专利名称：应用分泌型卷曲相关蛋白的药用组合物和方法
技术领域：
本发明涉及调节成骨活性的组合物和方法。更具体地说，本发明涉及用成骨细胞系产生的分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)、其部分以及以其为基础的抗体和核酸(包括反义核酸)调节成骨活性的方法和药用组合物。
背景技术：
有关成骨调节和骨相关疾病的课题近来获得了相当的关注；例如在妇女健康领域，对骨质疏松性骨相关疾病特别关注。骨骼骨恒定重建贯穿终生。在此重建过程中，成骨细胞骨形成和随后的破骨细胞骨吸收之间存在着脆弱的平衡。
作为衰老过程的正常组成部分，骨基质经历各种结构性变化，其性质仍未完全确定。对人骨的衰老相关变化的研究大多数集中于在形态水平阐明骨变化或定量比较骨丢失速率。辨别骨疾病相关机制对于理解骨生理学和骨疾病至关重要。尽管已经鉴定并克隆了无数参与调节骨细胞的基因和基因家族以及由它们编码的多肽，但由于成骨途径的复杂性使得它们的功能还没有获得清楚认识。WNT基因家族Wnt糖蛋白家族是一组在细胞发育调节中起重要作用的基因及其编码蛋白。Wnt蛋白是由12个以上的结构相关分子组成的生长因子家族，参与调节基本生物过程，例如凋亡、胚胎发生、器官发生、形态发生和肿瘤发生(综述见Nusse和Varmus 1992 Cell 691073-1087)。这些多肽为多能因子，与其它分泌型蛋白(如转化生长因子(TGF)-β、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)和骨形成蛋白(BMP))具有相似生物活性。一个叫做Wnt-x的Wnt生长因子家族一员优先在骨组织和骨衍生细胞中表达，并且似乎参与保持成熟成骨细胞(骨形成细胞)表型(PCT/US94/14708；WO 95/17416)。卷曲蛋白家族研究表明，某些Wnt蛋白作用于称为“Frizzled”的蛋白家族，所述“Frizzled”蛋白家族起Wnt蛋白受体作用，或者为Wnt受体复合物组分(综述见Moon等，1997 Cell 88725-728和Barth等，1997 Curr.Opin.Cell Biol.9683-690)。卷曲蛋白包含氨基端分泌信号序列、被认为结合Wnt的半胱氨酸富集结构域(CRD)、7个推定的类似于G蛋白偶联受体的跨膜结构域以及胞质羧基端。
1996年，Hoang等(J.Biol.Chem.27126131-26137)报道发现了第一种分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)。该蛋白由于在骨发育中的卷曲基序而叫做“Frzb”，根据其在大鼠体内刺激软骨形成活性的能力由牛关节软骨提取物纯化并克隆。还克隆了所述牛基因的人类同源物。然而，与卷曲蛋白不同，Frzb不含有蛇形跨膜结构域。因此，此卷曲蛋白家族新成员似乎是Wnt的分泌型受体。Frzb cDNA编码325aa/36,000道尔顿的蛋白，主要在四肢骨骼中表达。最高水平的表达见于发育长骨，与骺成软骨细胞相对应；于是向骨化中心表达下降，最终消失。
近来的研究表明，SFRP参与凋亡，并因此已经鉴定出某些SFRP为分泌型凋亡相关蛋白(“SARP”)。近来也已经鉴定了SFRP家族的其它成员，显示为Wnt作用的拮抗剂。目前存在至少5个已知的人SFRP/SARP基因SFRP-1/FrzA/FRP-1/SARP-2、SFRP-2/SDF-5/SARP-1、SFRP-3/Frzb-1/FrzB/Fritz、SFRP-4和SFRP-5/SARP-3(Leimeister等，1998Mechanisms of Development7529-42，该参考文献内容结合到本文中)。尽管SARP/SFRP在凋亡中所起的准确作用尚不明了，但这些蛋白似乎抑制或增强程序化细胞死亡过程。
总之，非常需要明确鉴定治疗人类骨疾病(包括骨吸收性疾病，如骨质疏松)和调节骨形成的靶。
发明概述按照本发明，提供调节哺乳动物成骨活性的方法和药用组合物，所述药用组合物含有分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)或其调节部分。本发明的其它组合物使用由所述蛋白或其部分形成的抗体，或者可以使用编码所述蛋白或其部分的核酸，包括反义序列。在一个优选的实施方案中，SFRP得自人成骨细胞。本发明组合物调节的成骨活性包括调节骨生长和骨密度。SFRP具有SEQ ID NO2显示的氨基酸序列，该序列是通过表达SEQ ID NO1显示的多核苷酸序列获得的。在最优选的实施方案中，SFRP为SFRP-1(SEQ ID NO2)。
另一方面，本发明的方法包括治疗哺乳动物(特别是人)骨疾病的方法，包括给予上述药用组合物的步骤。照此，治疗骨疾病的方法包括但不限于以下几种疾病(a)骨形成疾病，(b)骨吸收疾病和(c)骨密度疾病。
在本发明的另一方面，所述骨疾病为选自以下的退行性骨疾病神经退行性疾病、肌肉退行性疾病和骨退行性疾病。所述骨退行性疾病选自骨质减少、骨关节炎、骨质疏松。
在另一个实施方案中，本发明包括鉴定调节SFRP活性的受试化合物的方法。在该方法中，如下测定调节哺乳动物成骨活性的化合物首先将含SFRP的样品在含受试化合物的测试培养基中温育，第二步是确定SFRP活性，其中相对于单独的SFRP而言活性增加说明所述化合物为SFRP激活剂，活性降低说明所述化合物为SFRP抑制剂。
在再一个实施方案中，本发明包括调节Wnt介导的细胞信号转导的方法，包括使所述细胞与上述SFRP接触，其中所述Wnt活性受到调节。
另外，本发明涉及促进骨细胞培养物的骨形成或骨修复的方法，该方法包括从骨培养物中分离所述细胞，导入表达SFRP(具有SEQ IDNO2显示的氨基酸序列)的重组构建物，最后将所述细胞送回到所述骨培养物中。所述构建物优选表达编码完整SFRP蛋白或其部分的核酸序列的反义序列。
另一个实施方案涉及能够与具有SEQ ID NO1显示的核酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸探针。这样的探针用于检测得自哺乳动物宿主的样品中的SFRP多核苷酸的诊断方法，包括检测样品中是否存在SFRP。
IV.附图简述
图1显示了导致发现人成骨细胞(hOB)分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)cDNA的成骨RADE结果。该图显示了用处于三个不同分化期(增殖期、成熟期和前骨细胞)的三种hOB细胞系(hOB-03-C5、hOB-03-CE6和hOB-01-C1)进行的实验的差异显示聚合酶链反应(DD-PCR)凝胶的放射自显影。箭头指示276个碱基对(bp)的hOB SFRP基因片段(即RADE片段)，在hOB-03-C5和hOB-03-CE6细胞中PGE2处理上调该基因片段，但在hOB-01-C1细胞中TGF-β1处理下调该基因片段。还可以看出，hOB-01-C1细胞表达该基因的基础水平高。基本局部对比检索工具(BLAST)对公共数据库检索该基因片段显示，此cDNA与小鼠SFRP-1和牛FrzA基因同源。
图2显示用对照、PTH、PGE2和TGF-β1处理24小时后，由hOB-03-C5细胞分离的poly A+RNA的RNA印迹放射自显影。在此实验中，切除的hOB SFRP RADE基因片段和克隆的甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)cDNA都用做探针。箭头指示由PGE2处理所述细胞彻底上调的hOB SFRP mRNA(～4.4kb)。
图3显示了用对照、PGE2和TGF-β1处理24小时后，由hOB-03-C5细胞分离的poly A+RNA的RNA印迹放射自显影。在该实验中，克隆的hOB SFRP RADE基因片段和克隆的GAPDH cDNA都用作探针。再次表明，用PGE2处理所述细胞彻底下调hOB SFRP mRNA。
图4显示了用对照、PTH、PGE2和TGF-β1处理24小时后由hOB-03-CE6细胞或hOB-01-C1细胞分离的poly A+RNA的RNA印迹放射自显影。在该实验中，切除的hOB SFRP RADE基因片段和克隆的GAPDH cDNA都用作探针。箭头指示用PGE2处理hOB-03-CE6细胞彻底上调但用PTH处理hOB-01-C1细胞下调的hOB SFRPmRNA。还可以发现hOB-01-C1细胞表达所述mRNA的基础水平高。
图5显示了用对照和TGF-β1处理24小时后由hOB-01-Cl细胞分离的poly A+RNA的RNA印迹放射自显影。在该实验中，全长(1.1kb)克隆的hOB SFRP cDNA和克隆的β-肌动蛋白cDNA都用作探针。结果显示用TGF-β1处理所述细胞下调hOB SFRP mRNA。此外，还可以发现hOB-01-C1细胞表达高基础水平的所述mRNA。
图6显示了分离自23种不同人组织的poly A+RNA的RNA印迹放射自显影。在该实验中，切除的hOB SFRP RADE基因片段和克隆的β-肌动蛋白cDNA都用作探针。箭头指示的hOB SFRP mRNA在心脏和肾脏高度表达、在胎盘和子宫中等表达、在脑、胰腺和其它组织低水平表达而在胸腺和淋巴细胞不表达。
图7显示了用对照、PTH、PGE2和TGF-β1处理24小时后，由SaOS-2人骨肉瘤成骨细胞样细胞和正常人成骨细胞(hOB)的外植块培养物分离的poly A+RNA的RNA印迹放射自显影。在该实验中，全长克隆的hOB SFRP cDNA和克隆的GAPDH cDNA都用作探针。结果显示SaOS-2细胞表达低基础水平的hOB SFRP mRNA，其表达不受这些因子的调节。相比之下，hOB细胞表达中等水平的、受PGE2处理上调的所述mRNA。对PGE2处理的hOB细胞的TaqMan定量RT-PCR分析表明，PGE2将SFRP mRNA水平上调10倍。
图8显示了在用对照或PGE2处理24小时后由人胎盘或hOB-03-CE6细胞分离的总RNA的反转录酶(RT)-PCR产物的DNA印迹放射自显影。用人FRP-1/SARP-2特异性寡核苷酸引物进行RT-PCR，并将DNA印迹与人FRP-1/SARP-2特异性内部寡核苷酸探针杂交。此RT-PCR产物的预期大小为1.1kb。如同所预期的一样，结果显示胎盘表达FRP-1/SARP-2 mRNA，而PGE2处理hOB-03-CE6细胞强烈上调所述mRNA的表达。
图9显示使用Coulter细胞计数器进行的hOB-03-C5、hOB-03-CE6和hOB-01-C1细胞存活实验的结果。结果表示为相对于第0天对照(即6孔板每孔约200,000个细胞)的百分率。该实验的结果表明，hOB-03-C5细胞在含血清的培养基中于39℃缓慢增殖，而hOB-03-CE6细胞停止分裂，但在6天的温育中存活。相反，hOB-01-C1细胞经历了加速的细胞死亡，这与这些细胞中的hOB SFRP mRNA高基础水平表达相关。
图10显示使用Coulter细胞计数器进行的hOB-03-C5细胞(图10A)、hOB-03-CE6细胞(图10B)和hOB-01-C1细胞(图10C)存活实验的结果。对于这些实验，用对照或PGE2(图10A和10B)或者对照和TGF-β1(图10C)在无血清培养基中于39℃处理所述细胞3或6天。结果表示为相对于第0天对照(即6孔板每孔约200,000个细胞)的百分率。该实验的结果表明，hOB细胞在无血清培养基中的存活力随时间下降。另外，对于hOB-03-C5细胞和hOB-03-CE6细胞，用PGE2处理加速了这种下降速率。这种细胞死亡速率的增加与PGE2处理后这些细胞中的hOB SFRP mRNA水平上调有关。相反，用下调hOBSFRP mRNA水平的TGF-β1处理hOB-01-C1细胞增强细胞存活力。
图11显示了用PGE2处理hOB-03-C5细胞诱导凋亡或程序性细胞死亡。使用膜联蛋白V-FITC经流式细胞仪检测凋亡。图A显示，既不会被膜联蛋白V染色也不会被碘化丙锭染色(死细胞染色)的存活细胞数随PGE2浓度增加而降低。相反，图B显示被膜联蛋白V染色但不被碘化丙锭染色的凋亡细胞数随PGE2浓度增加而增加。同样，图C显示既可以被膜联蛋白V染色也可以被碘化丙锭染色的死细胞数随PGE2浓度增加而增加。
图12显示使用Coulter细胞计数器进行的hOB-03-C5细胞(图A)和hOB-03-CE6细胞(图B)的另一个存活力实验的结果。以和图10描述的相似方式进行这些实验，但是，对于这些实验，在存在或不存在人SARP-2的有义(对照)或反义的定向起始位点的硫代磷酸寡核苷酸的情况下，用载体对照(即0.1％乙醇)或PGE2共处理所述细胞。结果表示为相对于第0天对照(即6孔板每孔约200,000个细胞)的百分率或者表示为相对于载体处理对照的百分率。该实验的结果表明，用SARP-2的反义寡核苷酸共处理hOB细胞逆转了PGE2加速细胞死亡速率的能力，而用有义(对照)寡核苷酸共处理对该过程没有影响。
图13显示使用Coulter细胞计数器进行的hOB-01-C1-PS-09细胞存活力实验的结果(图A)。对于这些实验，用hOB SFRP cDNA(即SFRP-1/FRP-1/SARP-2)哺乳动物表达质粒或空载体(即pcDNA3.1)稳定转染所述细胞。结果表示为第0天对照细胞的百分率。该实验的结果表明，与对该过程没有影响的空载体相比，hOB细胞过量表达hOB SFRP/SFRP-1/FRP-1/SARP-2加速细胞死亡速率。图B显示分离自空载体细胞(V)或SARP-2过量表达细胞(S)的poly A+RNA的RNA杂交的结果。该分析证明SARP-2细胞表达的SFRP-1/FRP-1/SARP-2mRNA远比所述载体细胞多。
图14显示用表达空载体的hOB-01-C1-PS-09细胞(pcDNA3.1)和SFRP-1/FRP-1/SARP-2过量表达细胞的亚克隆(SARP-2克隆#1)进行的另一个细胞存活力实验的结果。图A显示分离自所述细胞的RNA的TaqMan定量RT-PCR分析的结果。该分析表明，SARP-2克隆#1细胞表达的人SFRP-1/FRP-1/SARP-2 mRNA比空载体表达细胞高50-60倍。同样，如图B所示，使用Coulter细胞计数器检测细胞数，SARP-2克隆#1细胞死亡速率比空载体对照细胞快3倍。
图15为分离自对照或PGE2处理24小时的hOB-03-CE6细胞的全细胞提取物的蛋白质印迹放射自显影。用β-连环蛋白的单克隆抗体(分子量为92,000)探测免疫印迹。结果显示用PGE2处理hOB细胞下调β-连环蛋白水平，这与hOB SFRP/SFRP-l/FRP-1/SARP-2对Wnt信号转导途径的拮抗作用相一致。
图16显示了hOB-01-C1-PS-09细胞(图A)和hOB-02-C1-PS-02细胞(图B)瞬时转染实验的结果。TCF-荧光素酶报道基因测定的检测结果显示，转染人[h]或大鼠[r]SARP-2或人Frzb-1表达质粒在hOB细胞中下调Wnt信号转导(与pcDNA3.1空载体对照相比)。该测定是Wnt信号转导和β-连环蛋白核活性的可信检测。
图17概述了使用hOB细胞和hOB SFRP/SFRP-1/FRP-1/SARP-2的骨合成代谢药物的筛选模式。该筛选模式可鉴定调节SFRP-1/FRP-1/SARP-2作用的化合物。
图18图示高通量筛选(HTS)测定抑制成骨细胞/骨细胞的SFRP-1/FRP-1/SARP-2功能的化合物的实例。使用CyQuant DNA荧光测定的结果显示，过量表达SFRP-1/FRP-1/SARP-2的hOB-01-C1-PS-09细胞(SARP-2#1细胞)比表达空载体的细胞(pcDNA3.1)死得快。而且，SFRP-1/FRP-1/SARP-2抗肽抗血清(SARP-2 AS)阻断所述基因过量表达引起的细胞死亡。
图19概述了用于产生SFRP-1/SARP-2基因敲除小鼠的策略。β-半乳糖苷酶和新霉素抗性表达盒取代编码整个半胱氨酸富集结构域(CRD)的小鼠SFRP-1/SARP-2基因外显子1。
图20图示分离自雌性和雄性野生型(WT)和敲除(KO)SFRP-1小鼠的肾脏的poly A+RNA的RNA印迹。该印迹显示WT肾脏表达高水平的SFRP-1 mRNA(4.4 kb)，而KO肾脏不表达该基因。
图21显示了得自雄性(图A)和雌性(图B)野生型(+/+)和敲除(-/-)SFRP-1的小鼠股骨的微型计算机X射线断层显象(micro-CT)分析的结果。当与+/+对照小鼠相比时，由该方法测定的数据表明，-/-小鼠的成骨参数(即BV/TV，Tb.Th.，Conn.Den.，Tb.N.&Tb.Sp.)升高。
图22是一组图，显示了(A)hOB细胞的细胞增殖；(B)于39℃维生素D3处理hOB细胞能够/增强上调碱性磷酸酶活性；和(C)维生素D3于34℃不能诱导hOB细胞分泌骨钙蛋白，见实施例A详细介绍。
图23图示关于PTH-1受体mRNA表达的实施例A的结果；其中于39℃培养hOB细胞48小时与细胞保持于34℃相比，使PTH-1受体的稳态mRNA水平增加7倍。
图24图示PTH 1-34浓度逐渐增加对hOB细胞胞内环腺苷酸(cAMP)的作用的实施例A的结果。
图25图示用合成糖皮质激素地塞米松处理时上调hOB细胞的碱性磷酸酶活性的作用，见实施例A详细介绍。
图26图示在使用Flexerall Strain Unit时机械性感觉刺激对前骨性hOB细胞作用的实验结果。
V.发明详述本发明涉及其表达在三种不同人成骨细胞(hOB)细胞系中受到成骨药物或骨形成药物体外调节的基因。在本发明的一个方面，该基因的表达在hOB分化期被上调，提示所述基因可能参与成骨过程。DNA序列分析表明，该基因片段与称作分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)-1的小鼠cDNA具有显著的序列同一性(Rattner等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942859-2863)。随后的cDNA克隆和其它的序列分析表明，称为hOB SFRP的该基因与人FRP-1/SARP-2相同(Finch等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 946770-6775；Melkonyan等，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413636-13641)。hOB SFRP的表征预示了其作为新型骨质疏松药物靶的用途和在鉴定骨合成代谢药物的新型药物筛选中的用途。定义术语“骨形成”是骨合成和矿化过程。成骨细胞调节该过程。
术语“骨生长”是骨骼增长过程。该过程为以下两种形式之一(1)直接产生于间充质细胞或骨髓细胞的膜内骨形成；(2)产生于软骨的纵向或软骨(endichindual)骨形成。
术语“成骨”与以上定义的术语骨形成同义。
术语“分泌型卷曲相关蛋白”或“SFRP”为Wnt信号转导途径的分泌型受体，具有许许多多使其成为细胞生长和分化的有用研究工具的特征。卷曲样基因家族编码具有未知功能跨膜结构域的细胞膜蛋白。
术语“分泌型凋亡相关蛋白”或“SARP”与以上定义的术语分泌型卷曲相关蛋白或SFRP同义。
术语“蛋白”、“肽”和“多肽”交互使用，包括纯化和重组产生的、包含通过肽键线性连接的氨基酸的SFRP分子。本发明的氨基酸可为L型或D型，只要所述多肽的生物活性得以保持。本发明的SFRP蛋白还可以包括通过反应(包括糖基化、乙酰化和磷酸化)翻译后修饰的蛋白。所述多肽还包括类似物、等位基因和等位变异体，与野生型蛋白或天然蛋白相比，它们可含有不影响SFRP蛋白的生物活性或功能活性的氨基酸衍生物或非氨基酸部分。术语氨基酸是指天然存在的氨基酸及其衍生物(诸如TyrMe和PheCl)，以及特征在于既存在可利用的羧基也存在氨基的其它部分。所述多肽可包含的非氨基酸部分包括例如氨基酸模拟结构。模拟结构和氨基酸具有大致相同的官能团空间排布，但不必同时具有氨基酸特征的氨基和羧基。
“突变蛋白”是指例如通过定点诱变或其它操作、通过转录或翻译错误引起氨基酸序列微小变化的SFRP蛋白或多肽，或者通过合理设计合成制备的SFRP蛋白或多肽。这些微小改变产生其蛋白或多肽的生物活性与野生型或天然存在的多肽或蛋白相比发生改变的氨基酸序列。突变蛋白的实例包括本文描述的SEQ ID NO2的SFRP-1。
本文使用的术语“疏水性”包括非极性的氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸模拟物和化学部分。疏水性氨基酸包括Phe、Val、Trp、Ile和Leu。本文使用的术语“带正电荷的氨基酸”是指带正电荷的氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸模拟物和化学部分。带正电荷的氨基酸包括例如Lys、Arg和His。
当“纯化的”用来指SFRP蛋白或多肽时，区别于天然的或天然存在的蛋白或多肽，因为它们以纯化形式存在。本文描述的这些“纯化的”SFRP蛋白或多肽或任一种设想的变异体，应当是指基本不含通常在其自然或天然环境中与其结合的污染物的化合物或分子。术语“大致纯”或“分离的”没有将多核苷酸或多肽同与其非天然结合的物质的混合物排除在外。
“天然”SFRP多肽、蛋白或核酸分子是指由天然或“野生型”资源中回收的SFRP。
“组合物”是指活性物质(即本发明的SFRP)和另一种惰性(例如可检测物质或标记物)或活性的化合物或组合物(例如佐剂)的组合。
“药用组合物”是指包括作为活性物质的SFRP(特别是SFRP-1)与使所述组合物适于体外、体内或活体外诊断或治疗使用的惰性或活性载体的组合。
本文使用的术语“药学上可接受的载体”包括任一种标准药用载体，诸如磷酸缓冲盐溶液、水和乳剂(如油/水或水/油乳剂)以及各种类型的润湿剂。所述组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的实例参见Martin，Remington′s Pharm.Sci.，第15版(Mack Publ.Co.，Easton(1975))。
涉及本文描述的SFRP的术语“核酸”是指单链和双链DNA、cDNA、基因组源DNA和RNA，以及相互之间互补的正链和负链核酸，包括反义RNA。“核酸分子”是可与“多核苷酸”交互使用的术语，均指多聚形式的任意长度核苷酸(或者核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸)或其类似物。所述术语还包括已知类型的修饰，例如本领域已知的标记(例如Sambrook等(1989)同上)、甲基化、“加帽”、类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如非电荷连接的修饰(例如氨基甲酸甲酯))、包含悬垂部分的修饰(例如蛋白(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽等))、嵌入剂修饰(例如吖啶、补骨脂素等)、包含螯合剂的修饰(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)、包含烷化剂的修饰、修饰性连接的修饰(例如α异头核酸等)以及未修饰形式的多核苷酸。所述多核苷酸可进行化学修饰或生物化学修饰，或者可含有非天然或衍化核苷酸碱基。所述核苷酸可与所述多核苷酸的编码mRNA互补。这些互补核苷酸包括但不限于能够形成三股螺旋的核苷酸或反义核苷酸。本发明还提供包含非天然存在序列的重组多核苷酸，正如改变的野生型多肽序列，包括但不限于由于缺失、插入、取代一个或多个核苷酸或通过融合至其它多核苷酸序列而产生的改变的野生型多肽序列。
如果天然状态的SFRP多核苷酸或使用本领域技术人员众所周知的方法对其进行了操作的SFRP多核苷酸可以被转录和/或翻译产生多肽或成熟蛋白，则认为SFRP多核苷酸“编码”SFRP多肽。因此，术语多核苷酸除了包括编码序列之外，还应包括加工序列和其它不编码成熟蛋白氨基酸的序列。所述多核苷酸的反义链也被认为编码所述序列。
术语“重组”多核苷酸或DNA是指通过组合两种互相分离的序列节段而制备的多核苷酸，所述组合通过基因工程技术或化学合成人工操作分离的DNA节段实现。如此操作时，人们可将具有需要功能的DNA节段连接在一起，以产生需要的功能组合。
SFRP DNA、RNA或多核苷酸的“类似物”是指在形式和/或功能(特别是增强序列特异性氢键键合互补核苷酸序列上的碱基对的能力)上类似于天然存在的多核苷酸，但在例如具有罕见或非天然碱基或改变的主链方面不同于DNA或RNA的大分子。参见例如Uhlmann等，(1990)Chemical Reviews 90543-584。
“分离的”当用来指SFRP核酸分子时，是指与其它的细胞组分分离，所述其它的细胞组分通常与胞内的天然或野生型SFRP DNA或RNA相结合。
“杂交”是指可在不同“严格”条件下进行的杂交反应。增加杂交反应严格性的条件在本领域广为人知并且已经在参见例如Sambrook等，同上中公开。相关条件的实例包括(按照严格性增加的顺序)25℃、37℃、50℃和68℃的温育温度；10×SSC、6×SSC、1×SSC和0.1×SSC的缓冲液浓度(其中SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)以及使用其它缓冲系统的等同缓冲液；0％、25％、50％和75％的甲酰胺浓度，5分钟至24小时的温育时间，洗涤时间延长、频率增加或缓冲液浓度降低。
“Tm”是这样的摄氏温度在该温度下，在所述实验条件下，由Watson-Crick碱基对反向氢键键合互补链组成的多核苷酸双链50％解离为单链。Tm可根据标准公式计算，例如Tm＝81.5+16.6log[Na+]+0.41(％G/C)-0.61(％F)-600/L其中Na+为阳离子浓度(通常为钠离子)(mol/L)；(％G/C)为G和C碱基在双链中占总碱基的百分比数；(％F)为溶液中的甲酰胺百分比(重量/体积)；而L为双链两条链的核苷酸数。
多核苷酸的“稳定双链体”或在生化反应中任意两种或多种组分之间形成的“稳定复合体”，是指在双链体或复合体形成与其随后的检测之间保持足够长时间的双链体或复合体。所述双链体或复合体必须能够经得起在形成时刻和检测时刻之间存在或引入的任何条件，这些条件随所要进行的测定或反应而改变。可任选存在和可除去双链体或复合体的介入条件包括清洗、加热、在反应混合物中加入其它的溶质或溶剂(如变性剂)以及与其它的反应物竞争。稳定的双链体或复合体可以为不可逆或可逆的，但必须满足该定义的其它要求。因此，在反应混合物中可以形成瞬时复合体，但只要其自然离解或由于新施加的条件或检测前引入的操作而解离，就不能构成稳定复合体。
当两个单链多核苷酸(特别是在高严格条件下)以反向构型形成稳定双链体时，所述链基本“互补”。一个双链多核苷酸可与另一个多核苷酸“互补”，只要第一个多核苷酸的一条链和第二个多核苷酸可形成稳定双链体。由单链多核苷酸序列预测的互补序列是预期与所述单链多核苷酸按照普遍接受的碱基配对原则形成氢键键合的最佳标准核苷酸序列。
“有义”链和“反义”链当用于同一情况时，是指相互之间互补的单链SFRP多核苷酸。它们可为双链多核苷酸的反向链，或者一条链可按照普遍接受的碱基配对原则由另一条链预测出来。除非另有说明或暗示，否则可随意将一条链或另一条链指定为“有义”链或“反义”链。
如果每个线性序列的核苷酸顺序都相同并且未发生取代、缺失或物质置换，则SFRP核苷酸线性序列与另一条线性序列“相同”。显然，依据Watson-Crick碱基配对，具有相似结构的嘌呤和嘧啶含氮碱基在功能上可以相同；而且，类似含氮碱基(特别是尿嘧啶和胸腺嘧啶)的互相取代或含氮碱基的修饰(如甲基化)不构成物质置换。当RNA序列反映了多核糖核苷酸中含氮碱基的顺序，DNA序列反映了多脱氧核糖核苷酸中含氮碱基的顺序，而两个序列满足了此定义的其它要求时，则所述RNA和DNA多核苷酸具有相同的序列。当至少一个序列为包含多义残基的简并寡核苷酸时，如果至少一种替代形式的简并寡核苷酸与其对比序列相同，那么这两个序列相同。例如，如果AYAAA(SEQ ID NO5)是ATAAA(SEQ ID NO6)和ACAAA(SEQ ID NO7)的混合物，则AYAAA(SEQ ID NO3)与ATAAA(SEQ ID NO4)相同。
当在两种多核苷酸之间进行对比时，隐含性知道很容易获得互补链，可以选定或预测所对比的多核苷酸之间同一性程度最大的有义链或反义链。例如，当要对比的一种或两种多核苷酸为双链时，如果第一种多核苷酸的一条链与第二种多核苷酸的一条链相同时，则所述两种序列相同。同样，当多核苷酸探针被描述为与其靶相同时，显然它是参与所述探针和所述靶之间杂交反应的靶的互补链。
如果两种线性序列都能够与同一互补多核苷酸杂交形成双链体，则一种所述核苷酸线性序列与另一种所述线性序列“基本相同”或“等同”。应当理解的是，尽管不总是明确指出申请人涉及特定核酸分子，但也包括其等同物。更优选在较高严格条件下杂交的序列。显然，杂交反应可适应核苷酸序列的插入、缺失和取代。因此，线性核苷酸序列即使部分核苷酸残基不精确对应或匹配时也可基本相同。相比之下更优选与本文公开的本发明更紧密对应或匹配的序列。一般而言，如果约25个残基的多核苷酸区与另一个多核苷酸区至少约80％相同；更优选至少约90％相同；更优选至少约95％相同；甚至更优选所述序列100％相同，则所述两个多核苷酸区基本相同。40个或更多个残基的多核苷酸区与另一个区在同源部分序列对比后，如果至少约75％相同；更优选至少约80％相同；更优选至少约85％相同；甚至更优选至少约90％相同；再更优选所述序列100％相同，则所述两个多核苷酸区基本相同。
在确定多核苷酸序列是否基本相同时，特别优选保留与其对比的多核苷酸的功能性的序列。可通过不同的参数测定功能性。例如，如果所述多核苷酸用于涉及与另一个多核苷酸杂交的反应，那么优选在相似的条件下与相同靶杂交的序列。一般而言，DNA双链体的Tm取决于错配残基的位置，对于200个或更多个残基的双链体来说，序列同一性每降低1％，Tm将下降约10℃；对于少于40个残基的双链体来说，序列同一性每降低1％，Tm下降约50℃(参见例如Meinkoth等)。约100个残基的基本相同或等同序列一般和互相之间各自的互补序列在低于Tm约20℃的温度形成稳定双链体；优选在低于Tm约15℃的温度形成稳定双链体；更优选在低于Tm约10℃的温度形成稳定双链体；甚至更优选在低于Tm约5℃的温度形成稳定双链体；再更优选在约Tm的温度形成稳定双链体。在另一个实施例中，如果所述多核苷酸编码的多肽是其功能的重要组成部分，那么优选编码相同或基本相同多肽的序列。因此，产生保守氨基酸取代的核苷酸差异优于产生非保守氨基酸取代的核苷酸差异，而产生非保守氨基酸取代的核苷酸差异又优于产生非保守取代的核苷酸差异，更优选不改变氨基酸序列的核苷酸差异，甚至更优选相同的核苷酸。导致多肽中插入或缺失的多核苷酸插入或缺失优于使下游编码区位相失调的多核苷酸插入或缺失；甚至更优选不包含插入或缺失的多核苷酸序列。杂交特性和多核苷酸编码的多肽序列的相对重要性取决于本发明的应用。
如果两个多核苷酸在相似的最大严格条件下都能够和特定的第三个多核苷酸形成稳定双链体，则该多核苷酸与另一个多核苷酸具有相同的特征或与其等同。除了相似的杂交特性之外，所述多核苷酸最好还编码基本相同的多肽。
多核苷酸序列的“保守”残基是指在对比的两个或多个相关序列的相同位置未发生改变的残基。相对保守的残基是指在更相关序列中比序列中其它位置出现的残基更保守的残基。
“相关”多核苷酸具有较大比例的相同残基。
本文使用的“简并”寡核苷酸序列是如下的至少两种相关原始多核苷酸序列产生的设计序列在原始序列中保守的残基保留在简并序列中，而在原始序列中不保守的残基在简并序列中可以有若干选择。例如，简并序列AYASA(SEQ ID NO 8)可由原始序列ATACA(SEQ ID NO 9)和ACAGA(SEQ ID NO 10)确定，其中Y为C或T，而S为C或G。Y和S是“多义”残基的实例。简并节段是包含简并序列的多核苷酸节段。
显然，包含简并序列的合成寡核苷酸实际上是除多义位置之外具有相同序列的紧密相关多核苷酸的混合物。这样的寡核苷酸通常合成为在多义位置的所有可能核苷酸组合的混合物。混合物中的每个寡核苷酸都被称为“替代形式”。
本文使用的多核苷酸“片段”或“插入片段”一般表示全长形式的亚区，但也可以包括整个全长多核苷酸。
如果一个多核苷酸从根本上讲来源于另一个多核苷酸，那么这两个不同的多核苷酸互相“对应”。例如，信使RNA对应于其转录基因。cDNA对应于其例如通过反转录反应或基于RNA序列信息通过化学合成DNA而产生的RNA。cDNA还对应于编码所述RNA的基因。如果多核苷酸在所对比的不同的物种、品系或变异体中具有相似的功能，诸如编码相关多肽，那么所述多核苷酸也互相“对应”。
“探针”当在SFRP多核苷酸操作的范围内使用时，是指作为试剂提供的寡核苷酸，它通过与靶杂交来检测可能存在于目标样品中的靶。通常，探针包含标记物或标记物通过其可在杂交反应之前或紧接杂交反应之后结合的物质。合适的标记物包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白(包括酶)。
“引物”是通常具有自由3′-OH基团的寡核苷酸，通过与靶杂交结合可能存在于目标样品中的靶，由此促进与所述靶互补的多核苷酸的多聚化。
生产重复拷贝的相同多核苷酸的方法，诸如PCR或基因克隆，在本文统称为“扩增”或“复制”。例如，可复制单链或双链DNA，以形成具有相同序列的其它DNA。例如，可通过RNA指导的RNA聚合酶或通过反转录DNA然后进行PCR复制RNA。在后一种情况下，扩增的RNA拷贝为具有相同序列的DNA。
“聚合酶链式反应”(“PCR”)是使用一个或多个引物以及聚合催化剂(诸如反转录酶或DNA聚合酶，特别是热稳定聚合酶)制备目标多核苷酸的复制拷贝的反应。一般来说，PCR包括反复形成的三个步骤“退火”，其中调节温度以允许寡核苷酸引物和要扩增的多核苷酸形成双链体；“伸长”，其中调节温度，以便使用与其形成双链体的多核苷酸作为模板，用DNA聚合酶伸长已形成双链体的寡核苷酸；以及“解链”，其中调节温度，以便解离所述多核苷酸和伸长的寡核苷酸。然后重复循环，直至获得需要量的扩增多核苷酸。在Mullis的USP第4,683,195号和Mullis等的USP第4,683,202号中讲述了PCR法。
基因中的元件包括但不限于启动子区、增强子区、阻抑蛋白结合区、转录起始位点、核糖体结合位点、翻译起始位点、蛋白编码区、内含子和外显子以及转录和翻译的终止位点。特定多核苷酸的“反义”拷贝是指能够氢键键合所述多核苷酸并因此能够调节所述多核苷酸表达的互补序列。其为上述的DNA、RNA或其类似物，包括具有改变主链的类似物。反义拷贝结合的多核苷酸可以为单链形式或者双链形式。
本文使用的术语“有效连接”意指相对于必须的调节序列(例如启动子或增强子)定位DNA分子，使得所述启动予以稳定或瞬时方式控制所述DNA分子转录为RNA。
“载体”是指将插入的核酸分子转移至宿主细胞内部和/或在宿主细胞之间转移插入核酸分子的自我复制核酸分子。该术语包括主要起复制核酸作用的载体和起转录和/或翻译DNA或RNA作用的表达载体。还包括提供一种以上的上述功能的载体。
“宿主细胞”包括任何单独的细胞或细胞培养物，它们可以是或已经成为载体或加入的外源核酸分子和/或蛋白的受体。“宿主细胞”还包括单个细胞的后代，所述后代由于天然、偶然或有目的的突变，与原始亲代细胞可以不必完全相同(在形态学或基因组DNA互补物或总DNA互补物方面)。
“抗体”是能够结合抗原的免疫球蛋白分子。本文使用的术语不仅包括完整的免疫球蛋白分子，而且包括抗独特型抗体、突变体、片段、融合蛋白、人源化蛋白和包含具有需要特异性的抗原识别部位的修饰免疫球蛋白分子。
“抗体复合物”是组合的抗体(如上所定义)及其结合配偶体或配体。
用于本发明的“合适细胞”包括但不限于表达SFRP的细胞，例如骨髓细胞，优选hOB细胞。
本文将核酸分子的“生物等同物”定义为和参比核酸分子具有基本同一性的核酸分子。参比核酸分子的片段是生物等同物的一个实例。
SFRP多肽或蛋白的“生物等同物”是保留参比蛋白或多肽相同特征的多肽或蛋白，并且包括参比蛋白或多肽的片段。
还可以使用市售的自动化肽合成仪，如Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA生产的型号为430A或431A的设备，通过化学合成获得SFRP蛋白和多肽，在SED ID NO 2中提供了氨基酸序列。合成的蛋白或多肽可被沉淀并通过例如高效液相色谱(HPLC)进一步纯化。因此，本发明还提供以下的化学合成本发明蛋白的方法提供所述蛋白的序列(例如SEQ ID NO 2)和试剂(诸如氨基酸和酶)，并以正确的方向将氨基酸和线性序列连接在一起。
或者，可通过例如Sambrook 等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，(Cold spring Harbor Laboratory(1989))描述的众所周知的重组方法，使用例如以下描述和例举的宿主细胞和载体系统，获得所述蛋白和多肽。本发明还提供通过培养含编码需要蛋白的核酸分子的宿主细胞产生SFRP、其类似物、突变蛋白或片段的方法，其中所述核酸有效连接至RNA转录启动子。可通过使用含有需要蛋白的核酸序列的启动子和终止子序列的基因构建物，将需要的蛋白引入到宿主细胞中。在合适的条件下培养宿主细胞，使得所述核酸被转录和翻译为蛋白。在一个单独的实施方案中，所述蛋白被进一步纯化。
本发明的蛋白还可以与各种液相载体组合，所述液相载体例如无菌溶液或水溶液、药学上可接受的载体、悬浮液和乳浊液。非水性溶剂的实例包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。当用于制备抗体时，所述载体还可以包括用于非特异性增强特异性免疫应答的佐剂。熟练的技术人员可以很容易地确定是否需要佐剂并选择一种佐剂。然而，仅为了说明目的，合适的佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂和不完全佐剂、无机盐和多核苷酸。SFRP/SARP的治疗用途尽管SFRP/SARP基因家族仅仅在最近才被发现，其生物学仍有许多问题需要了解，但这些蛋白还是具有几种潜在的治疗用途。因为已知Wnt与原癌基因有关，所以SFRP/SARP由于其能够拮抗Wnt活性而可以起肿瘤抑制剂的作用。这些蛋白还可以用于组织再生。例如，因为FrzB-1刺激体内的异位软骨形成活性，所以它可以用于加快骨折康复或髋和膝更换后的关节愈合(专利申请号WO 98/16641A1)。最后，因为SFRP/SARP似乎控制凋亡，所以这些蛋白还可以用于治疗各种退行性疾病，包括神经退行性疾病、肌退行性疾病和骨退行性疾病。药用组合物本发明还提供包含任一种上述蛋白、突变蛋白、片段、抗体、编码所述蛋白、突变蛋白、抗体或其片段的核酸分子以及表达所述核酸分子的载体和宿主细胞、以及可接受的固体或液体载体缓冲液或稀释剂的组合物。使用足以实现对成骨活性或凋亡活性的需要调节作用的有效量的一种或多种活性成分。可通过常规的需要活性的剂量-反应曲线测定有效量。当在药学上使用所述组合物时，它们可与“药学上可接受的载体”组合用于诊断和治疗用途。所述组合物的配制对本领域的技术人员而言是众所周知的。本发明的药用组合物可包含一种或多种其它的活性组分并优选包括药学上可接受的载体。所述其它的活性组分可与基于上述的一种或多种SFRP的活性组分的作用协同作用。在替代实施方案中，加入其它的活性组分，因为其和SFRP对相同的疾病或病症起作用，但作用方式与基于SFRP的活性组分不同，或者所述其它的活性组分可对存在于人或动物体内的其它疾病或病症起作用。合适的药学上可接受的载体和/或稀释剂包括任何和全部的常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水性溶液、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。术语“药学上可接受的载体”是指在给予患者中不引起变态反应或其它不适当作用的载体。合适的药学上可接受的载体包括例如水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。药学上可接受的载体还可以包括微量的增强所述组合物的一种或多种活性组分的有效期或有效性的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。这样的用于药学活性物质的介质和物质在本领域是众所周知的。常规培养基或物质例外不能使用的情况是它与所述活性成分不相容，还设想了其在本发明的免疫原性组合物中的应用。
这些组合物还可以用于制备诊断和治疗与神经退行性疾病(即Huntington氏病、Alzheimer氏病、脊髓损伤)、肌退行性疾病(即肌肉营养不良、重症肌无力、肌强直性肌病)和骨退行性疾病(即骨质疏松)相关的病理的药物。
在某些实施方案中，在所述组合物中使用结合整个或部分SFRP蛋白的抗体，以治疗任一种上述疾病或病症。可通过常规方法制备多克隆抗体和单克隆抗体。一般来说，产生的抗体针对(a)SFRP蛋白特异氨基酸序列和(b)更可能具有抗原性的氨基酸序列。可通过进行序列分析和使用任何常规序列排列和序列对比程序选择SFRP蛋白特异性序列。一般优选用在一个末端或多个末端(最好在两端)具有亲水性的氨基酸序列产生抗体。除了使用亲水性氨基酸以外，在优选的实施方案中所述亲水性氨基酸还可为碱性(非酸性)。可使用任何增加抗原性的氨基酸。例如，脯氨酸经常用于所述序列的中央部分。当产生抗SFRP蛋白特异性初始测试序列的抗体时，可根据产生抗体量的下降或增加来检测抗原性。在本发明的某些实施方案中，产生针对含SFRP蛋白的至少8个连续氨基酸(优选至少10个连续氨基酸)的序列的抗体。在更优选的实施方案中，产生针对含约15个至约30个氨基酸的氨基酸序列的抗体。在优选的实施方案中，产生针对含SEQ ID NO 2的SFRP蛋白的氨基酸217-231的序列或其序列变异体的抗体。
本发明的组合物可通过各种途径给予需要促进神经、肌肉、软骨和骨生长的个体，所述途径包括但不限于静脉内、皮下、肌内、鞘内、颅内和局部给予。所述组合物可通过体内或活体外方法直接给予至器官或器官细胞。
这些组合物可以为溶液形式或微粒形式，或者可以加入到微球或微泡中，包括微胶粒和脂质体。工业实用性上述组合物提供用于筛选为合适细胞Wnt受体激动剂或拮抗剂的药物或药用化合物的筛选测定的组分。
此外，预期本发明的SFRP多核苷酸可用作诊断剂或用于检测与SFRP编码基因或一个或多个参与Wnt信号转导途径的基因有关的遗传异常的的用途。所述遗传异常包括核苷酸的点突变、缺失或插入。若干遗传筛选法均适合使用本发明可提供的探针，所述遗传筛选法包括限制性片段长度多态性(RFLP)分析、连接酶链式反应或PCR。该基因突变表明出现异常的风险增高。
按照下文提供的详述，所述蛋白或其片段可用于体外无细胞和细胞测定系统，以筛选抑制或增强Wnt受体途径和凋亡的药物和药用化合物，或测试与该途径相关的疾病(例如骨形成性疾病、癌发生和心血管疾病)的可能疗法。所述蛋白或其片段还可以调节胚胎发生。
药物筛选方法可用于鉴定SFRP蛋白的激活剂或抑制剂。例如，在药物存在下的软骨生长与单独的SFRP相比增加可能表明激活了SFRP，而减少可能表明抑制了SFRP活性。
可使用本发明的方法筛选各种化合物。它们包括肽、大分子、小分子、化学混合物和生物混合物。所述化合物可以是生物化合物、合成化合物、有机化合物或无机化合物。
在本发明中，合适的细胞用于制备诊断测定、表达SFRP或制备核苷酸型诊断试剂盒。所述细胞可由酵母、细菌、真菌或病毒制备或产生。在优选的实施方案中，所述细胞为hOB细胞，特别是称为hOB-01-C1-PS-09细胞(保藏于Manassas，Va的美国典型培养物保藏中心，保藏号PTA-785)的新型永生化前骨细胞系，具有hOB-01-C1-PS-09细胞的鉴定特征的成骨细胞以及由其制备的成骨细胞(例如子代细胞)。永生化是指基本连续和永久建立的具有显著无限细胞分裂潜能的细胞培养物。也就是说，所述细胞可基本无限地培养，即在快速生长条件下培养至少约6个月，优选在较慢生长条件下培养更长时间，并可以使用常规细胞培养技术快速连续繁殖。换种方式说，本发明的细胞可培养至少约100、150或200个群体倍增。这些细胞产生具有正常人成骨细胞特征的补充蛋白，并能够进行成骨细胞分化。它们可用于成骨细胞对各种物质(诸如激素、细胞因子和生长因子)敏感性的细胞培养研究或用于组织治疗。这些细胞为先前由Bodine等1996 Endocrinology 1374592-4604公开的hOB-01-C1细胞系的衰老后亚克隆。
因此，如我们在本文的报导，SFRP为骨质疏松的新型药物靶，某些实施方案涉及编码至少一种SFRP蛋白的全部或部分的基因或核酸的表达。所述核酸或基因在人成骨细胞(hOB)细胞系中的表达与细胞死亡和凋亡的加速相关联。本发明的hOB-01C1PS-09细胞相对于其它hOB细胞特别有效，因为“-09”表示的细胞为成熟成骨细胞。另外，这些细胞为骨细胞(即成熟细胞)，相比之下其它hOB细胞通常为成骨细胞。而且，hOB-01-C1-PS-09细胞表达非常低水平的FRP-1/SARP-2 mRNA。因此，hOB-01-C1-PS-09细胞系是研究FRP-1/SARP-2再引入和过量表达作用的独特体外模型。hOB-01-C1-PS-09细胞的另一个重要特征在于它们既可用于瞬时转染研究，也可用于稳定转染研究。以下列出该细胞相对于亲代hOB-01-C1细胞的众多优势中的几种hOB-01-C1-PS-09细胞是真正的永生，在34℃的分裂快2-3倍，且它们还保留亲代细胞的许多前骨细胞特征。
hOB-01-C1-PS-09细胞可用于建立过量表达潜在的骨质疏松药物靶的稳定细胞系。所述稳定细胞系因而对表征这些药物靶以及开发鉴定调节其的化合物的高通量筛选和测定很有价值。
实施例本发明由以下的实施例进一步描述。提供所述实施例仅为了参照具体的实施方案阐述本发明。这些实施例尽管描述了本发明的某些具体方面，但不限制或限定本发明的范围。实施例AhOB细胞的产生和分析hOB-01-C1细胞是得自成人骨的条件转化细胞系，如实呈现前骨细胞表型。这些细胞用温度敏感型大T-抗原(tsA 209)转化，并在T-抗原突变体有活性时于34℃的许可温度增殖；然而，当T-抗原突变体无活性时，所述细胞于非许可温度(≥37℃)停止分裂。尽管hOB-01-C1细胞是建立的第一个骨细胞系，并适于探索研究，但它们具有某些药物开发劣势。同其它的SV-40大T-抗原转化的人细胞系一样，hOB-01-C1细胞在培养15-20代后经历转捩和衰老。因此，尽管经常被称为“永生化”，但所述细胞系实际上仅为“延长生命”。hOB-01-C1细胞还在34℃培养时缓慢增殖，倍增时间为约每5-6天一次。为了克服某些这样的缺点，建立了hOB-01-C1-PS-09细胞系。
通过在之前传代培养转捩点(即传代15-20代)后的亲代hOB-01-C1细胞系直至增殖恢复(传代20-25代)，产生hOB-01-C1-PS-09细胞。然后扩增培养衰老后细胞并亚克隆。使用反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析特征鉴定克隆，以检测甲状旁腺激素(PTH)-1受体mRNA的表达水平。选择hOB-01-C1-PS-09细胞进一步特征鉴定，因为该克隆于39℃表达最高水平的PTH-1受体mRNA。该细胞系在克隆和扩增步骤经过大约20-25次群体倍增，随后传代超过50次。这些细胞系可传代数百次。因此，hOB-01-C1-PS-09细胞是真正的永生细胞系。
同亲代hOB-01-C1细胞系一样，hOB-01-C1-PS-09细胞不能在组织培养皿上形成单层培养物和留出空间。所述细胞似乎还通过长细胞突起(long cellular process)形成细胞-细胞接触。根据电子显微镜分析，所述细胞具有使人联想到前骨细胞的指样细胞突出物(projection)，当它们接触邻近细胞时这些突起形成空位连接。如同亲代细胞系一样，据免疫细胞化学测定，hOB-01-C1-PS-09细胞也表达tsA 209大T-抗原。
与亲代hOB-01-C1细胞系不同，hOB-01-C1-PS-09细胞在许可温度的增殖快2-3倍，倍增时间为每2-3天1次(图22A)。然而，同亲代细胞一样，hOB-01-C1-PS-09细胞在非许可温度停止分裂(图22A)。该观察结果表明，尽管细胞已经通过了转捩点成为永生细胞，但它们仍然需要活性T-抗原进行增殖。而且，同亲代细胞系一样，hOB-01-C1-PS-09细胞需要T-抗原失活，以便展现增强的骨细胞表型。碱性磷酸酶和骨钙蛋白是骨细胞谱系的两个重要标志。如图22B所示，当于39℃温育所述细胞时，维生素D3处理上调碱性磷酸酶活性的能力增加了约4倍。而且，如图22C所示，维生素D3在34℃不能诱导所述细胞分泌骨钙蛋白。
然而，当所述细胞于39℃温育时，secosteroid将该骨特异性基质蛋白产量上调11倍。应当指出的是，hOB-01-C1-PS-09细胞表达的碱性磷酸酶基础水平和分泌的骨钙蛋白基础水平与亲代细胞系相似。因此，hOB-01-C1-PS-09细胞在形态学上和生物化学上都类似于亲代hOB-01-C1细胞，因此是研究人前骨细胞生物学的可靠体外模型。
如上所述，根据其高水平表达PTH-1受体mRNA选择用于进一步特征鉴定的hOB-01-C1-PS-09细胞系。如图23所示，于39℃温育所述细胞48小时与在34℃维持的细胞相比，PTH-1受体mRNA的稳态水平增加7倍。因为PTH-1受体表达是成骨细胞/骨细胞分化的标志，所以这还表明所述细胞在非许可温度具有更明确的骨细胞表型。和PTH-1受体表达增强相一致，于39℃预温育hOB-01-C1-PS-09细胞48小时，然后用浓度逐渐增加的人PTH 1-34(hPTH 1-34)于37℃处理10分钟，使胞内环腺苷酸(cAMP)水平产生5-6倍的剂量依赖性增加(图24)。相比之下，于34℃预温育所述细胞没有导致在hPTH1-34处理后接着发生cAMP浓度增加。因此，在tsA-209 T-抗原失活后PTH-1受体表达和反应性都得到增强。此cAMP测定的一个潜在用途是在PTH-1受体表达水平急剧变化的条件下，能够用重要的靶细胞特征鉴定PTH-类似物或PTH-模拟物的活性。
除了维生素D3和PTH之外，hOB-01-C1-PS-09细胞对其它的骨活性药物也有反应例如糖皮质激素和转化生长因子(TGF)-β1。用合成糖皮质激素地塞米松于34℃处理所述细胞使碱性磷酸酶活性上调约2倍(图25)，当于39℃温育所述细胞时这种作用再一次被增强。同样，用重组人(rh)TGF-β1于39℃处理所述细胞导致肝细胞生长因子(HGF)分泌剂量依赖性降低。已经证实HGF起破骨细胞趋化因子的作用，并因此可以在调节骨吸收方面起作用。
骨细胞的一个重要特性是能够对机械感受刺激产生应答，如在负重训练过程中发生的机械感受刺激。体外模拟这种刺激作用的一个方法是使用Flexercell Strain Unit(Flexcell International，Hillsborough，NC)。对于图26所描述的实验，将hOB-01-C1-PS-09细胞接种入胶原蛋白包被的BioFlex I型6孔组织培养板中，并于34℃温育24小时。然后在34℃或39℃在无血清培养基中再温育所述细胞24小时，再后使用FX-3000 Flexercell Strain Unit于37℃施加生理相关性应力(3400μE，2Hz，7200个循环)。应力处理之后，温育所述细胞4.5小时，此时收集条件培养基并分析其存在的一氧化氮(NO)情况。先前已经报导，对啮齿动物和小鸡成骨细胞和骨细胞的体外机械感受刺激或剪切应力刺激NO产生。如图26所示，hOB-01-C1-PS-09细胞的机械感受刺激(即“Flex”)使NO产量增加10-18倍。因此，这些数据表明，该细胞系是研究机械感受刺激的分子机制的有效体外模型。
其它的实验证实，hOB-01-C1-PS-09细胞既可用于瞬时转染研究，也可用于稳定转染研究。可使用Tfx-20脂质转染试剂(Promega，Madison，WI)转染该细胞系。在所述实验中，将所述细胞以不同密度接种入24孔组织培养板中，然后用0.25μg/孔的β-半乳糖苷酶和荧光素酶表达质粒转染(总DNA＝0.5μg/孔)。在34℃或39℃温育48小时后，测定细胞裂解液的β-半乳糖苷酶和荧光素酶活性。该实验的结果证实，不论是β-半乳糖苷酶表达水平，还是荧光素酶表达水平，都随细胞数增加而增加。而且，当为了控制转染效率而将荧光素酶表达对β-半乳糖苷酶表达归一化时，34℃温育的细胞的荧光素酶表达水平高2-3倍。因为荧光素酶表达处于SV-40启动子的控制之下，所以该观测结果与39℃时tsA 209 T-抗原失活一致。因此，因为这些细胞既是永生细胞又能够被转染，所以它们可用于产生人前骨细胞背景的稳定过量表达细胞系。实施例1分离SFRP使用Shiue 1997 Drug Develop.Res.41142-159(整体结合到本文中)描述的RADE(差异表达快速分析)技术鉴定hOB SFRP基因片段。三种hOB细胞系(hOB-03-C5、hOB-03-CE6和hOB-01-C1)代表三个不同的分化期(分别为增殖期、成熟期和前骨细胞)，使用这三种细胞系分离和鉴定SFRP。如前所述建立并培养hOB细胞系(Bodine等，1996J.Bone Miner.Res.11806-819；Bodine等，1996Endocrinology1374592-4604；Bodine等，1997J.Cell.Biochem.65368-387)。这些细胞用温度敏感型猿猴病毒(SV)40大T-抗原永生化，当T-抗原变异体有活性时这些细胞系在许可温度(34℃)表现出转化表型。然而，与骨肉瘤细胞相反(Stein和Lian 1993Endocrine Rev.14424-442)，在T-抗原突变体失活时hOB细胞系在非许可温度(＞37℃)忠实反映了增殖/分化关系。将所述细胞系以约40,000细胞/cm2接种入150mm培养皿中，并于34℃温育过夜，其中所用的生长培养基为含有10％(v/v)热失活胎牛血清(FBS)、1％(v/v)青霉素-链霉素和2mMGlutaMAX-1的D-MEM/F-12。第二天，取出培养基，用磷酸缓冲盐水(PBS)清洗细胞，向培养皿中加入20ml无血清培养基[无酚红的D-MEM/F-12(Gibco/BRL)，含有0.25％(w/v)牛血清白蛋白(BSA，Pentexcrystallized，Bayer)、1％(v/v)青霉素-链霉素、2mM GlutaMAX-1、50mM抗坏血酸-2-磷酸酯(Wako)和10nM甲基萘醌亚硫酸氢钠(维生素K3)]，将所述培养皿于39℃温育24小时。第二天，取出培养基，用20ml含载体(对照)、8nM人甲状旁腺激素1-34(PTH)、100nM前列腺素E2(PGE2)或0.1nM人转化生长因子-β1(TGF-β1)的新鲜无血清培养基于39℃再处理所述细胞24小时。PTH、PGE2和TGF-β1是已知的成骨因子(Whitfield和Morley 1995 Trends Pharmaceut.Sci.16382-386；Lee和Ma 1997 Bone 21297-304；Centrella等，1994 EndocrineRev.1527-39)。在处理期之后，用PBS清洗所述培养皿，使用TRIzol按照生产商(GibcoBRL)的说明由未处理的和处理的细胞分离总细胞RNA。然后用分离的RNA样品如上进行RADE；对受调节的基因片段进行鉴定、克隆和测序。这些实验总共鉴定出82个差异表达的基因。对RADE获得的基因片段进行BLAST(基本局部序列对比检索工具)公共数据库检索；其中一种基因片段与小鼠SFRP-1高度同源。使用以下的引物对在RADE期间鉴定了该基因片段3′末端5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′(HTl1A)(反向引物)和5′末端5′-AAGCTTGATTGCC-3′(H-AP1)(正向引物)，其序列分别示于SEQ IDNO 11和SEQ ID NO 12。通过RNA印迹分析证实与小鼠cDNASFRP-1同源的基因片段的表达和调节。实施例2hOB SFRP的特征鉴定图1概述了RADE结果。在增殖期(hOB-03-C5)hOB细胞系和成熟期(hOB-03-CE6)hOB细胞系中PGE2强烈上调hOB SFRP基因片段(箭头指示)，而在前骨细胞(hOB-01-C1)细胞系中TGF-β1强烈下调hOB SFRP基因片段。而且，该基因的基础表达在前骨细胞中急剧增加，表明hOB SFRP基因表达与成骨细胞分化过程有关。实施例3hOB SFRP基因片段的序列分析对以上实施例1鉴定的含276个碱基对(bp)的hOB SFRP基因片段进行克隆、测序，再对公共数据库进行BLAST检索。检索显示，该基因与先前鉴定的两个其它cDNA同源。序列比对表明，hOB SFRP基因片段与小鼠SFRP-1基因(GeneBankTM登录号#U88566；Rattner等1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942859-2863)的3′末端具有77％的序列同一性。hOB SFRP基因片段还显示与称为卷曲相关蛋白A(FrzA，GeneBankTM登录号#U85945)的相关牛cDNA 3′末端显著同源(87％)。另外，hOB SFRP基因片段与至少三种表达序列标记(EST)非常同源，所述三种表达序列标记为人克隆TM010(GeneBankTM登录号#U54715)、人CA11肿瘤抑制基因(GeneBankTM登录号#U69122)和人类婴儿大脑EST(GeneBankTM登录号#H16753、H16861)。实施例4成骨因子对hOB SFRP的调节作用为了证实不同的成骨因子(即以上实施例1中鉴定的DNA片段)调节hOB SFRP基因表达，用PTH、PGE2和TGF-β1处理hOB细胞系；然后分离RNA进行RNA杂交。结果示于图2-5。如下进行实验。将hOB细胞系接种入150mm培养皿中，如实施例1所述进行处理，不同之处在于使用Oligotex mRNA maxi试剂盒按照生产商(Qiagen)所述由总细胞RNA中分离polyA+RNA。使用切除的RADE hOB SFRP基因片段、克隆的hOB SFRP基因片段或克隆的全长hOB SFRP cDNA作为32P-标记的探针，进行RNA印迹分析(如结合到本文中的Bodine等，1996，J.Bone.Miner.Res.11806-819所述)。这些探针中的每一个在hOB细胞中都检测到4.4-4.6kb的mRNA。将hOB SFRP mRNA的表达对使用相应的32P-DNA探针的甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA或β-肌动蛋白mRNA归一化。用100nM PGE2处理增殖期的hOB-03-C5细胞24小时彻底上调约4.6千碱基对(kb)mRNA的表达(图2)，证明该基因受PGE2调节。当克隆的hOB SFRP基因片段用作探针时，在PGE2处理的细胞中观察到约4.4kb的优势mRNA，证实该mRNA实际上是SFRP基因(图3)。该mRNA的大小相当于人FRP-1/SARP-2基因转录物(Finch等，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 946770-6775；Melkonyan等，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413636-13641)。RNA印迹分析还证实，用PGE2处理成熟期hOB-03-CE6细胞上调hOB SFRP mRNA表达(图4)。另外，在前骨细胞hOB-01-C1细胞中该基因的基础表达升高。在用8nM PTH处理后，该基础水平表达抑制35％。而且，PGE2处理成熟期hOB-03-CE6细胞将SFRP表达水平提高至前骨细胞的基础表达水平，这暗示PGE2在成骨细胞中上调SFRP与细胞分化增强有关。最后，用100pMTGF-β1处理前骨细胞hOB-01-C1细胞24小时对hOB SFRP mRNA的水平产生80％的抑制(图5)。
为证实hOB SFRP mRNA水平随着细胞分化增加而改变，由前成骨细胞hOB-03-C5细胞、成熟成骨细胞hOB-03-CE6细胞、前骨细胞hOB-01-C1细胞和成熟骨细胞hOB-05-T1细胞中分离总RNA。然后通过TaqMan定量RT-PCR检测基础SFRP mRNA水平。当与hOB-03-C5细胞相比时，hOB-03-CE6细胞中的基础SFRP mRNA水平增加约4倍，而hOB-01-C1细胞中的基础SFRP mRNA水平增加约23倍。在另一方面，hOB-05-T1细胞中的SFRP mRNA水平下降至约0.5倍。因此，在成骨细胞谱系的细胞中，前骨细胞似乎表达最高水平的hOB SFRP mRNA。实施例5hOB SFRP的表达动力学如实施例1所述，将增殖的hOB-03-C5细胞接种入150mm培养皿中，并用浓度逐渐增加的PGE2处理24小时或用100nM PGE2处理不同时间长度。用切除的276bp的RADE hOB SFRP基因片段或克隆的1.1kb hOB SFRP基因片段作为32P-标记探针，对PolyA+RNA进行RNA印迹分析。用浓度逐渐增加的PGE2处理增殖期hOB-03-C5细胞以剂量依赖方式上调hOB SFRP mRNA表达，EC50约为8nM。同样，用浓度逐渐增加的PGE2处理成熟hOB-03-CE6细胞也以剂量依赖方式上调hOB SFRP mRNA水平，但是该反应的PGE2EC50比hOB-03-C5细胞约高10倍。
用100nM PGE2处理hOB-03-C5细胞2-24小时以时间依赖方式上调hOB SFRP mRNA表达。在处理2-4小时后观察到SFRP基因表达明显增加，在向细胞培养基加入PGE2后稳态mRNA水平持续增加长达24小时。这些结果提示，SFRP可能是一种对PGe2处理hOB细胞延迟响应的基因，并暗示其可能处于另一种基因产物的次级控制之下。用成熟hOB-03-CE6细胞也获得相似的结果，不过hOB SFRPmRNA表达的增加倍数没有在hOB-03-C5细胞中高。
以相似的方式将hOB-01-C1细胞接种入100mm培养皿中，并用浓度逐渐增加的TGF-β1处理24小时。然后由所述细胞中分离总RNA，并通过TaqMan定量RT-PCR检测hOB SFRP mRNA。TGF-β1以剂量依赖方式对SFRP基因表达产生约70％的抑制，IC50约为4pM。
除了PGE2之外，用白介素(IL)-1β、9-顺-视黄酸或全-反-视黄酸处理hOB-03-C5细胞或hOB-03-CE6细胞也增加hOB SFRP mRNA水平。另一方面，与TGF-β1一样，用PTH、骨形态发生蛋白(BMP)-2、胰岛素样生长因子(IGF)-1、17β-雌二醇(17β-E2)、维生素D3(VD3)、地塞米松(Dex)或胎牛血清(FBS)处理各种hOB细胞系，它们抑制hOBSFRP mRNA表达。总之，在这些不同因子增加或减少hOB SFRP表达的能力和它们增强或抑制成骨细胞/骨细胞凋亡的能力之间存在着良好的(虽然不完美)关联(参见例如Manolagas 2000 Endocrine Reviews115-137)。实施例6hOB SFRP的组织分布为了确定hOB SFRP基因表达的组织分布，如实施例4所述用切除的RADE hOB SFRP基因片段探测多种人组织poly(A)+RNA的RNA印迹(得自Clonetech)。当使用所述RADE片段探测poly(A)+RNA的RNA印迹时，几个组织表达约4.4kb的转录物(图6)。当这些结果对β-肌动蛋白归一化时，SFRP表达排列如下肾脏＞心脏＞胎盘＞肝脏＝骨骼肌＝胃＝甲状腺＞肾上腺＝睾丸＝子宫＝小肠＝胰腺＝大脑＞气管＝脊髓＝前列腺＝结肠＞脾脏＞肺＝淋巴结＝骨髓；在胸腺和外周血淋巴细胞中未观测到表达。该表达模式与人FRP-1/SARP-2基因类似(Finch等，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 946770-6775；Melkonyan等，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413636-13641)。实施例7SFRP在成骨细胞中的分布除了最初鉴定出SFRP的hOB细胞系以外，检测其它的体外人成骨细胞模型该基因的存在情况。由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得SaOS-2人骨肉瘤成骨细胞样细胞，并将其在含10％FBS、1％(v/v)青霉素-链霉素和2mM GlutaMAX-1的McCoy 5A改良型培养基中于37℃进行培养。同样，如前所述(Bodine等，1996 J.Bone.Miner.Res.11806-819，通过引用结合到本文中)由网状骨碎片建立正常人成骨细胞(hOB)的外植块培养物。然后如实施例1和4所述将所述细胞接种入150mm培养皿中并进行处理，不同之处在于所述细胞于37℃而不是39℃进行温育。使用32P-标记的克隆的1.1kb hOB SFRP基因片段对polyA+RNA进行RNA印迹分析。SaOS-2细胞表达相对低基础水平的SFRP mRNA，其不受PTH、PGE2或TGF-β1处理的调节(图7)。在这些细胞中由于表达水平低而难以量化所述基因的表达。相反，正常hOB细胞表达较高基础水平的SFRP mRNA，而用100nM PGE2处理所述细胞24小时似乎轻微上调所述mRNA的稳态水平(约1.3倍)。对这些RNA样品的TaqMan定量RT-PCR分析表明，PGE2在hOB细胞中上调SFRP 10倍。由于在骨肉瘤细胞中的低基础水平表达，这些细胞可能不是令人满意的研究SFRP基因调节的体外模型。因为所述基因在培养的正常人成骨细胞中表达并受PGE2调控，所以本发明描述的hOB细胞系已证实可用于体外成骨细胞模型。分离自人骨巨细胞瘤的总RNA的RNA印迹分析和RT-PCT在该组织中未能检测出hOB SFRP mRNA表达。这些结果表明，破骨细胞样细胞可能不表达所述基因。实施例8分离全长hOB SFRP cDNA因为得自RADE的克隆hOB SFRP基因片段与几种人类EST相同，所以进行EST数据库分析，以便装配hOB基因的全长cDNA，该分析表明，hOB SFRP实际上是已知的人类基因FRP-1(也叫做分泌型凋亡相关蛋白-2或SARP-2)。根据该分析以及小鼠SFRP-1基因与人FRP-1基因和人SARP-2基因明显同源的观察结果(Rattner等，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942859-2863；Finch等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 946770-6775；Melkonyan等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413636-13641)，设计一种基于RT-PCR的策略，以便由人胎盘RNA和PGE2处理的hOB-03-CE6细胞RNA获得全长的1.1kb hOBSFRP cDNA。使用1μg总RNA、跨越hFRP-1/SARP-2编码区的引物(正向引物5′-GCTGGGGACTGCGCCTTTTGT-3′，SEQ ID NO 13；反向引物5′-CCTGCCCCCGGGAGAATCACTTA-3′，SEQ ID NO14)、35个循环的PCR和Advantage-GC PCR试剂盒(Clonetech)，按照生产商的说明进行RT-PCR。为了检测mRNA的表达，使用与hFRP-1/hSARP-2编码区的碱基501-530特异性杂交的32P-寡核苷酸探针，用RT-PCR产物进行DNA印迹分析(参阅Bodine等1997 J.Cell.Biochem.65368-387中关于RT-PCR和DNA杂交的实验详述)。分离全长1.1kb hOB SFRP cDNA，用100nM PGE2处理hOB-03-CE6细胞24小时使其上调(图8)。同样，分离自PGE2处理的hOB-03-C5细胞的总RNA的RT-PCR鉴定出2.2kb的cDNA，其由hFRP-1/SARP-2cDNA的5′-区横跨至3′-末端的276bp的RADE片段。将这些cDNA片段克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)哺乳动物表达载体(1.1kb cDNA)或TA(Invitrogen)克隆载体(2.2kb cDNA)，并测序。hOB SFRP 1.1kb(SEQ.ID.NO.1)和2.2kb cDNA的序列分析使2.6kb cDNA的装配成为可能，所述2.6kb cDNA包括5′-末端的转录起始位点和3′-末端的RADE片段。使用1.1kb cDNA对公共数据库进行BLAST检索显示，其与人FRP-1/SARP-2基本上相同。SFRP cDNA编码区的推断氨基酸序列示于SEQ.ID.NO.2。该序列含有的一个氨基酸与已公开的人SARP-2序列不同174的丙氨酸代替了该位置的脯氨酸(Melkonyan等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413636-13641)。实施例9hOB凋亡活性的特征鉴定因为克隆的全长hOB SFRP基因与人SFRP-1/FRP-1/SARP-2相同，所以研究了该基因在hOB中的生物作用，以确定该基因产物是否调节hOB细胞存活力和Wnt信号转导(图9-16)。
如图9所示，将hOB细胞以200,000细胞/孔接种入6孔培养板中，并于34℃培养。第二天，将一组培养板用PBS清洗，胰蛋白酶消化，如前所述(Bodine等，1996 J.Bone Miner.Res.11806-819，通过引用结合到本文中)用Coulter Multisizer测定基线细胞数(和平均细胞体积)。将另一组培养板置于39℃的非许可温度，6天后测定细胞数(第3天更换培养基)。处于成骨细胞分化增殖期的hOB-03-C5细胞于39℃缓慢分裂，6天后细胞数增加60-80％；这种细胞分裂速率类似于正常hOB细胞的扩增培养(Bodine等，1996 Endocrinology 1374592-4604)。相反，成熟期hOB-03-CE6细胞在非许可温度停止分裂并且细胞数保持恒定，而前骨细胞hOB-01-C1细胞在39℃缓慢死亡，使得6天后存活的细胞少于40％。如前所述，SARP-2在MCF-7乳癌细胞中的过量表达加速了细胞死亡速率。与此观测结果相一致，如图1、4和5所示，与增殖期hOB-03-C5细胞系和成熟期hOB-03-CE6细胞系相比，前骨细胞hOB-01-C1细胞中的基础SFRP-1/FRP-1/SARP-2mRNA表达急剧增加。
接下来验证下面的假说SFRP-1/FRP-1/SARP-2基因表达上调加速hOB细胞死亡，而SFRP-1/FRP-1/SARP-2基因表达下调抑制细胞死亡。这些结果示于图10。用生长培养基将hOB-03-C5细胞、hOB-03-CE6细胞或hOB-01-C1细胞以200,000细胞/孔接种入6孔培养板中，并于34℃过夜培养。第二天，用PBS清洗所述6孔培养板，加入BSA培养基，在存在或不存在100nM PGE2(为了上调SFRP-1/FRP-1/SARP-2稳态mRNA水平；图A和B)或0.01-1.0nM TGF-β1(为了下调SFRP-1/FRP-1/SARP-2 mRNA水平；图C)的情况下于39℃进行处理。诱导凋亡的常用方法是在无血清培养基中培养细胞(Melkonyan等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413636-13641)，在这些条件下hOB-03-C5细胞系、hOB-03-CE6细胞系和hOB-01-C1细胞系都停止分裂并逐渐死亡。然而，当用PGE2处理hOB-03-C5细胞和hOB-03-CE6细胞时细胞死亡速率明显加快，使得处理6天后存活的细胞降低超过40％。相反，用TGF-β1处理hOB-01-C1细胞以剂量依赖方式增加细胞存活力约2倍。用PGE2处理所述细胞不仅加速细胞死亡，而且将平均细胞体积显著降低10-20％。此观测结果与已知导致胞质小囊泡形成、水丢失和细胞体积减小的凋亡诱导一致(Mesner和Kaufmann 1997，Advances in Pharmacology，41卷，57-88页)。与凋亡诱导还一致的是，PGE2处理hOB-03-C5细胞导致产生组蛋白相关性DNA片段。最后，据流式细胞仪检测，用PGE2处理hOB-03-C5细胞增加结合所述细胞的膜联蛋白V(凋亡的一种特异性标志)(图11)。实施例10细胞死亡诱导的逆转在图12中用hOB-03-C5细胞和hOB-03-CE6细胞证实了使用SFRP-1/FRP-1/SARP-2反义寡核苷酸逆转细胞死亡。以同图10描述的实验类似的方式进行这些实验。但是，对于这些实验，在存在或不存在人SARP-2的有义(对照)或反义的定向起始位点的硫代磷酸寡核苷酸的情况下，用载体对照(即0.1％乙醇)或PGE2共处理所述细胞。结果以相对于第0天对照(即6孔培养板每孔约200,000细胞)的百分率或以相对于载体处理对照的百分率表示。该实验的结果表明，用SARP-2的反义寡核苷酸共处理hOB细胞逆转了PGE2加速细胞死亡速率的能力，而用有义(对照)寡核苷酸共处理对该过程没有影响。另外，用PGE2和SARP-2的抗肽抗体共处理所述细胞阻断了PGE2诱导hOB细胞死亡的能力。人SFRP-1/SARP-2的有义和反义寡核苷酸的序列如下有义寡核苷酸5′-GGCATGGGCATCGGGCGC-3′(SEQ ID NO.15)反义寡核苷酸5′-GCGCCCGATGCCCATGCC-3′(SEQ ID NO.16)实施例11SFRP过量表达加速hOB细胞死亡图13显示了使用Coulter细胞计数仪的hOB-01-C1-PS-09细胞的细胞存活力实验结果。对于这些实验，用hOB SFRP cDNA(即SFRP-1/FRP-1/SARP-2)哺乳动物表达质粒或空载体(即pcDNA3.1，得自Invitrogen，Carlsbad，CA)稳定转染所述细胞。使用标准克隆技术(参阅Ausubel等，1997 Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley{New York})。结果以第0天对照细胞的百分率表示。该实验的结果表明，hOB细胞过量表达SFRP-1/FRP-1/SARP-2加速了细胞死亡速率，相比之下空载体对该过程没有影响。分离自空载体(v)或SFRP(S)表达细胞的总RNA的RNA印迹放射自显影表明，hOB细胞如所预期的一样过量表达SFRP基因。另外，TaqMan定量Rt-PCR分析表明，SFRP过量表达细胞表达的SFRP mRNA比空载体表达细胞高5-6倍。
为了提高SFRP-1/FRP-1/SARP-2诱导的细胞死亡速率，亚克隆并特征鉴定了过量表达hOB-01-C1-PS-09(图14)。TaqMan定量RT-PCR分析表明，一个亚克隆(SARP-2克隆#1)表达的SFRP-1/FRP-1/SARP-2 mRNA比pcDNA3.1(空载体)表达细胞高50-60倍。同样，与空载体表达细胞(t1/2＝～120小时)相比，BSA培养基中的SARP-2克隆#1细胞的死亡速率极大加快(t1/2＝39.2小时)。实施例12hOB SFRP对Wnt活性的作用为了测定SFRP-1/FRP-1/SARP-2基因表达上调是否对Wnt信号转导途径产生拮抗，用PGE2处理hOB-03-CE6细胞，并用β-连环蛋白单克隆抗体探测产生的细胞。Wnt蛋白在细胞中的过量表达上调被称为β-连环蛋白的信号转导蛋白(参见综述Moon等，1997 Cell 88725-728；Barth等，1997 Curr.Opin.Cell Biol.9683-690；和Nusse 1997Cell 89321-323)。而且，SFRP-1/FRP-1/SARP-2在MCF-7细胞中的过量表达下调β-连环蛋白水平，这与拮抗Wnt活性一致(Melkonyan等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413636-13641)。因此，如实施例1所述平板接种hOB-03-CE6细胞并用PGE2处理，例外之处在于提取总细胞蛋白并如前所述(Bodine等，1996 Endocrinology 1374592-4604；Melkonyan等，1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413636-13641)使用抗所述蛋白的单克隆抗体(Transduction Laboratories)对β-连环蛋白进行蛋白质印迹分析。与上调SFRP-1/FRP-1/SARP-2稳态mRNA水平相一致，用100nM PGE2处理hOB-03-CE6细胞24小时下调β-连环蛋白水平，表明拮抗Wnt活性(图15)。另外，将SFRP-1/FRP-1/SARP-2 cDNA共转染入hOB-01-C1-PS-09细胞或hOB-02-C1-PS-02细胞下调TCF-荧光素酶表达，TCF-荧光素酶表达是检测Wnt信号转导活性和β-连环蛋白核活性的可靠依据(图16)(例如Bafico等，1999 J.Biol.Chem.27416180-16187)。人和大鼠的SFRP-1/FRP-1/SARP-2以及人Frzb-1/FrzB/Fritz都抑制hOB细胞的TCF-荧光素酶活性。
总而言之，这些观测结果表明，Wnt蛋白延长了人成骨细胞的体外寿命，而SFRP-1/FRP-1/SARP-2对Wnt信号转导的拮抗促进成骨细胞死亡。因此，SFRP-1/FRP-1/SARP-2功能抑制剂可增强成骨细胞/前骨细胞存活，并因此增强体内骨形成。
我们使用几种鉴定hOB细胞Wnt表达的方法(例如RT-PCR、基因芯片分析和cDNA克隆)证实，这些细胞系在不同程度上表达Wnt-2B/13、-3、-4、-5A和-11。这些Wnt中的任一种或全部都可能参与延长hOB细胞生命。Wnt-2B/13也称作Wnt-x。实施例13hOB SFRP 在合成代高谢药物筛选方法中的应用设计了一种使用SFRP筛选骨合成代谢药物的新型模式。如图17所示意，该筛选模式使用hOB细胞和SFRP-1/FRP-1/SARP-2鉴定能够防止或延缓成骨细胞死亡的化合物。这样的化合物对SFRP-1/FRP-1/SARP-2加速hOB细胞死亡的能力起阻断作用。这些化合物结合SFRP-1/FRP-1/SARP-2，并防止其结合Wnt蛋白，或者它们可结合Wnt并防止其结合SFRP-1/FRP-1/SARP-2。如果SFRP-1/FRP-1/SARP-2具有与Wnt结合无关的活性(例如结合细胞表面受体)，那么这些化合物同样也可以起防止这种Wnt无关型功能的作用。
对于图17示意的筛选模式的初始测定，将化合物与hOB细胞系和SFRP-1/FRP-1/SARP-2温育。该测定可使用纯化的或部分纯化的SFRP-1/FRP-1/SARP-2蛋白，或包含SFRP-1/FRP-1/SARP-2的条件培养基或细胞提取物。hOB细胞系可以是一个天然表达高基础水平SFRP-1/FRP-1/SARP-2的细胞系(例如hOB-01-C1细胞)、瞬时或稳定过量表达SFRP-1/FRP-1/SARP-2的细胞系(例如hOB-01-C1-PS-09细胞)或者以条件方式稳定或天然表达SFRP-1/FRP-1/SARP-2的细胞系(例如PGE2处理的hOB-03-C5细胞)。作为对hOB细胞死亡的检测，可使用定量细胞数的测定(例如MTT或MTS染色转换或CyQuantDNA荧光)或定量凋亡的测定(例如DNA片段化或膜联蛋白V结合)。CyQuant试剂盒购自Molecular Probes(Eugene，OR)。
图18描述了一个SFRP-1/FRP-1/SARP-2抑制剂高通量筛选测定(HTS)的实例。对于该测定，将空载体(pcDNA3.1)或稳定过量表达SFRP-1/FRP-1/SARP-2(SARP-2#1)的hOB-01-C1-PS-09细胞以5000细胞/孔接种入使用生长培养基的96孔平板中。于34℃短暂温育6小时后，用PBS清洗各孔，并在BSA培养基中于39℃温育3天。在温育结束时，再用PBS清洗各孔，然后使用CyQuant DNA荧光测定(Molecular Probes)测定DNA含量。当与空载体细胞相比时，SARP-2过量表达细胞于39℃死亡得更快，使得3天后，仅有20-30％的细胞仍存活。相反，50-60％的空载体细胞在温育中存活。当用针对SFRP-1/FRP-1/SARP-2的氨基酸217-231产生的抗肽抗血清(AS)处理SARP-2过量表达细胞时，50-60％的细胞在3天后存活。这表明，抑制SFRP-1/FRP-1/SARP-2蛋白功能防止其加速hOB细胞死亡。作为对照的免疫前血清对SARP-2过量表达细胞没有作用，而无论是免疫前血清还是免疫血清对空载体表达细胞都没有作用。
然后，将阻断SFRP-1/FRP-1/SARP-2诱导的hOB细胞死亡的化合物进行另外的体外测定中。这些测定检测这些化合物以SFRP-1/FRP-1/SARP-2依赖性或非依赖性方式阻断hOB细胞死亡的能力，而且还就这些作用测定这些化合物的能力和效力。设计另外的测定，以检测这些化合物对这些作用的细胞选择性(例如，使用MCF-7细胞或其它细胞)以及这些化合物对SFRP-1/FRP-1/SARP-2与SFRP/SARP家族其它成员(例如FrzB/Fritz、SARP-1或SARP-3)的特异性。其它的测定也可以用于检测这些化合物是否调节涉及凋亡(例如caspase活性)或Wnt活性(例如TCF-荧光素酶测定的β-连环蛋白水平和功能)的下游信号转导事件。最后，则将在这些体外测定中具有合适活性的化合物用于骨形成、骨质减少或骨质疏松的各种动物模型(例如切除卵巢的大鼠或小鼠)。人们认为抑制成骨细胞/骨细胞凋亡的化合物是骨合成代谢药物，其延长这些细胞的生命，并因此增加合成和矿化的骨基质量和/或保持骨的完整性。
显然，可以不同于前述说明和实施例具体描述的方式来实施本发明。按照以上指导可对本发明进行各种修改和变化，它们因此属于所附权利要求书的范围。实施例14SFRP-1基因敲除小鼠的创建和使用如实施例13所述，抑制成骨细胞/骨细胞凋亡的化合物是令人信服的骨合成代谢药物，其延长这些细胞的生命，并因此增加合成和矿化的骨基质的量和/或保持骨的完整性。为了验证这种假说并测定SFRP-1/FRP-1/SARP-2是否影响骨骼，制备SFRP-1阴性(SFRPneg)小鼠(参见Wattler等，1999，BioTechniques 261150-1160)。由小鼠中去除SFRP-1/FRP-1/SARP-2基因类似于用药物抑制其功能，这个方法允许我们证实该基因/蛋白为骨质疏松的潜在药物靶。
如图19所概述，通过用β-半乳糖苷酶报道基因/新霉素药物抗性基因表达盒取代小鼠SFRP-1基因的外显子1，产生SFRP-1基因敲除小鼠。如图20所示，分离自雌性或雄性小鼠肾脏(16-18周龄)的polyA+RNA的RNA印迹分析显示，SFRP-1mRNA(4.4kb)在野生型(WT)对照小鼠中高水平表达，但在基因敲除(KO)小鼠中基因表达完全消失。
如图21所示，使用微型计算机X射线断层显象(micro-CT)特征鉴定雄性和雌性野生型对照(+/+)和基因敲除(-/-)小鼠的远端股骨的小梁骨结构(关于该技术的综述，参见Genant等，1999 Bone 25149-152和Odgaard 1997 Bone 20315-328)。在20周龄雄性小鼠中(图A)，-/-小鼠与+/+对照小鼠相比，小梁骨体积(BV/TV)高出31％，小梁厚度(Tb.Th.)增加8％。在26-27周龄雌性小鼠中(图B)，-/-小鼠与+/+对照小鼠相比，小梁接合密度(Conn.Den.)增加91％，小梁数(Tb.N.)增加16％，而小梁间距(Tb.Sp.)降低16％。因此，支持我们假说的这些结果证明，小鼠缺失SFRP-1基因导致小梁骨形成参数提高(P.J.Meunier 1995骨组织形态学，载于骨质疏松病因学、诊断和治疗，第二版，B.L Riggs和L.J.MeltonIII编著，Lippincott-Raven，Philadelphia，第299-318页)。
权利要求
1.一种调节哺乳动物成骨活性的药用组合物，该药用组合物包含至少一种以下组分(i)分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)或其调节作用部分；(ii)所述蛋白或其部分形成的抗体；(iii)编码(i)或(ii)的核酸；以及(iv)(iii)中任何一种核酸的反义核酸。
2.按照权利要求1的药用组合物，其中所述SFRP得自人成骨细胞。
3.按照权利要求1的药用组合物，其中所述成骨活性是调节骨生长。
4.按照权利要求1的药用组合物，其中所述成骨活性是调节骨密度。
5.按照权利要求1-3的药用组合物，其中所述SFRP具有SED IDNO2显示的氨基酸序列。
6.一种治疗哺乳动物骨疾病的方法，该方法包括给予 1-5的药用组合物的步骤。
7.权利要求6的治疗骨疾病的方法，其中所述疾病包括(a)骨形成疾病；(b)骨吸收疾病和(c)骨密度疾病。
8.权利要求6的方法，其中所述疾病为退行性骨疾病。
9.权利要求8的方法，其中所述退行性骨疾病选自神经退行性疾病、肌退行性疾病和骨退行性疾病。
10.权利要求9的方法，其中所述骨退行性疾病选自骨质减少、骨关节炎、骨质疏松。
11.权利要求6的方法，其中所述哺乳动物为人。
12.一种鉴定调节SFRP活性的受试化合物的方法，所述化合物调节哺乳动物的成骨活性，所述方法包括(a)在含所述受试化合物的测试介质中温育含SFRP的样品；(b)测定SFRP活性，其中相对于单独SFRP活性增加表明所述化合物为SFRP激活剂，而活性降低表明所述化合物为SFRP抑制剂。
13.一种调节Wnt-介导的细胞信号转导的方法，该方法包括使所述细胞与权利要求1-5的SFRP接触，其中所述Wnt活性受到调节。
14.权利要求13的调节Wnt-介导的信号转导的方法，其中所述SFRP具有SEQ ID NO2显示的氨基酸序列。
15.一种促进骨细胞培养物骨形成或骨修复的方法，该方法包括由骨培养物中分离所述细胞，引入表达编码具有SEQ ID NO2显示的氨基酸序列的SFRP的核苷酸序列的反义序列的重组构建物，再将所述细胞返回到所述骨培养物中。
16.一种多核苷酸探针，它能够与具有SEQ ID NO1显示的核酸序列的多核苷酸杂交。
17.一种检测得自哺乳动物宿主的样品中的SFRP多核苷酸的诊断方法，该方法包括使用权利要求16的探针检测所述样品中是否存在SFRP。
18.权利要求1的药用组合物，其中所述组合物包含可接受的载体或稀释剂。
19.一种调节哺乳动物成骨活性的组合物，该组合物包括至少一种针对分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)或其调节作用部分的抗体。
20.权利要求19的药用组合物，其中所述组合物包含可接受的载体或稀释剂。
21.权利要求19的药用组合物，其中所述抗体针对SFRP蛋白的至少8个连续氨基酸。
22.权利要求19的药用组合物，其中所述抗体针对SFRP蛋白的至少10个连续氨基酸。
23.权利要求19的药用组合物，其中所述抗体针对SEQ ID NO2的SFRP蛋白的至少氨基酸217-231。
24.按照权利要求1-4和18-21的药用组合物，其中所述SFRP具有通过表达SEQ ID NO1显示的多核苷酸序列获得的氨基酸序列。
25.一种鉴定调节SFRP活性的受试化合物的方法，所述化合物调节哺乳动物成骨活性，所述方法包括(a)比较样品对SFRPneg动物的活性和没有所述样品的活性，其中SFRP相关性活性升高和降低说明所述化合物是SFRP活性的调节剂。
26.一种表达猿猴病毒40大T蛋白抗原的温度敏感型突变体的永生化人成骨(hOB)细胞，其中当所述T-抗原突变体有活性时，所述细胞在约34℃下增殖，但在超过约37℃的温度下不增殖。
27.权利要求26的hOB细胞，它表达编码多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸编码SFRP或其片段。
28.权利要求26的hOB细胞，其中所述hOB为hOB-01-C1-PS-09细胞或其后代，hOB-01-C1-PS-09细胞保藏于美国典型培养物保藏中心，Manassas，Va，保藏号为PTA-785。
29.一种包含权利要求26的hOB细胞的纯系细胞群。
全文摘要
公开了用于调节SFRP(分泌型卷曲相关蛋白)的哺乳动物成骨活性的药用组合物和方法。SFRP是Wnt的分泌型受体,Wnt是已知调节基本生物过程(例如组织极性、胚胎发育和肿瘤发生)的重要多肽生长因子。在人成骨细胞中分离出SFRP,并鉴定为SFRP－1(也称作SARP－2),证实其在HOB细胞中以调节成骨细胞/前骨细胞生命的差异选择方式受成骨因子调节。
文档编号A61P19/08GK1387537SQ00815431
公开日2002年12月25日 申请日期2000年9月13日 优先权日1999年9月13日
发明者P·V·N·波蒂尼 申请人:惠氏公司