专利名称：免疫原性降低的分子内交联的枯草杆菌蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及改构的枯草杆菌蛋白酶，该蛋白酶被用于组合物，例如个人护理组合物、洗衣用组合物、坚硬表面清洁组合物和精细织品清洁组合物。
背景技术：
酶构成最大一类天然蛋白质。其中的一类酶是能催化水解其它蛋白质的蛋白酶。通过将天然及基因工程蛋白酶掺加到清洁组合物中，尤其是与洗衣用有关的那些清洁组合物中已使得这种水解蛋白质的能力得以开发利用。
清洁领域中，最常用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。大多数丝氨酸蛋白酶是细菌生成的，而其中的一小部分是由其它微生物生成的，例如真菌。参见，Siezen，Roland J.等人“枯草杆菌蛋白酶的同源性模拟及蛋白质工程策略，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族”，蛋白质工程，Vol.4，No.7，719-737页(1991)。遗憾地是，野生型蛋白酶在其天然环境中的功效往往不能被优化用于非天然清洁组合物的环境中。具体地说，蛋白酶特性，例如，热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性以及底物特异性等，在该蛋白酶天然环境之外都未必能达到最佳使用状态。
现已用几种方法改变丝氨酸蛋白酶的野生型氨基酸序列，以增强该蛋白酶在非天然洗涤环境中的功效。这些方法包括蛋白酶的基因重构和/或化学修饰以增强蛋白酶在迥然不同条件下的热稳定性和氧化稳定性。
但是，由于这种修饰的蛋白酶对于哺乳动物是外源性的，所以它们是潜在的抗原。作为抗原，这些蛋白酶会引起哺乳动物的免疫原性和/或变应原应答(本发明中统称为免疫原性应答)。
另外，虽然在通过基因工程和化学修饰来开发用于洗衣的更高效蛋白酶的持续研究中已取得了显著的成效，但是这种蛋白酶还未商业化用于个人护理组合物和精细织品洗涤剂中。肥皂、凝胶、浴液以及香波等产品中不添加这些蛋白酶的主要原因是由于人体致敏会导致不良的免疫应答的问题。因此，提供一种具有蛋白酶的清洁性能但又不激发免疫应答的个人护理组合物或精细织品洗涤剂将具有十分重要的意义。
目前，通过固定化，造粒，包裹或溶解化学修饰的蛋白酶以避免蛋白酶进行空气传播可以将对蛋白酶的免疫原性应答降低到最低程度。这些方法虽然考虑了消费者与空气传播的蛋白酶接触，但仍存在着组织与最终组合物持久接触的危险。
也已提出通过将聚合物连接到蛋白酶上可以达到降低蛋白酶的免疫原性的目的。例如，参见，1979年12月18日颁布的授予Davis等的美国专利4179337；1999年1月5日颁布的并且由Olsen等转让给Novo Nordisk的美国专利5856451；1999年1月7日公开的并且由Olsen等转让给NovoNordisk的WO 99/00489；1998年7月16日公开的并且由Olsen等转让给NovoNordisk的WO 98/30682；和1998年8月13日公开的，Von Der Osten等的WO 98/35026。然而，这些提议并没有表明为了最有效地降低免疫原性应答而将聚合物连接到所述蛋白酶的特定氨基酸区域的重要性。
本发明人已经惊奇地发现通过对所述蛋白酶进行分子内交联能够降低所述蛋白酶的免疫原性。还发现这些分子内交联的蛋白酶仍然保持各自亲本蛋白酶的活性。另外，本发明人已发现了所述蛋白酶中最适合参加交联的特定残基，这是由于，例如，相对所述蛋白酶的表位区域(即，所述蛋白酶与免疫应答有关的位置)或切割位点(即，所述蛋白酶在体内发生水解的位置)的空间位置所致。
本发明人已发现了能激发减弱的免疫原性应答但仍保持其作为有效的和具有活性的蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶。因此，本发明的蛋白酶适于在几种类型的组合物中使用，该组合物包括但不限于，洗衣、清洁餐具、清洁坚硬表面，护肤、护发、美容、口腔护理以及清洁接触透镜的组合物。
发明概述本发明涉及具有分子内交联的枯草杆菌蛋白酶，其中分子内交联包括所述蛋白酶的第一个残基的氨基酸和所述蛋白酶的第二个残基的氨基酸之间的共价连接。
本发明的所述蛋白酶具有低于亲本蛋白酶的免疫原性。因此，这种蛋白酶适用于几种类型的组合物，该组合物包括但不限于，洗衣、清洁餐具、清洁坚硬表面，护肤、护发、美容、口腔护理以及清洁接触透镜的组合物。
发明详述本发明的必需组分如下所述。还包括对用于本发明实施方案中的各种任选及优选组分的非限制性描述。
本发明可以包括任何本发明所述的必需或任选组分和/或限量，或者由或基本由任何本发明所述的必需或任选组分和/或限量所组成。
除另有说明外，所有百分比和比率都以重量来计算。除另有说明外，所有百分比都是根据组合物总量来计算的。
所有组分或组成含量都以该组分或组成的活性物含量为参照，并且排除杂质，例如，可能存在于商业来源产品中的残留溶剂或副产物。
本发明中所提及的所有文献，包括所有专利、专利申请以及印刷出版物均在此全文引入作为参考。
本发明提到一些物质的商品名，所述物质包括，但不限于酶。本发明人不想受具有一定商品名的物质限制。由商品名表示的物质的等同物(例如，那些来源不同且名称或目录(参考)号不同的物质)可以被用来替代并用于本发明的蛋白酶和组合物。
本发明使用缩写来描述氨基酸。表1中提供了本发明使用的一系列缩写
表I氨基酸 三字母缩写单字母缩写丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺 Asn N天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸 Glu E甘氨酸 Gly G组氨酸 His H异亮氨酸 Ile I亮氨酸 Leu L赖氨酸 Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸 Pro P丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y缬氨酸 Val V定义本发明使用的术语“突变”是指基因序列和/或由该基因序列产生的氨基酸序列中的变化。突变包括野生型蛋白质序列中氨基酸残基的缺失、取代以及插入。
本发明使用的术语“亲本”是指这样的蛋白质(野生型或变体)，其被用于进行进一步的修饰而形成一种蛋白酶缀合物。
如本文所述，术语“野生型”是指一种由未突变的微生物产生的蛋白质，例如一种蛋白酶或其它酶。
如本文所述，术语“变体”是指其氨基酸序列不同于其相应的野生型蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。
如本文所述，所有聚合物的分子量以重均分子量表示。
如本文所述，当本发明的分子内交联蛋白酶不只限于那些含有枯草杆菌蛋白酶BPN’和其变体的蛋白酶时，所有氨基酸编号方式均参照由SEQ ID NO1表示的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的进一步描述见Wells等人，核酸研究，Vol.II，7911-7925页(1983)。
如本发明所使用的，其中连字符被用来定义由若干个氨基酸残基组成的一个区域，其表示该区域包括所列出的残基以及所列出残基之间的每一残基。例如，区域70-84表示由氨基酸残基70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83和84组成的区域。
本发明的分子内交联蛋白酶本发明涉及分子内交联的枯草杆菌蛋白酶，其中分子内交联包括所述蛋白质的第一个残基的氨基酸与所述蛋白酶的第二个残基的氨基酸之间的共价连接。如果不拘泥于理论，应该肯定产生的交联可降低蛋白酶在抗原呈递细胞的内体区室中的降解速率(即，可增加稳定性)，这反过来又会阻碍蛋白酶表位的呈递。
本发明的可分子内交联的蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶，其野生型或变体。如本文中使用的术语“枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶”是指一种与枯草杆菌蛋白酶BPN′的序列具有至少50％，优选80％氨基酸序列同源性的蛋白酶。野生型枯草杆菌样蛋白酶由，例如，嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、Bacillus amylosaccharicus，地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、以及枯草芽孢杆菌等微生物产生。关于枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其同源性的讨论可参见Siezen等人，“枯草杆菌蛋白酶的同源性模拟和蛋白质工程策略，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族”，蛋白质工程，Vol.4，No.7，719-737页(1991)。
本发明优选的可分子内交联的蛋白酶包括，例如，从解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌中获得的蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶BPN，枯草杆菌蛋白酶BPN’，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶DY，枯草杆菌蛋白酶309，蛋白酶K以及铝热酶，包括A/SAlcalase(可从Novo Industries，Copenhagen，Denmark购得)，望菌酶(Esperase)(Novo Industries)，沙芬酶(Savinase)(NovoIndustries)，Maxatase(可从Genencor International Inc.购得)，Maxacal(Genencor International Inc.)，Maxapem 15(GenencorInternational Inc.)，以及上述酶的变体。本发明特别优选的可分子内交联的蛋白酶是从解淀粉芽孢杆菌获得的蛋白酶及其变体。本发明最优选的蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’及其变体。
下文中被称为“蛋白酶A”的，本发明中使用的特别优选的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体公开于1991年7月9日颁发给Venegas的美国专利US5,030,378中，其特征在于在枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中具有下列突变(a)第166位上的Gly被选自下列的氨基酸残基取代Asn、Ser、Lys、Arg、His、Gln、Ala以及Glu；第169位上的Gly被Ser取代；以及第222位上的Met被选自下列的氨基酸残基取代Gln、Phe、His、Asn、Glu、Ala和Thr；或者b)第160位上的Gly被Ala取代，以及第222位上的Met被Ala取代。
下文中称为“蛋白酶B”的，在本发明的分子内交联中使用的另一个优选的枯草杆菌蛋白酶BPN’的变体公开于1988年1月7日公开的、转让给Genencor国际公司的EP-B251,446中，所述变体的特征在于野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列在下列的一个或多个位点具有突变Tyr21，Thr22，Ser24，Asp36，Ala45，Ala48，Ser49，Met50，His67，Ser87，Lys94，Val95，Gly97，Ser101，Gly102，Gly103，Ile107，Gly110，Met124，Gly127，Gly128，Pro129，Leu135，Lys170，Tyr171，Pro172，Asp197，Met199，Ser204，Lys213，Tyr214，Gly215，以及Ser221；或者上列位点中的两个或多个位点与选自下列位点的1个或多个突变相结合Asp32，Ser33，Tyr104，Ala152，Asn155，Glu156，Gly166，Gly169，Phe189，Tyr217以及Met222。
用于本发明的分子内交联的其它优选的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体下文中称为“蛋白酶C”，其描述见1995年4月20日公开的转让给Genencor国际公司的WO 95/10615，所述变体的特征在于野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列在Asn76位点上具有一个突变，结合有选自下列位点上的1个或多个突变Asp99，Ser101，Gln103，Tyr104，Ser105，Ile107，Asn109，Asn123，Leu126，Gly127，Gly128，Leul35，Glu156，Gly166，Glu195，Asp197，Ser204，Gln206，Pro210，Ala216，Tyr217，Asn218，Met222，Ser260，Lys265以及Ala274。
用于本发明的分子内交联的其它优选的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，下文中称为“蛋白酶D”，其描述见1988年7月26日授予Estell等人的美国专利US4,760,025，所述变体的特征在于在野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列中具有选自下列氨基酸位点上的一个或多个突变Asp32，Ser33，His64，Tyr104，Asn155，Glu156，Gly166，Gly169，Phe189，Tyr217以及Met222。
用于本发明的分子内交联的更优选的蛋白酶选自枯草杆菌蛋白酶BPN’，蛋白酶A，蛋白酶B，蛋白酶C，以及蛋白酶D，其中蛋白酶D最优选。
本发明的分子内交联的蛋白酶包含一个上述蛋白酶的两个氨基酸之间的共价连接。这些氨基酸在本发明中独立地被称为第一个残基的氨基酸和第二个残基的氨基酸。如本文使用的术语“第一个残基”和“第二个残基”各自不应被解释为是指对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的位点1和位点2。而是，这些术语只被用来表明一个残基或另一个残基。例如，所述第一个残基可以对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的位点27以及所述第二个残基可以对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的位点118。当然，本发明的范围肯定也包括第一个残基对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的位点1或第二个残基对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的位点2。
另外，表示对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的特定位点的术语“相应于位点”的使用不应被解释为需要天然存在于该位点的氨基酸。而是，这种描述旨在表示位点序号，而不是存在于该位点的特定氨基酸残基。实际上，根据本发明，半胱氨酸(非天然存在于枯草杆菌蛋白酶BPN’中)是非常优选的第一个残基或第二个残基的氨基酸。
根据本发明，枯草杆菌蛋白酶的分子内交联包括所述蛋白酶的第一个残基的氨基酸和第二个残基的氨基酸之间的一种共价连接。这种共价连接包括桥接第一个残基和第二个残基的连接部分。所述连接部分可以是任何结构，通过该结构，第一个残基和第二个残基可以被共价桥接(连接)。然而，如本文所使用的，连接部分不仅仅是共价键如形成例如只一个二硫桥的共价键。不拘泥于理论，本发明人已经发现这种二硫桥对于提供一种分子内交联的蛋白酶，该蛋白酶的免疫原性低于亲本的免疫原性不起作用。
例如，连接部分可以是任何小分子，即一种分子量大约低于1600，优选地大约低于800，更优选地大约低于400，最优选地大约低于300的分子。
最优选的连接部分包括那些能共价连接一个或多个半胱氨酸残基，赖氨酸残基和/或所述蛋白酶的氨基端的连接部分。例如，在本发明的优选实施方案中，第一个残基的氨基酸含有一个氨基(例如，作为一个非限制性实例，第一个残基的氨基酸是赖氨酸(通过天然存在或突变)或第一个残基的氨基酸是所述蛋白酶的氨基端)。另外，在这个优选实施方案中，第二个残基的氨基酸含有一个巯基，例如，作为一个非限制性实例，第二个残基的氨基酸是半胱氨酸(通过天然存在或突变)。例如，下列非限制性试剂可以被用来形成本发明分子内交联的蛋白酶的共价连接N-[α-马来酰亚胺基乙酸基]琥珀酰亚胺酯；N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酸基琥珀酰亚胺；双马来酰亚胺基己烷；N-[β-马来酰亚胺基丙酸基]琥珀酰亚胺酯；双[2-(琥珀酰亚胺基氧羰氧基)-乙基]砜；双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸酯；1，5-二氟-2，4-二硝基苯；二甲基己二酰亚氨酸酯·2HCl；二甲基庚二酰亚氨酸酯·2HCl；二甲基辛二酰亚氨酸酯·2HCl；戊二酸二琥珀酰亚胺酯；辛二酸二琥珀酰亚胺酯；间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟琥珀酰亚胺酯；N-羟琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸；N-琥珀酰亚胺基-6-[4′-叠氮基-2′硝基苯氨基]己酸酯；2，3-二溴丙酸N-羟琥珀酰亚胺酯；4-[马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；4-(对-马来酰亚胺基甲苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯；琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸酯]；双[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧羰氧基)-乙基]砜；N-[γ-马来酰亚胺基丁酸基)]磺基琥珀酰亚胺酯；N-羟磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯；N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酸基]磺基琥珀酰亚胺酯；间-马来酰亚胺基苯甲酸基-N-羟磺基琥珀酰亚胺酯；磺基琥珀酰亚胺基[4-叠氮水杨酸基氨基]己酸酯；磺基琥珀酰亚胺基-7-叠氮-4-甲基香豆素-3-乙酸酯；磺基琥珀酰亚胺基-6-[4′-叠氮-2′-硝基苯基氨基]己酸酯；磺基琥珀酰亚胺基-4-[对叠氮苯基]丁酸酯；磺基琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯；磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯；和磺基琥珀酰亚胺基-4-[对-马来酰亚胺基苯基]-丁酸酯。这些试剂的每一种都从Pierce化学公司，Rockford，IL购得。下文中列举了使用类似的试剂制备本发明的分子内交联蛋白酶的非限制性实例。
连接部分的其它实例和相关化学公开于1995年8月29日颁布的授予Harris的美国专利5,446,090；1992年12月15日颁布的授予Merrill的美国专利55,171,264；1992年11月10日颁布的授予Rhee等人的美国专利5,162,430；1992年10月6日颁布的授予Shadle等人的美国专利5,153,265；1992年6月16日颁布的授予Zalipsky的美国专利5,122,614；Goodson等人，“重组白介素-2在其糖基化位点上的定点聚乙二醇化”，生物技术，Vol.8，No.4，pp.343-346(1990)；Kogan，“适用于选择性蛋白质修饰的取代的甲氧基-聚(乙二醇)衍生物的合成”，合成通讯，Vol.22，2417-2424页(1992)；以及Ishii等人，“琥珀酰亚胺基环的状态对芘马来酰亚胺标记的aa-原肌球蛋白的荧光及结构特性的影响”，生物物理学杂志，Vol.50，75-80页(1986)。最优选的连接部分是取代的(例如，烷基)或未取代的琥珀酰亚胺。
在本发明的一个优选实施方案中，第一个残基的氨基酸包括一个氨基(例如，作为一个非限制性实例，第一个残基的氨基酸是赖氨酸(通过天然存在或突变)或第一个残基的氨基酸包括所述蛋白酶的氨基端)。因此优选的是将位于不是第一和第二个残基位点上赖氨酸残基突变为一个或多个其它氨基酸残基以使例如在第一个残基上的赖氨酸残基的交联是选择性的。例如，赖氨酸残基位于本文定义的枯草杆菌蛋白酶BPN’的第一近表位区域中的位点43上。蛋白酶中存在的其它所有赖氨酸残基进行位点选择性突变后可以选择性地使位点43上的赖氨酸残基与第二个残基交联。或者，天然存在的第一个残基的氨基酸可以被突变为赖氨酸(例如)，接着进行蛋白酶中存在的其它所有赖氨酸残基的位点选择性突变，并使所述赖氨酸残基与第二个残基选择性的交联。
在这个相同的优选实施方案中，优选的是第二个残基的氨基酸包括一个巯基，例如，作为一个非限制性的实例，第二个残基的氨基酸是半胱氨酸(通过天然存在或突变)。在该实例中，其中半胱氨酸残基存在于一个不是第二个残基的位点上，优选的是在这些位点中的每一个位点上用另一个氨基酸残基取代半胱氨酸以使第一个残基和第二个残基之间进行选择性的交联。
在本发明的另一个优选实施方案中，第一和第二个残基的氨基酸各自包括一个巯基。例如，作为一个非限制性的实例，第一个残基的氨基酸是半胱氨酸(通过天然存在或突变)以及第二个残基的氨基酸是半胱氨酸(通过天然存在或突变)。在该实例中，其中半胱氨酸残基存在于一个不是第一和第二个残基的位点上，优选的是将这些位点中的每一个位点上的半胱氨酸取代为另一个氨基酸残基以使第一个残基和第二个残基之间进行选择性的交联。
在本发明的另一个优选实施方案中，第一和第二个残基的氨基酸各自包括一个氨基。例如，作为一个非限制性的实例，第一个残基的氨基酸可以是赖氨酸或氨基端(通过天然存在或突变)以及第二个残基的氨基酸是赖氨酸(通过天然存在或突变)。在该实例中，其中赖氨酸存在于一个不是第一和第二个残基的位点上，优选的是将这些位点中的每一个位点上的赖氨酸取代为另一个氨基酸残基以使第一个残基和第二个残基之间进行选择性的交联。
因此，在本发明的优选实施方案中，第一个残基的氨基酸是赖氨酸或包括氨基端以及第二个残基的氨基酸是半胱氨酸。在本发明的另一个优选实施方案中，第一个残基的氨基酸是半胱氨酸以及第二个残基的氨基酸是半胱氨酸。在本发明的另一个优选实施方案中，第一个残基的氨基酸是赖氨酸或氨基端以及第二个残基的氨基酸是赖氨酸。
在本发明的优选实施方案中，第一和第二个残基中的至少一个位于一个确定区域中。已经发现枯草杆菌蛋白酶含有三个表位区域。因此，如果不拘泥于理论，应该肯定其中这些表位区域中的一个或多个的残基参与了交联，由于阻碍了所述表位的呈递因而降低了免疫原性。例如，其中表位区域中的一个或多个的残基与蛋白酶的另一个残基交联，表位呈递前需要进行所述蛋白酶的多位点切割。已经发现第一表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的位点70-84；第二表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的位点103-126；以及第三表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN’的位点220-246。参见，例如，1998年6月2日由Weisgerber等申请的并且转让给宝洁公司的美国专利申请09/088,912；1999年7月22日由Rubingh等申请的共同未决的美国专利申请60/144991，“在表位区域具有氨基酸取代和缺失的丝氨酸蛋白酶变体”；和1999年7月22日由Sikorski等申请的共同未决的美国专利申请60/144980，“在表位区域具有氨基酸取代的丝氨酸蛋白酶变体”。
另外还发现所述蛋白酶的某些氨基酸残基与所述蛋白酶的表位区域紧密相邻。本发明人发现第一、第二和第三近表位区域的残基分别与第一、第二和第三表位区域紧密相邻。因此，如果不拘泥于理论，确信第一、第二和第三近表位区域中的一个或多个区域的一个残基参与了交联，免疫原性的降低是由于阻碍了表位的呈递。已经发现第一近表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点2，3，4，5，6，712，17，36，40，41，43，44，45，67，86，87，89，206，209，210，212，213，214，215和216；第二近表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点25，26，27，46，47，48，49，50，51，52，53，54，91，99，100，101，102，127，128，129，130，131，132，133，134，136，137，138，140，141，144和145；和第三近表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点9，10，22，23，24，62，63，143，146，154，155，156，157，172，173，187，189，195，197，203，204，253，254，256，265，267，269，271，272和275。参见，例如Rubingh等于1999年7月22日申请的临时美国专利申请60/144979，“具有空间保护的表位区域的蛋白酶缀合物”。
另外，作为本发明的优选实施方案，还发现枯草杆菌蛋白酶包含第一“切割位点”区域和第二“切割位点”(即，所述蛋白酶在体内发生水解的位置)。如果不拘泥于理论，确信这些切割位点区域中的一个或多个残基参与了交联，蛋白酶的水解受到了阻碍，因而表位的呈递也相应地受到了阻碍。已经发现，第一切割位点对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点156-165，170，186，191-196和259-262并且第二切割位点对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点12-24，27，84-88，271和274。参见，例如Weisgerber等于1999年7月22日申请的临时美国专利申请60/144981，“具有空间保护的切割位点的蛋白酶缀合物”。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，本发明的蛋白酶包含一种分子间的交联，其中分子间的交联包括所述蛋白酶的第一个残基的氨基酸与第二个残基的氨基酸之间的共价连接，其中至少一个残基位于选自以下区域的一个区域中(a)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点1对应的一个氨基端区域；(b)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点70-84对应的第一表位区域；(c)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点103-126对应的第二表位区域；(d)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点220-246对应的第三表位区域；(e)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点156-165，170，186，191-196和259-262对应的第一切割位点区域；(f)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点12-24，27，84-88，271和274对应的第二切割位点区域；(g)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点2，3，4，5，6，7，12，17，36，40，41，43，44，45，67，86，87，89，206，209，210，212，213，214，215和216对应的第一近表位区域；(h)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点25，26，27，46，47，48，49，50，51，52，53，54，91，99，100，101，102，127，128，129，130，131，132，133，134，136，137，138，140，141，144和145对应的第二近表位区域；和(i)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点9，10，22，23，24，62，63，143，146，154，155，156，157，172，173，187，189，195，197，203，204，253，254，256，265，267，269，271，272和275对应的第三近表位区域。
其中只有第一个残基和第二个残基中的一个残基位于上述的一个区域中，其它残基选自所述蛋白酶的其它任何位点。
优选地，至少一个残基位于选自氨基端区域，第一表位区域，第二表位区域，第三表位区域，第一切割位点区域和第二切割位点区域中的一个区域中。更优选地，至少一个残基位于选自氨基端区域，第一表位区域，第二表位区域和第三表位区域中的一个区域中。甚至更优选地，至少一个残基位于选自第一表位区域，第二表位区域和第三表位区域中的一个区域中。最优选地，至少一个残基位于第一表位区域。
在另一个本发明的优选实施方案中，所述蛋白酶的第一和第二个残基中的每一个位于选自氨基端区域，第一表位区域，第二表位区域，第三表位区域，第一切割位点区域，第二切割位点区域，第一近表位区域，第二近表位区域，第三近表位区域中的一个区域中。更优选地，第一个残基对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点1和第二个残基位于选自第一表位区域，第二表位区域，第三表位区域，第一切割位点区域，第二切割位点区域，第一近表位区域，第二近表位区域，第三近表位区域中的一个区域中。
其中至少一个残基位于第一表位区域中，该区域优选地对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点75-83。更优选地，该区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点78。
其中至少一个残基位于第二表位区域中，该区域优选地对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点109，114和118。最优选地是位点118。
其中至少一个残基位于第三表位区域中，该区域优选地对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点240。
其中至少一个残基位于第一切割位点区域中，该区域优选地对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点158，159，160，161，162，163，164，165，170，186，191，192，193，194，196，259，260，261和262。更优选地，该区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点158，159，160，161，162，163，164，165，170，191，192，193，194，261和262。甚至更优选地，该区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点158，159，160，161，162，163，164，192，193，194，261和262。最优选地，该区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点160，161，162，163和261。
其中至少一个残基位于第二切割位点区域中，该区域优选地对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点13，14，15，16，18，19，20和21。更优选地，该区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点14，15，16，18，19，20和21。最优选地，该区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点18，19，20和21。
其中至少一个残基位于第一近表位区域中，该区域优选地对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点2，3，4，5，6，7，12，17，40，41，43，67，86，87，89，206，209，214和215。更优选地，该区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点2，3，4，5，17，40，41，43，67，86，87和214。
其中至少一个残基位于第二近表位区域中，该区域优选地对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点25，26，27，46，47，48，49，50，51，52，53，54，91，99，100，101，102，127，128，129，130，131，132，134，136，137，138，140，141，144和145。最优选地，该区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点27，47，48，50，52，102，127，128，130，131，132，134，138和141。
其中至少一个残基位于第三近表位区域中，该区域优选地对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点9，10，22，23，24，62，63，243，246，154，155，156，157，172，173，187，189，195，197，203，204，253，254，256，265，267，269，271，272和275。最优选地，该区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点22，23，24，143，146，155，173，189，197，203，204，253，254，265和275。
下面的表2列出了优选的分子内交联的枯草杆菌蛋白酶的非限制性实例，其中，在每个实例中，所列位点序号分别表示第一和第二个残基，即，分子间的交联通过这两个残基进行。与本文公开的一致，所有残基的编号方式均对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的编号方式。
表2
任选部分本发明的分子内交联的蛋白酶可以另外包含一个或多个其它的化学结构，包括(例如)与所述蛋白酶的任何残基，尤其是不参与分子内交联的那些残基，共价连接的一个或多个小分子，多肽和/或聚合物(在本文中被定义为“附加部分”)。如本文使用的，术语“小分子”是指一种分子量小于大约1600，优选地小于大约800，更优选地小于大约400和最优选地小于大约300的分子。如本文使用的，术语“多肽”是指一种含有两个或多个氨基酸残基的分子。如本文使用的，术语“聚合物”是指一种含有两个或多个相同(优选地五个或更多个相同的)单体的分子。
附加的部分可以包括如以下文献中记载的多肽部分，聚合物部分和连接部分例如1996年6月13日公开的并且由Olsen等转让给NovoNordisk的WO 96/17929；1996年12月19日公开的并且由Olsen等转让给Novo Nordisk的WO 96/40792；1997年8月21日公开的并且由Bisgard-Frantzen等转让给Novo Nordisk的WO 97/30148；1998年7月16日公开的并且由Olsen等转让给Novo Nordisk的WO 98/30682；1998年8月13日公开的并且由Vov Der Osten等转让给Novo Nordisk的WO98/35026；1999年1月7日公开的并且由Olsen等转让给Novo Nordisk的WO 99/00849；1999年1月5日颁布的并且由Olsen等转让给NovoNordisk的美国专利5856451；1997年10月9日公开的并且由Bott等转让给Genencor International Inc.的WO 97/37007；1998年6月2日由Weisgerber等申请的并且转让给宝洁公司的美国专利申请09/088912；1997年7月30日由Weisgerber等申请的并且转让给宝洁公司的美国专利申请08/903298；1999年7月22日由Rubingh等申请的临时美国专利申请60/144979，“具有空间保护的表位区域的蛋白酶缀合物”；1999年7月22日由Weisgerber等申请的临时美国专利申请60/144981，“具有空间保护的切割位点的蛋白酶缀合物”。
制备方法通过对编码亲本氨基酸序列的核苷酸序列进行突变来制备在一个或多个表位保护位点(或所述部分的其它任何位置)中具有一个取代的所述蛋白酶部分。这类方法为本领域所熟知；一种这样方法的非限制性实例如下所述将含有野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’基因的噬菌粒(pSS-5)转入大肠杆菌dut-ung-菌株CJ236，以及对Yuckenberg等人，“使用含尿嘧啶的DNA和噬菌粒载体的体外定点诱变”，定点诱变-一种实用方法，McPherson，M.J.编著，27-48页(1991)一文中描述的方法改进后，用VCSM13辅助噬菌体(Kunkel等人，“不需表型选择的快速、有效的定点诱变”，酶学方法，Vol 154，367-382页(1987))制备含尿嘧啶的单链DNA模板。由在Zoller和Smith，“用M13衍生的载体进行寡核苷酸定点诱变一种用于在任意DNA片段中产生点突变的有效的通用方法”，核酸研究，Vol.10，6487-6500页(1982)中公开的方法改进而来的引物定点诱变被用来制备所有的突变体(基本上如Yuckenberg等人所提供的，上述)。
用380B DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.)制备寡核苷酸。将诱变反应产物转入大肠杆菌MM294菌株(美国典型培养物保藏中心大肠杆菌33625)中。所有突变都经DNA测序证实，并将分离的DNA转入枯草杆菌表达菌株PG632(Saunders等人，“从枯草杆菌中分泌人甲状旁腺激素的34-氨基酸片段的信号序列切割位点的优化”，基因，Vol.102，277-282页(1991)以及Yang等人，“枯草杆菌中性蛋白酶基因的克隆以及该克隆基因在建立体外衍生的缺失突变中的应用”，细菌学杂志，Vol.160，15-21页(1984))。
按下述方法进行发酵。用一升含有10g/L葡萄糖的LB肉汤将含有目的蛋白酶的枯草杆菌细胞(PG632)培养至对数中期，并接种到总体积为9升的Biostat C发酵罐(Braun Biotech，Inc.，Allentown，PA)中。发酵培养基中含有酵母提取物、酪蛋白水解产物、可溶性部分水解的淀粉(Maltrin M-250)、消泡剂、缓冲液、以及微量矿物质(参见“芽孢杆菌的生物学工业应用”，Doi，R.H.和M.McGloughlin，编著(1992))。发酵操作过程中肉汤的pH恒定保持在7.5。加入卡那霉素(50μg/mL)对诱变质粒进行抗生素选择。细胞在37℃下培养18小时直至A600约为60，收获产物。
通过下述步骤处理发酵培养液来得到纯的变体。通过切向流过0.16μm滤膜滤除培养液中的枯草杆菌细胞。然后，用8,000分子量切断滤膜超滤浓缩无细胞培养液。用浓缩后的MES缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)将pH值调至5.5。通过用S-琼脂糖凝胶进行的阳离子交换色谱法，并用NaCl梯度洗脱进一步纯化该蛋白酶。参见Scopes，R.K.“蛋白纯化原理及操作”，Springer-Verlag，纽约(1984)。
用pNA测定法(DelMar等人分析化学，Vol.99，316-320页(1979))测定梯度洗脱期间收集的级分中的活性蛋白酶浓度。本测定法可以测量出所述蛋白酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(sAAPF-pNA)时释放出对硝基苯胺的速率。用分光光度计在410nm处测量由水解反应产生的黄色的速率，该速率与活性酶浓度成比例。此外，用280nm处的吸光度测量值确定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白之比给出所述蛋白酶的纯度，并被用来鉴定作为原液收集的级分。
为了避免存储过程中所述蛋白酶的自身溶解，向从色谱柱中得到的收集级分中加入等重量的丙二醇。当纯化过程完成后，采用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测所述蛋白酶原液的纯度，用II-T型胰蛋白酶抑制剂火鸡卵清(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)通过活性位点滴定方法测定绝对酶浓度。
在以使用为目的的制备中，通过Sephadex-G25(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)大小排阻柱洗脱酶原液以除去丙二醇，并更换缓冲液。将酶原液中的MES缓冲液更换成0.01M的KH2PO4溶液，pH5.5。
下面给出了制备本发明的一种分子内交联蛋白酶的方法的非限制性实施例，其中在每个实施例中 符号表示如上文所示的一种蛋白酶。
实施例1 制备位点217上的酪氨酸被亮氨酸取代和位点78上的丝氨酸被半胱氨酸取代的枯草杆菌蛋白酶BPN′的变体。在pH5.5的缓冲液中用5升5mM的二硫苏糖醇(DTT；从Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO购得)将该变体透析(100ml、浓度大约为2mg/mL)4小时。将该变体转移到不含DTT的新鲜缓冲液中并透析大约16小时。该变体的浓度通过在280nm处的吸光度来测定。测定硫醇的浓度(参见Deaken等，生物化学杂志，Vol.89，263页(1963))以确保游离硫醇的浓度大于所述蛋白酶的浓度。以超过游离硫醇浓度1.2倍的量加入N-(γ-马来酰亚胺基丁酸基)琥珀酰亚胺酯(从Pierce Chemical，Rockford，IL购得)。五分钟后，加入大约20mL的1M pH6.8的缓冲液。再过三十分钟，加入大约100mL的1M pH5.5的缓冲液。然后通过大约5升的0.01M pH5.5的缓冲液透析该反应混合物。通过离子交换柱纯化在位点78的半胱氨酸和氨基端之间具有共价连接的分子内交联的蛋白酶。
实施例2 制备位点217上的酪氨酸被亮氨酸取代，位点240上的天冬酰胺被半胱氨酸取代以及位点118上的天冬酰胺被赖氨酸取代的枯草杆菌蛋白酶BPN′的变体。所述但蛋白酶的其它所有赖氨酸残基被一个赖氨酸或半胱氨酸以外的其它氨基酸所取代。在pH5.5的缓冲液中用5升5mM的二硫苏糖醇(DTT；从Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO购得)将该变体透析(100ml、浓度大约为2mg/mL)4小时。将该变体转移到不含DTT的新鲜缓冲液中并透析大约16小时。该变体的浓度通过在280nm处的吸光度来测定。测定硫醇的浓度(参见Deaken等，生物化学杂志，Vol.89，263页(1963))以确保游离硫醇的浓度大于所述蛋白酶的浓度。以超过游离硫醇浓度1.2倍的量加入琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基(6-氨基己酸酯)琥珀酰亚胺酯(从PierceChemical，Rockford，IL购得)。五分钟后，加入大约20mL的1M pH6.8的缓冲液。再过三十分钟，加入大约100mL的1M pH5.5的缓冲液。然后通过大约5升的0.01M pH5.5的缓冲液透析该反应混合物。通过离子交换柱纯化在位点240的半胱氨酸和位点118上的赖氨酸之间具有共价连接的分子内交联的蛋白酶。
实施例3实施例1中使用的N-(γ-马来酰亚胺丁酸)琥珀酰亚胺酯被下列任何一种试剂所替代以便在位点78的半胱氨酸和氨基端之间形成共价连接N-(α-马来酰亚胺基乙酸基)琥珀酰亚胺酯，N-(β-马来酰亚胺基丙酸基)琥珀酰亚胺酯，或间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟琥珀酰亚胺酯。每一种试剂都从Pierce Chemical，Rockford，IL购得。或者，任何包含马来酰亚胺部分和一个大小相似的琥珀酰亚胺酯部分的试剂可以被合成出来并取代N-(γ-马来酰亚胺基丁酸基)琥珀酰亚胺酯(参见Kalgutar等，医药化学杂志，Vol.39，1692-1703页(1996)及其所引用的参考文献)。
实施例4实施例2中使用的琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基(6-氨基己酸酯)琥珀酰亚胺酯被下列任何一种试剂所替代以便在位点240的半胱氨酸和位点118上的赖氨酸之间形成共价连接琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯，磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯，或N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酸基]磺基琥珀酰亚胺酯。每一种试剂都从PierceChemical，Rockford，IL购得。或者，任何包含马来酰亚胺部分和一个大小相似的琥珀酰亚胺酯部分的试剂可以被合成出来并取代N-(γ-马来酰亚胺基丁酸基)琥珀酰亚胺酯(参见Kalgutar等，医药化学杂志，Vol.39，1692-1703页(1996)及其所引用的参考文献)。
实施例5 制备位点217上的酪氨酸被亮氨酸取代和位点78上的丝氨酸被半胱氨酸取代的枯草杆菌蛋白酶BPN′的变体。所述但蛋白酶的其它所有赖氨酸残基被一个赖氨酸或半胱氨酸以外的其它氨基酸所取代。在pH7-8的缓冲液中用5升5mM的二硫苏糖醇(DTT；从Sigma-AldrichCo.，St.Louis，MO购得)将该变体透析(100ml、浓度大约为2mg/mL)4小时。将该变体转移到不含DTT的新鲜缓冲液中并透析大约4小时。该变体的浓度通过在280nm处的吸光度来测定。测定硫醇的浓度(参见Deaken等，生物化学杂志，Vol.89，263页(1963))以确保游离硫醇的浓度大于所述蛋白酶的浓度。以超过游离硫醇浓度1.2倍的量加入琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(从PierceChemical，Rockford，IL购得)。五分钟后，加入大约20mL的1M pH6.8的缓冲液。再过三十分钟，加入大约100mL的1M pH5.5的缓冲液。然后通过大约5升的0.01M pH5.5的缓冲液透析该反应混合物。通过离子交换柱纯化在位点78的半胱氨酸和氨基端之间具有共价连接的分子内交联的蛋白酶。
实施例6 制备位点217上的酪氨酸被亮氨酸取代和位点78上的丝氨酸被半胱氨酸取代的枯草杆菌蛋白酶BPN′的变体。所述蛋白酶的其它所有赖氨酸残基被一个赖氨酸或半胱氨酸以外的其它氨基酸所取代。在pH5.5的缓冲液中用5升5mM的二硫苏糖醇(DTT；从Sigma-AldrichCo.，St.Louis，MO购得)将该变体透析(100ml、浓度大约为2mg/mL)4小时。将该变体转移到不含DTT的新鲜缓冲液中并透析大约16小时。该变体的浓度通过在280nm处的吸光度来测定。测定硫醇的浓度(参见Deaken等，生物化学杂志，Vol.89，263页(1963))以确保游离硫醇的浓度大于所述蛋白酶的浓度。以超过游离硫醇浓度1.2倍的量加入N-马来酰亚胺基[4′-叠氮-2′硝基苯氨基]丁酸酯。五分钟后，该反应物暴露在紫外光(320nm-350nm)下照射10分钟。或者，该反应物暴露于标准照相机快门的10次闪光。然后通过大约2升的0.01M pH5.5的缓冲液透析该反应混合物。通过离子交换柱纯化在位点78的半胱氨酸和氨基端之间具有共价连接的分子内交联的蛋白酶。
实施例7实施例6中使用的GMAB被下列任何一种试剂所替代以便在位点78的赖氨酸和氨基端之间形成共价连接(其中所述蛋白酶的其它所有赖氨酸残基被另一个氨基酸所取代)N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酸基琥珀酰亚胺，N-琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′硝基苯氨基)己酸酯，N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯，磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮基水杨酸基氨基)己酸酯，磺基琥珀酰亚胺基-7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯，磺基琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′硝基苯氨基)己酸酯，和磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-叠氮基苯基)丁酸酯。每一种试剂都从Pierce Chemical，Rockford，IL购得。
实施例8 制备位点217上的酪氨酸被亮氨酸取代，位点78上的丝氨酸被半胱氨酸取代和位点1上的丙氨酸被半胱氨酸取代的枯草杆菌蛋白酶BPN′的变体。所述但蛋白酶的其它所有赖氨酸残基被一个赖氨酸或半胱氨酸以外的其它氨基酸所取代。在pH5.5的缓冲液中用5升5mM的二硫苏糖醇(DTT；从Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO购得)将该变体透析(100ml、浓度大约为2mg/mL)4小时。将该变体转移到不含DTT的新鲜缓冲液中并透析大约16小时。该变体的浓度通过在280nm处的吸光度来测定。测定硫醇的浓度(参见Deaken等，生物化学杂志，Vol.89，263页(1963))以确保游离硫醇的浓度大于所述蛋白酶的浓度。将10mL 1M的(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸))(HEPES)/NaOH缓冲液pH7.0加到所述蛋白酶溶液中。以超过游离硫醇浓度1.2倍的量加入双马来酰亚胺基己烷(从Pierce Chemical，Rockford，IL购得)。一小时后，通过20个体积的0.01M pH5.5的缓冲液将该反应混合物透析两次。通过离子交换柱纯化在位点78的半胱氨酸和氨基端的半胱氨酸之间具有其价连接的分子内交联的蛋白酶。
分析方法测定使用下述两种方法，本发明的分子内交联的蛋白酶可被用于酶活性的测定和免疫原性应答，这两种方法为本技术领域的技术人员所熟知。或者也可以使用本技术领域的其它已知方法。
蛋白酶活性可以用本领域熟知的方法来测定本发明的分子内交联的蛋白酶活性。两种这样的方法描述如下皮肤碎屑活性方法用Scotch#3750G带，反复地从受试者腿部剥取人体皮肤碎屑直到带子上基本铺满碎屑。然后，将带子切割成1平方英寸的正方形，放在一边。在10mm×35mm陪替氏培养皿中，将2mL 0.75mg/mL的对照酶(例如，枯草杆菌蛋白酶BPN’)或待测蛋白酶加入到0.01M KH2PO4、pH5.5的缓冲液中。向该溶液中加入1mL 2.5％、pH8.6的月桂酸钠溶液。将溶液置于平台振荡器上轻轻混合。将上述制得的正方形带在不断轻轻的混合下浸泡于溶液中(碎屑面向上)10分钟。然后，用自来水轻轻漂洗正方形带15秒。将Stevenel蓝染液(3mL，购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)吸移到一干净的陪替氏培养皿中。在轻轻混合下将漂洗过的正方形带置于染液中(碎屑面向上)3分钟。从染液中取出正方形带，在两个盛有300mL蒸馏水的烧杯中连续漂洗，每次15秒。空气干燥该正方形带。目测或用比色计比较从对照酶获得的正方形带与从所述蛋白酶获得的正方形带之间颜色强度的差异。与对照酶正方形带相比，蛋白每正方形带的颜色强度较弱，这说明蛋白酶的活性较高。着色胶原活性方法将50mL含有0.01M CaCl2的且pH为8.6的0.1M tris缓冲液(三-羟甲基-氨基甲烷)和0.5g azocoll(偶氮颜料浸渍的胶原，购自SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)混合。在25℃下温育该混合物，同时在平板振荡器上轻轻混合。用0.2微米注射滤器过滤2mL该混合物，读取该混合物在520nm处的吸光度后把分光光度计调整归零。向剩余的48ml tris/azocoll混合物中加入1ppm对照酶(例如，枯草杆菌蛋白酶BPN’)或待测蛋白酶。在总共10分钟的时间内，每隔2分钟用0.2微米注射滤器过滤2mL的含对照物/蛋白酶的溶液。对于每份过滤后的样品，立即读取520nm处的吸光度。绘制结果数据相对于时间的曲线。对照物及所测蛋白酶的斜率表示该样品的相对活性。斜率越大表示活性越高。可以将所测蛋白酶的活性(斜率)表示为对照物活性(斜率)的百分比。
用于测定免疫原性的小鼠鼻内试验用本领域已知方法或通过本文下述的用于测定免疫原性的小鼠鼻内试验可以测定本发明的分子内交联的蛋白酶的免疫原性潜力。该试验类似于Robinson等，“小鼠对枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(Alcalase)的特异性抗体应答反应一种鼻内暴露模型的研制”，基础和应用毒理学(Fundamental and Applied Toxicology)，Vol.34，15-24页(1996)和Robinson等，“利用小鼠鼻内试验(MINT)来测定洗涤剂酶的变应原效力与豚鼠气管内(GPIT)试验的比较”，毒理学科学，Vol.43，39-46页(1998)中描述的测定法，这两种测定法可以用来代替下文所述的试验。
重量大约为18至大约20克的BDF1雌性小鼠(Charles River实验室，Portage，MI)被用于该试验。给药前将这些小鼠隔离一个星期。将这些小鼠关在放有木屑垫草的笼子中，这些笼子放置在控制湿度(30-70％)和温度(67-77°F)的房间内，该房间内进行12小时明暗交替的循环。这些小鼠随意食用Purina鼠食(Purina Mills，Richmond，IN)和水。
用待测潜在抗原(作为阳性对照的枯草杆菌BPN′或一种本发明的分子内交联的蛋白酶)对一组中的5只小鼠进行给药。给药前，通过腹膜内(i.p.)注射Ketaset(88.8mg/kg)和Rompun(6.67mg/kg)的混合物对每只小鼠进行麻醉。将被麻醉的小鼠握在手掌中，背朝下，用5mL溶解了蛋白酶的缓冲液(0.01M KH2PO4，pH5.5)进行鼻内给药。当每组给药剂量相同时，可以针对不同的剂量进行试验。给药溶液被轻轻地点在每只小鼠的鼻孔外并被小鼠吸入。在第3，10，17和24天重复给药。
在第29天收集血清样品。通过抗原捕获ELISA方法测定小鼠血清中的酶-特异性IgG1抗体。利用标准的ED50值可以比较分子内交联的蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶BPN’的免疫原性。
本发明的组合物本发明的分子内交联的蛋白酶可以被用于适合使用各自亲本蛋白酶的任何应用中。一个这样的实例包括清洁组合物。由于本发明分子内交联的蛋白酶能达到所希望的弱免疫原性的要求，该蛋白酶还可以被用于曾经从使用蛋白酶中受益最小的应用中。这类应用的实例包括分子内交联的蛋白酶必定与哺乳动物皮肤紧密接触的应用，例如使用个人护理组合物的应用。
清洁组合物本发明的蛋白酶可被用于清洁组合物包括，但不限于，洗衣组合物、坚硬表面清洁组合物、包括餐具洗涤组合物在内的精细织品清洁组合物，以及自动洗碗机洗涤剂组合物。
本发明的清洁组合物含有有效量的一种或多种本发明的蛋白酶以及一种清洁组合物载体。
本发明使用的“有效量的蛋白酶”或者类似表述是指达到特定清洁组合物中所需蛋白水解活性的分子内交联的蛋白酶的必需量。所述有效量可被本领域普通技术人员容易地确定，并取决于多种因素，例如所用蛋白酶的具体种类，清洁的用途，清洁组合物的具体组成，以及需要使用的组合物是液体还是干的(例如，颗粒状、棒状)组合物，等。优选地，所述清洁组合物中包含约0.0001％～约10％，更优选约0.001％～约1％，以及最优选约0.01％～约0.1％的一种或多种本发明的蛋白酶。下面更详细地讨论了所述蛋白酶可以用于不同清洁组合物的几个实例。
除本发明的蛋白酶外，本发明的清洁组合物还包含其中含有一种或多种与所述蛋白酶相容的清洁组合物材料的清洁组合物载体。本发明使用的术语“清洁组合物材料”是指任何选定的用于特定类型的所需清洁组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、棒状、喷雾剂、条、膏、凝胶)的材料，这些材料也与用于组合物中的蛋白酶相容。清洁组合物材料的具体选择可通过考虑待清洁的表面材料、针对使用过程中的清洁条件(例如，通过洗涤剂的使用)所需的组合物形式容易地进行。本发明所用的术语“相容的”是指清洁组合物材料不会使蛋白酶的蛋白水解活性降低到这样的程度，即在正常使用情况下所述蛋白酶不像所期望的那样有效。下文详细列举了具体的清洁组合物材料。
本发明的蛋白酶可被用于期望泡沫丰富且清洁效果良好的多种清洁剂组合物中。因此，所述蛋白酶可以与各种常规成分一起使用以便提供充分配制的坚硬表面清洁剂、餐具清洗组合物、织物洗涤组合物等。这类组合物可以是液体、颗粒、棒状等形式。这类组合物可以配制成“浓缩”清洁剂，该清洁剂含有多达约30％～约60％(重量)的表面活性剂。
本发明所述的清洁组合物可以任选地，以及优选地，包含各种表面活性剂(例如，阴离子、非离子或两性离子表面活性剂)。典型地，这类表面活性剂在组合物中的含量约5％～约35％。
用于本发明的表面活性剂的非限制性实例包括常规的C11-C18烷基苯磺酸盐以及伯和无规烷基硫酸盐，通式为CH3(CH2)X(CHOSO3-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸盐，其中x和(y+1)是至少约为7的整数，优选至少约为9，以及M是一种水溶性的阳离子，特别是钠；C10-C18烷基烷氧基硫酸盐(特别是EO 1-5乙氧基硫酸盐)；C10-C18烷基烷氧基羧酸盐(特别是EO 1-5乙氧基羧酸盐)，C10-C18烷基聚葡糖苷及其相应的硫酸化聚葡糖苷；C12-C18α-磺化脂肪酸酯，C12-C18烷基及烷基酚烷氧基化物(特别是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜碱及磺基甜菜碱，C10-C18胺氧化物等。本发明优选的是烷基烷氧基硫酸盐(AES)和烷基烷氧基羧酸盐(AEC)。另外，根据配方师的需要，将这类表面活性剂与胺氧化物和/或甜菜碱或磺基甜菜碱表面活性剂联用也是优选的。其它常规的有用表面活性剂列于标准教科书中。特别有用的表面活性剂包括C10-C18N-甲基葡糖酰胺，其描述见1993年3月16日颁布的授予Connor等人的美国专利US5,194,639。
本发明所述组合物中可以含有多种用于洗涤剂清洁组合物的其它成分，其中包括，例如，其它活性成分、载体、水助溶剂、加工助剂、染料或色料以及用于液体制剂的溶剂。如果希望额外增加泡沫，则可以向组合物中加入C10-C16烷醇酰胺等增泡剂，典型地加入量为约1％～约10％。C10-C14一乙醇酰胺和二乙醇酰胺代表一类典型的这种增泡剂。将这类增泡剂与高效发泡辅助表面活性剂，例如上述的胺氧化物、甜菜碱以及磺基甜菜碱联用也是有利的。如果需要，可以加入MgCl2、MgSO4等可溶性镁盐，典型地约0.1％～约2％，以提供额外的泡沫。
本发明所述的液体清洁剂组合物可以包含水以及其它作为载体的溶剂。低分子量的伯或仲醇的实例有甲醇、乙醇、丙醇以及异丙醇，它们都是合适的。优选地用一元醇来溶解表面活性剂，但是含有约2～约6个碳原子和约2～约6个羟基的多元醇(例如，1，3-丙二醇、乙二醇、丙三醇以及1，2-丙二醇)也可以使用。所述组合物可以包含约5％～约90％，典型地约10％～约50％的这类载体。
本发明的洗涤剂组合物优选地被配制成在含水的清洁操作使用中，使得洗涤用水的pH值为约6.8～约11。因此，典型地将成品在该范围内配制。将pH值控制在推荐的使用水平的技术包括，例如缓冲液、碱和酸的使用。这类技术为本领域技术人员所熟知。
当配制本发明所述的坚硬表面清洁组合物和织物清洁组合物时，配方师可能希望使用约5％～约50％(重量)的各种助洗剂。典型的助洗剂包括1-10微米沸石、聚羧酸盐例如柠檬酸盐和氧代丁二酸氢盐、层叠硅酸盐、磷酸盐等。其它常规助洗剂见标准配方手册。
同样，配方师可能希望在这类组合物中使用各种附加的酶，例如纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，典型用量为约0.001％～约1％(重量)。各种去污酶及织物护理酶都为洗涤剂领域所熟知。
各种漂白化合物，例如过碳酸盐、过硼酸盐等也可以用于此类组合物中，典型用量为约1％～约15％(重量)。如果需要，这类组合物还可以包含漂白活化剂，例如四乙酰乙二胺、壬酸基苯磺酸盐等，这些也为本领域已知。典型用量为约1％～约10％(重量)。
去污剂，尤其是阴离子低聚酯型，螫合剂，尤其是氨基磷酸盐以及乙二胺丁二酸氢盐，粘土污垢去除剂，尤其是乙氧基化四亚乙基五胺，分散剂，尤其是聚丙烯酸酯和聚天冬氨酸酯，增白剂，尤其是阴离子增白剂，抑泡剂，尤其是硅氧烷及仲醇，织物软化剂，尤其是绿土粘土等都可以被用于这类组合物中，用量为约1％～35％(重量)。标准配方手册以及公开的专利中都包含了对这类常规材料的丰富详尽的描述。
酶稳定剂也可以用于清洁组合物中。这类酶稳定剂包括丙二醇(优选地为约1％～约10％)、甲酸钠(优选地为约0.1％～约1％)以及甲酸钙(优选地为约0.1％～约1％)。
本发明所述的变体也可以用于坚硬表面清洁组合物中。本发明使用的“坚硬表面清洁组合物”是指用于清洁坚硬表面，例如地板、墙壁、浴室瓷砖等的液态及颗粒状的清洁剂组合物。本发明所述的坚硬表面清洁组合物包含有效量的一种或多种本发明所述蛋白酶，优选组合物中的蛋白酶含量为约0.001％～约10％，更优选约0.01％～约5％，还更优选约0.05％～约1％(重量)。除含有一种或多种蛋白酶外，这类坚硬表面清洁组合物典型地还包含一种表面活性剂和一种水溶性的螯合助洗剂。但是，在某些专用产品，例如喷雾型窗户清洁剂中，有时并不使用所述表面活性剂，这是由于它们可能会在玻璃表面产生薄膜状和/或斑点状的残迹。
当含有表面活性剂组分时，其在本发明组合物中的含量可低至0.1％，但是，典型地，该组合物中表面活性剂的含量为约0.25％～约10％，更优选约1％～约5％。
典型地，所述组合物中包含约0.5％～约50％的去垢助剂，优选地约1％～约10％。
优选的pH范围应为约7～12。如果需要调节pH，常用的pH调节剂，例如氢氧化钠、碳酸钠或盐酸都可以使用。
溶剂也可以包含在所述组合物中。有用的溶剂包括，但不限于，乙二醇醚例如二甘醇单己基醚，二甘醇单丁基醚，乙二醇单丁基醚，乙二醇单己基醚，丙二醇单丁基醚，二丙二醇单丁基醚，以及二醇例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。在使用时，这类溶剂的典型用量为约0.5％～约15％，更优选约3％～约11％。
此外，当向要清洁的表面“全强度”施用本发明的组合物而不清洗该表面时，可以在该组合物中使用高挥发性溶剂，例如异丙醇或乙醇以加快表面上组合物的蒸发。使用时，挥发性溶剂在组合物中的典型用量为约2％～约12％。
实施例7-12液态坚硬表面清洁组合物
所有配方均调至pH7。
在本发明的另一个实施方案中，餐具洗涤组合物包含一种或多种本发明所述的变体。本发明使用的“餐具洗涤组合物”是指用于清洁餐具的所有形式的组合物，包括但不限于颗粒状的以及液态的形式。
实施例13-16液态餐具洗涤剂
所有配方均调至pH7。
实施例17-19液态织物清洁组合物
个人护理组合物本发明的蛋白酶特别适合用于个人护理组合物，例如留存型和漂洗型头发调理剂，香波、留存型和漂洗型防治粉刺组合物、面乳及护肤剂、淋浴凝胶、肥皂、泡沫及非泡沫型洁面剂、化妆品、手用、面用及体用洗液、保湿剂、饰颜片和面膜，留存型面部保湿剂，化妆及清洁擦剂、口腔护理组合物和接触透镜护理组合物。本发明所述的个人护理组合物包含一种或多种本发明的蛋白酶和个人护理载体。
为了便于说明，本发明的蛋白酶适合包含在下列参考文献中所述的组合物中1997年6月24日颁布的授予Linares等人的美国专利5,641,479(皮肤清洁剂)；1997年2月4日颁布的授予Wivell等人的美国专利5,599,549(皮肤清洁剂)；1996年12月17日颁布的授予Ha等人的美国专利5,585,104(皮肤清洁剂)；1996年7月30日颁布的授予Kefauver等人的美国专利5,540,852(皮肤清洁剂)；1996年4月23日颁布的授予Dunbar等人的美国专利5,510,050(皮肤清洁剂)；1997年3月18日颁布的授予Guang Lin等人的美国专利5,612,324(抗粉刺制剂)；1996年12月24日颁布的授予Warren等人的美国专利5,587,176(抗粉刺制剂)；1996年8月27日颁布的授予Venkateswaran的美国专利5,549,888(抗粉刺制剂)；1995年11月28日颁布的授予Corless等人的美国专利5,470,884(抗粉刺制剂)；1997年7月22日颁布的授予Gordon等人的美国专利5,650,384(淋浴凝胶)；1997年3月4日颁布的授予Moore等人的美国专利5,607,678(淋浴凝胶)；1997年4月29日颁布的授予Coffindaffer等人的美国专利5,624,666(头发调理剂和/或洗发香波)；1997年4月8日颁布的授予Bolich等人的美国专利5,618,524(头发调理剂和/或洗发香波)；1997年3月18日颁布的授予Inman的美国专利5,612,301，(头发调理剂和/或洗发香波)；1996年11月12日颁布的授予Wells的美国专利5,573,709(头发调理剂和/或洗发香波)；1996年1月9日颁布的授予Pings的美国专利5,482,703(头发调理剂和/或洗发香波)；1994年4月12日再颁布的授予Grote等人的美国专利Re.34,584(头发调理剂和/或洗发香波)；1997年6月24日颁布的授予Date等人的美国专利5,641,493(化妆品)；1997年2月25日颁布的授予Blank等人的美国专利5,605,894(化妆品)；1996年12月17日颁布的授予Yoshioka等人的美国专利5,585,090(化妆品)；1990年7月3日颁布的授予Cheney等人的美国专利4,939,179(手用、面用及体用洗液)；1997年3月4日颁布的授予McAtee等人的美国专利5,607,980(手用、面用及体用润肤剂)；1977年8月30日颁布的授予Richter等人的美国专利4,045,364(化妆用或清洁用的擦剂)；1994年10月12日公开的Touchet等人的欧洲专利申请EP 0 619 074(化妆用或清洁用的擦剂)；1990年12月4日颁布的授予Brown-Skrobot等人的美国专利4,975,217(化妆用或清洁用的擦剂)；1992年3月17日颁布的授予Seibel的美国专利5,096,700(口腔清洁组合物)；1991年7月2日颁布的授予Sampathkumar的美国专利5,028,414(口腔清洁组合物)；1991年7月2日颁布的授予Benedict等人的美国专利5,028,415(口腔清洁组合物)；1989年9月5日颁布的授予Davies等人的美国专利4,863,627(接触透镜清洁组合物)；1988年5月24日再颁布的授予Huth等人的美国专利Re.32,672(接触透镜清洁组合物)；以及1986年9月2日颁布的授予Schafer的美国专利4,609,493(接触透镜清洁组合物)。
为了进一步说明本发明的口腔清洁组合物，可以向组合物中加入药学上可接受量的一种或多种本发明的蛋白酶用来清除牙齿或假牙上的蛋白质的污渍。本发明使用的“口腔清洁组合物”是指洁齿剂、牙膏、牙胶、牙粉、漱口剂、口腔喷雾剂、口胶、口香糖、糖锭、香囊、片剂、生物凝胶、预防用糊剂、牙齿处理液等。优选地，所述的口腔清洁组合物包括约0.0001％～约20％(重量)的一种或多种本发明的蛋白酶，更优选约0.001％～约10％，还更优选约0.01％～约5％，以及药学上可接受的载体。本发明使用的“药学上可接受的”是指该术语描述的药物、药剂或惰性成分适合用于与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、刺激作用、过敏反应等，而具有合理的效果/风险比。
典型地，所述口腔清洁组合物的药学上可接受的口腔清洁载体成分通常占组合物重量的约50％～约99.99％，优选约65％～约99.99％，更优选约65％～约99％。
可加入到本发明所述口腔清洁组合物的药学上可接受的载体成分以及任选成分为本技术领域技术人员所熟知。多种多样的组合物类型、口腔清洁组合物中使用的载体成分以及任选成分都已在本发明上述的参考文献中公开。
在本发明的另一个实施方案中，用于在口腔外清洁假牙的假牙清洁组合物包含一种或多种本发明所述的蛋白酶。这类假牙清洁组合物中包含有效量的一种或多种所述蛋白酶，以及假牙清洁载体，所述蛋白酶在组合物中的重量百分含量优选地约0.0001％～约50％，更优选地约0.001％～约35％，还更优选地约0.01％～约20％。各种假牙清洁组合物形式，例如泡腾片等都为本技术领域所熟知(参见，例如美国专利US5,055,305，Young)，并且通常适合于掺入一种或多种所述蛋白酶用于清除假牙上的蛋白质污渍。
在本发明的另一个实施方案中，接触透镜清洁组合物中包括一种或多种本发明所述的蛋白酶。这类接触透镜清洁组合物中包含有效量的一种或多种所述蛋白酶以及接触透镜清洁载体，所述蛋白酶在组合物中所占重量百分比优选地约0.01％～50％，更优选地约0.01％～约20％，还更优选地约1％～约5％。各种接触透镜清洁组合物形式，例如片剂、液体等都为本技术领域所熟知，并且通常适合于掺入一种或多种本发明的蛋白酶用于清除接触透镜上的蛋白质污渍。
实施例20-23接触透镜清洁溶液
实施例24-27洗浴产品
实施例28-31洗面产品
实施例32-33留存型皮肤保湿组合物
实施例34擦净剂组合物
上述组合物被浸渍到一种由纤维素和/或聚酯所组成的机织吸收层上，以吸收层重量计，该组合物约为250％。
序列表<110>宝洁公司<120>免疫原性降低的分子内交联的枯草杆菌蛋白酶<130>交联蛋白酶<140>PCT/US00/<141>2000-07-11<160>1<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>275<212>PRT<213>解淀粉芽孢杆菌<400>1Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln27权利要求
1.一种枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶，其特征在于所述蛋白酶具有一种分子间的交联，其中分子间的交联包括所述蛋白酶的第一个残基的氨基酸与所述蛋白酶的第二个残基的氨基酸之间的一个连接部分。
2.如权利要求1所述的蛋白酶，其中至少一个残基位于选自以下区域的一个区域中(a)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点1对应的一个氨基端区域；(b)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点70-84对应的第一表位区域；(c)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点103-126对应的第二表位区域；(d)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点220-246对应的第三表位区域；(e)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点156-165，170，186，191-196和259-262对应的第一切割位点区域；(f)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点12-24，27，84-88，271和274对应的第二切割位点区域；(g)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点2，3，4，5，6，7，12，17，36，40，41，43，44，45，67，86，87，89，206，209，210，212，213，214，215和216对应的第一近表位区域；(h)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点25，26，27，46，47，48，49，50，51，52，53，54，91，99，100，101，102，127，128，129，130，131，132，133，134，136，137，138，140，141，144和145对应的第二近表位区域；和(i)与枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点9，10，22，23，24，62，63，143，146，154，155，156，157，172，173，187，189，195，197，203，204，253，254，256，265，267，269，271，272和275对应的第三近表位区域。
3.如权利要求2所述的蛋白酶，其中第一近表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点2，3，4，5，6，7，12，17，40，41，43，67，86，87，89，206，209，214和215；第二近表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点27，47，48，50，52，102，127，128，130，131，132，134，138和141；第三近表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点22，23，24，143，146，155，173，189，197，203，204，253，254，265和275。
4.如权利要求3所述的蛋白酶，其中第二切割位点区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点13-24。
5.如权利要求4所述的蛋白酶，其中第一切割位点区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点156-165，170，191-195，261和262。
6.如权利要求1所述的蛋白酶，其中第一表位区域对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点75-83。
7.如权利要求6所述的蛋白酶，其中第一个残基的氨基酸是赖氨酸或其中第一个残基的氨基酸对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点1；以及其中第二个残基的氨基酸是半胱氨酸。
8.如权利要求6所述的蛋白酶，其中第一个和第二个残基中的每一个残基位于选自氨基端区域，第一表位区域，第二表位区域，第三表位区域，第一切割位点区域，第二切割位点区域，第一近表位区域，第二近表位区域，和第三近表位区域中的一个区域中。
9.如权利要求8所述的蛋白酶，其中第一个残基对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点1以及第二个残基位于选自第一表位区域，第二表位区域，第三表位区域，第一切割位点区域，第二切割位点区域，第一近表位区域，第二近表位区域，和第三近表位区域中的一个区域中。
10.如权利要求9所述的蛋白酶，其中连接部分包含一种烷基琥珀酰亚胺；第二个残基位于第一表位区域中；和其中第二个残基对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点78。
11.一种清洁组合物，该组合物含有一种如权利要求1所述的蛋白酶和一种清洁组合物载体。
12.一种个人护理组合物，该组合物含有一种如权利要求1所述的蛋白酶和一种个人护理载体。
全文摘要
本发明记载了具有一种分子内交联的枯草杆菌蛋白酶,其中分子内交联包含所述蛋白酶的第一个残基的氨基酸与所述蛋白酶的第二个残基的氨基酸之间的一个共价连接。所述蛋白酶的免疫原性与亲本蛋白酶相比降低了。因此,这种蛋白酶适合用于几种类型的组合物,该组合物包括,但不局限于,洗衣、餐具清洁、坚硬表面清洁、皮肤护理、护发、美容、口腔护理和接触透镜清洁组合物。
文档编号A61K8/30GK1369008SQ00810743
公开日2002年9月11日 申请日期2000年7月11日 优先权日1999年7月22日
发明者L·T·劳戈林二世, D·N·鲁宾夫, D·J·维斯格伯, P·E·克雷 申请人:宝洁公司