专利名称：酵母菌表达人组织型纤溶酶原激活剂的生产方法及活性测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程产品的生产方法和生物活性测定领域。特别是一种在酵母中分泌表达人组织纤溶酶原激活剂的生产方法及其生物学特征的测定。
组织纤溶酶原激活剂(Tissue-type plasminogen activator，t-pA)是目前公认的最好的溶纤药。临床上常用于因血管栓塞所引起的心肌梗死、脑栓塞肺静脉栓塞、肾静脉栓塞、下肢深部静脉栓塞和器官移植后血管再通的治疗。
组织纤溶酶原激活剂最早是从人血液中分离纯化而获得组织纤溶酶原激活利。由于含量很少，难以大量获得。国内外虽然有采用(1)在中国仓鼠卵巢细胞--CHO中表达，(2)在大肠杆菌Ecoli中表达，(3)在酵母中表达3种途径生产组织纤溶酶原激活剂，但都存在各种问题，难以工业化生产。
酵母表达系统尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)早已广泛应用。以S.cerevisiae为代表的常规酵母表达系统虽已积累大量经验，但也存在缺陷，如生长速度慢，密度不高，外源蛋白的表达，翻译后加工和分泌不够理想，重组质粒游离于酵母染色体，在高密度发酵培养过程中，质粒易丢失而导致目的蛋白表达水平逐渐下降。近年来迅速崛起的非常规酵母表达系统部分克服了上述缺点，能高效表达外源蛋白，如Pichia pastotis,HansenulaDolymorpha,Kluyveromyces lactis，其中以Pichia pastoris表达系统最为成功。Phillips公司和SIBIA公司联合开发了甲基营养型酵母一Pichia Pastoris(毕赤巴斯德酵母)基因表达体系(1987 NucleicAcids Res.15:3859-3876)。该体系以醇氧化酶(AOXI)为启动子，通过同源双交换使外源基因稳定地整合于酵母染色体，有效的避免了外源基因丢失。毕赤巴斯德酵母不但能使表达产物糖基化，避免酿酒酵母的超糖基化作用，更重要的是它可将表达产物分沁于胞外(并非任何外源基因皆可以被分泌于胞外)，而且自身蛋白的分泌却很少，非常有利于下游的纯化制备。目前，尚未见有组织型纤溶酶原激活剂分子在酵母表达体系分泌表达的报道。
本发明的目的是通过酵母菌分泌表达、分离纯化，大量获取与天然tPA具有相同生物学活性的重组htPA分子，以利于大规模药用开发。
本发明采用的技术方案为在获取人tPA cDNA的基础上，将其5′端序列加以修饰，克隆入分泌型酵母菌表达载体，构建了高效表达的酵母工程菌，建立一整套酵母工程菌诱导表达、蛋白质分离纯化工艺，以获得rhtPA纯品，并对htPA的生物学特性进行了测定。
本发明在自行克隆htPA cDNA的基础上，1)对其cDNA编码序列5′端和3’端进行修饰，使其正确克隆入酵母表达载体pPIC9的α因子信号肽序列的下游，构建htPA酵母菌分泌型表达载体pPIC-9tPA；2)电穿孔法转化酵母菌GS115细胞，经筛选获得高效分泌表达htPA的基因工程酵母菌株(pPIC-9tPA/GS115)；3)发酵，分离纯化；5)生物学特性检测。
本发明的主要优点(1)改进酵母培养基和优化培养表达条件以进一步提高表达水平。(2)表达的产物有天然的结构、正确的折叠，适度的糖基化和高的生物活性(20000IU/mg)。(3)表达产物分泌到培养基中，方便回收、纯化。
结合
本发明的具体实施方法如下图1根据核苷酸序列推导的rhtPA氨基酸序列；图2rhtPA纯化产物的SDS-PAGE结果；图3rhtPA的Western blot分析；图4酪蛋白板溶圈法测定表达产物rt-PA的活性。
实施例1．PCR扩增htPA cDNA设计如下引物对htPA cDNA末端进行修饰上游引物5′-TCT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GAA GCC AGGTCT TAC-3′下游引物5′-TT CGC GGC CGC TCA CGG TCG CAT GTT GTC AC-3′应用PCR方法，在htPA cDNA5′端引入酵母菌分泌信号肽序列，直接将tPA成熟肽编码区克隆入酵母α因子信号肽编码序列下游，以利于酵母菌的表达和分泌；同时利用密码子简并性原理，将htPA结构基因的第三个密码子AGA改为AGG，以利于htPA cDNA的转化和重组酵母菌的筛选。
2．pPIC-9tPA的构建用XhoⅠ/NotⅠ双酶解htPA cDNA PCR产物，回收后定向克隆入表达载体pPIC-9的α因子信号肽序列下游，构建表达载体pPIC-9tPA，序列测定结果与设计序列一致。
3．htPA酵母表达工程菌的建立重组质粒pPIC-9tPA经BglⅡ酶解，电穿孔方法转化酵母主菌GS115，依据重组菌在MD即1.34％YNB,4×10-5％生物素，1％葡萄糖和MM即1.34％YNB,4×10-5％生物素，0.5％甲醇平板上的生长速度不同，初步筛选重组菌，进一步以其染色体DNA为模板，用PCR方法检测tPA基因鉴定阳性重组克隆，筛选出htPA酵母工程菌于。
根据核苷酸序列推导的rhtPA氨基酸序列见图1。
4．工程菌的发酵和诱导表达1．菌种制备2．发酵和诱导表达在小量摇瓶中，以2％浓度将菌种接种于500mlBMG，即1.34％YNB,4×10-5％生物素，1％甘油中，于30℃,250rpm/min振荡培养，至菌密度达到OD 600=4，离心弃上清，加入100ml MM培养，每天补加0.5％体积甲醇，3天后收集菌液，离心弃沉淀，电泳鉴定目的蛋白表达量及测定活性。(发酵罐)。
5．表达产物的分离纯化采用现有技术的方法收集、盐析、柱层析等等，具体如下1)．分离酵母菌从发酵罐收获培养液，置低温(4℃)离心机，4000转/分离心15分钟，弃沉淀，留取上清液。
2)．透析将离心好的上清，用透析袋装好，每袋300ml，在4℃去离子水中透析24h，中间换水二次，透析完后调PH至5.8。
3)．阳离子交换层析分离纯化将10×30cm阳离子交换层析柱CM52用0.02mol/L NaAC缓冲液PH5.8平衡，透析好的培养液缓慢上柱，4℃，每流速60ml/min,280nm检测流出液，然后用0.02mol/L NaAc,PH6.0含0.75mol/L NaCl洗脱液洗脱，收集蛋白峰检测活性，留有活性峰，产品-20℃保存。
4)．凝胶过滤层析纯化
10×120cm G25层析柱，用缓冲液(0.01mol/L PB PH7.0，含0.4mol/LNaCL)平衡柱床，流速25ml/min，阳离子交换层析纯化产品500ml上柱，流速20ml/min,280nm检测，收集蛋白峰，实验温度4℃，产品-20℃保存，检测活性，留有活性峰。
5)．阳离子交换层析分离纯化、浓缩方法同3)，上柱前用2)方法透析。
6．表达产物的生物学签定(SDS-MGE、活性测定，免疫原性检测等等)。
1)SDS-PAGE鉴定浓缩胶5％，分离胶10％。直接取培液上清与2×上样缓冲液等体积混合后取40μl上样，作SDS-PAGE电泳，银盐染色，结果显示在60kDa左右出现一条表达条带，而空白对照无此条带。在加PMSF作为蛋白酶抑制剂的蛋白表达中，蛋白条带多，但表达的蛋白浓度相似；甲醇诱导后作SDS-PAGE，比较不同时间表达产物rt-PA条带，表明诱导后第3天条带最明显。
2)活性测定取诱导后第3天培液上清20μl直接点在酪蛋日板上的孔内，37°，湿盒过夜，通过与标准t-PA的溶圈大小作对比，测定rt-PA的生物活性，结果表明rt-PA具有溶栓活性且在诱导表达后第3天为最高，其中的1株酵母菌表达rt-PA的最高活性达到2500IU/ml培液。
3)免疫原性测定诱导后第3天的培液上清上样，10％SDS-PAGE，半干转移至硝酸维膜，以2％脱脂牛奶作封闭试剂，封闭90min后加入抗人tPA抗血清，4oC过夜，洗涤处理，加入鼠抗兔IgG的酶标抗体。最后在DAB、H2Q2下显色，结果表明在表达条带处出现了能被抗t-PA多抗所识别的蛋白，即表达条带具有tPA的免疫原性。
rhtPA纯化产物的SDS-PAGE结果见图2；rhtPA的Western blot分析结果见图3。酪蛋白板溶圈法测定表达产物rt-PA的活性见图4。
上述结果表明组织纤溶酶原激活剂的嗜甲醇酵母表达体系可将组织型纤酶原激活剂分子高效分泌表达于培养液，所产生的组织纤溶酶原激活剂rhtPA纯品，其生物特征为分子量60Kda，经免疫、酶免疫吸附、纤维蛋白结合和降解实验证实，表达产物与天然组织型纤溶酶原激活剂生物活性相同，可大规模工业化生产。
权利要求
1．酵母菌表达人组织型纤溶酶原激活剂的生产方法，包括构建工程菌、发酵、蛋白质分离纯化工艺。
2．根据权利要求1所述的酵母菌表达人组织型纤溶酶原激活剂的生产方法，其特征是将htPA cDNA5′端序列加以修饰，使htPA结构基因正确置于酵母表达载体pPIC-9的α因子信号下游，构建表达载体pPIC-9htPA，转化酵母菌GS115，经筛选建立分泌型表达htPA的酵母工程菌。
3．根据权利要求1所述的酵母菌表达人组织型纤溶酶原激活剂的生产方法，其特征是包括1)菌种制备2)发酵和诱导表达在小量摇瓶中，以2％浓度将菌种接种于500mlBMG，即1.34％YNB,4×10-5％生物素，1％甘油中，于30℃,250rpm/min振荡培养，至菌密度达到OD 600=4，离心弃上清，加入100ml MM培养，每天补加0.5％体积甲醇，3天后收集菌液，离心弃沉淀，电泳鉴定目的蛋白表达量及测定活性。
4．根据权利要求1所述的方法，其特征是1)．分离酵母菌从发酵罐收获培养液，置低温(4℃)离心机，4000转/分离心15分钟，弃沉淀，留取上清液；2)．透析将离心好的上清，用透析袋装好，每袋300ml，在4℃去离子水中透析24h，中间换水二次，透析完后调PH至5.8；3)．阳离子交换层析分离纯化将10×30cm阳离子交换层析柱CM52用0.02mol/L NaAC缓冲液PH5.8平衡，透析好的培养液缓慢上柱，4℃，每流速60ml/min,280nm检测流出液，然后用0.02mol/L NaAc,PH6.0含0.75mol/L NaCl洗脱液洗脱，收集蛋白峰检测活性，留有活性峰，产品-20℃保存；4)．凝胶过滤层析纯化10×120cm G25层析柱，用缓冲液(0.01mol/LPB PH7.0，含0.4mol/LNaCL)平衡柱床，流速25ml/min，阳离子交换层析纯化产品500ml上柱，流速20ml/min,280nm检测，收集蛋白峰，实验温度4℃，产品-20℃保存，检测活性，留有活性峰；5)．阳离子交换层析分离纯化、浓缩。
5．根据权利要求1所述的方法，其特征是活性测定包括1)SDS-PAGE鉴定浓缩胶5％，分离胶10％。直接取培液上清与2×上样缓冲液等体积混合后取40μl上样，作SDS-PAGE电泳，银盐染色，结果显示在60kDa左右出现一条表达条带，而空白对照无此条带。在加PMSF作为蛋白酶抑制剂的蛋白表达中，蛋白条带多，但表达的蛋白浓度相似；甲醇诱导后作SDS-PAGE，比较不同时间表达产物rt-PA条带，表明诱导后第3天条带最明显；2)活性测定取诱导后第3天培液上清20μl直接点在酪蛋日板上的孔内，37oC，湿盒过夜，通过与标准t-PA的溶圈大小作对比，测定rt-PA的生物活性，结果表明rt-PA具有溶栓活性且在诱导表达后第3天为最高，其中的1株酵母菌表达rt-PA的最高活性达到2500IU/ml培液；3)免疫原性测定诱导后第3天的培液上清上样，10％SDS-PAGE，半干转移至硝酸维膜，以2％脱脂牛奶作封闭试剂，封闭90min后加入抗人tPA抗血清，4oC过夜，洗涤处理，加入鼠抗兔IgG的酶标抗体。最后在DAB、H2Q2下显色，结果表明在表达条带处出现了能被抗t-PA多抗所识别的蛋白，即表达条带具有tPA的免疫原性。
全文摘要
本发明涉及在酵母菌中分泌表达人组织纤溶酶原激活剂(htPA)及其活性测定方法。在获得htPA cDNA的基础上,对该基因5’端加以修饰,使其正确入pPIC9载体的α因子信号肽序列下游,经转化构建阳性工程菌。通过工程菌发酵、诱导表达、蛋白质分离纯化和活性测定方法,获得分子量60Kda的rhtPA纯品,经免疫、酶免疫吸附、纤维蛋白结合和降解实验证实,表达产物与天然组织型纤溶酶原激活剂性能相同。
文档编号A61K38/49GK1314490SQ01111048
公开日2001年9月26日 申请日期2001年3月21日 优先权日2000年3月21日
发明者李宏 申请人:李宏