ)发明名称新的人促神经营养因子及其编码序列，及制法和用途(ⅲ)序列数目4(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度828bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)序列描述SEQ ID NO.11 ATGAATTTGG CTCAAATCGC TGCGTTGAAT CAAATTTCAA ATTTGAATGC AATCCGCGTG61 GGACAAGTTT TGAAGGTATC TAACGCCGCC GGTTCAAATA ATACGCAAAA TACAACCCAG121 CCTTCTGCAG GGGTACCAAC GAATACGGCG TCAAGCACAA CAGGTTATAC TGTTAAGTCT181 GGGGATACGT TGTCAGCAAT CGCTGCGGCA AACGGTGTTT CATTGGCGAA CTTGCTCAGC241 TGGAACAACT TGTCATTGCA AGCCATTATC TATCCTGGAC AAAAGTTAAC GATTCAAAAC301 GCTAACAATG CCACGGTCAC AACGCCAAAC GCACCGACAA GTACGCCAAC GGTTATGCCA361 TCAACGAACG GTAGTTACAC GGTGAAGTCA GGCGATACAT TGTATGGTAT TGCAGCAAAG421 CTAGGGACGA ACGTGCAAAC GTTGCTATCT TTGAATGGTT TGCAATTGTC AAGCACCATT481 TATGTGGGGC AAGTTTTGAA AACAACAGGC GCACCAGTTG CTGGTGCTGG AACTGCCACA541 TCAACACCAA CACCAGTAAC ACCAACAGTC TCAAAACCGG CTGCAGCAAA CGGTGTGTCA601 ACAGCTGGCT TAAGTGCTGC GCAAGCCGCA TGGTTGCGGA CAGCGGTTGT TGATGCGCAA661 GCGGCAACAG CAGGGACGGG CGTTTTGGCA TCCGTAACGG TTGCTCAAGC GATTCTTGAA721 AGCGGTTGGG GACAATCAGC GTTGGCTTCA GCACCATACC ATAACTTTAA TTTATATTTA781 ATAAAGGTGA AAAACACATG GAAATTGATG ACATTGCTGC TATCGTAA(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度275个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅲ)序列描述SEQ ID NO.21 Met Asn Leu Ala Gln Ile Ala Ala Leu Asn Gln Ile Ser Asn Leu16 Asn Ala Ile Arg Val Gly Gln Val Leu Lys Val Ser Asn Ala Ala31 Gly Ser Asn Asn Thr Gln Asn Thr Thr Gln Pro Ser Ala Gly Val46 Pro Thr Asn Thr Ala Ser Ser Thr Thr Gly Tyr Thr Val Lys Ser61 Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ala Ala Ala Asn Gly Val Ser Leu76 Ala Asn Leu Leu Ser Trp Asn Asn Leu Ser Leu Gln Ala Ile Ile91 Tyr Pro Gly Gln Lys Leu Thr Ile Gln Asn Ala Asn Asn Ala Thr106 Val Thr Thr Pro ASh Ala Pro Thr Ser Thr Pro Thr Val Met Pro121 Ser Thr Asn Gly Ser Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Tyr136 Gly Ile Ala Ala Lys Leu Gly Thr Asn Val Gln Thr Leu Leu Ser151 Leu Asn Gly Leu Gln Leu Ser Ser Thr Ile Tyr Val Gly Gln Val166 Leu Lys Thr Thr Gly Ala Pro Val Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr181 Ser Thr Pro Thr Pro Val Thr Pro Thr Val Ser Lys Pro Ala Ala196 Ala Asn Gly Val Ser Thr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Gln Ala Ala211 Trp Leu Arg Thr Ala Val Val Asp Ala Gln Ala Ala Thr Ala Gly226 Thr Gly Val Leu Ala Ser Val Thr Val Ala Gln Ala Ile Leu Glu241 Ser Gly Trp Gly Gln Ser Ala Leu Ala Ser Ala Pro Tyr His Asn256 Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Lys Val Lys Asn Thr Trp Lys Leu Met271 Thr Leu Leu Leu Ser(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度28碱基(B)类型核酸(C)链性单链
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID NO.3:
TAAAGCTTAT GAATTTGGCT CAAATCGC 28(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID NO.4:GCGGAATTCT TACGATAGCA GCAATGTC 28
权利要求
1．一种分离的人SHMUN01蛋白，其特征在于，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2．一种分离出的DNA分子，其特征在于，它编码具有人SHMUN01蛋白活性的多肽的核苷酸序列，且该多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3．如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸1-828位的核苷酸序列。
4．一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的人SHMUN01蛋白、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；以及药学上可接受的载体。
5．如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，它含有具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的人SHMUN01蛋白。
6．如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，它还含有安全有效量的选自下组的成分神经营养因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3、和神经营养因子4。
7．一种如权利要求1所述的人SHMUN01蛋白的用途，其特征在于，它被用于制备治疗神经生长缺陷或神经损伤病症的药物。
全文摘要
本发明提供了一种新的人源蛋白及其编码核苷酸序列。更具体地说,本发明涉及人源蛋白SHMUN01的cDNA序列,该序列所编码的蛋白是一种促神经生长因子。本发明还涉及这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。本发明还涉及含人SHMUN01蛋白的药物组合物。
文档编号A61P25/00GK1324821SQ0011574
公开日2001年12月5日 申请日期2000年5月18日 优先权日2000年5月18日
发明者顾建新, 陈淳, 徐沁, 张颂文, 方向东 申请人:上海医学生命科学研究中心有限公司