专利名称：一种含蛇毒提取的生物活性酶的抗癌胶囊及制备方法
技术领域：
本发明涉及抗癌药剂，具体涉及一种含蛇毒提取的生物活性酶的抗癌胶囊及制备方法。
目前国内外均有从蛇毒中分离提取生物活性酶类的报道，如CN92100555.5，披露了使用离子交换柱层析，从腹蛇毒中分离提取蛇毒抗栓酶，从蕲蛇毒中提取去纤酶，按照防治目的合理配方组合，该方法使用的层析柱直径26毫米，高500毫米，每次仅可投入约4克蛇毒。CN86104422也披露了从蛇毒中提取生物活性酶，主要是精氨酸酯酶，制备蛇毒抗栓酶，由于精氨酸酯酶具有抗凝、去纤、降脂、溶栓、扩张血管等多种功能，制成的蛇毒抗栓酶适用于脑血栓、血栓性脉管炎等常见的疾病，其总有效率可达90％，使用的层析柱高度为1100毫米，每次可处理约5克蛇毒。蛇毒中分离提取的生物活性酶还可用于配制消除和抑制粉刺的化妆品。但是由于蛇毒中的毒性成分复杂，毒性大，使用不当，会对皮肤造成损伤。需要对蛇毒中的生物活性酶分离提纯。
本发明目的在于提取蛇毒中的活性成分，经过长期研究，从蛇毒中提取生物活性酶，该生物活性酶具有很好的抗癌活性，不同于现有的蛇毒抗栓酶。并且本发明人采用的白眉蝮蛇毒为原料，提取的生物活性酶活性好，能透过癌细胞膜，破坏癌细胞的DNA结构，达到抑制肿瘤，控制肿瘤的发生发展及扩散的效果。这些均是国内外文献尚未报道的。
本发明提供了一种含蛇毒提取的生物活性酶的抗癌胶囊(神龙酶素1号胶囊)，该胶囊内容物是由80-240毫克蛇毒提取的生物活性酶与10-170毫克的药用淀粉组成100％的组成。
经上海市药检所检验，本发明的“蛇毒酶抗癌胶囊”在1.0g/kg剂量下，一次灌胃观察7天，结果无小鼠死亡，证明基本无毒副作用。
发明人运用肠溶胶囊，因为小肠pH和酶类最适pH相近，减少酶活力的破坏。
本发明生产的抗癌活性成份，经近百例晚期肿瘤病人试用，总效率达39-50％，剂量加大，抗癌作用增加(安全剂量为80-240毫克酶/粒，1粒/次，3次/日，一个疗程为0.5-3个月)。可缩小肿瘤(1/2-2/3)、止痛、提高免疫能力和防止肿瘤扩散。
本发明的含蛇毒酶的抗癌胶囊临床应用实例如下杨浦区中心医院肿瘤科应用神龙酶素I号治疗晚期肿瘤适期疗效观察材料与方法病例来源所收病人均为住院病人，有病理证实，共52例，男性34例，女性18例，年龄30-88岁，平均63岁。全组按不同的使用方法分三组。第一组，单用神龙酶素I号共6例；第二组，合并化疗组共30例，此二组均有可作评价的客观指标，如可以明显触摸到的肿瘤或通过影象学发现的肿块；第三组为术后辅助治疗组共16例，此组无客观指标，仅作观察其毒性反应。
疾病种类胃癌29例，结直肠癌11例，肺癌5例，乳癌3例，肛管癌1例。使用方法第一组单服大剂量神龙酶素I号组，服药期间，停用其它一切抗癌药物，服药每次8-10片，每片含10毫克蛇毒生物活性酶，一日三次，逐渐加量，最大增至每日60片。服药至少一个月以上。
第二组合并化疗组，在口服神龙酶素I号时合并化疗。服药每次2-4片一日三次。化疗方案为卡铂、氟脲嘧啶/环磷酰胺、氟脲嘧啶等。
第三组术后辅助治疗组，无客观指标，口服每次2-4片，一日三次。疗效评价CR(完全缓释) 肿块完全消失，维持一个月以上。
PR(部分缓释) 肿块的二维直径缩小50％至少一个月MR(轻微缓释) 肿块的直径缩小不到50％SD(稳定或无变化) 肿块无变化PD进展肿块增大结果剂量 总数 CR PR MR SD PD 有效率(PR+MR)％12-18片/日14127 4 2124-30片/日2 2 100由表可见每日药量达24片以上比每日12-18片，其疗效明显提高。毒性反应本组病例中，未见明显副反应，对神经系统、肝肾功能、心脏功能、骨髓功能均无影响，有1例服药每日达30片亦未见毒性反应。小结1.本组16例晚期肿瘤采用神龙酶素I号治疗，取得总有效率为31％，其中PR 3例(占19％)，MR 2例(占12％)，SD 7例(占44％)，PD 4例(占25％)。说明神龙酶素I号对晚期肿瘤有一定的治疗作用。本组的结果还提示，口服给药可能对胃肠道肿瘤的效果较好。
2.本组的结果还表明，神龙酶素I号的抗肿瘤效应与剂量有关，剂量加大，其抗瘤作用增加。本组病例中给予口服，每日12-18片时，有效率为21％，而给予口服每日24-30片时，有效率为100％，治疗2例，均获PR其治疗效果令人满意。
3.从本组的观察中，未见到明显毒副反应，对心、肝、肾、骨髓均无影响，是一种较为安全而服用方便的药物。
上海医科大学附属华山医院肿瘤科应用大剂量神龙酶素胶囊抗肿瘤疗效总结殷洪德病例介绍患者殷洪德，男性，1934年出生政协上海市委员会退休职工家住上海市控江二村92号8室住院号281494A主要病史及治疗经过患者于92年9月，在无明显诱因情况下出现咳嗽、咳痰，劳累后感气促。92年11月，来院就诊后胸透示左侧胸腔大量积液，以“左侧胸腔积液”收住入院。入院后抽出红色胸水600ml，送肿瘤医院作病理涂片见腺癌细胞。92年11月24日胸部CT示左上肺纵隔旁肿块，伴纵隔、左肺门转移，考虑为肺癌。采用环磷腺胺、阿霉素、VP16等药物治疗后，肿块缩小，胸水减少出院。
患者出院后间隙给予化疗。94年6月起，患者出现左侧腰背部持续性疼痛，为除外肺癌转移至腰椎、左肾而再次收住入院。入院后除外肾、骨转移，对症治疗后症状缓解。因患者不愿接受化疗，于6月16日起给予神龙酶素工号胶囊80mg，Tid口服，连续用药三个月，用药期间随访肺部CT，见肿瘤病灶缩小。患者服药后无任何不适出现；治疗过程中随访肝、肾功能).血尿常规、凝血酶原时间等(见附表)，均未见顷显异常出现。
因此认为，此剂量神龙酶素胶囊对该病员有一定抗肿瘤疗效，并且较为安全，无任何副作用出现。
附用药前后有关实验室检查比较用药前 用药后血常规WBC 11.4 RBC 3.79WBC 11.2 RBC 4.2Hb 114 Hb 131PLT 152 PLT 229尿常规正常 正常肝功能GPT＜50 Sb＜12 r-GT 6GPT＜50 r-GT 28肾功能BUN 7.5 Cr 60BUN 7.5 Cr 140出凝血凝血酶原时间11秒(100％) 凝血酶原时间12秒(100％)KPTT 39秒KPTT 37秒免疫球蛋白 IgG 13.5 IgA 1.35 IgG 17.5 IgA 1.41
IgM 1.3 IgM 1.25淋巴细胞亚型 CD3 45％ CD3 48％(68.8±7.0)CD4 35％ CD4 24％(45.5±6.4％)CD8 23％ CD8 37.5％(25.7±4.0％)CD4/CD8 1.5 CD4/CD8 0.64(1.6-2.1)CD16 27％ CD16 40％(19.8±3.7％)尿常规正常 正常心电图正常 正常胸 片左上肺Ca，肺内胸膜左上肺Ca，左侧胸膜炎肥厚粘连CT左侧肺癌，肺内转移不除外 左上肺癌，左肺内胸膜转伴胸膜转移移，纵隔内淋巴结转移左侧少量胸水 左胸少量胸水纵隔内淋巴结明显增大邵宁病例介绍患者邵宁，男性，71岁上海冶金局干部(离休)家住上海市延平路44 6弄6号402室住院号238079主要病史及治疗经过患者于89年1工月，因“低热三月，体检发现右肾占位性病变”收住入院。经B超、CT、肾动脉造影等检查，明确诊断后于89年工1月行右肾癌根治术，当时未发现有转移病灶。术后患者一般情况好，病理检查诊断为右肾透明细胞性腺癌。
患者出院后，曾用5-FU、丝裂霉素等治疗。91年5月，肺部CT发现胸壁小结节，92年4月胸片示两肺转移性肿瘤，以后采用化疗及免疫治疗。94年3月复查CT示肺内阴影明显增大，为进一步治疗于94年4月再次收住入院。入院后经有关检查后，明确诊断为右肾癌术后，肺转移。于94年5月12日起服用神龙酶素工号胶囊80mg，Tid治疗，连续用药三个月，用药期间患者无任何不适出现，随访有关实验室指标，均末见异常(结果见后)，复查肺部CT，见转移性病灶稳定，未见继续增大，说明该药对该病员有一定治疗作用，可以控制病情发展且无任何毒副作用出现。停用神龙酶素胶囊后，肺部病灶较用药前增大，亦说明神龙酶素的治疗作用。
附用药前后有关实验室检查比较用药前 用药后血常规WBC 7.6 RBC 2.77 WBC 8.2 RBC 2.9Hb 92Hb 95PLT 158 PLT 179尿常规正常 正常肝功能GPT＜50 GOT 7 r-GT 29GPT＜50 GOT 38 r-GT 22肾功能BUN 5.5 Cr 100 BUN 5.5 Cr 110出凝血凝血酶原时间11秒(100％) 凝血酶原时间11秒(100％)KPTT 36秒KPTT 35秒免疫球蛋白 IgG 14.0 IgA 2.95 IgG 11.5 IgA 2.9IgM 0.96 IgM 1.1淋巴细胞亚型 CD3 23％ CD3 33％(68.8±7.0)CD4 16％ CD4 15％(45.5±6.4％)CD8 10％ CD8 12.6％(25.7±4.0％)CD4/CD8 1.6 CD4/CD8 1.2(1.5-2.1)CD16 41％CD16 40％(19.8±3.7％)心电图正常 正常胸 片肾癌肺转移，最大约 肾癌肺转移，与前片比相仿1.5×2CM2殷文宝，男，62岁住院号274030住院日期94年4月9日-6月8日患者因持续性中上腹痛伴消瘦经B超检查诊断为胰头癌。入院后，经各项检查发现有淋巴结、皮肤、肺转移，因此采用插管化疗及全身化疗。住院过程中，曾一度停用化疗药物，单独采用神龙酶素I号胶囊，80mg，Tid口服，用药过程中，患者耒主诉特别不适，有关实验室检查，如血尿常规、肝肾功能、出凝血时间无异常出现，但因腹部转移结节继续增大而停用神龙酶素，改用化疗。根据两周使用神龙酶素情况分析，该药无任何毒、副作用出现。姚志明，男，59岁94年6月起出现咳嗽、痰血、吞咽梗阻。X胸片示右上肺阴影CT示右上肺伴纵隔阴影94年6月9日行手术治疗，病理证实为未分化癌，因病期较晚，肿块未能切处。
94年6月20日-8月9日，采用放射治疗，放疗间隙采用Adr50mg+DDP，100mg+MMC 8mg化疗。并用过a干扰素100万单位，Biw治疗。
7月6日化疗9月5日化疗9月15日服用神龙酶素I号胶囊，80mg，Tid。
本发明的另一目的是提供了上述一种含蛇毒提取的生物活性酶的抗癌胶囊的制备方法。本发明的方法是利用本发明人设计的装置进行的。该装置已于2000年11月28日申请专利，专利号为00259359.9发明名称为“从蛇毒种分离提取生物活性酶类的工业生产装置。”本发明的方法包括下列步骤1、DEAE葡聚糖凝胶A-50，经碱—酸—碱处理后，用0.01mol/LTris-HCl缓冲液浸泡并平衡；2、装柱(2000×100mm)，凝胶层高1500mm，凝胶层下有50mm高的石英砂；3、原毒50克溶于缓冲液中，高速离心(8000转/分，10分钟)，弃沉淀，取上清液上柱；4、上柱后用缓冲液洗脱，待第一峰下来后，加含0.4mol/L NaCl的缓冲液直线梯度洗脱；5、洗脱液用特制的部份收集器收集，10分钟一瓶，约100ml/瓶，用核酸蛋白仪自动测定在280nm波长下的光密度，自动描曲线，直到核酸蛋白仪指示出直线时，洗脱完毕；6、洗脱液冷冻干燥得冻干粉，与药用淀粉混合后装入胶囊。
本发明洗脱液pH值应保持6.8-7.0，操作时的温度应控制在4-10℃。
本发明的含蛇毒提取物的抗癌胶囊，可利用检测半成品冻干粉的精氨酸酯酶活力1.1-1.3国际单位/毫升来保证制剂质量。
本发明与现有技术相比有如下优点1、生产周期短，由报道的15、10、7天缩短为2天，简化了方法。
2、洗脱液pH为6.8-7.0，是最佳条件，一次投料量可达50克原毒。生物活性酶类的总收率达到40％，适用于药厂的工业化生产。
3、操作温度为4-10℃，使酶活力达到最佳状态，可使原毒的精氨酸酯酶活力从0.9-1.0国际单位/毫升提高到1.1-1.3国际单位/毫升。
2.装柱(2000×100mm)，凝胶层高1500mm，凝胶层下有50mm高的石英砂。
3.原毒50克溶于缓冲液中，高速离心(8000转/分，10分钟)，弃沉淀，取上清液上柱。
4.上柱后用缓冲液洗脱，待第一峰下来后，加含0.4mol/L NaCl的缓冲液直线梯度洗脱。
5.洗脱液用特制的部分收集器收集，10分钟一瓶，约100ml/瓶，用核酸蛋白仪自动测定在280nm波长下的光密度，自动描曲线，直到核酸蛋白仪指示出直线时，洗脱完毕。
6.将上述洗脱液冻干得提取物20克。
7.将提取物冻干粉80-240毫克与药用淀粉10-170毫克混合后填充于I号肠溶胶囊内，每粒250毫克。
权利要求
1.一种含蛇毒提取的生物活性酶的抗癌胶囊，其特征在于该抗癌胶囊内容物是由80-240毫克蛇毒提取的生物活性酶与10-170毫克的药用淀粉组成的。
2.一种如权利要求1所述的一种含蛇毒提取的生物活性酶的抗癌胶囊的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)DEAE葡聚糖凝胶A-50，经碱—酸—碱处理后，用0.01mol/LTris-HCl缓冲液浸泡并平衡；(2)装柱(2000×100mm)，凝胶层高1500mm，凝胶层下有50mm高的石英砂；(3)毒50克溶于缓冲液中，高速离心(8000转/分，10分钟)，弃，取上清液上柱；(4)后用缓冲液洗脱，待第一峰下来后，加含0.4mol/L NaCl冲液直线梯度洗脱；(5)洗脱液用特制的部份收集器收集，10分钟一瓶，约100ml/瓶，用核酸蛋白仪自动测定在280nm波长下的光密度，自动描曲线，直到核酸蛋白仪指示出直线时，洗脱完毕；(6)洗脱液冷冻干燥得冻干粉，与药用淀粉混合后装入胶囊。
3.根据权利要求2所述的一种含蛇毒提取的生物活性酶的抗癌胶囊的制备方法，其特征在于其中所述洗脱步骤中洗脱液的PH为6.8-7.0，温度为4-10℃。
全文摘要
本发明提供了一种含蛇毒提取物的抗癌胶囊及制备方法。本发明的抗癌胶囊内含物是由从白眉蝮蛇毒中提取的生物活性酶与药用淀粉组成的,该胶囊具有抑制肿瘤,控制肿瘤发生发展及扩散的效果。本发明同时提供了制备方法,该方法生产周期短,产量高,宜于工业化生产。
文档编号A61P35/00GK1370599SQ01105350
公开日2002年9月25日 申请日期2001年2月19日 优先权日2001年2月19日
发明者刘耀北 申请人:刘耀北