专利名称：引导和促进神经有效再生的部分脱乙酰甲壳质生物套管及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种生物套管及其制造方法，特别是一种可以引导和促进神经有效再生的可吸收性人工生物套管及其制造方法，更具体地说，本发明涉及引导和促进神经有效再生的部分脱乙酰甲壳质生物套管及其制造方法，属于生物医用材料领域。
为了能在手术中进行神经束的定性吻接，多年来人们从解剖学和免疫组织化学等方面进行了神经功能束定位的研究，但迄今为止都无法应用于临床。Forssman和Cajal的选择性再生理论，即在神经对接的两断端间留出供其选择性再生的空间将有利于混合神经的再生；这一理论为神经良好的对接指出了新的可行之路，其方法被称为小间隙套接法，近年来被一些实验所证实，如通过自体动脉套接混合神经模型，从显微外科手术观察、组织学、电生理学、神经免疫化学等多方面证实了周围神经选择性再生的客观性及小间隙套接缝合的优越性。但自体动脉不可能在临床中应用，自体静脉在临床中也难以广泛应用。比较理想的套接材料应是一种生物相容性较好、可吸收并有一定促进和引导神经再生效果的人工生物材料。
目前国内外用于修复神经缺损的材料有硅胶管、聚四氟乙烯导管、纤维素套管等，但这些材料在可吸收性和组织相容性方面都存在一定缺陷，难以在临床上得到广泛应用。
WO9844020A1和WO9844021A1报道了含磷酸酯基团的合成聚合物用于制作神经生长的导管；US5844017A报道了一种脂族聚氧酯预聚物可制备用于神经连接的导管；US4534349A中采用聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乙交酯-丙交酯)、聚酯酰胺等合成聚合物及其共聚、共混物制备神经修复导管；US4669474A、US4883618A、US5147399A、EP0327022A中采用如US4534349A中采用的聚合物的纤维产品，经充膜和粘接处理制备多孔、表面粗糙的导管用于断裂神经修复；EP0286284A和WO9005490A1中分别采用丙烯酸共聚物或聚氨酯和聚合物驻极体材料制备用于修复神经断裂的膜管；WO9403212A1采用透明质酸酯基体和透明质酸酯线交织增强结构，制备用于修复周围神经缺损的导管。然而，所报道的这些材料，或者制备困难，或者在可吸收性和组织相容性方面具有一定缺陷，或存在不利于神经再生的因素，并没能在临床上取得实际应用。
中国修复重建外科杂志7(3)169-171(1993)中报导了用几丁质(或称甲壳质、聚N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖)桥接周围神经缺损的实验研究，采用二甲基乙酰胺-氯化锂溶剂体系溶解精制的蚕蛹壳几丁质，以一定口径和管壁厚度的模具置于丙酮凝固浴中凝固成形，脱模后以蒸馏水漂洗、凉干，再复水制成所需长度，浸泡于75％酒精中消毒，用生理盐水漂洗后得到所需几丁质管。但上述溶剂体系中的二甲基乙酰胺具有很强的毒性，并与几丁质有牢固的吸附作用，漂洗和萃取十分困难，极易吸附残留而对生物体造成毒害。采用模具和凝固脱模工艺制备几丁质管时，由于几丁质大分子未受到拉伸取向，所得制品未获得韧性而易于脆裂。另外，几丁质膜与神经再生中作用重大的雪旺氏细胞之间的组织相容性不及几丁糖(或称壳聚糖、壳多糖、甲壳胺、脱乙酰甲壳质)液。
中国修复重建外科杂志12(2)90-93(1998)中报导了几丁质及几丁糖与雪旺氏细胞相容性的实验研究，发现几丁质及几丁糖与雪旺氏细胞有着良好的组织相容性，几丁糖液优于几丁质膜片，两者均可抑制成纤维细胞的生长。以上结论具有重要意义，因为雪旺氏细胞不但能够引导神经再生，而且还分泌多种促神经再生的因子，如神经生长因子、运动神经营养因子等。如果一种材料能够与雪旺氏细胞有很好的相容性，则能成为一种促进和引导神经再生的理想的神经修复材料，如果抑制其生长则应慎用。从几丁质及几丁糖均可抑制成纤维细胞的生长的特性来看，这一特性的意义是早期可以防止瘢痕长入再生神经中，晚期可避免瘢痕缩窄引起压迫，这一点对再生神经功能的恢复、不引起功能失常具有重要作用。但是，该实验研究中所述“几丁糖”为2％几丁糖稀醋酸水溶液无菌风干后所得产物，大分子结构中的-NH2基团已呈离子化状态，这种“氨基离子化”的几丁糖不具备抗水溶性，无法制得具有一定物理机械性能和降解吸收周期的膜管，用于混合神经再生的间隙套接。
CN1262961中采用几丁糖(文献中称为壳聚糖)100份、明胶5-10份及其它微量元素、戊二醛、多聚赖氨酸，制备用于神经修复的壳聚糖导管。但是采用交联剂戊二醛对壳聚糖进行交联，会影响壳聚糖的生物相容性和体内降解吸收性能。另外，中国修复重建外科杂志14(3)175-179(2000)中曾指出，几丁糖(文献中称为壳聚糖)周围的明显炎症反应可能与壳聚糖未呈离子化的-NH2基正电荷密度增高有关，因此有人认为几丁糖(文献中称为壳聚糖)不适合作为体内埋植材料。
综上所述，几丁糖(甲壳胺)与醋酸形成的“氨基离子化”的几丁糖(甲壳胺)不具备抗水溶性，无法制得具有一定物理机械性能和降解吸收周期的膜管；未呈“氨基离子化”的几丁糖(甲壳胺)在体内的生物相容性和降解吸收性能较差。可见目前还没有一种生物相容性较好、可吸收、具有一定促进和引导神经再生效果、物理机械性能和价格适宜的用于制备人工生物套管的材料。
本发明的另一目的在于提供一种引导和促进神经有效再生的可吸收性部分脱乙酰甲壳质人工生物套管的制造方法，所述制备方法可以得到具有适宜的脱乙酰基的中空生物套管，方法简单，适宜工业化生产。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为，一种引导和促进神经有效再生的部分脱乙酰甲壳质生物套管，所述的生物套管为脱乙酰度15-45％的甲壳质中空生物套管，优选甲壳质的脱乙酰度为25-35％。
其中所述的生物套管的管壁上进一步吸附、渗透有0.3-3％重量的海藻酸钠及5-10％促神经生长因子药物。
其中所述的生物套管的尺寸根据需要调整，用于动物试验的管内径一般为0.7-1.5mm，壁厚0.1-0.2mm；用于临床(人体)的管内径一般为1-6mm，壁厚1-2mm。
本发明中一种引导和促进神经有效再生的可吸收性部分脱乙酰甲壳质人工生物套管的制造方法，以甲壳胺为原料，经中空纤维纺丝和牵伸工艺制得具有适合修复神经缺损的管径与壁厚的甲壳胺中空管，然后对所得甲壳胺中空管进行乙酰化处理，控制反应条件得到脱乙酰度15-45％的部分脱乙酰甲壳质生物套管，再进行后处理。
本发明中采用脱乙酰度≥70％的甲壳胺的稀醋酸水溶液通过中空纤维纺丝和牵伸工艺制得甲壳胺中空管，然后通过乙酰化处理回补乙酰胺基-NHCOCH3，通过控制乙酰化试剂的浓度、反应温度和时间，可以有效地控制脱乙酰度的范围。
本发明所述的中空纤维纺丝和牵伸工艺除说明书中及实施例中描述之外，还可以采用现有技术的方法及工艺参数。
其中所述的乙酰化处理的处理液为体积百分比为2-8％的醋酸酐-甲醇溶液，处理温度为室温至60℃。
其中所述的制备方法进一步包括将脱乙酰度15-45％的部分脱乙酰甲壳质套管以含促神经生长因子药物的处理液浸渍处理，得到促进神经再生功能更佳的含药物型生物套管。
所述的浸渍处理液为含促神经生长因子的海藻酸纳水溶液。
所述的后处理为用醇类溶剂洗涤、浸泡。
具体地说，本发明所述的一种引导和促进神经有效再生的可吸收性部分脱乙酰甲壳质人工生物套管的制造方法将脱乙酰度大于70％、重均分子量15至50万的甲壳胺按1-8％的浓度(W/W)溶解于1.5-6％的稀醋酸水溶液中，得到高粘度溶液，抽真空脱泡至得到无泡纺丝原液。将纺丝原液从釜中压出，经纺丝计量泵计量，从中空喷丝孔的皮层挤出，与此同时，将3-10％NaOH(W/W)水溶液凝固剂从中空喷丝孔的芯层挤出。纺丝原液挤出后直接进入3-10％NaOH(W/W)水溶液凝固浴，在外界和芯层凝固剂的同时作用下甲壳胺得以析出凝固，经导辊引出后牵伸0.5-3倍，得到连续的甲壳胺中空管，管内径一般为0.7-6mm，壁厚0.1-2mm。当用于动物试验时，管内径一般为0.7-1.5mm，壁厚优选为0.1-0.2mm；当用于临床时，管内径一般为1-6mm，壁厚为1-2mm。
将甲壳胺中空圆管用水洗涤中性，用甲醇脱水后置于10-60℃2-8％醋酸酐-甲醇溶液(V/V)中乙酰化50分钟至16小时后取出，用甲醇洗涤，再以乙醇洗涤，洗涤后浸泡于乙醇中消毒备用，所得部分脱乙酰甲壳质中空圆管，在生理盐水(0.9％NaCl水溶液)中无溶解，湿态下穿针无脆裂。
本发明所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备方法，进一步包括将所得的部分脱乙酰甲壳质中空圆管置于含0.5-2.5％海藻酸钠和5-15％促神经生长因子的水溶液中浸渍10-300分钟，处理温度4-10℃。
其中所述“促神经生长因子”可以为促进神经细胞生长的药物或活性物，如市售的NGF(神经生长因子，由第二军医大学生物制品检测中心提供)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，由丽珠医药集团股份有限公司提供)、复方红芪注射液(由北京儿科研究所与北京大学人民医院共同提供)，公知的雪旺细胞或适合本发明的其他促进神经细胞生长的药物或活性物，也可以是其一种以上的组合，如促神经生长因子为重量比NGF/bFGF/复方红芪注射液＝1/1/1.5-1/2/3。所得“含药物型生物套管”将上述药物带入体内，缓释于局部，从而起到促进神经再生的作用。添加促神经生长因子后，各个工艺环节的温度均控制为处理温度1-10℃。
进一步，上述经过处理液处理的部分脱乙酰甲壳质生物套管取出后置于含1-10％促神经生长因子、1-8％氯化钙或1-8％氯化锌或0.1-8％氯化钙和0.1-8％氯化锌的混合水溶液中浸渍。上述处理液的温度控制为4-10℃，浸渍后取出冷冻干燥，得到促进神经再生功能更佳的含药物型生物套管。
脱乙酰度反映了甲壳质大分子链上的-NHCOCH3基转化为-NH2基的程度。关于甲壳胺的概念并非是很严密的，如脱乙酰度为50％左右称甲壳胺，全部脱乙酰基也称甲壳胺，也有将能溶解于1％盐酸或醋酸的可溶性甲壳质衍生物称为甲壳胺。总的来说，脱乙酰度高者称之为甲壳胺，脱乙酰度低者称之为甲壳质。为避免混淆和叙述方便起见，在本发明中将脱乙酰度≥70％的甲壳质衍生物称为甲壳胺，将脱乙酰度15-45％范围的甲壳质衍生物称为部分脱乙酰甲壳质。本发明的研究结果发现，脱乙酰度为15-45％范围的部分脱乙酰甲壳质既具有促进雪旺氏细胞生长和抑制成纤维细胞生长的功能，又具有良好的生物相容性和降解吸收性能，从而可以避免脱乙酰度低的甲壳质对雪旺氏细胞促进性较差，而脱乙酰度高的甲壳胺生物相容性和降解吸收性能较差的矛盾。鉴于上述脱乙酰度范围的部分脱乙酰甲壳质既不能很好地溶解于适用于甲壳质的二甲基乙酰胺一氯化锂溶剂体系，又不能很好地溶解于适用于甲壳胺的稀醋酸水溶液溶解体系，本发明中采用脱乙酰度≥70％的甲壳胺的稀醋酸水溶液通过中空纤维纺丝和牵伸工艺制得甲壳胺中空管，然后通过乙酰化处理回补乙酰胺基-NHCOCH3，通过控制乙酰化试剂的浓度、反应温度和时间，可以有效地控制脱乙酰度的范围。
本发明所述“含药物型生物套管”的浸渍处理液为含促神经生长因子并具有一定粘度的海藻酸纳水溶液。海藻酸纳具有优良的生物相容性和降解可吸收性，溶于水后形成一定的粘度，从而作为促神经生长因子的载体使之附着于套管管壁，经固化后得到“含药物型生物套管”。
由于在纺丝和牵伸过程中大分子受到拉伸取向，因而所得中空管具有韧性而不易脆裂，同时所采用的制备工艺路线避免了毒性试剂二甲基乙酰胺的残留问题。
按照上述方法制造的可吸收性人工生物套管，生物相容性好，对生物体无毒性和炎症反应。易于在体内降解吸收，降解吸收周期适宜并可以人为调控。能够促进雪旺氏细胞生长和抑制成纤维细胞的生长，加入的促进神经再生因子能够缓释于神经断端，从而起到引导和促进神经有效再生的作用。将其置于神经的两断端间，进行小间隙套接，可使复杂的神经修复方法简单化、程序化，并取得理想再生效果，从而可以替代周围神经修复中传统外膜原位缝合的方法。
以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。
将SD大鼠的腓总神经于坐骨神经分叉处分出后约5mm处切断，切断处留2mm间隙，将从75％乙醇中取出并以生理盐水漂洗后备用的甲壳质生物套管置于神经两断端之间，用9-0缝线做1针套管壁神经外膜挂线缝合，然后在对侧套管端与神经外膜表面加缝1针，使神经两断端各嵌入套管内。术后第3周，显微镜下解剖观察，原切口解剖腓总神经及套管桥接体，套管周围无炎性反应，与周围组织无粘连，分界清楚，无瘢痕样组织。管壁无塌陷，神经近、远端与管腔无脱落。7周后管壁脆弱，仔细剥去管壁，见近端神经已与远端神经连接，在神经连接处无瘢痕及粘连。11周后大体观察出现展趾反射，显微镜下解剖观察见套管基本软化被组织吸收。将套管桥接部分新生神经用1％锇酸固定染色后，制成3-5μm横断切片及10μm的纵行切片，光学显微镜下观察并计数有髓神经纤维，在10×40倍下单位视野的有髓神经纤维数为10.02。取近缝合点末梢侧5mm神经节段，2.5％戊二醛固定，812树脂包埋后作成超薄切片，扫描电镜下观察，在4000-10000倍放大扫描电镜下，可见有髓神经纤维密集，髓鞘发育良好，髓鞘旁可见雪旺细胞胞质，并可见到髓鞘的分层。上述实验证明本发明所述的可吸收性人工生物套管可以有效地引导和促进神经再生。
实施例2其它同实施例1，所不同的是将实施例1中脱乙酰度82％的甲壳胺中空圆管经醋酸酐-甲醇溶液乙酰化处理后所得脱乙酰度27％的部分脱乙酰甲壳质中空圆管置于含7％神经生长因子(NGF/bFGF/复方红芪注射液＝1/1/1.5重量比)的1％海藻酸钠水溶液中浸渍30分钟，取出后置于含组成同上的7％神经生长因子、0.7％氯化钙和1％氯化锌的水溶液中浸渍20分钟，然后取出，上述各处理液的温度均控制为4-10℃。取出的套管在冷冻干燥机中冷冻干燥后置于冰箱中2-8℃保存备用。经此生化处理后的套管增重8.2％，即套管中含神经生长因子约6.5％，含海藻酸钙/海藻酸锌约1％(W/W)。术后第3周，显微镜下解剖观察，原切口解剖腓总神经及含缓释药物的生物套管桥接体，套管周围无炎性反应，与周围组织无粘连，分界清楚，无瘢痕样组织。管壁无塌陷，神经近、远端与管腔无脱落。7周后管壁脆弱，仔细剥去管壁，见近端神经已与远端神经连接，在神经连接处无瘢痕及粘连。10周后大体观察出现展趾反射，显微镜下解剖观察见套管基本被组织吸收。将套管桥接部分新生神经用1％锇酸固定染色后，制成3-5μm横断切片及10μm的纵行切片，光学显微镜下观察并计数有髓神经纤维，在10×40倍下单位视野的有髓神经纤维数为10.27。取近缝合点末梢侧5mm神经节段，2.5％戊二醛固定，812树脂包埋后作成超薄切片，扫描电镜下观察，在4000-10000倍放大扫描电镜下，可见有髓神经纤维密集，髓鞘发育良好，髓鞘旁可见雪旺细胞胞质，并可见到髓鞘的分层。
实施例3将市售脱乙酰度为70％、重均分子量45万的甲壳胺按2％浓度(W/W)溶解于6％的稀醋酸水溶液中，得到高粘度溶液，抽真空脱泡至得到无泡纺丝原液。将纺丝原液以0.8MPa空气压力从釜中压出，经纺丝计量泵计量，从中空喷丝孔的皮层挤出，与此同时，以0.3Mpa的空气压力将10％NaOH(W/W)水溶液凝固剂从中空喷丝孔的芯层挤出。纺丝原液挤出后直接进入10％NaOH(W/W)水溶液凝固浴，在外界和芯层凝固剂的同时作用下甲壳胺得以析出凝固，经导辊引出后牵伸3倍，得到连续的甲壳胺中空管，管内径6mm，管壁厚度2mm。将甲壳胺中空圆管用水洗涤至pH＝7.1，用甲醇脱水后置于50℃7％醋酸酐-甲醇溶液(V/V)中，10小时后取出，用75％乙醇洗涤，洗涤后浸泡于75％乙醇中消毒备用，所得甲壳质中空圆管的脱乙酰度为25％，在生理盐水(0.9％NaCl水溶液)中无溶解，湿态下穿针无脆裂。
体外试验及动物试验证明产物的强度、抗水溶性、生物吸收、炎症反应等性能均符合要求，该尺寸规格的产品可以用于临床。
实施例4-6表1为本发明的一种引导和促进神经有效再生的可吸收性部分脱乙酰甲壳质人工生物套管的制造方法及产品，基本采用实施例1的方法，不同之处见表1中所述。
表1
表2列出了对实施例4-6的产品进一步处理的方法及产品。表2
比较例将脱乙酰度85％、分子量35万的壳聚糖溶于2％(V/V)醋酸溶液，使壳聚糖的终浓度为2％(V/V)，充分搅拌、过滤、脱泡得壳聚糖原液，经流延、NaOH水溶液处理、洗涤得纯壳聚糖(脱乙酰度85％)膜，动物试验中在大白鼠左腿后外侧肌间隔处包埋该膜，至第6周基本未吸收，并伴有轻度的炎症反应。
权利要求
1.一种引导和促进神经有效再生的部分脱乙酰甲壳质生物套管，其特征在于所述的生物套管为脱乙酰度15-45％的甲壳质中空生物套管。
2.根据权利1所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管，其特征在于所述的生物套管为脱乙酰度25-35％的甲壳质中空生物套管。
3.根据权利要求1或2所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管，其特征在于所述的生物套管或管壁上进一步包括海藻酸盐和促神经生长因子药物。
4.根据权利要求3所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管，其特征在于其中所述促神经生长因子为NGF、bFGF、复方红芪注射液，雪旺细胞或其一种以上的组合。
5.根据权利要求1所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管，其特征在于所述的生物套管的内径0.7-6mm，壁厚0.1-2mm；适用于修复人神经缺损的套管的内径优选为1-6mm，壁厚1-2mm。
6.权利要求1所述的引导和促进神经有效再生的部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备方法，其步骤为以经过脱泡的甲壳胺的醋酸溶液为原料，经中空纤维纺丝和牵伸工艺制得甲壳胺中空管，然后对所得甲壳胺中空管进行乙酰化处理，以得到部分脱乙酰甲壳质生物套管。
7.根据权利要求6所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备方法，其中所述的乙酰化处理的处理液为体积百分比为2-8％的醋酸酐-甲醇溶液，处理温度为室温至60℃。
8.根据权利要求6或7所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备方法，进一步包括将脱乙酰度15-45％的部分脱乙酰甲壳质套管以含促神经生长因子药物的处理液浸渍处理的步骤。
9.根据权利要求8所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备方法，其中所述的浸渍处理液为含促神经生长因子的海藻酸纳水溶液。
10.根据权利要求6或7所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备方法，其步骤为将脱乙酰度大于70％、重均分子量15至50万的甲壳胺按1-8％的浓度(W/W)溶解于1.5-6％的稀醋酸水溶液中，得到高粘度溶液，使该溶液经真空脱泡至得到无泡纺丝原液。将该纺丝原液，经纺丝计量泵计量，从中空喷丝孔的皮层挤出，与此同时，将1-10wt％NaOH水溶液凝固剂从中空喷丝孔的芯层挤出。该纺丝原液挤出后直接进入1-10wt％NaOH水溶液凝固浴，经导辊引出后牵伸0.5-3倍，得到连续的甲壳胺中空管，将该甲壳胺中空圆管用水洗涤至中性，用甲醇脱水后置于醋酸酐-甲醇溶液中乙酰化至脱乙酰度15-45％后取出，用醇洗涤。
11.根据权利要求10所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备方法，其中乙酰化的温度为10-60℃，醋酸酐-甲醇溶液的体积浓度2-8％，反应时间50分钟-16小时。
12.根据权利要求8或9或10所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备方法，包括将脱乙酰度15-45％的甲壳质中空生物套管置于含0.5-2.5％海藻酸钠和5-15％促神经生长因子药物的水溶液中浸渍10-300分钟，处理温度1-10℃。
13.根据权利要求9或10所述的部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备方法，将经过处理的部分脱乙酰甲壳质生物套管取出后置于含1-10％促神经生长因子、1-8％氯化钙或1-8％氯化锌或0.1-8％氯化钙和0.1-8％氯化锌的混合水溶液中浸渍，处理温度1-10℃，然后取出置于冷冻干燥机中干燥，得到含药物型生物套管。
全文摘要
本发明公开了一种引导和促进神经有效再生的可吸收性人工生物套管及其制造方法。以甲壳胺为原料，经中空纤维纺丝和牵伸工艺制得具有所需尺寸和物理机械性能的甲壳胺中空圆管，通过对所得甲壳胺中空圆管进行乙酰化处理，得到脱乙酰度15－45％的部分脱乙酰甲壳质生物套管。以海藻酸纳水溶液为促神经生长因子的载体，使之附着于部分脱乙酰甲壳质套管的管壁，经固化后得到含药物型生物套管。本发明的可吸收性人工生物套管，生物相容性好，对生物体无毒性和炎症反应，易于在体内降解吸收，降解吸收周期适宜并可以人为调控。能够促进雪旺氏细胞生长和抑制成纤维细胞的生长，从而具有优良的引导和促进神经有效再生作用。
文档编号A61L29/00GK1411873SQ0113631
公开日2003年4月23日 申请日期2001年10月9日 优先权日2001年10月9日
发明者姜保国, 孙玉山, 傅中国, 朱庆松, 张殿英, 林华体, 李剑, 张彩霞, 任侠飞, 陆伊伦 申请人:中国纺织科学研究院, 北京大学人民医院