专利名称：用于预防激素引起的副作用的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明为预防激素如植物雌激素和甾体雌激素用药带来的副作用提供了方法和组合物。
与这种有益的效应相反，长期使用雌激素与子宫内膜癌风险增高呈现正相关性。由于孕激素可以防止子宫内膜细胞的过度增殖，通过与孕激素同时给药可以降低这种风险。因此，一种雌激素/孕激素结合的HRT方案成为具有完整子宫妇女的推荐方案。然而这种联合治疗形式明显减少了雌激素对血清脂质谱的有益效应(Lobo R.1992，孕激素在激素替代疗法中的作用；Am.J Obstet.Gynecol，1661997-2004)。此外，一些孕激素还增加乳腺癌发生风险(Staffa J.A.等1991，孕激素和乳腺癌的流行病学综述，57473-491；King R.J.B.1991，关于雌激素与孕激素在人类乳腺癌发生中的作用的讨论，J.Ster.Biochem.Molec.Bio.398111-8118)。
正如美国专利第5,516,528号中所公开的，已经开发了HRT制剂，其中包括植物雌激素如大豆异黄酮金雀异黄素和大豆黄素。第一次提到这些植物产品保健作用的是流行病学资料，资料显示以大豆为饮食原料的亚洲人罹患乳腺、子宫和其他激素依赖性癌症的发生率相对较低，表面上看来是由于大豆和大豆产品摄取量高。
尽管大豆异黄酮对体外人腺癌和乳腺癌细胞系具有抗增殖作用，但功效只在相对高浓度即15摩尔(“M”)浓度时才会出现(Constantinou，A.I.等1998，金雀异黄素可引起培养的人乳腺癌细胞的成熟并可防止裸鼠肿瘤生长，Am.J.Clin.Nutr，681426s-1430s；LeBail，J.C.等1998，黄酮类对MCF-7人乳腺癌细胞的雌激素和抗增殖活性，Cancer Lett，130209-216)。植物雌激素在所述高浓度下体外对癌细胞的抗增殖效应可能没有临床意义，因为IC50值至少比大豆型饮食获得的血药浓度要高一个数量级。
植物雌激素浓度变化范围为约0.1到10微摩尔浓度，代表了基于大豆饮食的亚洲及欧洲健康人群的基本水平。(Adlercreutz，H.等1993，日本男性植物雌激素血清浓度，Lancet 3421209-1210；Goodham等，1996，一种富含金雀异黄素和大豆黄素的大豆蛋白分离物及其对正常人体血清异黄酮浓度、血小板聚集、血脂和血清磷脂的脂肪酸成分的影响，J.Nutr，1252000-2006)。在上述较低浓度情况下，各种植物雌激素，包括金雀异黄素、counestrol、鹰嘴豆素A、芹黄素、luiolin、山奈酚和肠内酯，都可对雌激素受体阳性而不对雌激素受体阴性的人乳腺癌细胞系引起细胞增殖，因而阐明了这些化合物的雌激素效应(Wang，C.和Kurtzer，M.S，1997，植物雌激素浓度对人乳腺癌细胞DNA合成的决定性影响，Nutr.Cancer 28236-247)。
因此，尽管公开植物雌激素是HRT制剂的有益成分，但发现在健康人体中正常水平存在的植物雌激素可增加激素依赖性癌症的发病风险。
已经阐明，类胡萝卜素虾青素在啮齿类动物模型中有体内抗致癌效应(Tanaka，T.等，1995，食用天然存在的叶黄素虾青素和角黄素对氧化偶氮甲烷诱导的大鼠结肠癌发生的抑制作用，Carcinogenesis162957-2963；Tanaka，T.等，1995，天然存在的叶黄素、虾青素和角黄素对大鼠口腔癌的化学预防作用，Canc.Res，554059-4064)。
还证实类胡萝卜素八氢番茄红素具抗癌活性。通过引入在正常情况下哺乳动物细胞中缺乏的编码八氢番茄红素合酶的基因，从而阐明了八氢番茄红素的预防癌症的活性。这些细胞获得了抗激活的癌基因转染所造成的恶性转化的抗性(Nishino，H，1998，类胡萝卜素的癌症预防作用，Mutat.Res.402159-163)。
β-胡萝卜素是最早被发现具抗癌性质的类胡萝卜素(peto等1981，类胡萝卜素和癌症着重于人类干预研究的更新，Nature290201-208)。但是，β-胡萝卜素对癌症的作用的流行病学研究却出现了矛盾的结果。尽管一些研究表明β-胡萝卜素增加了癌症发病风险(Omenn等，1996，β-胡萝卜素和维生素A联合用药对肺癌和心血管疾病的作用，N.Engl.J.Med 3341150-1155)，但其他的细胞培养和动物研究结果相当一致，即β-胡萝卜素具有抗癌效应。
番茄红素是一种存在于番茄中的类胡萝卜素，具有强大的抗氧化剂和抗癌活性。研究发现，番茄红素的体外抗乳腺癌细胞增殖的效应是通过干扰IGF-1受体信号通路和细胞周期过程介导的(Karas等2000，番茄红素干扰哺乳动物癌症细胞细胞周期过程和胰岛素样生长因子I信号传导，Nutr.Cancer，36101-11)。IGF-I是一种生长因子，专性引起乳腺组织恶性转化，其血清浓度决定患乳腺癌(LeRoith，D.，Werner，H.，Beitner-Johnson，D.and Roberts，C.T.，Jr.，1995，胰岛素样生长因子受体的分子和细胞，Endocr.Rev.16143-59；Hankinson S.E.等1998，胰岛素样生长因子I循环浓度与乳腺癌发病风险，Lancet3511393-6)和前列腺癌(Chan，J.M.，Stampfer，M.J.Giovannucci，E.，Gann，P.H.，Ma，J，1998，血清胰岛素样生长因子I与前列腺癌风险前瞻性研究，Science 279563-66)的风险系数。
美国专利第5,827,900号公开了应用番茄红素体内及体外抑制癌生长，包括激素依赖性内皮癌和乳腺癌。美国专利5,827,900要求非常高的类胡萝卜素剂量水平。‘900专利公开了其作为例证的番茄红素剂量为每天7毫克/公斤体重到20毫克/公斤体重。因此，‘900专利方法对体重70公斤(154 lbs.)的人来说，就要求每天490毫克到1400毫克的剂量。
在膳食增补剂中番茄红素和大豆异黄酮的组合应用，已被美国专利5,904,924公开。‘924专利公开了含有大豆异黄酮(植物雌激素)和番茄红素的营养性粉末组合物。‘924专利只提到了植物雌激素降低雌激素依赖性癌症发病风险的能力。‘924专利完全没有公开饮食性摄取植物雌激素招致健康副作用的风险，并且这种风险可被同时摄取类胡萝卜素减小。
美国专利第5,830,887号和第5,807,586号已公开了膳食增补剂中植物雌激素的用途。美国专利5,807,586公开了供妇女用的含有类胡萝卜素混合物、维生素A和植物雌激素的膳食添加剂组合。‘586专利公开的维生素A和类胡萝卜素混合物的剂量范围为约400到约2000微克视黄醇当量(“RE”)。1RE等于约6微克β-胡萝卜素和约12微克α-胡萝卜素或隐黄素。因此，‘586专利公开的剂量范围约等于约2.4-12毫克β-胡萝卜素和约4.8-24毫克α-胡萝卜素或隐黄素。既然番茄红素和叶黄素没有明显维生素A原活性，这些类胡萝卜素的RE值就无法计算。然而，‘586专利公开的剂量水平只以RE单位表示。因此，对那些没有明显维生素A原活性的类胡萝卜素如番茄红素和叶黄素，‘586专利公开内容没有限制其剂量水平。
本发明涉及用于预防摄入以下物质可能伴有的副作用的方法和组合物含有激素如雌激素、植物雌激素和孕激素的药用组合物、食品、营养添加剂或营养剂。所述副作用包括但不限于各种类型癌症的发病风险增高。先前已公开，服用植物雌激素有利于降低癌症的发病风险。然而，已经发现植物雌激素的摄入可引发激素依赖性癌症发病风险的增高。
因此，长久以来人们渴求一种方法和组合物用于预防以下物质的摄入可能导致的副作用，这些物质包括含有植物雌激素、甾体雌激素和/或孕激素的食品、药用组合物、营养添加剂或营养剂。同时，也需要一种组合物用于预防摄入含有激素如甾体雌激素和孕激素的药用组合物而导致的副作用，同时不抑制所述激素的有益作用。
所以，本发明的目的之一就是提供一种方法，用来抑制含有植物雌激素和孕激素的食品添加剂或膳食添加剂的摄入可能导致的副作用。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，用于防止含有植物雌激素和孕激素的食品添加剂或膳食添加剂的摄入可能导致的副作用。
此外，本发明再一目的是提供一种新型含激素的药用组合物，其副作用轻微，针对所述激素可能具有的副作用，从而克服先有技术已知的药用组合物的缺陷。
本发明其他的目的会随说明的展开而明朗。
相应地，本发明方法的目的是预防激素替代疗法中雌激素和/或孕激素给药带来的副作用，同时并不抑制所述激素的有益作用。
本发明的另一目的是提供一种方法来预防植物雌激素给药带来的副作用。本发明要求保护的方法的再一目的是预防植物雌激素给药带来的副作用，同时并不抑制所述激素的有益作用。
本发明进一步提供了可用来预防激素用药带来的副作用的组合物。本发明的组合物可以是适用于人类一日用药一次的单位剂型。
本发明的目的之一是提供一种组合物用来预防植物雌激素给药带来的副作用。
本发明的进一步目的是提供一种组合物用来预防甾体激素或孕激素给药带来的副作用。
本发明的另一目的是提供一种组合物用来预防植物雌激素、甾体激素或孕激素给药带来的副作用，同时并不抑制所述激素的有益作用。
图2番茄红素抑制金雀异黄素和雌二醇诱导的对激素依赖性恶性细胞的刺激作用。
图3番茄红素对在金雀异黄素和IGF-1存在下培养的乳腺癌细胞的作用。
图4各种类胡萝卜素抑制雌二醇和金雀异黄素诱导的ECC-1子宫内膜癌细胞增殖。
图5番茄红素以剂量依赖形式抑制雌二醇和金雀异黄素诱导的ECC-1子宫内膜癌细胞增殖。
图6番茄红素和八氢番茄红素对金雀异黄素诱导的ECC细胞增殖的联合作用。
本发明最佳实施方案详述以下说明书阐明本发明最佳实施方案。下述说明不能解释为对本发明的限制，应理解为技术熟练者可对本发明进行许多显而易见的变更。
整个说明书中使用的“激素”是指来自于高等植物的甾体雌激素、孕激素和非甾体雌激素(植物雌激素)以及化学修饰衍生物、合成等同物的它们的混合物。
整个说明书中使用的“甾体雌激素”或“雌激素”是指雌二醇、雌酮、雌三醇、合成等同物、化学修饰衍生物及其混合物。
整个说明书中使用的“孕激素”是指可引起孕酮效应的物质，例如孕酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、炔诺孕酮、合成等同物、化学修饰衍生物及其混合物。
整个说明书中使用的“植物雌激素”是指大豆蛋白异黄酮、黄酮以及其葡萄糖苷、马来酰基葡萄糖苷和乙酰基葡萄糖苷衍生物、合成等同物、化学修饰衍生物及其混合物。例证性植物雌激素包括例如大豆黄素、金雀异黄素和黄豆黄素。
整个说明书中使用的“给药”或“用药”是指通过各种途径中的一种或多种途径包括口服、皮肤、阴道、子宫内、肌肉内或静脉注射将药物导入患者。
可用于本发明的类胡萝卜素包括但不限于番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、黄体素、玉米黄素、隐黄素、虾青素及其混合物。整个说明书中的类胡萝卜素为天然或合成来源的类胡萝卜素或来源于遗传修饰生物体的类胡萝卜素。
本发明提供一种方法，用来预防没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而可能引起的副作用，本方法包括给上述患者服用至少一种类胡萝卜素，且用药剂量可有效预防所述副反应。所述类胡萝卜素可以以独立于所述激素的组合物给药或以还含有所述激素的组合物给药。
本发明方法中可给予单一类胡萝卜素及给予组合类胡萝卜素或给予类胡萝卜素混合物。令人惊讶地发现，各种番茄红素、八氢番茄红素、六氢番茄红素的组合在预防激素给药引起的副作用方面表现出有益的协同效应。相应地，类胡萝卜素混合物番茄红素和八氢番茄红素；番茄红素和六氢番茄红素；番茄红素、八氢番茄红素和六氢番茄红素都可在本发明要求保护的方法中使用。
在消费含植物雌激素的产品时，患者血清中植物雌激素的生理浓度可达0.4到4微摩尔水平。
图1A说明，培养ECC-1子宫内膜癌细胞时，植物雌激素金雀异黄素或大豆黄素，或存在于大豆提取物的二者的混合物，在这样的浓度范围内时，可引发细胞增殖率的显著增高(用cpm表示，每分钟计数)。因此，植物雌激素浓度达到这种水平的患者患某些类型癌症的风险增高，尤其是子宫内膜和乳腺癌。
图2通过在有或无番茄红素存在的两种情况下，对比培养癌症细胞在植物雌激素金雀异黄素和雌二醇浓度逐渐增高下的细胞增殖率，说明了这个效应。很清楚地表明，番茄红素的存在充分抑制了金雀异黄素引起的细胞增殖率增高。同样的效应在子宫内膜癌细胞(图2，上图)和乳腺癌细胞(图2，下图)中也可看到。这种抑制效应在图4中得到进一步证实，其中可清楚看出不仅番茄红素，而且类胡萝卜素如虾青素、八氢番茄红素和β-胡萝卜素都是植物雌激素金雀异黄素引起的细胞增殖的有效抑制剂。
当消费了含有植物雌激素的食品或饮食增补剂后，植物雌激素的生理浓度很快会高于约10微摩尔。这样的水平超过了0.4到4微摩尔这一人类消费植物雌激素后的稳定状态植物雌激素生理浓度范围。图1B说明了这种短暂的高浓度雌激素可诱发细胞增殖，并因此增加了癌症发病风险。图1B说明培养ECC-1子宫内膜癌细胞时，40微摩尔水平的大豆黄素或金雀异黄素，或存在于大豆提取物的二者的混合物，在培养第一天即可引发细胞增殖率的显著增高。植物雌激素的抑制效应从接种的第二天才变得显著。本发明方法可有效抑制由消费含植物雌激素的产品或组合物后，很快产生的这种高植物雌激素水平引起的副作用。
根据本发明实施方案，没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而引起的副作用，可通过与有效预防所述副作用的剂量的至少一种类胡萝卜素共同给药来加以预防。本发明方法包括预防所述副作用却不抑制所述植物雌激素的有益作用。
类胡萝卜素给药剂量从每天约2毫克到约10毫克，优选从每天约2毫克到约6毫克，最优选每天约2毫克。没有明显维生素A原活性的类胡萝卜素，例如ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、黄体素、玉米黄素、虾青素和番茄红素，优选给药剂量为每天约2毫克。
当本发明方法包括给予患者至少一种选自α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、隐黄素的类胡萝卜素时，所述类胡萝卜素优选用药剂量为每天约2毫克。
本发明方法也可用来预防没有可检测到的癌症的患者使用激素如雌激素和孕激素而可能引起的副作用。所述方法可用于例如激素替代疗法，由此激素可与用药量足以预防所述激素引起的副作用的至少一种类胡萝卜素联合用药。所述类胡萝卜素可以以与所述激素分离的组合物给药，或以另外含有所述激素的组合物给药。
本发明要求保护的方法对激素替代疗法有特殊的帮助作用。仅使用雌激素的激素替代疗法，或雌激素替代疗法存在子宫内膜癌的风险。在减少这种风险的尝试中，经常使用包括雌激素/孕激素联合用药的激素替代疗法。然而，这种用药形式可减少雌激素的有益效应。而且，一些孕激素可使得乳腺癌发病风险增高。本发明方法可预防雌激素和孕激素用药带来的副作用，同时并不抑制传统激素替代疗法中激素的有益活性。在另一实施方案中，本发明方法用于预防IGF-1水平升高引起的累加副作用。IGF-1天然存在于正常健康人的血清中。然而，当IGF-1水平升高时，就构成了乳腺癌和前列腺癌的显著风险因子。因此，在IGF-1水平提高的个体中，激素用药引发的癌症发病风险就增高了。由IGF-1水平提高和激素消费联合引起的累加副作用，可由给以用药量足以预防所述副作用的至少一种类胡萝卜素来预防。
在再一实施方案中，本发明方法用于预防无激素存在情况下IGF-1水平提高引起的副作用。当IGF-1水平升高时，即使无激素存在，也会构成某些癌症的显著风险因子。这些由IGF-1水平升高引起的副作用，包括癌症风险升高，都可由给以用药量足以预防所述副作用的至少一种类胡萝卜素来预防。
本发明提供了可用于预防激素用药引起的副作用的组合物。这些副作用包括例如癌症发病风险的增高。本发明组合物是适于人类用药的单位剂型。本发明组合物包含生理有效量的至少一种激素和用药剂量可有效预防所述副作用的至少一种类胡萝卜素。本发明要求保护的组合物可预防激素用药引起的副作用，并且不抑制所述激素的有益活性。
本发明组合物中可使用单一类胡萝卜素以及其组合物或混合物。令人惊讶地发现，各种组合的番茄红素、八氢番茄红素、六氢番茄红素在预防激素给药引起的副作用方面表现出有益的协同效应。相应地，类胡萝卜素混合物番茄红素和八氢番茄红素；番茄红素和六氢番茄红素；番茄红素、八氢番茄红素和六氢番茄红素都可用于本发明要求保护的组合物。当给予所述混合物时，优选番茄红素和八氢番茄红素的混合物。
本发明组合物可有效抑制由消费含植物雌激素的产品或组合物后，很快产生的植物雌激素水平升高引起的副作用(见图1和2)。
给消费植物雌激素的患者同时服用至少一种类胡萝卜素，用药剂量每天约2毫克，可减少由消费植物雌激素引起的癌症发病风险。本发明包括适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种雌激素和至少一种类胡萝卜素，后者的优选剂量为约2毫克。最好类胡萝卜素用量足以使所述类胡萝卜素有效血清浓度达到约1.5微摩尔。
当本发明组合物中包括至少一种植物雌激素时，类胡萝卜素优选没有明显维生素A原活性。没有明显维生素A原活性的类胡萝卜素包括例如番茄红素、ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、黄体素、玉米黄素和虾青素。当所述类胡萝卜素包含多种类胡萝卜素的混合物时，这些混合物优选包含番茄红素和六氢番茄红素；更优选包含番茄红素、六氢番茄红素和八氢番茄红素；最优选包含番茄红素和八氢番茄红素。
本发明进一步的实施方案是适合人类一日一次给药的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种激素以及至少一种类胡萝卜素，所述激素选自甾体雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、孕激素、炔诺孕酮和孕酮，其中所述类胡萝卜素的用量能够有效预防所述激素用药可能带来的副作用。这种单位剂型可预防所述激素引起的副作用，同时不抑制所述激素的有益活性。优选类胡萝卜素剂量为约2到约10毫克，更优选类胡萝卜素剂量为约2到约6毫克，最优选约2毫克。最好，类胡萝卜素用量足以引起所述类胡萝卜素有效血清浓度达到约1.5微摩尔浓度。当所述类胡萝卜素包含多种类胡萝卜素的混合物时，所述混合物优选包含番茄红素、八氢番茄红素和六氢番茄红素；更优选包含番茄红素、六氢番茄红素和八氢番茄红素。
本发明要求保护的包含至少一种甾体雌激素或孕激素的组合物对治疗女性绝经的激素替代疗法有特殊的帮助作用。常规的激素替代疗法用于绝经治疗时，可引起某些癌症发病风险增高。本发明组合物可用于激素替代疗法，同时也可预防甾体雌激素或孕激素用药引发的副作用，例如癌症发病风险增高。本发明要求保护的组合物可预防所述副作用，同时不抑制所述激素的有益活性。
本发明组合物可用于预防植物雌激素和共同摄入的生长因子IGF-1水平升高对细胞增殖产生的累加副作用。IGF-1天然存在于正常健康人的血清中，然而，当IGF-1水平升高时，可显著增加乳腺癌和前列腺癌的发病风险。图3A说明了培养激素依赖性MCF-7乳腺癌癌细胞时，金雀异黄素(用量范围为约0.4到4微摩尔浓度)和IGF-1(30纳摩尔浓度)与只用金雀异黄素加以刺激的对照组相比，可显著增高细胞增殖率。增加3到5微摩尔浓度范围的番茄红素，可抑制组合存在的IGF-1和金雀异黄素激发的细胞增殖。相应地，包含至少一种植物雌激素和至少一种类胡萝卜素的本发明组合物可给予IGF-1水平增高的患者以预防IGF-1水平增高所引发的累加副作用。
本发明将在以下实施例中进行进一步解释，这是更进一步地描述而不是限制本发明范围。
实施例通用方法类胡萝卜素的来源和溶液番茄红素(≥97％)提取于5％番茄油树脂，如美国专利5,827,900所述。合成番茄红素购自Sigma Chemical Co.(以色列)，虾青素和β-胡萝卜素也购自此公司。八氢番茄红素提取自番茄提取物，LycoredNatural Products Industries Ltd.，Beer Sheva，以色列。
四氢呋喃(THF)含0.25％丁基化羟甲苯，将其加入纯化的类胡萝卜素中作为抗氧化剂。类胡萝卜素用2毫摩尔浓度THF溶解，并于-70℃保存。临用前，解冻贮备液并在氮气下加入细胞培养基中，然后剧烈搅拌。用Millex-HV滤器(Millipore)过滤，去除沉淀。在经2-丙醇和n-己烷∶二氯甲烷提取后，培养基中类胡萝卜素终浓度用光谱法测定，如美国专利5,827,900所述。
THF的最终浓度0.5％对测得的参数没有任何显著影响。所有过程避光操作。激素、生长因子和其他细胞培养物质雌二醇、金雀异黄素和大豆黄素购自Sigma Chemical.(以色列)。含有15％金雀异黄素、15％大豆黄素和1％黄豆黄素的大豆提取物购自Kikkoman，(Chiba-ken，日本)。人重组IGF-1购自GroPep，(Adelaide，澳大利亚)。Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FCS)和不含Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液购自Biological Industries(Beth Haemek，以色列)。细胞系人子宫内膜癌(雌激素依赖型)细胞系ECC-1开发自Dr.P.G.Satyaswaroop，宾夕法尼亚州立大学，宾夕法尼亚州，美国，惠赠自Dr.R.Oregan，西北大学，芝加哥，依利诺依州，美国。人乳腺癌细胞系MCF-7(雌激素依赖型)和MDA-231(激素非依赖型)得自于美国典型培养物保藏中心(洛克维尔，马撒诸塞州，美国)。细胞培养和细胞增殖分析细胞在DMEM中培养，含青霉素(100U/毫升)，链霉素(0.1毫克/毫升)，制霉菌素(12.5微克/毫升)，胰岛素(0.6微克/毫升)和10％FCS。根据Vignon等(1987，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1461502-8)的程序，连续在不含酚红、含有10％然后3％的活性炭吸附过的FCS的培养基中传代使细胞去除内源性类固醇。细胞接种于96孔板中(每孔5000个细胞)，培养基为DMEM，含3％活性炭吸附过的FCS。一天后，培养基更换为只含有溶解的类胡萝卜素或THF的培养基。此培养基每天更换以确保类胡萝卜素的连续供应。
培养后，细胞数目和细胞增殖率通过[3H]标记的胸苷掺入细胞DNA的掺入情况来估算，见美国专利第5,827,900号。细胞生长情况也可在胰蛋白酶作用后并在Isotone-II(Coulter Electronics，卢顿，英格兰)中稀释后，用Coulter计数器进行直接细胞计数来测量。两种方法相关性良好。
实施例1异黄酮对ECC-1子宫内膜癌细胞增殖的刺激作用。
将ECC-1细胞在浓度递增的大豆产品两种主要的异黄酮金雀异黄素和大豆黄素以及大豆提取物一同培养。3天后，细胞增殖通过[3H]标记的胸苷掺入DNA来测定(图1A)。金雀异黄素、大豆黄素和大豆提取物在0.4和4微摩尔浓度皆可刺激细胞增殖，这一浓度范围也可见于大豆补偿性个体的血清中。在更高的非生理性浓度(≥10微摩尔浓度)时，经过3天培养后金雀异黄素和大豆提取物而不是大豆黄素可抑制细胞增殖(图1A)。这些结果说明，金雀异黄素对子宫内膜癌细胞生长具有双重效应，而大豆黄素只具刺激作用。
此外，ECC-1细胞只用单一高浓度(40微摩尔)的金雀异黄素、大豆黄素和大豆提取物分别培养，在3天期间内每天分析细胞增殖情况。结果如图1B所示，培养一天后高浓度异黄酮也可刺激细胞增殖，金雀异黄素的抑制效应只在培养第二天见到。这些结果表明，短暂提高的异黄酮水平，特别是金雀异黄素的水平，以及通常细胞生长抑制相关水平，实际上会在大豆补偿性个体中起刺激作用。
实施例2番茄红素抑制金雀异黄素和雌二醇对激素依赖性恶性细胞的刺激作用。
考察了雌二醇和金雀异黄素的补充给药法对激素依赖型细胞系MCF-7乳腺癌和ECC-1子宫内膜癌的增殖的比较效应(图2)。在每种细胞系中，金雀异黄素对增殖表现出双重效应，低浓度刺激而高浓度抑制(图2)，如实施例1所证实。雌二醇在每个测试浓度(1和10nM)时对细胞生长只具有刺激作用(图2)。这些结果表明金雀异黄素的刺激效应可能是因为其具有雌激素作用。
如上所述，金雀异黄素或雌二醇都可刺激细胞培养，在培养基中补充番茄红素，培养三天后分析细胞生长情况。如图2所示，番茄红素补充给药在3到5微摩尔浓度可显著抑制两种受试激素依赖性癌细胞系的基础生长和雌激素诱导(金雀异黄素或雌二醇)的生长。
实施例3番茄红素抑制激素依赖型和激素非依赖型乳腺癌细胞的IGF-1刺激性生长。
图3表明，IGF-1(30纳摩尔浓度)补充给药对激素依赖型MCF-7乳腺癌细胞(A图)和激素非依赖型MDA-231乳腺癌细胞(B图)生长都有显著刺激作用。在MCF-7细胞中，由于IGF-1(图3A)的存在，使得金雀异黄素的刺激效应进一步增强。MDA-231受IGF-1而不受金雀异黄素刺激。因此，金雀异黄素不仅刺激激素依赖型癌细胞增殖，同时IGF-1象其他生长因子一样可对此效应进一步增强。
如上细胞培养补充给药外，补充番茄红素3到5微摩尔浓度。如图3所示，番茄红素可抑制IGF对激素依赖型和激素非依赖型乳腺癌细胞系的刺激作用。就MDA-231细胞来说，细胞增殖减到低于对照组的水平。
实施例4各种类胡萝卜素抑制雌二醇和金雀异黄素诱导的ECC-1细胞增殖。
ECC-1激素依赖型细胞系用雌二醇(10纳摩尔浓度，图4)或金雀异黄素(1微摩尔浓度，图4)刺激，并另外补充各种类胡萝卜素进行培养试验。结果清楚地表明，所有受试类胡萝卜素(番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素以及八氢番茄红素和六氢番茄红素的混合物)皆可有效抑制雌二醇和金雀异黄素诱导的细胞增殖。
实施例5番茄红素以剂量依赖方式抑制雌二醇和金雀异黄素诱导的ECC-1子宫内膜癌细胞增殖。
激素依赖型子宫内膜癌细胞系ECC-1用雌二醇(10纳摩尔浓度，图5)或金雀异黄素(1微摩尔浓度，图5)刺激，并另外补充各种浓度番茄红素进行培养试验。结果清楚地表明，番茄红素浓度升高时抑制所用增强，番茄红素各种测试浓度皆可有效抑制雌二醇和金雀异黄素诱导的细胞增殖。番茄红素最低测试浓度(0.9微摩尔浓度)在人血清生理浓度范围内。
实施例6MCF-7乳腺癌细胞用金雀异黄素(4微摩尔浓度)刺激，并另外补充番茄红素或八氢番茄红素或两者的组合物，在两种生理浓度下(图6A)或比生理浓度约大一个数量级的浓度下(图6B)进行培养试验。结果表明，高的非生理浓度的各种类胡萝卜素可有效显著抑制植物雌激素诱导的细胞增殖，两者组合效果更佳(图6B)。在低生理浓度情况下，番茄红素临界性有效抑制植物雌激素诱导的细胞增殖，而八氢番茄红素无效。然而，番茄红素和八氢番茄红素的组合物在生理浓度下有效显著抑制植物雌激素诱导的细胞增殖。
尽管本发明所述实施方案已通过例证方式加以说明，很明显，可在不背离本发明宗旨或不超出本权利要求范围内对本发明进行各种修饰、变动和修改。
权利要求
1.一种用于预防没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而可能引起的副作用的方法，该方法包括给予所述患者至少一种类胡萝卜素，其用药剂量为每天约2-10毫克。
2.权利要求1的方法，其中所述类胡萝卜素的使用剂量为每天约2-6毫克。
3.权利要求1的方法，其中所述类胡萝卜素的使用剂量为每天约2毫克。
4.一种用于预防没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而可能引起的副作用方法，该方法包括给予所述患者至少一种没有明显维生素A原活性的类胡萝卜素，其用药剂量为每天约2毫克。
5.一种用于预防没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而可能引起的副作用的方法，该方法包括给予所述患者至少一种类胡萝卜素，其用药剂量为每天约2毫克，其中所述类胡萝卜素选自α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和隐黄素。
6.权利要求1、4或5任一项的方法，其中所述类胡萝卜素的用量足以使所述类胡萝卜素的有效血清浓度达到约1.5微摩尔。
7.权利要求1、4或5任一项的方法，其中所述激素包括植物雌激素、非甾体雌激素或其混合物。
8.权利要求1、4或5任一项的方法，其中所述激素包括甾体雌激素、孕激素或其混合物。
9.权利要求1或4的方法，其中所述类胡萝卜素为番茄红素。
10.权利要求1或4的方法，其中所述类胡萝卜素选自番茄红素、ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、黄体素、玉米黄素和虾青素。
11.权利要求1-4任一项的方法，其中所述类胡萝卜素包括番茄红素和八氢番茄红素的混合物。
12.权利要求1-4任一项的方法，其中所述类胡萝卜素包括番茄红素和六氢番茄红素的混合物。
13.权利要求1-4任一项的方法，其中所述类胡萝卜素包括番茄红素、八氢番茄红素和六氢番茄红素的混合物。
14.权利要求1、4或5任一项的方法，其中所述类胡萝卜素以独离于所述激素的组合物与所述激素同时给药。
15.权利要求1、4或5任一项的方法，其中所述类胡萝卜素以进一步含有所述激素的组合物与所述激素同时给药。
16.一种用于预防没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而可能引起的副作用的方法，其中所述激素选自雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、炔诺孕酮、孕激素和孕酮，该方法包括给予所述患者至少一种没有明显维生素A原活性的类胡萝卜素，其用药剂量为每天约2-10毫克，同时不会抑制所述激素的有益作用。
17.一种用于预防没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而可能引起的副作用的方法，其中所述激素选自雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、炔诺孕酮、孕激素和孕酮，该方法包括给予所述患者至少一种没有明显维生素A原活性的类胡萝卜素，其用药剂量为每天约2-6毫克，同时不会抑制所述激素的有益作用。
18.一种用于预防没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而可能引起的副作用的方法，其中所述激素选自雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、炔诺孕酮、孕激素和孕酮，该方法包括给予所述患者至少一种没有明显维生素A原活性的类胡萝卜素，其用药剂量为每天约2毫克，同时不会抑制所述激素的有益作用。
19.一种用于预防没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而可能引起的副作用的方法，其中所述激素选自雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、炔诺孕酮、孕激素和孕酮，该方法包括给予所述患者至少一种选自α-胡萝卜素、隐黄素的类胡萝卜素，其用药剂量为每天约2毫克，同时不会抑制所述激素的有益作用。
20.权利要求16-18任一项的方法，其中所述类胡萝卜素选自番茄红素、ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、黄体素、玉米黄素和虾青素。
21.权利要求16-18任一项的方法，其中所述类胡萝卜素包括番茄红素和八氢番茄红素的混合物。
22.权利要求16-18任一项的方法，其中所述类胡萝卜素包括番茄红素和六氢番茄红素的混合物。
23.权利要求16-18任一项的方法，其中所述类胡萝卜素包括番茄红素、八氢番茄红素和六氢番茄红素的混合物。
24.权利要求16-19任一项的方法，其中所述类胡萝卜素以独立于所述激素的组合物与所述激素同时给药。
25.权利要求16-19任一项的方法，其中所述类胡萝卜素以进一步含有所述激素的组合物与所述激素同时给药。
26.一种适合人类用药的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种激素以及至少一种类胡萝卜素，其中所述激素选自甾体雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、孕激素、炔诺孕酮和孕酮，其中所述类胡萝卜素的用量能够有效预防所述激素用药可能带来的副作用。
27.一种适合人类用药的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种激素以及至少一种类胡萝卜素，其中所述激素选自甾体雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、孕激素、炔诺孕酮和孕酮，其中所述类胡萝卜素的用量能够有效预防所述激素用药可能带来的副作用，同时不会抑制所述激素的有益作用。
28.权利要求26和27任一项的单位剂型，其中所述类胡萝卜素的剂量为约2-6毫克。
29.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种激素以及至少一种类胡萝卜素，其中所述激素选自甾体雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、孕激素、炔诺孕酮和孕酮，其中所述类胡萝卜素的用量能够有效预防所述激素用药可能带来的副作用。
30.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种激素以及至少一种类胡萝卜素，其中所述激素选自甾体雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、孕激素、炔诺孕酮和孕酮，其中所述类胡萝卜素的用量能够有效预防所述激素用药可能带来的副作用，同时不会抑制所述激素的有益作用。
31.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种激素以及至少一种类胡萝卜素，其中所述激素选自甾体雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、孕激素、炔诺孕酮和孕酮，其中所述类胡萝卜素的用量为约2-10毫克。
32.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种激素以及至少一种类胡萝卜素，其中所述激素选自甾体雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、孕激素、炔诺孕酮和孕酮，其中所述类胡萝卜素的用量为约2-6毫克。
33.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种激素以及至少一种类胡萝卜素，其中所述激素选自甾体雌激素、雌二醇、雌酮、甲羟孕酮、炔诺酮、norethisterone、孕激素、炔诺孕酮和孕酮，其中所述类胡萝卜素的用量为约2毫克。
34.根据权利要求26-33任一项的单位剂型，其中所述类胡萝卜素选自番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、黄体素、玉米黄素、隐黄素和虾青素。
35.根据权利要求26-33任一项的单位剂型，其中所述类胡萝卜素包括番茄红素和六氢番茄红素的混合物。
36.根据权利要求26-33任一项的单位剂型，其中所述类胡萝卜素包括番茄红素和八氢番茄红素的混合物。
37.根据权利要求26-33任一项的单位剂型，其中所述类胡萝卜素包括番茄红素、八氢番茄红素和六氢番茄红素的混合物。
38.根据权利要求26、27、32或33任一项的单位剂型，其中所述类胡萝卜素的用量足以使该类胡萝卜素的有效血清浓度达到约1.5微摩尔。
39.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种植物雌激素以及至少一种类胡萝卜素，所述类胡萝卜素选自ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、黄体素、玉米黄素和虾青素，其中所述类胡萝卜素的用量为约2毫克。
40.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种植物雌激素以及至少一种类胡萝卜素，所述类胡萝卜素选自ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、黄体素、玉米黄素和虾青素，其中所述类胡萝卜素的用量足以使该类胡萝卜素的有效血清浓度达到约1.5微摩尔。
41.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种植物雌激素以及番茄红素和八氢番茄红素的混合物，其中所述混合物的用量为约2毫克。
42.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种植物雌激素以及番茄红素和六氢番茄红素的混合物，其中所述混合物的用量为约2毫克。
43.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种植物雌激素以及番茄红素、八氢番茄红素和六氢番茄红素的混合物，其中所述混合物的用量为约2毫克。
44.一种适合人类一日用药一次的单位剂型，它包含生理有效量的至少一种植物雌激素以及至少一种选自α-胡萝卜素、隐黄素的类胡萝卜素，其中所述类胡萝卜素的用量为约2毫克。
45.权利要求44的单位剂型，其中所述类胡萝卜素的用量足以使该类胡萝卜素的有效血清浓度达到约1.5微摩尔。
全文摘要
本发明公开了一种预防没有可检测到的癌症的患者使用至少一种激素而可能引起的副作用，包括给所述患者服用至少一种类胡萝卜素。本发明方法可用于预防各种由激素用药引起的副作用，包括例如用于防止癌症发生风险增高。本发明要求保护的方法可预防这些副作用，同时并不抑制所述激素的有益作用。本发明进一步提供了可用于预防激素用药副作用的组合物。本发明所述组合物可以为适用于人类每日用药的单位剂型。
文档编号A61K31/56GK1434707SQ01810131
公开日2003年8月6日 申请日期2001年3月28日 优先权日2000年3月29日
发明者J·利维, Y·沙罗尼 申请人:利库德天然产品工业有限公司