利用rnf43突变状态选择wnt信号转导抑制剂给药的癌症患者的制作方法

利用rnf43突变状态选择wnt信号转导抑制剂给药的癌症患者的制作方法
【专利摘要】公开了用于确定预计将受益于Wnt拮抗剂的治疗性给药的癌症患者的生物标志物、方法和检测。生物标志物包括RNF43和ZNRF3基因缺失、降低的RNF43和ZNRF3mRNA表达、降低的RNF43和ZNRF3蛋白表达、RNF43和ZNRF3失活突变、磷酸化LRP6、磷酸化蓬乱、和卷曲蛋白表达的检测。这些生物标志物可以与用Wnt通路抑制剂治疗的癌症患者的更好结果相关。
【专利说明】利用RNF43突变状态选择WNT信号转导抑制剂给药的癌症 患者 优先权.声明
[0001] 本申请要求2012年2月28日提交的美国临时专利申请序列号61/604, 290的优 先权。

【技术领域】
[0002] 本发明总体上涉及包含用于肿瘤细胞或癌细胞检测的细胞膜结合抗原或细胞膜 结合受体的测量或测试方法及其组合物或测试条，具体地本发明涉及鉴定预计将受益于 Wnt抑制剂治疗的癌症患者。本发明还涉及一种用于特别选择的患者的Wnt抑制剂或者包 含该Wnt抑制剂的药物组合物。

【背景技术】
[0003] 在生物学和医学中，经典Wnt/P-连环蛋白（P-catenin)通路是一系列的细胞内 信号转导事件，这些事件涉及到分泌的Wnt配体、细胞表面受体和转录共激活因子P -连环 蛋白、以及这些核心蛋白成分的许多其他效应物和调节物。在fct配体不存在的情况下， ￠-连环蛋白常常被引起其多链泛素化（poly-ubiquitination)和蛋白酶体降解的多蛋白 复合体磷酸化。当Wnt蛋白结合到其受体时，细胞质￠-连环蛋白通过对破坏复合体的抑 制而被稳定，并且转位到细胞核而激活fct靶基因的转录。
[0004] 用于Wnts的一级受体是卷曲（Frizzled,FZD)家族的蛋白质，以LRP5或LRP6(LDL 受体相关蛋白5和6)作为Wnt/P-连环蛋白信号转导的必需辅助受体。Nusse R(2005)， Cell Research 15(1) :28-32。卷曲受体是具有长半胱氨酸富集区的七次跨膜分子。LRP5/6 辅助受体是单次跨膜蛋白。Huang H-C 和 Klein PS (2004) Genome Biol. 5 (7): 234。与 LRP5 相比LRP6占优势，LRP5只是成人骨稳态所必需的。McDonald BT等人（2009)Developmental celll7(l):9-26。
[0005] 非经典Wnt信号转导是0 -连环蛋白依赖性的。卷曲受体（Frizzled receptors) 参与非经典Wnt信号转导，但LRP6辅助受体对于非经典通路活动则不是必需的。存在至少 两个非经典Wnt信号转导通路：平面细胞极性（PCP)通路、和Wnt钙释放通路。
[0006] 在胚胎发育期间，Wnt/P-连环蛋白信号转导对于细胞生长和分化的调节而言是 重要的。在成年人中，fct信号转导促进组织稳态并且其调节异常与多种人类疾病（特别 是癌症）有关。Nusse R(2005)Cell Research 15(1):28-32。
[0007] Wnt通路的异常过度激活常常对于结直肠癌的肿瘤发生而言是重要的。还已证明 其他类型癌症与异常fct信号转导有关。这些其他类型癌症包括胰腺癌、肝癌、乳腺癌和皮 肤癌。Wnt/PCP非经典通路中的提高的活性也与肿瘤发生有关。
[0008] 现已开发出用于治疗Wnt依赖性肿瘤的Wnt信号转导拮抗剂。许多Wnt抑制剂例 如Porcupine抑制剂、端锚聚合酶（tankyrase)抑制剂、卷曲抗体（Frizzled antibodies) 和LRP6抗体，正被开发用于癌症治疗。然而，这些Wnt抑制剂中的大部分是将Wnt信号转 导通路的上游蛋白成分作为标靶。这些fct抑制剂将不会抑制带有Wnt通路下游基因突 变的肿瘤中的fct信号转导，因此常常不能有效地对抗带有存在于Wnt通路下游基因例如 APC (腺瘤性结肠息肉病）、AXINl/2、和P -连环蛋白中的致癌突变的肿瘤。
[0009] 被确定为带有Wnt通路上游基因突变的肿瘤的缺乏已阻碍了 Wnt抑制剂的临床开 发。因此，本领域中需要fct通路上游成分的基因或基因产物中的癌症相关Wnt通路突变 的鉴定方法。


【发明内容】

[0010] 本发明提供两种同源跨膜E3泛素连接酶（RNF43和ZNRF3)的诊断用途，这两种酶 通过卷曲泛素化而负向调节fct受体复合体卷曲蛋白/LRP6水平。在一个方面，本发明提 供RNF43基因或ZNRF3基因中的失活突变作为生物标志物用于选择对于因Wnt通路抑制剂 而使其生长减缓敏感的肿瘤细胞的用途。在另一方面，本发明提供对用fct抑制剂进行治 疗的癌症患者的选择，其中该选择通过将RNF43或ZNRF3基因中的失活突变用作对Wnt抑 制剂治疗具有易感性的肿瘤的生物标志物而实现。在一个具体方面，本发明提出RNF43失 活突变（例如错义突变和移码突变）存在于胰腺导管腺癌（PDAC)的原发性肿瘤和细胞系 中。因为内源性野生型RNF43调节PDAC细胞中的Wnt信号转导并且对PDAC中内源性RNF43 的抑制提高卷曲蛋白水平和fct信号转导，所以本发明提供对在癌症中正发生突变的上游 fct通路成分（RNF43)的鉴定。
[0011] 本发明还表明带有RNF43基因突变的癌细胞对Wnt通路抑制更加敏感。对癌细胞 中RNF43的抑制导致卷曲蛋白的细胞表面水平提高。因此，增强的Wnt信号转导和具有突 变RNF43的癌细胞（尤其是胰腺癌细胞）对Wnt拮抗剂更加敏感。因此，本发明提出RNF43 突变状态可被用作治疗性给药fct信号转导抑制剂的癌症患者选择方案。
[0012] fct抑制剂可用于人用或兽用的药物组合物，其中，例如，在对肿瘤或异常细胞生 长的治疗中，显示对fct通路的抑制。本发明提供一种用Wnt抑制剂治疗癌症患者的方法， 包括向已被检测为带有对fct抑制剂显示敏感性的生物标志物的患者施用Wnt抑制剂或包 含Wnt抑制剂的药物组合物。例如，可以利用DNA测序方法来测试患者样品中对Wnt抑制 剂显示敏感性的RNF43突变或ZNRF3突变的存在。可替代地，可以测试患者样品中RNF43 基因表达、RNF43蛋白表达、ZNRF3基因表达、ZNRF3蛋白表达或另一种生物标志物的水平， 其中患者的生物标志物水平在统计学上类似于或小于已与对fct抑制剂的敏感性相关联 的生物标志物对照水平，或者如果患者肿瘤细胞中的生物标志物水平在统计学上类似于已 与对Wnt抑制剂的敏感性相关联的生物标志物水平。对照水平可以是生物标志物的正常水 平或基线水平、健康细胞或组织样品中的生物标志物水平、或者已与对Wnt抑制剂的耐受 性相关联的生物标志物对照水平。
[0013] Wnt抑制剂或者包含Wnt抑制剂的药物组合物可用于患者治疗,其中患者的生物 标志物水平与对fct抑制剂的敏感性相关联。在一个【具体实施方式】中，Wnt抑制剂或者包 含Wnt抑制剂的组合物意欲于患者患有癌症时使用。
[0014] ZNRF3和RNF43是功能性同系物，并且ZNRF3也在特定类型的肿瘤中发生突变。因 此，ZNRF3的突变状态也是对用Wnt拮抗剂进行治疗性给药的癌症患者选择的提示。
[0015] 在一种实施方式中，本发明提供一种用于选择预计将受益于或者不受益于fct抑 制剂治疗性给药的癌症患者的方法。该方法包括以下步骤： (a) 检测取自患者的肿瘤细胞样品中的生物标志物水平，其中该生物标志物可以是： (i )用于确定杂合性丢失的在RNF43染色体区域或者在ZNRF3染色体区域的检测到的 DNA拷贝数；（ii )用于检测RNF43基因或ZNRF3基因中的失活突变的、取自癌症组织的经 测序的基因组DNA、cDNA或RNA ; ( iii )测量RNF43mRNA表达或ZNRF3mRNA表达的检测结果； (iv )测量RNF43蛋白表达或ZNRF3蛋白表达的检测结果；（V )RNF43基因丢失或ZNRF3 基因丢失的功能性作用；或者（vi )生物标志物（i )-( V )的组合； (b) 将肿瘤细胞样品中生物标志物水平与选自如下的生物标志物对照水平进行比较： (i )已与对Wnt抑制剂的敏感性相关联的生物标志物对照水平；和（ii )已与对Wnt抑 制剂的耐受性相关联的生物标志物对照水平；和 (c) 如果患者的肿瘤具有RNF43或ZNRF3突变，或者患者肿瘤具有降低的RNF43mRNA或 蛋白质的表达或者降低的ZNRF3mRNA或蛋白质表达，表明患者肿瘤有可能对Wnt抑制剂是 敏感的，则选择该患者作为预计将受益于fct抑制剂的治疗性给药的患者。
[0016] 可以利用以下方法中的任意方法或者利用这些方法的组合来检测肿瘤细胞中 RNF43基因或ZNRF3基因的突变状态。 (i )对染色体17中基因组位点17q22处的RNF43区域的DNA拷贝数分析，用于判断 RNF43基因的一个或两个拷贝是否丢失。可替代地，对染色体22中基因组位点22ql2. 1处 的ZNRF3区域的DNA拷贝数分析，用于判断ZNRF3基因的一个或两个拷贝是否丢失。RNF43 或ZNRF3的杂合性丢失是被选择用于经Wnt抑制剂治疗而降低生长速率的肿瘤的生物标志 物。 (ii )对取自癌症组织的基因组DNA、cDNA或RNA进行测序以检测RNF43基因中的失 活突变。RNF43或ZNRF3的失活突变是被选择经Wnt抑制剂治疗而降低生长速率的肿瘤的 生物标志物。失活突变可以是导致在保守性残基处的氨基酸变化的无义突变、移码突变、剪 接突变体或错义突变。 (iii )采用Taqman或其他类似技术的RNF43mRNA表达检测或ZNRF3mRNA表达检测。 mRNAs中的无义突变或移码突变常常导致无义介导的mRNA降解。因此，可以将癌细胞中 RNF43mRNA表达的丢失用作RNF43无义突变或移码突变的二级检测或替代检测。RNF43mRNA 的缺失也可以是由于表观遗传沉默所致，在这种情况下在基因组DNA处没有突变。 (iv )检测RNF43基因丢失或ZNRF3基因丢失的功能性作用，例如通过检测和测定与 正常对照相比肿瘤样品中的增加的卷曲蛋白水平、增加的LRP6蛋白水平、增加的LRP6磷酸 化、和增加的蓬乱磷酸化。
[0017] 将RNF43基因或ZNRF3基因突变状态用作被选择用于通过Wnt抑制剂治疗来降低 生长速率的肿瘤的生物标志物的一个优点是在药物开发过程中的结果更好。
[0018] 在一种实施方式中，本发明提供用于测试RNF43基因或ZNRF3基因突变状态的检 测或试剂盒。该检测或试剂盒可以是在相关的fct抑制剂的药物审批后使用的共同诊断检 测。
[0019] 在另一种实施方式中，本发明提供一种包含用于患者癌症治疗的Wnt抑制剂的药 物组合物，其中患者的生物标志物水平（如本文中的定义）在统计上类似于或小于生物标 志物对照水平，并且该对照生物标志物水平已与对fct抑制剂的敏感性相关。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 图1是显示用LGK974处理的集落形成检测的照片。图I (a)显示在LGK974存在情 况下在两种浓度（300nM和IiiM)下的HPAF II细胞集落形成检测。将1300个细胞接种入 含有指定治疗剂的培养基中，每5天更换培养基直到第14天进行结晶紫染色。LGK974抑制 在RNF43基因处具有无义突变的HPAF II细胞的集落形成。图I (b)显示在单独存在I ii M LGK974下或者在其连同每日添加10% Wnt3a的条件培养基（CM)存在下，PKl (具有功能性 RNF43蛋白）和HPAF II (具有非功能性RNF43蛋白）细胞集落形成检测。在10天检测期 间RNF43野生型PKl细胞不显示对LGK974的敏感性。RNF43突变HPAF II细胞被LGK974 抑制，并且通过添加外源性fct3a可以部分缓解该抑制，因此LGK974的生长抑制是Wnt信 号转导依赖性的。
[0021] 图2是显示RNF43蛋白与ZNRF3蛋白的比对从而显示保守性残基的图表。此信息 可以用于预测是失活突变的错义突变。人RNF43蛋白的序列也提供于SEQ ID N0:3中，以 及人ZNRF3的序列也提供于SEQ ID N0:4中。
[0022] 图3是显示利用表达野生型RNF43的胰腺癌细胞YAPC中的RNF43对Wnt信号转 导进行负向调节的一组柱形图。图3(a)显示了 RNF43的缺失增加YAPC胰腺癌细胞系中的 Super TOPFlash(STF)活性。在Wnt3a条件培养基（CM)不存在或存在的情况下，用指定的 siRNA转染YAPC-STF细胞，并且测量STF荧光素酶报告基因活性。pGL2siRNA用作阴性对 照。图3(b)表明RNF43siRNA引起的STF活性的激活依赖于内源性Wnt。用指定的siRNA 转染YAPC-STF细胞，然后用DMSO或Porcupine抑制剂LGK974进行处理。然后测量STF报 告基因活性。图3(c)显示了 RNF43的缺失提高AXIN2(P-连环蛋白靶基因）的表达。用指 定的siRNA转染表达空载体（EV)或siRNA-抗性RNF43的YAPC细胞，并且利用定量RT-PCR 测量AXIN2和RNF43的相对mRNA水平。
[0023] 图4是显示若干Wnt/P -连环蛋白信号转导相关基因的mRNA水平的改变的一组 柱形图。图4(a)表明P -连环蛋白的缺失降低AXIN2和RNF43的mRNA水平。用siRNA 对细胞进行处理，利用定量RT-PCR对指定基因的相对mRNA水平进行分析。图4 (b)表明 Porcupine 抑制剂降低 RNF43mRNA 和 AXIN2mRNA 的表达。用 3 ii M IWP2 或 I ii M LGK974 对 YAPC细胞进行处理，并且利用定量RT-PCR进行基因表达分析。 发明详述 导论
[0024] 本发明人已发现Wnt信号转导的的两个负调节因子锌/环指蛋白3(ZNRF3， Swiss-Prot Q9ULT6, SEQ ID N0:4)和环指蛋白 43(RNF43, Swiss-Prot Q68DV7, SEQ ID N0:3)的功能。Hao HX 等人（2012)Nature 485(7397) :195-200。RNF43, 一种癌症相关 环指蛋白，是与核蛋白HAP95相互作用的泛素连接酶。Sugiura T等人（2008)Exp.Cell Res. 314(7) : 1519-28。ZNRF3和RNF43两者都是卷曲Wnt受体的同源细胞表面跨膜E3泛素 连接酶。这两种蛋白质均抑制由卷曲受体和LRP6构成的Wnt受体复合体的细胞表面水平。
[0025] 本发明人还表明ZNFR3是由Wnt通路激活而转录诱导的。ZNRF3的过表达降低Wnt 信号转导，同时ZNRF3siRNA或显性负向ZNRF3强效地提高Wnt信号转导。当抑制ZNRF3时 LRP6磷酸化被提高，这表明ZNRF3在Wnt通路的上游起作用。因此，ZNRF3调节细胞对Wnt 配体刺激的反应性。本发明人通过使用斑马鱼和基因敲除小鼠的体内实验在细胞系统中证 实了此观察结果。本还表明RNF43是ZNRF3的功能性同系物并且调节Wnt信号转导。 RNF43和胰腺肿瘤
[0026] PDAC是最常见形式的胰腺癌。PDAC是非常凶猛的，并且与不良预后相关。Matthaei H 等人（2011)Ann. Surg. Oncol. 18(12):3493-9 ;Luebke AM 等人（2012)Pancreatology 12(1):16-22 ;Hezel AF(2006)Genes Dev.20(10)。胰腺上皮内瘤变（PanIN)、导管内乳头 状黏液瘤（IPMN)和粘液性囊性肿瘤（MCN)被认为是PDAC的前身。尽管具有其导管特性， 但PDAC不必然产生于导管腔室。
[0027] Wnt/P -连环蛋白信号转导通路在胰腺发育期间被动态调节，并且对于外分泌胰 腺的发育是必需的。Wells JM(2007)BMC Dev. Biol. 7:4。对Wnt/P-连环蛋白信号转导的 抑制影响腺泡但不影响胰腺的胰岛发育。成年小鼠胰腺中的稳定化￠-连环蛋白的可诱导 表达提高成熟外分泌细胞的增殖并且对胰岛细胞产生极小的影响。Heiser PW等人（2006) Development 133(10) :2023-32。有越来越多的证据表明，Wnt通路激活可有助于PDAC的 维持和 / 或发展。Morris JP 等人（2010)Nat. Rev. Cancer 10(10) :683-95。在一个 PDAC 亚组中观察到￠-连环蛋白的细胞核或细胞质积聚（Pasca di Magliano M等人（2007) PLoS 0ne2(ll):e1155)，这表明通路被激活。细胞质基质内和细胞核￠-连环蛋白的水平 与 PanIN 等级和 PDAC 的发展正相关（Wang L 等人（2009) Cancer Sci. 101(3) :700-6)，因此 3 _连环蛋白信号转导促进PDAC的发展。P -连环蛋白的缺失降低PDAC细胞的增殖，这表 明连环蛋白在转化表型的维持中的重要性。
[0028] MPN 和 MCN 中常发生 RNF43 突变（Furukawa T 等人（2011) Sci. R印? 1:161 ;Wu J 等人（2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (52): 21188-93)。IPMN 和 MCN 是侵袭性 PDAC 的 前身。
[0029] 人RNF43的序列在本领域是已知的。全长人RNF43cDNA(NM_017763. 4)可以从商 业来源购得（例如，Open Biosystems，Glastonbury，CT，USA 06033)。关于 RNF43 的进一 步信息，参见美国专利第7, 425, 612号。TAT179多肽与RNF43信号肽后面的胞外域是相同 的。参见在欧洲获得批准的国际专利申请W02003/024392,如EP1487877B1。
[0030] 近来，有人提出RNF43是胰腺囊性肿瘤中的肿瘤抑制基因。Wu J等人（2011)Proc. Natl.Acad. Sci. 108:2188。在全外显子组测序研究中，8例导管内乳头状黏液瘤（IPMN)中 的6例和8例粘液性囊性肿瘤（MCN)中的3例被证明具有RNF43的失活突变。RNF43失活 突变的优势及其位点杂合性的丢失（LOH)将RNF43确立为IPMN和MCN中的肿瘤抑制基因。 在他们的报告中，Wu等人未提供RNF43的功能研究。
[0031] 最近，有人证明Znrf3和Rnf43两者的肠特异性缺失引起小鼠中肠隐窝的过度增 殖和肠腺瘤的形成。Koo BK等人（2012)Nature 488(7413) :665_9。另外，已在不同的肿瘤 (包括胰腺囊性肿瘤）中鉴定出RNF43的突变。这些研究表明RNF43如同ZNRF3充当Wnt/ 3_连环蛋白信号转导的负向调节物。
[0032] 然而，尚未鉴定出RNF43在其中重要的细胞系统，并且RNF43的体外功能丢失研究 尚无可能。因此，癌症中RNF43突变的生理学相关性以前是未知的。 Wnt/ 13 -连环蛋白信号转导通路
[0033] 进化中保守的Wnt/P -连环蛋白信号转导通路对于胚胎发育和成人组织稳态而 言是重要的。Logan CY 和 Nusse R(2004)Annu. Rev.Cell.Dev.Biol. 20:781-810 ;Clevers 11(2〇〇6)〇611 127(3):469-8〇。1拉信号转导调节转录辅因子0-连环蛋白的转换并且控制 关键发育基因表达程序。MacDonald BT等人（2009) Dev. Cell. 17(1): 9-26。在缺失Wnt通 路激活的情况下，细胞质基质内￠-连环蛋白与￠-连环蛋白破坏复合体结合，该￠-连环 蛋白破坏复合体包含包括腺瘤性结肠息肉病（APC)、AXIN、和糖原合成酶激酶3AGSK3 a / ￠)在内的多种蛋白质。在此复合体中，￠-连环蛋白被GSK3组成性地磷酸化，并且磷酸化 3 -连环蛋白被泛素蛋白酶体通路降解。fct信号被它的两种受体（卷曲受体和RP5/6受 体）接收，这导致￠-连环蛋白破坏复合体的解离。稳定化的￠-连环蛋白进入细胞核，结 合到TCF家族的转录因子，并且启动转录。
[0034] Wnt/ @ -连环蛋白信号转导的异常激活与肿瘤发生有关，并且Wnt通路的许多下 游成分在癌症中发生突变。在80%的结直肠癌中发现APC的截短突变。在各种癌症中也 发现￠-连环蛋白的稳定突变和AXIN1/2的功能丢失突变。尽管有大量的研究，但由于缺 乏易于处理的标靶，因而在靶向具有下游通路突变的癌症中的P -连环蛋白信号转导仍然 面临挑战。另一方面，在fct信号转导通路的上游存在着若干易处理的标靶。现在正在开 发靶向上游fct信号转导作为标靶的各种试剂，包括LRP6抗体（Ettenberg S等人（2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(35) : 15473-8)、卷曲抗体（Gurney A 等人（2012) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 109(29):11717-22)、和 Porcupine 抑制剂（Chen B 等人（2009)恥七 Chem. Biol. 5(2) : 100-7)。然而，以前这些试剂的临床开发很困难，因为这些分子不抑制具 有下游突变的肿瘤中的P _连环蛋白信号转导，并且鉴定具有配体诱导fct/ P -连环蛋白 信号转导的人类肿瘤是具有挑战性的。
[0035] "癌症"，如美国专利8, 093, 011和美国专利8, 093, 011中所描述的（这两篇专利 的全部内容以参考的方式并入本文中）是大范围细胞恶性肿瘤的通用名称，其特征是不受 控制的生长、缺乏分化、以及能够侵入局部组织和转移。这些致瘤性恶性肿瘤以各种不同程 度的发生率影响身体的各个组织和器官。因此，本文中使用的术语"癌症"是指具有致癌细 胞典型特性的细胞的存在，所述典型特征例如是不受控制的增殖、永生性、转移潜能、快速 生长和增殖速率、和某些特征性形态特征。癌细胞常常表现为肿瘤的形式，但这种细胞可单 独存在或者可以作为独立细胞（例如白血病细胞）在血流中循环。
[0036] "异常细胞生长"是指与不依赖于正常调节机制的细胞生长（例如，接触抑制的丢 失）。这包括以下的异常生长：（1)由于细胞中fct通路的过度激活而增生的肿瘤细胞（肿 瘤）；（2)其他增生性疾病的良性和恶性细胞，其中在细胞中发生Wnt通路的异常过度活性； (4)由于细胞中Wnt通路的过度活性而增生的任何肿瘤；（5)由于细胞中Wnt通路的过度活 性而增生的任何肿瘤；和（6)其他增生性疾病的良性和恶性细胞，其中发生Wnt通路的异常 过度活性。
[0037] "生物标志物"是可以用作生物体（例如人）的特定疾病状态或一些其他生理状 态的指不物的任何物质。生物标志物可以是基因、基因的等位基因的存在、基因表达的测量 值、蛋白质、或者可以测量且与生理状态相关联的蛋白质活性功能性作用。在医学中将生物 标志物用作实验室参数，医生可以利用这些实验室参数来帮助作出诊断决策和选择治疗过 程。
[0038] "杂合性丢失"（LOH)是几乎所有类型癌症所经历的与正常细胞相比遗传物质 (DNA)的缺失。参见美国专利7, 718, 364 (其全部内容以参考的方式并入本文中）。遗传物 质从癌细胞中丢失可以导致在染色体中特定位点处的基因的两个以上等位基因中的一个 等位基因的选择性丢失，其中该基因影响细胞生长。由于遗传异质性或DNA多态性，许多的 基因的配对等位基因彼此是不同的。当这两个等位基因是相同时，该个体被称为在该特定 位点处的这对等位基因是纯合的。可替代地，当这两个等位基因是不同的时，该个体在该位 点是杂合的。通常，这两个等位基因都被转录并最终被翻译成（在纯合的情况下）相同的 蛋白质或者（在杂合的情况下）不同的蛋白质。如果一对杂合等位基因中的一个等位基 因由于DNA从配对染色体中的一条中缺失而丢失，那么仅剩余的等位基因将被表达并且该 受影响的细胞将是功能性纯合的。将此情况被称为"杂合性丢失"（LOH)或者降低到纯合 性。通过使用DNA探针，可以将取自个体正常细胞的DNA与取自相同个体肿瘤细胞中的DNA 进行比较，并且可以利用本领域众所周知的实验技术来鉴定L0H。可替代地，可以通过证明 正常杂合细胞中的蛋白质的两种多态形式以及在已经发生了等位基因缺失的癌细胞中的 仅有一个形态，来检测出L0H。参见例如Lasko等人（1991) Annu. Rev. Genet. 25:281-314。 已在许多类型的恶性肿瘤中报道了在特定染色体区域中发生频繁的L0H，这表明在这些位 点上或者附近存在推测的肿瘤抑制基因或肿瘤相关基因。因此，LOH分析是通过限定和鉴 定推测基因所存在的区域来寻找肿瘤抑制基因的强大工具。参见Vogelstein等人（1988) New Engl. J. Med. 319 (9) : 525-532 ;Fearon 等人（1990) Cell 61:759-767 ;和 Friend 等人， Nature 323:643-646(1986)。分析已鉴定了许多类型的候选肿瘤抑制基因或肿瘤相关基 因。参见 Call 等人（1990)Cell 60:509-520 ;Kinzler 等人（1991)Science 253:661-665; 和 Baker 等人（1989)Science 244:217-221。
[0039] "功能丢失"（LOF)突变是指基因的等位基因或突变，其结果是在细胞或生物体 (包括人细胞或人类）中基因产物（例如编码的蛋白质）具有小于正常的功能或没有功能。 当等位基因具有完全功能丢失（无效等位基因）时，它常常被称为无定形突变。与功能丢 失突变相关的表现型常常是隐性的。
[0040] "取代"是指将一个碱基交换成另一个碱基的突变（即，单个"化学字母"变化，例 如将A转换成G)。这种取代可以（1)将一个密码子改变成一个编码不同氨基酸并导致所 生产的蛋白质出现小变化的密码子，例如，镰状细胞贫血是由于P血红蛋白基因中的取代 所引起，由此改变所产生蛋白质中的单个氨基酸；（2)将一个密码子改变成一个编码相同 氨基酸且不引起所产生蛋白质中的变化的的密码子（"沉默突变；或者（3)将氨基酸编 码密码子改变成单个"终止"密码子并导致不完全蛋白质（不完全蛋白质通常是非功能性 的）。
[0041] "插入"是指将额外碱基对插入DNA中的一个位置的突变。
[0042] "缺失"是指一部分的DNA发生丢失或缺失的突变。
[0043] "移码"是指由若干不能被三整除的核苷酸在DNA序列中的插入或缺失所导致的突 变。由于藉由密码子进行的基因表达的三联体性质，插入或缺失可以改变阅读框（密码子 的分组），从而导致与初始翻译完全不同的翻译。这常常产生导致功能丢失的截短蛋白质。
[0044] "Sanger测序"（根据其发明人Frederick Sanger命名）是测定多核苷酸序列的 链终止法。Sanger测序法的一个特征是用三磷酸双脱氧核苷酸（ddNTPs)作为DNA链终止 齐IJ。Sanger测序法常常是自动化的方法。
[0045] "下一代测序"方法是一组近来开发的高通量测序方法，其使测序过程平行进行， 从而同时产生数千或数百万个序列。所生成数据的增加的组合，加上生成这些数据所需成 本降低，已使此技术被本领域技术人员认为是易处理的通用工具。
[0046] 除非另有说明，本文中使用的术语"治疗"表示逆转、缓解、抑制肿瘤转移物、或其 他导致癌症或致瘤性的细胞的进展，或者部分地或完全地预防肿瘤转移物、或其他导致癌 症或致瘤性的细胞的生长。除非另有说明，本文中使用的术语"治疗"是指治疗的行为。 [0047] 词组"治疗方法"或其等同用语，当应用于癌症治疗时，是指被设计用来减少或消 除癌细胞数量或者缓解癌症症状的行为的步骤或过程。用于癌症或另一种增生性疾病的 "治疗方法"不必然意味着癌细胞或其他不正常细胞将实际上被清除，细胞或疾病的数量将 实际上被减少，或者癌症或其他疾病的症状将实际上被缓解。治疗癌症的方法常常是在甚 至低成功可能性的情况下而实施，但考虑到病史和估计的预期生存时间，即便如此其仍然 被认为是总体有益的行为过程。
[0048] "治疗有效药剂"是指将产生被研究人员、兽医、医师或其他临床医生所寻求的组 织、系统、动物或人的生物或医学响应的组合物。
[0049] "治疗有效量"或"有效量"是将产生被研究人员、兽医、医师或其他临床医生所寻 求的组织、系统、动物或人的生物或医学响应的组合物的对象化合物或组合的量。
[0050] "抑制剂"是抑制（例如，拮抗、减轻、降低、阻断、逆转、或改变）如上所述天然或 参考化合物的作用的化合物。这样的抑制剂可以包括任何提供拮抗效果的化合物、蛋白质、 肽、或核酸（包括核酶和反义）或者药物/化合物/肽设计或选择的产物。
[0051] "分离的"多核苷酸或者分离的核酸分子，是已从其自然环境中取出（即，已经历 人工操作）的核酸分子，其自然环境是自其中将该核酸分子从自然界中发现的基因组或染 色体。因此，"分离的"不必反映核酸分子已被纯化的程度，但表明该分子不包含自其中将 该核酸分子从自然界中发现的整个基因组或整个染色体。多核苷酸，例如本发明方法中用 于检测基因（例如，通过与基因杂交）的多核苷酸，通常是适于用作用于鉴定给定样品（例 如，细胞样品）中全长基因（或其一部分）的杂交探针或PCR引物的靶基因的一部分。分 离的核酸分子可以包括基因或基因的一部分（例如，调控区或启动子）。包含一个基因的分 离的核酸分子不是包含这种基因的染色体的片段，而是包含与该基因相关的编码区和调控 区，但不包含在相同的染色体中自然发现的其他基因。分离的核酸分子也可以包含特定的 核酸序列，该特定核酸序列两侧（即，在序列的5'末端或3'末端，或者两端）与自然界中 正常情况下不与该特定核酸序列相接的其他核酸（即，异源序列）相接。分离的核酸分子 可以包括DNA、RNA (例如，mRNA)、或者DNA或RNA (例如，cDNA)的衍生物。尽管词组"核酸 分子"主要是指物理的核酸分子并且词组"核酸序列"主要是指核酸分子中核苷酸的序列， 但这两个词组可以互换地使用，特别是就能够编码蛋白质的核酸分子或核酸序列而言。可 以利用重组DNA技术（例如，聚合酶链反应（PCR)扩增、克隆）或化学合成而产生分离的核 酸分子。
[0052] "探针"（寡核苷酸探针）是指通常其长度在大约50-100个核苷酸至数百个核苷 酸至数千个核苷酸范围内的核酸分子。因此，探针可以具有用于本文中所描述检测的任何 合适长度，包括以整数增量在50至数千个核苷酸范围内的任意长度。这种分子通常是用于 通过在严格杂交条件下与这种靶核酸序列杂交来鉴定样品中的靶核酸序列。杂交条件在本 领域是已知的。见例如Sambrook等人（1989)分子克隆（Molecular Cloning):实验室手 册? Cold Spring Harbor Labs 出版公司。
[0053] "引物"也是核酸序列。PCR引物通常是用于聚合酶链反应的、具有相当短长度 (例如，8-30核苷酸）的寡核苷酸。本领域技术人员可以使用来自靶序列的序列信息而 容易地制作和制造PCR引物和杂交探针。见Sambrook等人（1989)分子克隆（Molecular Cloning) ：A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs 出版公司。
[0054] 术语"测试样品"或"患者样品"通常可用于指含有待根据本发明方法进行评估的 细胞或从细胞分泌出的产物的任何类型的样品，包括但不限于分离细胞的样品、组织样品 或体液样品。分离细胞的样品是指细胞的试样，通常在悬浮液中或者脱离于结缔组织，所述 结缔组织可能在体内将这些细胞与一个组织连接，该结缔组织是利用任何合适的方法从器 官、组织或体液中采集的，所述合适的方法可收集用于本发明方法进行评价的合适数量细 胞。细胞样品中的细胞不一定是属于相同类型，尽管可以利用纯化方法来富集被优选地评 价的细胞类型。可以例如通过刮擦组织、处理组织样品以释放单个细胞、或者从体液中分离 而获得细胞。
[0055] "组织样品"，尽管类似于分离细胞的样品，在本文中被定义成通常包含若干细胞 类型的身体器官或组织的一部分，任选地具有使细胞结合在一起细胞支架结构。在一些情 况下，术语"组织样品"可与"细胞样品"互换地使用，尽管术语"组织样品"可能更经常用于 表示比细胞样品更复杂的结构。组织样品可以通过活组织检查获得，例如包括通过切割、切 片、或穿孔。
[0056] "体液样品"，类似于组织样品，含有被评价的细胞，并且是可通过适用于特定被采 样体液的任何方法所获得的液体。适于采样的体液包括但不限于：血液、粘液、精液、唾液、 痰液、支气管灌洗液、母乳、胆汁和尿。
[0057] "对照水平"是指杂合性的对照水平，可以包括与对Wnt抑制剂的敏感性相关联的 水平或者与对Wnt抑制剂的耐受性相关联的水平。因此，可以确定，正如与杂合性丢失的对 照或基线水平相比较，患者样品是否更有可能对fct抑制剂治疗敏感或耐受（例如，良好应 答者或应答者（将受益于治疗）、或者不良应答者或非应答者（将不受益于或者将很少地 受益于该治疗）。更具体地，"对照水平"可以表示杂合性的对照水平；显示野生型正常或 基线状态的DNA、cDNA或RNA序列；RNF43mRNA或活性的对照水平；ZNRF3mRNA或活性的对 照水平，RNF43基因丢失或ZNRF3基因丢失的功能性作用，其可以包括与对Wnt抑制剂的敏 感性相关联的水平、序列或作用或者与对fct抑制剂的耐受性相关联的水平。因此，可以确 定，正如与对照杂合性；显示野生型正常或基线状态的DNA、cDNA或RNA序列；正常或基线 RNF43mRNA或活性；正常或基线ZNRF3mRNA或活性，或者RNF43或ZNRF3基因的正常或基线 功能性作用相比，患者样品、癌细胞或细胞是否更有可能对fct抑制剂敏感或耐受。"对照 水平"可以指为进行比较而在非癌性的健康野生型组织或细胞或者在【具体实施方式】中安慰 剂治疗的肿瘤细胞中测量的序列、参数或水平。
[0058] 术语"匹配的个体"是指基于适于被评价细胞或肿瘤生长的类型一个或多个特性 的对照个体的匹配。对照个体可以基于性别、年龄、种族、或者会影响对照个体和患者的基 线的任何相关的生物或社会因素（例如，预先存在的条件、特定物质的消耗、其他生物因子 或生理因子的水平），而与被评价的患者匹配。
[0059] "药物组合物"是活性剂与另一种载体的组合，例如化合物或组合物，惰性（例如， 可检测试剂或标记）或活性的，例如辅助剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶 齐U、防腐剂等。载体还包括药用赋形剂和添加剂，例如蛋白质类、肽类、氨基酸类、脂类、和 碳水化合物（例如糖类，包括单糖类和寡糖类；糖类衍生物，例如糖醇、醛糖酸、酯化的糖类 等；和多糖类或糖聚合物），它们可以单独地或组合地存在，包括单独地或者以1-99. 99重 量或体积％组合地存在。碳水化合物赋形剂包括例如；单糖类，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、 葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖类，例如乳糖、鹿糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖类，例如 棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖 醇、木糖醇、山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。它可以是固体或液体形态。 方法
[0060] 在一种实施方式中，本发明提供一种选择预计将受益于或者不受益于fct抑制剂 的治疗性给药的癌症患者的方法。该方法包括以下步骤： (a) 检测取自患者的肿瘤细胞样品中的生物标志物水平，其中该生物标志物可以是： (i )用于确定杂合性丢失的在RNF43染色体区域或者在ZNRF3染色体区域的检测到的 DNA拷贝数；（ii )用于检测RNF43基因或ZNRF3基因中的失活突变的、取自癌症组织的经 测序的基因组DNA、cDNA或RNA ; ( iii )测量RNF43mRNA表达或ZNRF3mRNA表达的检测结果； (iv )测量RNF43蛋白表达或ZNRF3蛋白表达的检测结果；（V )RNF43基因丢失或ZNRF3 基因丢失的功能性作用；或者（vi )生物标志物（i )-( V )的组合； (b) 将肿瘤细胞样品中生物标志物水平与选自如下的生物标志物对照水平进行比较： (i )已与对Wnt抑制剂的敏感性相关联的生物标志物对照水平；和（ii )已与对Wnt抑 制剂的耐受性相关联的生物标志物对照水平；和 (c) 如果患者的肿瘤具有RNF43或ZNRF3突变，或者患者肿瘤具有降低的RNF43mRNA或 蛋白质的表达或者降低的ZNRF3mRNA或蛋白质表达，表明患者肿瘤有可能对Wnt抑制剂是 敏感的，则选择该患者作为预计将受益于fct抑制剂的治疗性给药的患者。
[0061] 可以利用以下方法中的任意方法或者利用这些方法的组合来检测肿瘤细胞中 RNF43基因或ZNRF3基因的突变状态。 (i )对染色体17中基因组位点17q22处的RNF43区域的DNA拷贝数分析，用于判断 RNF43基因的一个或两个拷贝是否丢失。可替代地，对染色体22中基因组位点22ql2. 1处 的ZNRF3区域的DNA拷贝数分析，用于判断ZNRF3基因的一个或两个拷贝是否丢失。RNF43 或ZNRF3的杂合性丢失是被选择用于经Wnt抑制剂治疗而降低生长速率的肿瘤的生物标志 物。 (ii )对取自癌症组织的基因组DNA、cDNA或RNA进行测序以检测RNF43基因中的失 活突变。RNF43或ZNRF3的失活突变是被选择经Wnt抑制剂治疗而降低生长速率的肿瘤的 生物标志物。失活突变可以是导致在保守性残基处的氨基酸变化的无义突变、移码突变、剪 接突变体或错义突变。 (iii )采用Taqman或其他类似技术的RNF43mRNA表达检测或ZNRF3mRNA表达检测。 mRNAs中的无义突变或移码突变常常导致无义介导的mRNA降解。因此，可以将癌细胞中 RNF43mRNA表达的丢失用作RNF43无义突变或移码突变的二级检测或替代检测。RNF43mRNA 的缺失也可以是由于表观遗传沉默所致，在这种情况下在基因组DNA处没有突变。 (iv )检测RNF43基因丢失或ZNRF3基因丢失的功能性作用，例如通过检测和测定与 正常对照相比肿瘤样品中的增加的卷曲蛋白水平、增加的LRP6蛋白水平、增加的LRP6磷酸 化、和增加的蓬乱磷酸化（其中肿瘤样品中提高的卷曲蛋白水平、提高的LRP6蛋白水平、提 高的LRP6磷酸化、和提高的蓬乱磷酸化指示RNF43基因生物标志物或ZNRF3基因生物标志 物低于对照水平）。
[0062] 检测步骤可以通过使用与SEQ ID N0:1(用于RNF43)或SEQ ID N0:2(用于ZNRF3) 中所提供序列杂交的核苷酸探针。
[0063] 失活突变可以是无义突变（见表1和表2)、移码突变（见表1和表2)、剪接位点 突变或导致保守残基处氨基酸变化的错义突变。图2显示了人RNF43蛋白与人ZNRF3蛋白 的比对，该比对提供对蛋白质中保守氨基酸的指导。
[0064] 剪接位点突变是指在将信使RNA前体加工成成熟信使RNA过程中发生内含子剪接 的特定位点中插入或敲除一些核苷酸的基因突变。剪接位点的废除导致一个或多个内含子 保持停留在成熟mRNA中并且会导致异常蛋白质的产生。
[0065] mRNAs中的无义或移码突变常常导致无义介导的mRNA降解。因此，可以将癌细胞 中RNF43mRNA表达的丢失用作RNF43无义或移码突变的二级或替代检测。RNF43mRNA的缺 失也可以是由于表观遗传沉默所致，在此情况下在基因组DNA没有突变。
[0066] 比较的步骤可以通过将肿瘤细胞中的生物标志物水平与对Wnt抑制剂耐受的一 或多种对照细胞、或者对Wnt抑制剂敏感的的一或多种对照细胞、或者两者中的生物标志 物对照水平进行比较完成。在一个方面，已预先确定了已与对fct抑制剂的敏感性或耐受 性相关联的生物标志物的对照水平。
[0067] 就选择预计将受益于或者不受益于Wnt抑制剂治疗的患者的步骤而言，可以想到 对于大部分测试患者，大多数患者将带有对使用fct抑制剂的治疗具有耐受性的肿瘤。预 计肿瘤对fct信号转导的依赖性并非如肿瘤对生长因子信号转导的依赖性那样频繁。而 且，如果fct依赖性肿瘤在Wnt通路的下游具有遗传突变，那么肿瘤将不会应答大多数现有 的Wnt抑制剂。因此，在本领域需要为治疗而选择对Wnt抑制剂治疗是良好应答者的癌症 患者组。预测良好应答者的能力是确定癌症患者肿瘤中的RNF43突变状态或ZNRF3突变状 态的主要应用。
[0068] 上述的本发明方法的任何实施方式可以用于患有任何类型癌症的患者。在一种实 施方式中，患者具有导管癌、腺癌或黑色素瘤（见表1)。在另一种实施方式中，患者患有胰 腺癌、结肠癌、食道癌或皮肤癌（见表1、表2、表3、表4、和表5)。在本发明的又一方法中， 患者患有带RNF43突变的胃部肿瘤。
[0069] 在上述本发明的任一实施方式中，可以评价对任何Wnt抑制剂的反应性。在体外 实验中，可以在标准细胞增殖、分化、和细胞凋亡检测中测定fct抑制剂的反应性。可以通 过检查P -连环蛋白、P -连环蛋白靶基因AXIN2的mRNA表达、和LRP6的磷酸化的水平， 来评估fct抑制剂对肿瘤细胞中Wnt信号转导状态的作用。在临床上，评价是以在成像中 的肿瘤缩小量（如果肿瘤是实体瘤）或肿瘤状态的生物标志物（例如通过PET扫描）为基 础的。
[0070] 肿瘤体积的测量方法在本领域是已知的。见Therasse P.等人（2000) J. Natl. Cancer Inst. 92(3) :205_216。应将相同的评估方法和相同的技术用于表征在基线处和在 随访期间的各鉴定和报告的病变。当已这两种方法均已被用于评估治疗的抗肿瘤效果时， 基于成像的评估由于通过临床检查的评估。
[0071] 临床检查。当临床检测的病变是浅表性病变（例如，皮肤结节和可感知的淋巴结） 时，临床检测的病变将仅被看作是可测量的。就皮肤病变的情况而言，推荐采用彩色照片的 文件记录，包括用于估计病变大小的尺子。
[0072] 胸部X射线检查。当病变可清楚地确定且被充满气体的肺包围时，可将胸部X 射线检查中的病变看作是可测量病变。然而，CT是优选的。Therasse P等人提供了关于 此方法在用于客观肿瘤反应评价的评估中的应用的更多细节内容（2000) J. Natl. Cancer Inst. 92(3) : 205-216。
[0073] CT和MRI。X射线计算机断层扫描（CT)和核磁共振成像（MRI)是目前最佳的可利 用且最可重现的、用于测量被选择用于反应评估的靶病变的方法。常规的CT和MRI应当采 用切片厚度为1〇_以下的连续切割完成。螺旋CT应当通过使用5-_连续重建算法而执 行；此技术规格适用于胸部、腹部和盆腔的肿瘤，而头颈部肿瘤和四肢的肿瘤通常需要特定 的方案。参见 Therasse P 等人（2000) J. Natl. Cancer Inst. 92 (3): 205-216。
[0074] 超声诊断。当研究的主要终点是客观反应评估时，不应将超声诊断用于测量临床 上不易进入的肿瘤病变。它可以用作用于浅表的可感知淋巴结、皮下病变、和甲状腺结节的 临床测量的可能的替代。超声诊断也可用于确认通常通过临床检查所评估的浅表病变的完 全消失。附录I中提供了不利用超声诊断来测量用于客观反应评价的肿瘤病变的确证。
[0075] 内窥镜检查和腹腔镜检查。这些技术在客观肿瘤评价中的应用尚未被完全地或广 泛地确认。它们在此特定情况中的使用需要仅在一些医疗中心可获得的复杂设备和高水平 专业技能。因此，这种技术在客观肿瘤反应中的应用应当限制在专门医疗中心的确认目的。 然而，当获得活检标本时，可以将这种技术用于验证完全组织病理学反应。
[0076] 肿瘤标志物。用于与肿瘤体积的测量相关联的肿瘤标志物（即，不是本发明的标 志物）不能单独地用于评估反应。然而，如果标志物最初超过正常上限，那么当全部肿瘤病 变已消失时它们必须返回到被认为处于完全临床反应的患者的正常水平。针对前列腺特异 性抗原和CA (癌症抗原）125反应在临床试验支持中的标准化应用的特定额外标准正在被 验证。
[0077] 细胞学和组织学。在少数情况下，可以将细胞学和组织学技术用于部分反应与完 全反应之间的区别（例如，在治疗后用于区分比如生殖细胞肿瘤这样的肿瘤类型中的剩余 良性病变和剩余恶性病变）。当可测量肿瘤已符合反应或稳定疾病的标准时，对治疗期间出 现或恶化的任何渗液的致瘤性性质的细胞学确认是必需的。在这种情况下，对所采集液体 的细胞学检查将能够区分反应或稳定疾病（渗液可以是治疗的副作用）与进行性疾病（如 果液体的致瘤性起源被确认）。当能够更好地确立客观肿瘤反应的新技术已被完全确认生 效可用于肿瘤反应评价中时，它们将会并入这些标准中。 杂合件丢失
[0078] 在本发明的一种实施方式中，具有RNF43基因或ZNRF3基因的杂合性丢失的肿瘤 更有可能对对Wnt抑制剂治疗产生反应（即，它们的生长被Wnt抑制剂延缓）。因此，带有 具有RNF43基因或ZNRF3基因的杂合性丢失的肿瘤的癌症患者更有可能对Wnt抑制剂治疗 具有更高的反应率、更低疾病进展速率、更长的进展时间、和更高的长期生存率。在一种实 施方式中，带有含一个拷贝RNF43基因或ZNRF3基因的肿瘤样品的患者被预测对于使用Wnt 抑制剂的治疗是良好应答者。
[0079] 基于样品类型、获得样品的组织或器官、和被评价患者的状态，选择用于确立杂合 性丢失的对照水平的方法。所述方法可以是将用于评价患者中样品的相同方法。在一种实 施方式中，利用与被评价细胞相同的细胞类型来确立对照水平。在另一种实施方式中，基于 取自患者或已知对Wnt抑制剂是耐受或敏感的细胞系的对照样品确立对照水平。在一个方 面，从匹配个体的群体中获得对照样品。
[0080] 为了确定对照水平，获得来自若干匹配个体的样品并且对其以与测试样品同样的 方式进行评价。从其中必需获得建立适宜对照水平的对照样品的匹配个体的数量（例如， 人群）可以由本领域技术人员确定，但应当在统计学上适合于确立用于与被评价患者（即， 测试患者）进行比较的合适基线。利用任何合适的统计分析方法对从对照样品中获得的值 进行统计学处理以便利用本领域中用于确立该值的标准方法来确立合适的基线水平。
[0081] 可以利用荧光原位杂交（FISH)技术检测每个肿瘤细胞的RNF43基因或ZNRF3基 因的拷贝数。FISH是基于DNA的技术并且可以在新鲜或加保存的石蜡包埋肿瘤样品中成 功地实施。该技术是成熟建立的技术，并且可以在临床细胞遗传室和分子病理实验室中以 短的周转时间容易地制作探针。用于小鼠RNF43的FISH探针是市售的，因此本领域技术 人员能够容易地制作用于人RNF43的相应的FISH探针。参见Rogan P等人（2001)Genome Res. 11 (6) : 1086-1094。可替代地，用于人基因（例如人RNF43或人ZNRF3)的FISH探针定 制设计的服务是市售的，例如由来自Empire Genomics, Buffalo, NY，美国的FISH Probes 获得。 杂夺
[0082] 可以利用杂交检测来完成对基因的探测。核酸杂交仅仅包括在其中探针及其互补 的标靶可以通过互补碱基配对而形成稳定的杂交体双重构造的条件下将探针（例如，寡核 苷酸或者较大的多核苷酸）和靶核酸接触。本文中采用的杂交条件是指用核酸分子鉴定 相似核酸分子的标准杂交条件。这种标准条件公开于例如Sambrook等人（1989年）分子 克隆（Molecular Cloning):实验室手册.Cold Spring Harbor Labs出版公司（其全部内 容以参考的方式并入本文中，具体地参见第9. 31-9. 62页）。另外，用于计算实现允许不同 程度的核苷酸错配的杂交的适当杂交和清洗条件公开于例如Meinkoth等人（1984)Anal. Biochem. 138,267-284(其全部内容以参考的方式并入本文中）。从杂交的核酸和杂交的核 酸中清洗出不形成杂交体双重构造的核酸，然后可以通常通过对附着的可检测标记的检测 而检测到。通过提高温度或降低含有核酸的缓冲液的盐浓度而使核酸变性。在低严格条件 (例如，低温或高盐或者两者）下，甚至在退火序列并不完全地互补的情况下，将形成杂交 体双重构造（例如，DNA:DNA、RNA:RNA、或RNA:DNA)。因此在较低的严格度下降低了杂交的 特异性。相反，在较高的严格（例如，较高的温度或较低的盐）下成功的杂交需存在较少的 错配。
[0083] 高严格杂交和清洗条件，如本文中所提及的，是指允许与用作杂交反应中的探针 的核酸分子具有至少大约90%的核酸序列一致性的核酸分子的分离的条件（即，允许大 约10%以下的核苷酸错配的条件）。本领域技术人员可以用Meinkoth等人（1984)Anal. Biochem. 138,267-284中的公式来计算用于实现这些特定水平的核苷酸错配的适当的杂交 和清洗条件。这种条件将根据是否正在形成DNA = RNA或DNA = DNA杂交体而变化。可替代 地，可以，如Sambrook等人（1989年）分子克隆（Molecular Cloning):实验室手册.Cold Spring Harbor Labs出版公司，第9. 31至9. 62页中所描述的按照经验计算Tm。
[0084] 通过检测附着到样品核酸的一个或多个标记探测杂交的核酸。可以通过本领域 技术人员熟知的许多方式中的任何方式加入这些标记。适合使用于本发明的可检测标记 包括可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法进行检测的任何组 合。可用于本发明的标记包括荧光染料（例如，荧光素、德州红、罗丹明、Alexa fluor系列 染料、光谱吸收染料等）、量子点、放射性同位素标记（例如，咕、1251、34、 14(：、或3牛)、和比色 标记。检测这种标记的方法对于本领域技术人员是熟知的。因此，例如，可以用感光胶片或 闪烁计数器检测放射性同位素标记，可利用检测发出光的光电检测器和荧光显微镜来检测 荧光标志物。仅仅通过使着色标记可视化而检测比色标记。优选地，利用荧光标记、最优选 荧光原位杂交（FISH)检测法来检测杂交核酸。FISH检测在本【技术领域】是众所周知的。
[0085] 在本发明的一个方法中，将肿瘤细胞样品中RNF43基因或ZNRF3基因的杂合性丢 失的水平与选自以下的RNF43基因或ZNRF3基因的杂合性丢失的对照水平进行比较：（i ) 已与对Wnt抑制剂的敏感性相关联的对照水平；和（ii )已与对Wnt抑制剂的耐受性相关 联的对照水平。如果患者肿瘤细胞中RNF43基因或ZNRF3基因杂合性丢失的水平统计学上 类似于或大于已与对fct抑制剂的敏感性相关联的RNF43基因或ZNRF3基因杂合性丢失的 对照水平，或者如果患者肿瘤细胞中RNF43基因或ZNRF3基因杂合性丢失的水平在统计学 上大于与对Wnt抑制剂的耐受性相关联的RNF43基因或ZNRF3基因杂合性丢失的水平，则 将该患者选择为预测受益于fct抑制剂、其激动剂、或者具有与Wnt抑制剂基本上类似的生 物活性的药物的治疗性给药。如果患者肿瘤细胞中杂合性的RNF43基因或ZNRF3基因丢失 的水平在统计学上小于已与对fct抑制剂的敏感性相关联的杂合性的RNF43基因或ZNRF3 基因丢失的对照水平，或者如果患者肿瘤细胞中杂合性的RNF43基因或ZNRF3基因丢失的 水平在统计学上类似于或小于已与对fct抑制剂的耐受性相关联的杂合性的RNF43基因或 ZNRF3基因丢失的水平，则将患者选择为预测不受益于Wnt抑制剂、其激动剂、或者具有与 Wnt抑制剂基本上类似的生物活性的药物的治疗性给药。 失活突夺
[0086] 在本发明的一种实施方式中，在RNF43基因或ZNRF3基因中有失活突变的肿瘤更 加有可能对Wnt抑制剂产生反应（即，它们的生长被减慢）。在RNF43基因或ZNRF3基因 中检测到一个或多个突变预示患者将受益于使用fct抑制剂的治疗。实施例中提供了该对 RNF43基因中的一个或多个突变的检测的指导。
[0087] 在RNF43基因或ZNRF3基因中检测到一个或多个突变预示患者更有可能对Wnt抑 制剂治疗产生反应或受益。没有突变的检测是较不可能对Wnt抑制剂治疗产生反应或受益 的患者的预测。筛选基因突变的方法在本领域是众所周知的，描述于Sambrook等人（1989) 分子克隆（Molecular Cloning):实验室手册.Cold Spring Harbor Labs出版公司；并且 包括杂交、聚合酶链反应、聚丙烯酰胺凝胶分析、色谱法或光谱法。由于"下一代测序"中的 最新进展，可以设想多核苷酸的直接测序正成为检测RNF43基因突变状态或ZNRF3基因突 变状态的费用最低的可靠方法。
[0088] 基因筛选突变方法还可以包括对由基因所编码的改变的蛋白质产物的筛选（例 如，通过免疫印迹（例如，免疫印迹法）、酶联免疫吸附测定（ELISA)、放射免疫测定（RIA)、 免疫沉淀、免疫组织化学法、免疫荧光法、荧光激活细胞分选（FACS)和免疫荧光显微镜检 查）。
[0089] 就RNF43mRNA的丢失或ZNRF3mRNA的丢失而言，至少50 %的mRNA降低可以被认为 是功能丢失的指示，因为肿瘤样品并非同质地由肿瘤细胞组成。 患者样品
[0090] 获得患者样品的合适方法对于本领域技术人员是已知的。患者样品可以包括取自 患者的可能含有肿瘤细胞或肿瘤细胞的蛋白质的任何体液或组织。
[0091] 一般来说，基于被用来评价肿瘤细胞生长的器官或组织的可进入性和结构、或者 基于待评价的癌症是什么类型来选择样品类型（即，细胞、组织或体液）。本发明尤其可用 于评价例如导管癌、腺癌或黑色素瘤（见表1)这样的肿瘤或者取自患有胰腺癌、结肠癌、食 道癌或皮肤癌的患者的肿瘤（见表1、表2、表3、表4和表5)。在这些情况下，典型的样品 分别是取自患者的肿瘤样品或者来自胰腺组织样品的切片。
[0092] -旦样品从患者中获得，则对样品进行评价以便对本文中所描述任何生物标志物 中的一种或多种进行检测。在本发明的一些实施方式中，使组织、细胞或其部分（例如，组 织的切片、细胞的某个成分（例如核酸）等）与一或多种核酸接触。例如，这种方案被用于 检测基因表达或杂合性丢失。这种方法可以包括基于细胞的检测或非基于细胞的检测。通 常，通过任何合适方法，通过例如混合、杂交、或组合这样的方法，以允许通过合适技术检测 到靶基因的方式，使表达靶基因的组织或细胞与检测试剂（例如，探针、引物、或者其他可 检测标志物）接触。
[0093] 利用适合于所采用检测技术的任何方法制备患者样品。在一种实施方式中，可以 使用新鲜的、冷冻的、固定的或保存的患者样品。例如，可以通过将患者组织固定于石蜡中 而制备患者肿瘤细胞。可以将固定化组织切片然后与用于检测靶基因（例如，RNF43基因 或ZNRF3基因）与探针杂交的探针接触。 对照
[0094] 当进行检测时，无需对各个检测确立对照水平。相反，可以通过参考有就以前确定 的敏感和耐受患者的（应答者和无应答者）的对照水平的以某种形式所存储的信息来确立 基线或对照。可以为任何上述检测方法，为使用相应的检测方法，而确立对照水平。这样的 存储信息形式可以包括关于敏感性和耐受性的肿瘤/患者的群体或个体数据的参考图表、 列表或电子文件，或者对待评价患者有用的有关基因杂合性丢失对照水平的任何其他数据 来源。
[0095] 用于比较的对照水平可以是任何类型的对照，包括以某种信息形式所提供的预先 确立的对照。其他评分系统可以基于与对照以及在截点附近的患者的比较来设计，可以利 用其他标准、生物标志物、或技术进行评价从而确认诊断。另外，需要时可由临床医生或研 究者根据患者群体改变截点。
[0096] 就已与对Wnt抑制剂的耐受性相关联的对照而言，当生物标志物是RNF43基因或 ZNRF3基因中的失活突变时，对照可以是RNF43基因或ZNRF3基因的野生型序列。这种序列 可公开地获得并且是十分明确的。在一种实施方式中，RNF43基因序列提供于SEQ ID NO: 1。 在另一种实施方式中，ZNRF3基因提供于序列SEQ ID N0:2。
[0097] 就RNF43mRNA的丢失而言，在肿瘤样品中观察到至少50%的mRNA表达降低。
[0098] 用于对Wnt抑制剂的耐受性的另一个对照将会是取自相同患者的非肿瘤样品。如 果不能获得这种非肿瘤样品，则可以比较来自其他患者或健康受试者的平均值，因为大多 数患者将不会对Wnt抑制剂产生反应。 统计分析
[0099] 如上所述可以按不同组合将根据本发明的生物标志物的检测步骤加以组合。这些 步骤可以按任何顺序或者基本上同时地执行。确定对照与患者样品之间差异的统计分析可 以利用本领域中已知的任意方法来完成，包括用于定性变量的皮尔森卡方检验的费舍尔精 确检验，和对连续变量采用Student's检验或方差分析。统计显著性通常被定义为p〈0. 05。 Wnt抑制剂
[0100] 本发明的方法可用于判断或预测最有可能对使用fct抑制剂或具有与Wnt抑制剂 基本上相似生物活性的药物的治疗产生反应（例如，具有治疗获益）的患者，以及判断或预 测最有可能不对使用Wnt抑制剂的治疗产生反应的患者。本发明还提出具有RNF43基因突 变的癌细胞对fct通路的抑制更加敏感。对癌细胞中RNF43的抑制导致细胞表面卷曲蛋白 水平提高。因此，fct信号转导增强和带有突变RNF43的癌细胞（尤其是胰腺癌细胞）对 Wnt拮抗剂更加敏感。参见关于HPAF II的图3和图4, HPAF II是具有非功能性RNF43蛋 白的细胞系。本发明人也已观察到也具有非功能性RNF43蛋白的细胞系PanclO. 05也对 Porcupine抑制剂敏感。
[0101] 在一种实施方式中，Wnt抑制剂是适用于人类的Porcupine抑制剂。Wnt抑制 剂可以是具有类似于已知的Porcupine抑制剂（例如IWP-2、IWP-3或IWP-4)的功能 的Porcupine抑制剂，上述已知的Porcupine抑制剂描述于Chen B等人（2009)Nature Chem. Biol. 5:100 - 107，并且可从 Miltenyi Biotech 以 Stemolecule?、Wnt 抑制剂 IWP-2 (#130-095-584)、Stemolecule? Wnt 抑制剂 IWP-3 (#130-095-585)和 Stemolecule? Wnt 抑制剂 IWP-4 商购获得。Stemolecule? IWP-2、Stemolecule? IWP-3、和 Stemolecule? IWP-4防止Porcupine (PORCN)( -种膜结合的0-酰基转移酶）对Wnt蛋白的棕榈酰化。
[0102] 可替代地，Wnt抑制剂可以是药物设计的产物并且可以利用本【技术领域】已知的 各种方法制备。参见于2010年9月10日公布的国际专利申请W02010/101849。可用 于设计本发明中所使用的模拟物或者其他化合物的各种药物设计的方法描述于Maulik 等人(1997)Molecular Biotechnology !Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss有限公司（其全部内容以参考的方式并入本文中）。Wnt抑制剂可以从分子多 样性策略（允许快速构建大的化学多样性分子库的的相关策略的组合）、天然或合成化合 物的库获得，尤其是从化学或组合库（即，序列或大小不同但具有类似构建单元的化合物 库），或者通过合理化、定向或随机药物设计获得。参见例如Maulik等人（1997) Molecular Biotechnology:Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss 有限公司。在一 个分子多样性策略中，例如，利用生物学、酶或化学方法，从肽类、寡核苷酸类、天然或合成 甾体化合物、碳水化合物或者天然或合成的有机和非留体分子来合成大化合物文库。开发 分子多样性策略中的关键参数包括：亚单位多样性、分子大小、和文库多样性。筛选这种文 库的总体目标是利用组合选择的顺序应用来获得针对目的标靶的高亲和力配体，然后通过 随机或定向设计策略来优化主导分子。分子多样性的方法详细描述于Maulik等人（1997) Molecular Biotechnology:Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss有限 公司。
[0103] 在一个优选实施方式中，fct抑制剂是化学式（1)的化合物：

【权利要求】
1. 一种预测肿瘤细胞生长对Wnt抑制剂的抑制的敏感性的方法，包括： (a) 检测取自患者的肿瘤细胞的样品中的生物标志物水平，其中所述生物标志物是选 自： (i )用于确定杂合性丢失的在RNF43染色体区域和/或在ZNRF3染色体区域的DNA 拷贝数； (? )用于检测RNF43基因和/或ZNRF3基因中的失活突变的、取自癌症组织的经测序 的基因组DNA、cDNA或RNA ; (iii ) RNF43mRNA 表达和 / 或 ZNRF3mRNA 表达； (iv )RNF43蛋白表达和/或ZNRF3蛋白表达； (v ) RNF43基因丢失和/或ZNRF3基因丢失的功能性作用；或者 (vi)生物标志物（i ) - ( v )的组合； (b) 将所述肿瘤细胞样品中的生物标志物水平与选自如下组的生物标志物对照水平进 行比较： (i )已与对fct抑制剂的敏感性相关联的生物标志物对照水平；和 (ii )已与对Wnt抑制剂的耐受性相关联的生物标志物对照水平；和 (c) 如果所述患者的肿瘤具有失活RNF43或ZNRF3突变，如果患者的肿瘤具有减少的 RNF43或ZNRF3拷贝数，或者所述患者肿瘤具有降低的RNF43mPNA或蛋白质表达或者降低的 ZNRF3mRNA或蛋白质表达，这表明所述患者肿瘤有可能对Wnt抑制剂敏感，则选择所述患者 为预计将受益于所述Wnt抑制剂的治疗性给药。
2. -种预测肿瘤细胞对fct抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与至少 一种Wnt抑制剂接触，并 (a) 检测患者肿瘤细胞中生物标志物水平，其中所述生物标志物选自： (i )用于确定杂合性丢失的在RNF43染色体区域和/或在ZNRF3染色体区域的DNA 拷贝数； (? )用于检测RNF43基因和/或ZNRF3基因中的失活突变的、取自肿瘤细胞的基因组 DNA、cDNA 或 RNA ; (iii ) RNF43mRNA 表达和 / 或 ZNRF3mRNA 表达； (iv )RNF43蛋白表达和/或ZNRF3蛋白表达； (v ) RNF43基因丢失和/或ZNRF3基因丢失的功能性作用；或 (vi)生物标志物（i )-( v )的组合： (b) 将所述肿瘤细胞中的生物标志物水平与对照水平进行比较； (c) 基于肿瘤细胞中生物标志物水平与所述对照水平之间的差异来判断肿瘤细胞对 Wnt抑制剂的敏感性。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤l(a)( i )中对在RNF43染色体区域中 的DNA拷贝数的检测通过使用可与具有SEQ ID NO: 1的序列的核苷酸杂交的探针杂交完 成。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤1 (a) ( i )中对在ZNRF3染色 体区域中DNA拷贝数的检测通过使用可与具有SEQ ID N0:2的序列的核苷酸杂交的探针杂 交完成。
5. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤l(a)( i )中对ZNRF3染色体 区域的DNA拷贝数进行检测的步骤通过荧光原位杂交（FISH)完成。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤1 (a) ( iii )中用于测量RNF43mRNA表达 的检测通过使用可与具有SEQ ID NO: 1序列的核苷酸杂交的探针杂交完成。
7. 如权利要求1、2或6所述的方法，其中在步骤1 (a) ( iii )中用于测量ZNRF3mRNA表 达的检测通过使用可与具有SEQ ID N0:2序列的核苷酸杂交的探针杂交完成。
8. 如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤1 (a) ( iv )中用于测量RNF43蛋白质表 达的检测通过免疫组织化学法完成。
9. 如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤1 (a) ( v )中用于测量功能丢失的检测 通过使用抗卷曲蛋白抗体进行FACS检测完成。
10. 如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤1(a) ( v )中用于测量功能丢失的检测 通过利用fct报告基因检测完成。
11. 如权利要求10所述的方法，其中fct报告基因检测测量蛋白质活性，其中所述蛋白 质活性是选自增加的卷曲蛋白水平、增加的LRP6蛋白水平、增加的LRP6磷酸化、和增加的 蓬乱磷酸化。
12. 如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述比较步骤包括将肿瘤细胞中的 生物标志物水平与对fct抑制剂耐受的一或多种对照细胞中的生物标志物对照水平进行 比较。
13. 如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述比较步骤包括将肿瘤细胞中的 生物标志物水平与对fct抑制剂敏感的一或多种对照细胞中的生物标志物对照水平进行 比较。
14. 如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中生物标志物的对照水平已被预先确 定，该生物标志物已被与对fct抑制剂的敏感性相关联。
15. 如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中生物标志物的对照水平已被预先确 定，该生物标志物已被与对Wnt抑制剂的耐受性相关联。
16. -种用于选择预计将受益于或不受益于Wnt抑制剂治疗性给药的癌症患者的检测 试剂盒，所述检测试剂盒包括： (a) 用于检测肿瘤细胞样品中的选自以下组的生物标志物或生物标志物组合的水平的 手段： (i ) RNF43基因和/或ZNRF3基因的杂合性丢失； (ii ) RNF43基因和/或ZNRF3基因的功能丢失的水平； (iii ) RNF43mRNA 和 / 或 ZNRF3mRNA 表达的水平； (iv )RNF43蛋白和/或ZNRF3蛋白表达的水平；和 (v ) RNF43基因和/或ZNRF3基因丢失的功能性作用； (b) 对照。
17. 如权利要求16所述的检测试剂盒，其中所述对照是选自： (i )用于检测对所述fct抑制剂的敏感性的对照样品； (? )用于检测对所述fct抑制剂的耐受性的对照样品； (iii)含有预先确定的生物标志物对照水平的信息，该生物标志物已被与对Wnt抑制剂 的敏感性相关联；和 (iv )含有预先确定的生物标志物对照水平的信息，该生物标志物已被与对Wnt抑制剂 的耐受性相关联。
18. 如权利要求16或17所述的检测试剂盒，其中在步骤15 (a) ( i )和21 (a) ( i )中 的任一步骤中用于检测所述NF43基因的手段包括可与具有SEQ ID NO: 1序列的核苷酸杂 交的核苷酸探针。
19. 如权利要求16至18中任一项所述的检测试剂盒，其中在步骤15 (a) ( i )和21 (a) (i )中的任一步骤中用于检测所述NF43基因的手段包括可与具有SEQ ID N0:2序列的核 苷酸杂交的核苷酸探针。
20. 如权利要求16或17所述的检测试剂盒，其中在步骤15 (a)( i )中用于检测RNF43 基因的手段包括可与基因组位点17q22杂交的核苷酸探针。
21. 如权利要求16、17或20所述的检测试剂盒，其中在步骤16(a)( i )中用于检测 ZNRF3基因的手段包括可与基因组位点22ql2. 1杂交的核苷酸探针。
22. 如权利要求16、17或20所述的检测试剂盒，其中在步骤16(a)(iii)中用于检测 RNF43蛋白的手段包括可选择性结合于具有SEQ ID NO:3序列的多核苷酸的抗体或其抗原 结合片段。
23. 如权利要求16至22中任一项所述的检测试剂盒，其中在步骤16(a) (iii)中用于 检测ZNRF3蛋白的手段包括可选择性结合于具有SEQ ID NO:4序列的多核苷酸的抗体或其 抗原结合片段。
24. 如权利要求16至23中任一项所述的检测试剂盒，其中所述检测手段包括可检测标 记。
25. 如权利要求16至24中任一项所述的检测试剂盒，其中所述检测手段被固定在基质 上。
26. -种用于治疗患者癌症的包含Wnt抑制剂的药物组合物，其中如权利要求1中定义 的患者的生物标志物水平在统计学上类似于或小于所述生物标志物对照水平，并且对照生 物标志物水平已与对fct抑制剂的敏感性相关联。
27. 如权利要求26所述的包含Wnt抑制剂的药物组合物，其中对照水平是所述生物标 志物的正常或基线水平，健康细胞或组织样品中的所述生物标志物水平或者生物标志物对 照水平已与对fct抑制剂的耐受性相关联。
28. 如权利要求26或27所述的包含Wnt抑制剂的药物组合物，其中所述癌症是胰腺 癌。
29. 如权利要求1至15中任一项所述的方法、或者如权利要求16至25中任一项所述 的检测、或者如权利要求26至28中任一项所述的药物组合物，其中Wnt抑制剂是式（1)的 化合物：
或者其生理学可接受的盐，其中： X^X^X3 和 X4 选自 N 和 CR7 ; X5、X6、X7和X8之一是N并且其他是CH ; X9选自N和CH ; Z选自苯基、吡嗪基、吡啶基、哒嗪基和哌嗪基；其中Z的各苯基、吡嗪基、吡啶基、哒嗪 基或哌嗪基任选地被R6基团取代； R1、R2和R3是氢； m为1 ; R4选自氢、卤素、二氟甲基、三氟甲基和甲基； R6选自氢、卤素和-C(0)R1(l ;其中R1(l是甲基；并且 R7选自氢、卤素、氰基、甲基和三氟甲基。
30.如权利要求1至15中任一项所述的方法、或者如权利要求16至25中任一项所述 的检测、或者如权利要求26至28中任一项所述的药物组合物，其中Wnt抑制剂是选自以下 的化合物： N-[5-(3-氟苯基）吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(哒嗪-4-基）吡啶-3-基]乙酰胺； 2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基）吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基）吡啶-2-基] 乙酰胺； N- (2, 3' -联批陡-6' -基）_2_ (2'，3-二甲基-2, 4' -联批陡_5_基）乙醜胺； N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基）吡啶-2-基）-2-(2'-甲基-3-(三氟甲基）-2, 4'-联吡 啶-5-基）乙酰胺； N- (5- (4-乙酰基哌嗪-1-基）吡啶-2-基）-2- (2' -氟-3-甲基-2, 4' -联吡啶-5-基） 乙酰胺；和 2-(2' -氟-3-甲基-2, 4' -联吡啶-5-基）-N-(5-(吡嗪-2-基）吡啶-2-基）乙酰 胺，或者其药学上可接受盐。
【文档编号】C12Q1/68GK104302782SQ201380011506
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月28日
【发明者】丛枫, 郝淮湘, H-i·谢, 姜小默, 刘峻, N·吴 申请人:诺华股份有限公司, Irm有限公司