主链环化的促黑皮质素激素(αMSH)类似物的制作方法

专利名称：：主链环化的促黑皮质素激素(αMSH)类似物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及促黑皮质素激素(aMSH)类似物(melanocortinstimulatinghormone(aMSH)analogs)、含有所述促黑皮质素激素类似物的药物组合物以及使用这样的化合物来治疗包括肥胖症的代谢紊乱的方法。
背景技术：
：肥胖症的治疗世界范围内的肥胖症患病率日渐增长并且目前被认为是二十一世纪西方世界的主要流行病。美国超过50%的人口被认为超重，其中超过25%的人被诊断为临床上的肥胖。统计数据显示肥胖症始于年轻时期——15%的儿童和少年体重超重，该数据比25年前所报道的高出3倍。因此，研究预防肥胖症的疗法具有明确的经济和医学理据。目前，全世界的许多科学家和制药公司正在探索适于解决此问题的药理学解决方案。已知较高的身体肥胖是II型糖尿病最高的风险因素，并且是心血管疾病的高风险因素。肥胖症^皮^H人为以下的风险因素高血压、动月永粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、胆嚢疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停；生殖障碍(reproductivedisorders)，如多嚢卵巢综合征、乳腺癌、前列腺癌和直肠癌；以及全身麻醉并发症增加的发病率(参见，如，Kopelman,Nature404:635-43,2000)。肥胖症缩短寿命并且带来如上所述的并存病(co-morbidities)以及诸如以下疾病的严重风险感染、静脉曲张、黑棘皮症、湿渗、运动不耐受(exerciseintolerance)、胰岛素抵抗、高血压、高胆固醇血症、胆石症、矫形损伤(orthopedicinjury)和血才全栓塞性疾病(Rissanen等人，BMJ301:835-7,19卯)。肥胖症还是称为胰岛素抵抗综合征或"X综合征"的病症组的风险因素。肥胖症是由进入身体的卡路里数量与同时被利用和消耗的能量之间的慢性失调引起的。因此，食用高卡路里的食物并且缺乏体育活动可导致肥胖。尽管在食物利用率和体育活动方面存在很大变动，但是哺乳动物中的能量储存却保持着相对的恒定。通过受瘦素激发的内分泌反馈回路来实现这种严密的调节。由脂肪细胞产生的瘦素向下丘脑发送营养状况的信号。血浆中瘦素的浓度与脂肪组织的质量有关并且在禁食期间下降。瘦素信号触发了涉及调节食欲和能量消耗的神经肽的神经内分泌响应。瘦素中的一部分还影响脑垂体的分泌，从而介导了以下与食物剥夺相关联的适应性激素反应循环曱状腺激素水平的变化、生殖能力和线性生长的抑制。促进食^t的肽(神经肽Y、食欲肽等)受到瘦素的抑制，相反瘦素激发了^L食欲减退的信号。目前，所有可获得的用于治疗肥胖症的药物均是次优的。当前可获得的肥胖症的治疗包括奥利司他和西布曲明。奥利司他(四氢泥泊司它汀(tetrahydrolipstatin))是由链霉菌属的霉菌生成的天然脂肪酶抑制剂获得的合成药物。该药物与胰脂肪酶的活性位点共价结合，所述胰脂肪酶是负责甘油三酯水解的主要的酶，甘油三酯占饮食脂肪的99%;该药物还抑制了其它肠和肠外的脂肪酶，但是所述药物的作用局限于肠腔，原因是其基本上为非吸收性的。治疗剂量的奥利司他(每天3次，每次120mg)阻断了大约30%的饮食脂肪的消化和吸收，这只占其重量减轻作用的部分而非全部，剩下的可归因于患者选^^避免能够引起胃肠道副作用的高脂肪食物。西布曲明是中枢作用食欲抑制剂，其也具有温和的产热性能。西布曲明通过增强于下丘脑和其他脑部区域作用以诱导负能不足的两种一元胺(即5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素)的作用而起作用。当在啮齿类和低级的灵长类中进行中枢注射时，5-HT和去甲肾上腺素均抑制食物掘^取并通过刺激至产热组织的交感神经传出而增加能量消耗。西布曲明阻断两种一元胺的重摄取，并由此提高所述一元胺在突触间隙中的利用率；与芬氟拉明不同的是，西布曲明并未促进5-HT从5-羟色胺能神经末梢的释放。去曱肾上腺素重摄取的抑制增加了交感紧张，其结果包括所希望的产热作用和不希望的心血管副作用一一血压和脉率的升高。由于西布曲明对两种一元胺的作用，而使其被称为"SNRT(5-羟色胺/去曱肾上腺素重摄取抑制剂)。新型抗肥胖药物的潜在的CNS靶包括食物摄取和能量调节中所涉及的各种肽。这些肽是有关转化为口服活性的抗肥胖药物的热点研究的主题。这些肽包括神经肽Y(NPY)、食欲肽和黑皮质素。应强调的是这些肽类似物不能跨越肠壁，因而不具有口服生物利用度。黑皮质素激动肽一种被提议用于这种显著健康问题的药物疗法的解决方案是调节身体中控制食物消耗和代谢平衡的生物化学通路。"黑皮质素通路"是关键的能量平衡内分泌调节系统(Cummings和Schwartz2000,NatGenet.26(1):8-9)。用于控制热量摄取的药理学方法的现有技术集中于"黑皮质素通路，，反馈级联过程的晚期。该过程包括将分解代谢的内源性神经肽促黑皮质素激素(aMSH)结合于其黑皮质素亚型4(MC4)受体，从而产生对抗作用。这种黑皮质素(MC)亚型受体调节脂肪燃烧的速率并因此影响重量稳态(Luevano，C.H.等人，Biochemistry,2001.40:p.6164-6179)。由于其直接参与摄食行为，因此MC4受体是设计选择性强效激动剂以治疗肥胖症的靶以及设计选择性拮抗剂以治疗厌食症的靶。中枢黑皮质素系统在能量稳态的调节中起关键作用。黑皮质素肽(a，β,"促黑激素和促肾上腺皮质激素ACTH)是黑皮质素受体的内源性激动剂配体，且通过阿黑皮素(POMC)基因转录物的翻译后加工获得。所有的黑皮质素肽激动剂均含有核心四肽His-Phe-Arg-Trp，其是配体选捧性和黑皮质素受体兴奋的原因。因此，可以将四肽His-Phe-Arg-Tip作为设计对抗肥胖症的治疗剂的先导(Haskell-Luevano，Lim等人.2000，Peptides.21(1):49-57)。迄今为止，黑皮质素家族包括5种已鉴别的、刺激cAMP第二信使信号转导途径的受体(MC1R-MC5R)。黑皮质素家族成员间的序列同源性范围从35%至60%(Cone等人，Rec.Prog.HormoneRes.1996,51:287-318),但是这些受体的功能却各异。例如，MC1-R是响应MC1-R的强效激动剂aMSH来调节色素沉着的G蛋白偶联受体。MC1-R受体的激动导致黑素细胞兴奋，从而产生真黑素并增加皮肤癌的风险。MC1-R的激动还可以具有神经学效应。MC2-R活性的激发可导致肾上lli且织癌。MC3-R和MC5-R的激动效应仍未知。所有的黑皮质素受体均可响应肽激素类的促黑素细胞激素(MSH)。由于各种受体的功能各异，因而使得同时激动多种黑皮质素受体的活性具有？1起不期望的副作用的潜力。因此，希望获得受体选择性的激动剂。口服药物施用保留了最优的化学实体全身给药途径，特别是用于治疗诸如肥胖症的慢性疾病。然而，作为广泛的肠内代谢降解和弱的肠渗透性的结果，肽具有差的口服生物利用度。肽在肠腔和刷状缘中的酶稳定性是决定肽口服生物利用度的主要因素，原因是这些区域具有大量的蛋白水解酶。因此，蛋白水解酶显著地削弱了完整肽继口服施用后到达全身循环的能力。对于四(和更大的)肽而言，超过90%的蛋白水解活性是由结合于刷状缘膜的酶产生的。弱的肽渗透性一般归因于导致低细胞穿透的、不相容的理化性质的组合。因此，肽的成功口服递送将取决于设计来改变这些潜在药物的物理化学特性以改善代谢稳定性和肠渗透性而不影响所述药物药理活性的策略。由于内源性aMSH的肽类似物在血液和胃肠(GI)道中均具有弱的代谢稳定性(极短的半衰期)，因此其不能用作对抗肥胖症的治疗化合物。已经证明将具有MC4-F激动剂活性的aMSH的环状七肽类似物注射入小鼠第三脑室或进行腹膜内注射时，可在小鼠中引起持久的食物摄取抑制作用。当与MC4-R拮抗剂共同施用时，这种效应是可逆的(Fan等人，Nature,1997385:165-168)。因此，MC4-R活性的激动剂可用于治疗或预防肥胖症。美国专利申请公布No.20010056179公开了具有黑皮质素-4受体(MC4-R)激动剂活性的选择性线性肽。WO2003/095474公开了具有黑皮质素-4受体激动剂活性的具体的肽衍生物。WO2005/009950公开了哌啶衍生物，所述哌咬衍生物为人黑皮质素-4受体的选择性激动剂。美国专利申请公布No.20020143141公开了具有MC4-R激动剂活性的选择性内酰胺桥连的环状肽。WO02/18437公开了具有用于治疗肥胖症的MC4-R激动剂活性、经由二硫化物或内酰胺桥环化的肽。WO2003/006604公开了作为有效的选择性黑皮质素-4受体激动剂的环状肽。WO2005/030797公开了具有MC4-R激动剂活性的、包括7-12个氨基酸的环状肽。然而，这些肽类似物不能跨越肠壁，因而不具有口服生物利用度。改善的肽类似物作为有机化学和分子生物学主要进展的结果，目前可以足够用于药理学和临床应用的量来制备生物活性肽。因此在最近几年中，确立了用于治疗和诊断疾病的、其中涉及肽的新方法。然而，使用肽作为治疗剂和诊断剂受到以下因素的限制a)弱的组织穿透；b)对于胃肠道和血清中蛋白酶解的低的代谢稳定性；c)口服摄入后差的吸收，其可特别归因于肽相对高的分子量或特异性转运系统的缺乏或两者都有；d)通过肝和肾的快速排泄；和e)由于肽受体广泛分布于有机体而产生的不期望的非靶器官系统中的副作用。希望获得具有更高特异性的肽类似物，从而实现提高的临床选择性。制备克服天然肽分子缺陷的构象约束的肽类似物并由此提供改善的治疗性能将是最有益的。Gilon等人提出构象约束肽的新概念上的方法(Biopolymers，1991，31，745),其提出肽的主链环化。主链环化是将构象约束施加于肽的一般方法。在主链环化中，肽主链中的原子(N和/或C)相互共价连接形成环。这种策略的理论优势包括经由肽主链的碳或氮来实现环化的能力，且不干扰对于与给定肽的特异性受体相互作用而言至关重要的侧链。Gilon和同事做出了进一步的公开(WO95/33765、WO97/09344、US5,723,575、US5,811,392、US5，883，293、US6,265,375和US6,407059),其提供了主链环化的肽类似物合成中所需要的结构单元(buildingunits)的制备方法。还公开了使用这些方法可以成功地制备出以下主链緩激肽类似物的环化的肽类似物(US5,874,529)和具有促生长素抑制素活性的主链环化的肽类似物(WO98/04583、WO99/65508、US5,770,687、US6,051,554和US6,355,613)。尚需合成具有增加的体内稳定性的、口服可利用的aMSH拟肽(peptidomimetic)类似物，以便用于治疗诸如肥胖症的代谢紊乱。希望获得对MC4受体具有更高亲合力和选4奪性的aMSH肽类似物，并由此获得用于治疗代谢紊乱的药物化合物。
发明内容本发明提供了治疗上有用的aMSH类似物(其为主链环状的肽类似物)、包括这些aMSH类似物的药物组合物及其使用方法。本发明特别提供了用于治疗代谢紊乱的、受体特异性的aMSH主链环化的类似物。对肥胖症关联的黑皮质素-4受体(MC-4R)具有激动剂活性的、根据本发明的新类似物可用于治疗包括肥胖症的代谢紊乱。根据本发明所提供的类似物具有延长的代谢稳定性、高的肠渗透性、口服利用率和体内药理活性。根据本发明的一方面，提供了主链环化的aMSH类似物，该类似物包括引入至少一个结构单元的4至12个氨基酸的肽序列，所述结构单元包括与桥基相连的肽主链中的一个氮原子，所述桥基包括二硫化物、酰胺、碌u醚、碌u代酸酯、亚胺、醚或烯桥，其中所述至少一个结构单元经由桥基连接至选自由第二结构单元、所述肽序列的氨基酸残基的侧链和N末端氨基酸残基组成的组的部分，以形成环状的结构。优选地，所述肽序列引入了5至8个氨基酸。根据一些实施方案，桥基是具有如下通式(VII)的化学连接体Z-(CH2)m-M-(CH2)n式(vII)其中m和n分别独立地为1至8的整数；M选自二硫化物、酰胺、硫醚、石克代酸酯、亚胺、醚或烯桥组成的组，且Z不存在或者为包括两个羧基的分子。本发明的一个实施方案是通式I的主链环状的肽类似物(SEQIDNO:2):<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式(i)其中R为氨基酸的侧链，X为OH、NH2或酯，m表示从1至8的整数，并且n表示从1至8的整数。根据一些实施方案，m表示从2至5的整数，且n表示从2至6的整数。根据本发明的另一个实施方案是式II的主链环状的肽类似物(SEQIDNO:3):<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage16</formula>(II)其中m表示从1至8的整数，且n表示从l至8的整数。根据一些实施方案，m表示从2至5的整数，且n表示从2至6的整数。根据式II的优选的肽是其中环大小为约20至约27个原子的那些肽。更优选的肽选自以下肽组成的组根据式II的肽，其中n=2,m=2;根据式II的肽，其中n=3，m=3;根据式II的肽，其中n^3,m二2;根据式II的肽，其中n二3,m二5;根据式II的肽，其中n^2,m二4。目前一个优选的实施方案是其中n^2且m二2的式n的肽，此处表示为BBC-1。根据本发明的另外的实施方案是式m的主链环状的肽类似物<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中n表示从1至8的整数。根据一些实施方案，n表示从2至6的整数。根据式III的优选的肽选自以下肽组成的组根据式m的肽，其中n=2;根据式m的肽，其中n=3;根据式in的肽，其中n=4根据式ni的肽，其中n=6。根据本发明的另一个实施方案是式IV的主链环状的肽类似物:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage17</formula>式(iv)其中n表示从l至8的整数。根据一些实施方案，n表示从2至6的整数。根据式IV的优选的肽选自以下肽组成的组根据式IV的肽，其中n=2;根据式IV的肽，其中11=3;根据式IV的肽，其中n=4;根据式IV的肽，其中n=6。根据本发明的另一方面，提供了包括aMSH主链环状的肽类似物作为活性成分的药物组合物。根据一个实施方案，该药物组合物经配制用于口服施用。根据另外的方面，本发明提供了用于治疗或预防与黑皮质素-4受体活性关联的疾病或病症的方法，其包括向需要其的受试者施用治疗有效量的包括aMSH的主链环状肽类似物作为活性成分的药物组合物。根据一些实施方案，所述病症为代谢紊乱。根据一个实施方案，所述代谢紊乱为糖尿病。根据优选的实施方案，所述代谢紊乱为肥胖症。根据另一个实施方案，活性成分的量范围从约10昭/kg至1000吗/kg。根据又一方面，本发明提供了aMSH的主链环状的肽类似物在制备用于治疗或预防与黑皮质素-4受体活性关联的疾病或病症的药物中的用途。结合以下的附图、说明和权利要求，本发明这些和其他的实施方案将变得显而易见。附图简述困l描绘了合成根据本发明的肽文库的图解(m=2、3、4、5;n=2、3、4、6)。图2描述了受保护的源自甘氨酸的结构单元的合成。图3描述了根据本发明的主链环化(BBC)文库的一般结构。图4显示来自文库I的MC-4肽与具有已知的肠渗透性的标准分子相比较的渗透性系数值(Papp):甘露醇显示出弱的渗透性，而睾酮和普萘洛尔表示出强的肠渗透性。困5证实了肽的主链环化对大鼠肠刷状缘膜中代谢稳定性的影响。困6显示主链环状的肽BBC-1的化学结构。图7证实了BBC-1对小鼠食物消耗的影响。将数据表示为平均值土SEM。通过使用Dunnett事后^r验的单因素方差分析来进行统计分析；*，P<0.05。图8A-B显示由反相HPLC(RP-HPLC)(8A)和MALDI國TOFMS(8B)进行的BBC1表征。发明详述目前公开了主链环状的拟肽方法已经导致具有黑皮质素-4受体激动剂活性的主链环状肽aMSH类似物的发现。所述(xMSH类似物优选通过口服施用，用于治疗包括肥胖症的代谢紊乱。根据本发明，具有强的肠渗透性、延长的代谢稳定性、口服利用率和体内药理活性的aMSH主链环状的肽类似物选自主链环化的肽类似物的文库。如此处所用，术语"主链环状的肽类似物，，指氨基酸残基序列，其中所述肽主链中的至少一个氮或碳与选自另一个这样的氮或碳的部分、侧链或所述肽的一个末端连接在一起。此外，该序列中的一个或多个肽4定可以被还原或由非肽键所取代。术语"氨基酸"指具有氨基和羧酸基团、优选在碳主链上以1,2-、1，3-或1，4-模式进行取代的化合物。a-氨基酸是最优选的，并且其包括在蛋白质中发现的20种天然氨基酸(其为除了甘氨酸之外的L-氨基酸)、相应的D-氨基酸、相应的N-曱基氨基酸、侧链修饰的氨基酸、蛋白质中未发现的生物合成的可利用的氨基酸(如，4-羟基-脯氨酸、5-羟基-赖氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、p-氰基酸(p-cyanolanine))和合成得到的a-氨基酸，如氨基异丁酸、正亮氨酸、正缬氨酸、同型半胱氨酸和同型丝氨酸。p丙氨酸和Y氨基丁酸分别为1，3和1,4-氨基酸的实例，并且其他多种氨基酸为本领域公知。Statine样(Statine-Uke)电子等排物(包括两种氨基酸的二肽，其中以CHOH代替CONH键)、羟基乙烯电子等排物(包括两种氨基酸的二肽，其中以CHOHCH2代替CONH键)、被还原的酰胺电子等排物(包括两种氨基酸的二肽，其中以CH2NH键代替CONH键)和硫代酰胺电子等排物(包括两种氨基酸的二肽，其中以CSNH键代替CONH键)也是本发明有用的残基。本发明中使用的氨基酸是商业上可获得的或可通过常规的合成方法获得的那些氨基酸。某些残基可能需要特殊的方法来引入肽，并且连续的、发散的或汇集的合成肽序列的方法在本发明中是有用的。根据IUPAC规定，天然编码的氨基酸及其衍生物由三字母的代码表示。当没有指示时，使用L异构体。在残基缩写之前，将D异构体标为"D"。如本领域技术人员已知的，氨基酸的保守置换在本发明的范围内。氨基酸保守置换包括一种氨基酸与另一种具有相同类型官能团或侧链的氨基酸的置换，所述官能团或侧链如脂肪族的、芳香族的、正电荷的、负电荷的。这些置换可以提高口服生物利用度、增强进入中枢神经系统的穿透、靶向特异性的细胞群等等。技术人员将理解，改变、添加或除去编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的对肽、多肽或蛋白质序列的个别置换、去除或添加是"保守修饰的变体，，，其中所述改变导致了氨基酸与化学性质类似的氨基酸的置换。提供官能类似的氨基酸的保守置换表为本领域所公知。以下六组各自包括相互为保守置换的氨基酸1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和6)苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。如此处所用，"肽，，指经由肽键连接的氨基酸序列。根据本发明的肽包括4至12个氨基酸残基、优选5至8个残基的序列。根据本发明的肽类似物可以任选地包括至少一个酰胺取代键，如脲键、氨基曱酸酯键、氨磺酰键、肼键或任何其它共价键。本发明肽的盐和酯均包括在本发明的范围内。本发明肽的盐为生理上可接受的有机盐和无机盐。本发明肽的功能衍生物覆盖了可以通过本领域已知的方式来从作为残基上的侧链或N-或C-末端基团出现的官能团制备的衍生物，并且只要所述衍生物保持为药学上可接受的，即，只要所述衍生物均可包括在本发明中。例如，这些衍生物可以包括羧基的脂肪族酯；通过与氨或与伯胺或仲胺反应生成的羧基酰胺；通过与酰基部分(如，烷酰基或碳环的芳酰基)反应形成的氨基酸残基游离氨基的N-酰基衍生物；或通过与酰基部分反应形成的游离羟基(例如丝氨酸或苏氨酰残基的羟基)的O-酰基衍生物。术语"类似物”指除了一个或多个氨基酸改变之外，具有根据本发明的氨基酸序列的分子。合适的"类似物，，的设计可以是计算机辅助的。根据本发明的肽类似物可以任选地包括至少一个酰胺置换键，如脲键、氨基甲酸酯键、氨磺酰键、肼键或任何其它共价键。术语"拟肽"指以如下方式修饰的根据本发明的肽其包括至少一个非编码的残基或非肽键。例如，这样的修饰包括一个或多个残基的烷基化和更具体的曱基化、插入非天然的氨基酸或将天然的氨基酸置换为非天然的氨基酸、使用其他的共价键来置换酰胺键。根据本发明的拟肽可以任选地包括至少一个键，该键为酰胺置换键，如脲键、氨基曱酸酯键、氨磺酰键、肼键或任何其它共价键。合适的"拟肽"的设计可以是计算机辅助的。"稳定的化合物“或"稳定的结构”在此处是指足够稳固以便能够从反应混合物分离至有效纯度并配制成有效治疗剂的化合物。如此处所用，术语"取代的"指在指定原子上的任何一个或多个氢原子被替换为来自指定组的选择，条件是不能超过指定原子的正常原子价并且该取代得到稳定的化合物。当任何变量(例如n、m等)在本文任何部分或任何式中出现超过一次时，其在每种情况下的定义独立于其在任何其他情况下的定义。此外，取代基和/或变量的组合只有在该组合得到稳定的化合物时才是允许的。术语"受体激动剂"指可以与细胞上的受体结合以产生天然物质特有的生理反应的分子。术语"MC-4受体激动剂"优选地指，该分子能够模拟通过MC受体亚型-4介导的aMSH的至少一种作用的分子。如此处所用，短语"治疗有效量"指施用至宿主以获得针对本文公开的适应症(例如但不限于肥胖症)的期望结果的新型主链环化的肽类似物或含有该类似物的组合物的量。肽的主链环化主链环化的类似物是经由桥基来环化的肽类似物，其中所述桥基与允许新的非肽键合的氨基酸的a氮或a羰基相连。一般而言，用以从其结构单元构建这样的肽类似物的过程依赖于已知的肽合成原理；最方便地是，可以根据已知的固相肽合成原理来实施所述过程。在主链环化的肽的固相合成期间，将受保护的结构单元偶联至肽链的N末端或者通过与其他氨基酸偶联相似的步骤偶联至肽树脂。在肽组装完成后，从结构单元的官能团除去保护性基团，并且通过将结构单元的官能团与第二官能团偶联来实现环化，所述第二官能团选自第二结构单元、所述肽序列的氨基酸残基的侧链和N末端氨基酸残基。如此处所用，术语"主链环状的肽"或"主链环状的类似物"指线性肽的类似物，所述线性肽包括引入至少一个结构单元的、优选为3至24个氨基酸的肽序列，所述结构单元包括与桥基相连的肽主链中的一个氮原子，所述桥基包括酰胺、硫醚、硫代酸酯、二硫化物、脲、氨基曱酸酯或氨磺酰，其中至少一个结构单元经由所述桥基相连而形成环状的结构，所述环状的结构具有选自由第二结构单元、所述序列的氨基酸残基的侧链或末端氨基酸残基组成的组的部分。"结构单元"(BU)指Na或Ca衍生的氨基酸。Na衍生的氨基酸由通式(V)表示<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(v>其中X是选自亚烷基、取代的亚烷基、亚芳基、环亚烷基和取代的环亚烷基组成的组的间隔基；R'是任选地与特定保护基结合的氨基酸侧链；并且G是选自胺、硫醇、醇、羧酸、磺酸盐、酯和烷基卣组成的组的官能团；将其引入肽序列且随后经由官能团G与所述肽序列中的一个氨基酸侧链、与一个肽末端或与另一个(0官能化的氨基酸衍生物来选择性地环化。本发明通过使用通式(VI)的Na衍生的甘氨酸来举例说明<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(VI)其中X为亚烷基，R'为氢；且G为胺；将其引入肽序列且随后经由官能团G与和所述肽序列的N末端相连的羧基来选择性地环化。在本发明的结构单元以其化学结构被描述为部分肽序列，或者缩写为相应修饰的氨基酸的三字母代码，之前带有反应性基团的类型(N代表胺，C代表羧基)。例如，N-Gly描述了具有胺反应性基团的修饰的Gly残基，因此，才艮据本发明，在主链环化的肽序列之内的N-Gly等于NH-(CH2)n-N-CH2-CONH2。用于生产结构单元的方法学在以WO95/33765和WO98/04583公布的国际专利申请中以及在美国专利第5,770,687号和5,883,293号中描述，此处特别通过引用将其全部内容并入，如同此处提出其全部内容一样。根据本发明的术语"桥基"指化学连接体或间隔基，其将肽主链的氮原子与第二结构单元、序列的氨基酸残基的侧链或末端的氨基酸残基相连。根据一些实施方案，所述化学连接体或间隔基由通式(VII)表示Z-(CH2)m-M-(CH2)n式(vn)其中m和n分別独立地为1至8的整数；M选自二硫化物、酰胺、硫醚、硫代酸酯、亚胺、醚或烯桥组成的组；并且Z不存在或为包括两个羧基的分子，如二羧酸残基。根据本发明的Z的非限制性实例为琥珀酸残基和苯二甲酸残基。可以使用本领域已知的任何方法来合成根据本发明的主链环化的肽，所述方法包括拟肽的方法学。这些方法包括固相合成法以及溶液相合成法。据此描述了这些方法的非限制性实例。可以使用本领域已知的用来制的范围中。根据本发明的主链环化的类似物的设计和合成方法在以下的专利中公开美国专利第5,811,392、5,874,529、5,883,293、6,051,554、6,117,974、6,265,375、6,355613、6,407059、6,512092号;以及国际申请WO95/33765、WO97/09344、WO98/04583、WO99/31121、WO99/65508、WO00/02898、WO00/65467和WO02/062819。此处通过引用将所有这些方法的全部内容并入。主链环化最为显著的优势在于1)在不破坏肽的任何侧链下获得肽序列的环化，从而减少失去生物识别(如，与特异性受体结合)所必须的官能团以及功能的机会；2)通过允许变更桥的长度和键的类型(如，酰胺、二硫化物、硫醚、硫代酸酯、脲、氨基曱酸酯或氨磺酰等)、键的方向以及键在环中的位置来实现肽构象的优化；3)当应用于已知活性的线性肽的环化时，可以如下方式设计桥最小化与肽的活性区域及其关联受体的相互作用。这就减少了环化臂妨碍识别和干扰功能的机会。"主链环状的拟肽”方法的原理基于以下步骤(i)阐明靶蛋白质中的活性残基，(ii)设计并建立包括活性残基的原型(prototypic)主链环状的肽系综(ensemble)及其类似于母蛋白质的构象的模型，(iii)环扫描(cycloscan)每种主链环状的原型直到发现先导化合物为止，(iv)对最佳的先导化合物进行结构分析，并(v)通过迭代(iteration)优化。"循环扫描，，是基于构象约束的主链环状肽文库的选择方法，该方法允许快速检测由给定序列衍生的最具活性的主链环状的肽，所述给定序列如WO97/09344中所公开的。此处通过引用将该公开的教导全部并入。循环扫描的多样性允许以逐步分立的方式来产生大量仅其构象不同的顺序偏向的肽，其中所述多样性包括主链环化的模式、环的位置、环的大小和环的化学性质。药理学除了其他考虑之外，本发明的新型活性成分为肽、肽类似物或拟肽的事实说明该制剂适用于递送这些类型的化合物。但是通常由于易受到胃酸或肠酶的消化，因而使得肽不太适合进行口服施用。根据本发明，为了合成代谢稳定的和口服可利用的拟肽类似物，使用了新的主链环化方法。本发明肽的优选给药途径是口服施用。其他的给药途径为关节内、静脉内、肌内、皮下、皮内或膜内。本发明的药物组合物可以通过本领域公知的过程来制备，例如，通过常规的混合、溶解、粒化、研磨、精细粉碎、制糖衣片(dragee-making)、磨细、乳化、包嚢、包埋或冷冻干燥过程。因此，可以常规的方式使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅料)来配制依据本发明使用的药物组合物，所述载体有助于将活性化合物加工可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合型(push-fit)胶嚢以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的密封软胶嚢。推入配合型胶嚢可以包括与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶嚢中，可以将活性化合物溶解或悬浮于适合的液体中，所述液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。为了进行注射，可以将本发明的化合物在水溶液中、优选在生理学相容的缓冲液中配制，所述緩冲液如Hank's溶液、林格氏溶液或生理盐水緩沖液。为了经粘膜施用，在制剂中使用了适合于待透过的屏障的渗透剂。诸如聚乙二醇的这样的渗透剂通常为本领域已知。糖衣片片芯(Drageecores)可以具有适宜的涂层。为了这个目的，可以使用浓缩的糖溶液，所述糖溶液可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carb叩olgel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆用溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣片涂层中加入染料或颜料以识别或表征不同的活性化合物剂量组合。为了口腔施用，该组合物可以釆用以常M^方式配制的片剂或4t剂的形式。为了吸入施用，才艮据本发明使用的变型(variants)可以气溶胶喷雾的形式从加压的包装或使用合适的推进剂的喷雾器方便地递送，所述推进剂如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟曱烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况中，可以通过提供用以递送测定量的阀来确定剂量单位。例如，可以将用于吸入器或吹入器的明胶的胶嚢和药筒制成含有肽与适宜的粉末基质(如，乳糖或淀粉)的粉末混合物。用于胃肠外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性成分的水溶液。此外，可以将活性化合物的悬浮液制备为适当的含油注射悬浮液。适宜的天然或合成载体为本领域所公知(Pillai等人，Curr.Opin.Chem.Biol.5，447:2001)。任选地，该悬浮液还可以包含增加了化合物的溶解度的适宜的稳定剂或物质，以允许制备非常浓的溶液。可选地，活性成分可以为粉末形式，在使用前用适宜的载体(如，无菌无热原水)进行重构。例如，还可以使用诸如可可脂或其他甘油酯的常规栓剂基质来将本发明的化合物配制成直肠组合物，如栓剂或滞留(retention)灌肠剂。适合在本发明上下文中使用的药物组合物包括其中活性成分以有效实现预期目的量包括在其中的组合物。更具体地，治疗有效量指可以有效地预防、减轻或改善受治疗患者的疾病症状的化合物的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内。可以通过细胞培养或实验动物的标准药物规程，如，通过测定受试化合物的IC50(提供50%抑制作用的浓度)和LD50(造成50%受试动物死亡的致死剂量)来确定此处描述的肽的毒性和治疗效果。可以使用从这些细胞培养试验和动物研究获得的数据来配制一系列用于人的剂量。所述剂量可以根据所采用的剂型和所利用的给药途径而改变。精确的配方、给药途径以及剂量可以由私人医师考虑患者的情况来进行选择(如，在Fingl等人1975年的"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",Ch.1p.l中)。这种药物组合物优选的施用剂量范围为每天约0.1μg/kg体重至约20mg/kg体重。优选地，活性成分的数量范围为约10μg/kg至1000ng/kg。根据待治疗的病症的严重性和反应性，剂量给药还可以为緩慢释放组合物的单独施用，其中治疗疗程可从几天持续到几周，或者直到治愈，或者直到疾病状态得到緩解。当然，即将施用的组合物的量将取决于受治疗的受试者、痛苦的严重程度、施用的方式、处方医师的诊断以及所有其他相关的因素。ocMSH类似物的一般筛选通常在体外测试aMSH类似物对结合于其黑皮质素-4(MC4)受体的天然肽(剌鼠(Agouti)关联蛋白)的抑制作用。可以进一步在体外测试该类似物对环腺苷酸(cAMP)浓度的影响。可以在体内测试该类似物的肠渗透性和代谢稳定性。可以在临床前模型中对该类似物做进一步的体内测试，以便确定施用的最佳模式和适当的剂量，并且证实这些新的潜在治疗药物的安全性和功效。实施本发明的优选方式根据本发明，公开了新的肽类似物，其特征在于所述肽类似物使用与a氨基酸的a氮相连的桥基来引入新的结构单元。具体地，这些化合物为包括4至12个氨基酸肽序列的主链环化的aMSH类似物，所述类似物引入了至少一个结构单元，所述结构单元包含与桥基相连的肽主链中的一个氮原子，所述桥基包括二硫化物、酰胺、硫醚、疏代酸酯、亚胺、醚或烯桥，其中至少一个结构单元经由桥基连接于第二结构单元、所述肽序列的氨基酸残基的侧链或N末端的氨基酸残基，以便形成环状的结构。优选地，所述肽序列引入了4至12个残基，更优选引入5至8个氨基酸。根据本发明的原理，提供了基于活化MC4受体的激素aMSH活泼区域的主链环状的肽。为了这种目的，合成了基于MC4R活性母序列Phe-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH2(SEQIDNO:1)的主链环状的肽文库。文库中所有的肽均具有母序列。所述肽的环大小和环化学性质彼此不同。研究所有肽的MC4R官能度和选择性以及体外肠吸收和肠代谢降解。发现一种此处指定为BBC-1的肽是高度官能和高度选择性的，同时其具有高的肠代谢稳定性和渗透性。小鼠体内研究显示当口服施用时，在24hr的时期内食物消耗减少40%。目前根据本发明优选的实施方案为式II的主链环状的肽类似物(SEQIDNO:3)。此处将本发明目前优选的肽指定为BBC-1(图6)。发现因其特异性活化MC4R而选择的BBC-1是酶稳定的，同时具有增强的体外肠渗透性。小鼠一次口服施用BBC-1导致24小时的食物消耗减少。本发明的主链环状的类似物以高亲合力结合于MC4受体。这种受体的选择性预示了潜在的体内生理选择性。此外，本发明首次提供了获得具有特异性MC4受体选择性的一组主链环化类似物的可能性。这就使得其在包括肥胖症的代谢紊乱中具有治疗用途。可以使用本发明的ccMSH类似物来治疗肥胖症或预防超重、调节食欲、诱发饱腹感、预防在成功的重量减轻后的重量恢复、增加能量消耗并治疗与超重或肥胖症相关的疾病或病状。含有本发明aMSH类似物的药物组合物可以配制成通过各种方式以强效施用于经历不期望的体重升高的人或动物患者，所述不期望的体重升高可以单独或作为不利的医学病症或疾病(如，n型糖尿病)的一部分。本发明的aMSH类似物可作为主要的药剂用于治疗II型糖尿病，以及用于治疗I型糖尿病。根据本发明的aMSH类似物还可作为辅助剂用于治疗I型糖尿病或II型糖尿病。aMSH类似物可以用于由异常的葡萄糖代谢引起的或与异常的葡萄糖代谢同时发生的疾病的治疗。aMSH类似物可以用于延緩从葡萄糖耐量降低(IGT)至II型糖尿病的进展，以及用于延缓从II型糖尿病至胰岛素依赖型沣唐尿病(insulinrequiringdiabetes)的进展。目前已经大致地描述了本发明，并且通过参考以下的实施例可以更容易地理解本发明，所述实施例经由说明的方式提供并且不预期限制本发明。实施例材料与方法肽合成受保护的氨基酸、9-药基甲基氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)、溴-三-p比咯烷酮-六氟磷酸鳞(phosphoniumhexafluorophosphate)(PyBrop)、Rink酰胺甲基二苯曱基胺(MBHA)聚苯乙烯树脂(Rinkamidemethylbenzhydrylamine(MBHA)polystyreneresins)以及许多用于固相肽合成(SPPS)的有机物和载体从NovaBiochemicals(Laufelfmgen,Switzerland)购买。双(三氯曱基)碳酸酯(BTC)从Lancaster(Lancashire,England)购买，用于高效液相色谱(HPLC)的三氟乙酸(TFA)和溶剂从Bio-Lab(Jerusalem,Israel)购买。二幾乙酸、1，2-二氨基乙烷、1,3-二氨基丙烷和1,4-二氨基丁烷从Merck(Darmstadt,Germany)购买，四(三苯膦)把(0)从ACROS(Geel,Belgium)购买。有机化学溶剂从Frutarom(Haifa,Israel)购买。通过BrukerAMX-300MHz分光计记录核磁共振(NMR)谱。通过FinniganLCQDUO离子阱质谱仪进行质谱。通过MerckF24560硅胶板(Darmstadt,Germany)进行薄层色谱(TLC)。使用多孔层实心球分析RP柱(Ci8，4.6x250mm，产品号201TP54)以及Merck-HitachiL-7100泵和在215nm运作的Merck-HitachiL-7400可变波长4企测器来施行HPLC分析。流动相由梯度系统组成，其中溶剂A相当于具有0.1。/。TFA的水，以及溶剂B相当于具有0.1%TFA的乙腈(ACN)。流动相在0至5min时以95%的A开始，随后从5至55min为从5%B至95%B的线性梯度。该梯度在95%B保持另外5min，且随后从60至65min降到95%A和5%B。该梯度在95%A保持另外5min以达到柱平衡。流动相的流速为1mL/min。通过采用多孔层实心球制备RP柱(C8,22x250mm，产品号218TP1022)的反相HPLC(RP-HPLC)(L-6200A泵，Merck-Hitachi,日本)来进行肽的纯化。所有制备HPLC均使用具有溶剂A和溶剂B的梯度系统来实施，其中溶剂A相当于具有0.1%TFA的水，溶剂B相当于具有0.1%TFA的ACN。实施例1.主链环状的aMSH类似物的固相肽合成(困1)遵循以下的通用Fmoc化学实验方案在设置有熔结玻璃底部的反应容器中进行合成将Rink酰胺曱基二苯曱基胺(MBHA)树脂(1g,0.66mmol/g)在N-曱基吡咯烷酮(NMP)中预溶胀2h。使用20%哌啶的NMP实施Fmoc脱保护步骤(2x30min),随后使用NMP(5x2min)和DCM(2x2min)洗涤。如下进行结构单元Fmoc-Na(乙胺-Alloc)Gly-OH(Fmoc-GlyN2)与树脂的偶联以及Fmoc-氨基-酸-OH(Fmoc-Axx-OH)与结构单元的偶联将Fmoc-GlyN2(3eq.，1.98mmol)和双-(三氯曱基)碳酸酯(BTC，三光气)(1当量，0.66mmol)悬浮于DCM中。向冰浴中预冷却的悬浮液加入2,4,6-可力丁(10当量，6.6mmol)。在所有固体溶解后(约lmin),将该溶液倾倒至树脂上并在室温下振摇3h。重复一次该偶联循环。在第二次偶联循环结束时，使用DCM洗涤肽基-树脂(5x2min)。在第一氨基酸后进行帽化(Capping),并且通过使肽基-树脂与乙酸酐(l.lmL,0.5M)、二异丙基乙胺(D正A)(0.5mL，0.125M)在二曱基曱酰胺(DMF)(25mL)中的混合物反应来重复两次。在使用DMF(5x2min)、DCM(2x2min)和NMP(2x2min)洗涤树脂后进4亍帽化。以上述相同的方式使用BTC作为偶联剂来进行Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc－Arg(Pbf)－OH、Fmoc－D-Phe-OH和Fmoc-Phe-OH的偶联。在1当量DMAP和10当量D正A存在下，使肽基-树脂(Phe)最后的氨基酸与IO当量琥珀酸酐(m=2)的NMP于室温酰化2h。使用NMP(2x5min)和DCM(2x5min)洗涤树脂，在干燥器中干燥过夜，并在氩下使用四(三苯膦)钯(0)(0.1当量，0.066mmol)在含有乙酸(5%)和N-曱基吗啉(morpholin)(2.5%)NMP中来施行从结构单元除去Alloc保护基。该步骤在剧烈振摇下避光操作4h。使用氯仿(chlorofome)(8x2min)和具有0.5%DIEA的NMP(3x2min)来实施洗涤步骤。继Alloc脱保护之后，通过加入6当量PyBoP和12当量D正A的NMP(重复两次)来使肽环化。使用NMP(5x2min)和DCM(5x2min)进行洗涤步骤。肽基-树脂在真空下干燥过夜。使用95%TFA、2.5。/。TDW和2.5。/。三异丙基硅烷(TIS)的预冷却混合物来同时进行树脂的裂解和侧链保护基的去除。在加入树脂后，于冰浴中搅拌该混合物30min,且随后于室温振摇2.5h。通过氮气流来4吏合并的TFA滤液蒸发至干燥。使用冷醚研磨含油的残留物三次以除去清除剂，并通过离心除去醚。将干燥的粗品肽溶解于ACN/H20(1:1)并进行冷冻干燥。实施例2.结构单元的合成(i)根据图2来进行源自甘氨酸的结构单元的合成。(ii)制备Alloc-NH(CH2)2-4NH2(1)将1mol的1，2-二氨基乙烷、1,3-二氨基丙烷或1,4-二氨基丁烷(10当量，分别为66.85m"l,82.40m"l或98.05m"l)溶解于氯仿(500mL)并在冰浴中冷却。在0。C下于3h内向冷却的溶液中逐滴加入含有0.1mol氯曱酸烯丙酯(Allylchloroformat)(1当量)的氯仿(250mL),然后在室温下搅拌过夜。用水(200mLx2)洗涤反应混合物，经硫酸钠干燥并真空蒸发。(iii)合成AllocNH-(CH2)n-NH-CH2-COOH(2)将NaCNBH3(1.1当量，0.052mol)加入MeOH(100mL)中。化合物(1)(0.0454mol)溶解于MeOH(50mL)，并加至NaCNBH3溶液。加入乙酮酸(Glyoxilicacid)(0.95当量，0.0434mol)并使反应搅拌过夜。在减压下蒸发MeOH。(iv)合成Fmoc-Gly(Nn)Alloc-OH(3)将残留物溶解于水(110mL)中，并加入三乙胺(11mL，0.079mol)。加入含Fmoc-OSu(9.82g，0.0291mol)的AcCN(170mL)并搅拌反应4h,同时使用三乙胺将pH保持为碱性。使用石油醚PE(180mLx3)和7:3的醚:PE(180mLx3)来洗涤反应混合物。在冷却期间使用2MHC1(lOmL)将水层酸化至pH3-4，并使用乙酸乙酯(EA)(150mLx4)进行萃取。有机层用1MHC1(100mLx2)和饱和KHS04(100mLx2)洗涤，经Na2S04干燥并在真空下蒸发得到5.50g,0.0115mol(39.5%)随后凝固的无色油。该产物在没有进一步纯化下用于SPPS。实施例3.肽合成表l示出主链环状的肽的结构及其MS和纯度。所有的肽均具有相同的序列——即Phe-DPhe-Arg-Trp-Gly-NH2，并且具有相同的内酰胺环位在Gly的N"与氨基末端之间。文库中的肽的环大小和环化学性质^&此不同。环大小的范围/人20个原子(肽MCR4-1)至25个原子(肽MC4-14)。环化学性质的差异是通过改变烷基链n和m的相对尺寸来实现的，所述烷基链n和m的相对尺寸导致环大小相同但内酰胺环中的酰胺键位置不同的肽。例如，肽MCR4-6、MCR4-10和MCR4-11均具有22个原子的环尺寸，但是它们的n和m却各异。因此，肽MCR4-6的n=3以及m^3，而肽MCR4-10的n=2以及m=4,肽MCR4-11的n=4以及m=2。实施例4.肠渗透性的评价细胞的生长和维持；从ATCC获得Caco-2细胞，并且随后在5%的C02气氛和相对湿度95%下，使其以大约0.5x106细胞/烧瓶于37°C的75cn^烧瓶中生长。生长培养基由Dulbecco改进的Eagle培养基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)(DMEM)组成，其添加有10%热灭活的胎牛血清(FBS)、1%非必需氨基酸(NEAA)和2mML-谷氨酰胺。培养基每周更换两次。制备用于转运研究的细胞；为了进行转运研究，将传代范围为60-66的细胞以25x105细胞/cn^的密度接种在具有0.4pm孔和1cn^表面积的未处理的聚碳酸酯膜培养插入物上。将含有Caco-2单层的培养插入物置入12mm的Costar24转孔板(transwellsplates)中。每隔一天更换培养基。在接种后21-23天，当细胞完全分化并且TEER值稳定时(300-500pcm2)进行转运研究。实验方案通过从单层的两侧除去培养基并替换为加热至37。C的顶端的缓沖液(550^1)和基底外侧的緩冲液(1200^1)而开始转运研究。细胞在振摇下(100圈/min)于37。C孵育30分钟时间。在孵育周期之后，除去緩冲液并替换为基底外侧的1200^d基底外侧緩冲液。事先将测试溶液加热至37。C并将其(600^1)加至单层的顶面。在实验开始时立即从顶面取出50pl样品，使得实验期间的顶端体积为550W。在实验期间，细胞在振摇下保持在37。C。在预计的时间(30、60、90、120、150和180min)，从基底外侧取出200^样品并替换为相同体积的干净基底外侧緩沖液，从而维持恒定的体积。实施例5.肠代谢稳定性的评价通过Ca+十沉淀法(PEERCE)从组合的十二指肠、空肠和上回肠(upperileum)来制备刷状缘膜小泡(BBMVs)。使用冰冷的0.9%Nacl漂洗5只雄性Wistar大鼠的肠(200-250g),并清除粘液(mucos),使用载玻片从内腔的表面刮下粘膜并立即放入含有50nMKcl和10mMTris-HCl(pH7.5，4°C)的缓沖液中，并通过Ploytron(PolytronPT1200，KinematicaAG，Switzerland)来勻浆该混合物。将CaCl加至10mM的终浓度。将该匀浆在4°C下振摇30min,之后以10,000g离心10min(离心机)，然后将上清液以48,000g离心30min，通过将粒状沉淀悬浮于300mM的甘露醇和10mM的Hepes/Tris(pH7.5)并以24,000g/hr离心来进行另外的两项纯化步骤。使用刷状缘膜酶标记物GGT、LAP和碱性磷酸酶对纯化的刷状缘膜进行分析。在这些研究期间，刷状缘膜酶的富集可以在13倍和18倍之间变动。实施例6.受体结合试验使用结合緩冲液8来洗涤转染的CHO细胞并将其分配入96-孔板(大约40,000细胞/孔)。然后在37℃下于每个含有0.05ml结合緩沖液的孔中孵育细胞2h，其中该緩冲液含有恒定浓度的[1251]NDP-a-MSH和适当浓度的未标记的配基。在孵育后，使用0.2ml的水冷结合緩沖液洗涤细胞并使用0.2ml的0.1NNaOH使其从板中分离。计算放射性(Wallac，Wizardautomaticgammacounter(自动Y计数器))并使用用于方文射性配体结合分析的软件包(WanSystem,Umea,Sweden)来分析数据，其将数据与通过一般称为计算机模型的方法从质量作用定律获得的公式进行拟合。所述结合试验在双孔(duplicatewells)中进行。实施例7.受体活化的测定(cAMP作为探针的试验)cAMP富集试验在转染后48h,使用PBS洗涤CHO细胞一次并且随后使用含有0.02%EDTA(Sigma)的PBS使其从板中分离。通过离心收获分离的细胞并将其悬浮于含有0.5mMIBMX、2mMHEPES(IBMX緩冲剂)(pH7.5)的Hanks'平衡盐溶液(Invitrogen)中。在37℃孵育15min以允许IBMX^聂取后，向含有各种浓度激动剂或含有10pM福司柯林的0.1mlIBMXi爰冲液中加入0.4ml的细胞悬浮液(5x105细胞/ml)。此后将细胞在37℃孵育15min以便允许cAMP富集。通过加入0.5ml的5%三氯乙酸来终止活性，并且通过cAMP125I闪烁迫近分析系统(AmershamBiosciences)来只于溶4匕细I包释力文的cAMP进行分析。使用GraphPadPrism软件来计算具有95%置信区间的EC5。值(使用非线性回归分析拟合具有可变斜率的S型剂量反应曲线)。实施例8.三种主链环状的肽文库的表征表l:文库l的表征(式II)<table>compelxtableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table><row><column>BBC6</column><column>3</column><column>3</column><column>22</column><column>864.45</column><column>865.13</column><column>84.2</column></row><row><column>BBC7</column><column>3</column><column>24</column><column>892.48</column><column>893.40</column><column>89.3</column></row><row><column>BBC8</column><column>3</column><column>2</column><column>21</column><column>850.43</column><column>851.60</column><column>88.8</column></row><row><column>BBC9</column><column>2</column><column>5</column><column>23</column><column>878.46</column><column>879.47</column><column>97.6</column></row><row><column>BBC10</column><column>2</column><column>4</column><column>22</column><column>864.45</column><column>865.70</column><column>97.8</column></row><row><column>BBC11</column><column>4</column><column>2</column><column>22</column><column>864.45</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC12</column><column>4</column><column>3</column><column>23</column><column>878.46</column><column>879.33</column><column>97.8</column></row><row><column>BBC13</column><column>4</column><column>4</column><column>24</column><column>892.48</column><column>894.00</column><column>79.2</column></row><row><column>BBC14</column><column>4</column><column>5</column><column>25</column><column>906.49</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC15</column><column>4</column><column>23</column><column>878.46</column><column>879.72</column><column>96,2</column></row><row><column>BBC22</column><column>6</column><column>2</column><column>24</column><column>892.48</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC23</column><column>6</column><column>3</column><column>25</column><column>906.49</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC24</column><column>6</column><column>4</column><column>26</column><column>920.52</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC25</column><column>6</column><column>5</column><column>27</column><column>948.58</column><column>--</column><column>IP</column></row><table>合成并表征了基于活化MC4受体(参见图3)的激素aMSH活跃部位的三种主链环状的肽文库(参见表1-3)。测试了文库I的主链环状的肽与已知的标准样品相比较的肠渗透性。如图4所示，肽BBC1(图6)具有高的肠渗透性。表4示出这些肽对MC4R的ICs。值。所有的肽均具有与天然激素(70nM)相似的ICso值，其中两种类似物具有更好的亲合力。图5示出肽的肠代谢稳定性。环状的肽与线性类似物相比，具有延长的代谢稳定性。通过反相HPLC(RP-HPLC)和基质辅助激光解吸电离飞4亍时间质谱(matrix-associatedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectroscopy)(MALDI-TOFMS)来施行BBC1肽的表征(分别为图8A和图8B)。表2:文库2的表征(式III)<table>complextableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table><row><column>BBC19</column><column>3</column><column>892.06</column><column>N.D.</column></row><row><column>BBC21</column><column>4</column><column>906.08</column><column>N.D.</column></row><row><column>BBC27</column><column>6</column><column>934.14</column><column>N.D.<table>表3:文库3的表征(式IV)<table>complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>N.D.——未测定表4:BBC肽的ICso值<table><row><column>肽</column><column>IC50nM</column></row><row><column>BBC1</column><column>90</column></row><row><column>BBC6</column><column>110</column></row><row><column>BBC8</column><column>60</column></row><row><column>BBC7</column><column>100</column></row><row><column>BBC9</column><column>100</column></row><row><column>BBC10</column><column>120</column></row><row><column>BBC12</column><column>100</column></row><row><column>BBC13</column><column>100</column></row><row><column>BBC15</column><column>60</column></row><row><column>BBC16</column><column>100</column></row><row><column>BBC17</column><column>90<table>实施例9.评价口llife用BBC-1对正常小鼠食物消耗作用的体内研究在隔离的笼子里饲养7-8周大的ICR:Hsd(CD-I)雄性小鼠，并且将其保持在23土rC的12小时光亮、12小时黑暗的循环中(0700-1900小时光亮)。允许随意地给小鼠喂水以及喂食标准的食物颗粒(chowpellets)。小鼠一到达即允许其适应1周。在禁食16小时后，使动物(n=8)经受一次BBC1(100pg/ml,1000昭/ml)或载体(水)的口服灌胃(PO,5ml/kg)。在施用后立即喂食固定量的食物，并且在1、2、3、4、5、8和24小时后重新称重。在随后24小时期间，小鼠并未显示出测试项目的任何特殊的给药后临床症状。如图7所示，当口服施用时，BBC-1在24小时的时间内将小鼠的食物消耗减少到40%。这些结果表明通过利用主链环化可能合成出生物活性的肽，所述生物活性的肽在肠环境下是稳定的并且可跨越肠壁，因此，其具有潜在的良好口服生物利用度而且同时保持其药理活性。具体实施方案的前述描述充分揭示了本发明的一般特征，使得其他人通过应用现有的知识可以随时对这样具体的实施方案进行修改和/或使其适用于各种应用，而无需过多的实验并且不脱离一般概念，因此，应该并且预期将这样的修改和改进理解为在所公开的实施方案等同的含义和范围内。尽管本发明已经结合其具体实施方案进行了描述，但是明显的是，许多备选方案、改进和变动对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，预期包括所有落入所附权利要求的精神和宽范围内的这样的备选方案、改进和变动。应理解的是，虽然详细描述和具体实施例描述了本发明的优选实施方案，但由于根据该详细的描述使得在本发明的精神和范围内的各种改变和改进对于本领域技术人员而言变得显而易见，因此本发明优选实施方案的详细描述和具体实施例仅作为示例给出。权利要求1.一种主链环化的αMSH类似物，其包括引入至少一个结构单元的4至12个氨基酸的肽序列，所述结构单元包括与桥基相连的肽主链中的一个氮原子，所述桥基包括二硫化物、酰胺、硫醚、硫代酸酯、亚胺、醚或烯桥，其中至少一个结构单元经由所述桥基连接于选自第二结构单元、所述肽序列氨基酸残基的侧链和N末端氨基酸残基组成的组的部分，以形成环状的结构。2.根据权利要求1所述的aMSH类似物，其中所述桥基是具有如下通式(VII)的化学连接体-Z-(CH2)m-M-(CH2)n-式(vii)其中m和n分别独立地为1至8的整数；M选自二硫化物、酰胺、硫醚、石危代酸酯、亚胺、醚或烯桥组成的组；且Z不存在或为包括两个羧基的分子残基。3.根据权利要求1所述的主链环化的aMSH类似物，其具有如下通式(I)(SEQIDNO:2):<formula>seeoriginaldocumentpage2</formula>式U)其中R为氨基酸的侧链，X为OH、NH2或酯，m表示从l至8的整数，并且n表示从1至8的整数。4.根据权利要求3所述的主链环化的aMSH类似物，其中m表示从2至5的整数，并且n表示从2至6的整数。5.根据权利要求3所述的主链环化的aMSH类似物，其具有如下通式(II)(SEQIDNO:3):<formula>seeoriginaldocumentpage3</formula>其中m表示从1至8的整数，并且n表示从l至8的整数。6.根据权利要求5所迷的主链环化的aMSH类似物，其中m表示从2至5的整数，并且n表示从2至6的整数。7.根据权利要求6所述的主链环化的ctMSH类似物，其中所述类似物选自以下肽组成的组才艮据式II的肽，其中n==2，m==2;根据式n的肽，其中n==3,m==3;才艮据式n的肽，其中n==3，m==2;才艮据式n的肽，其中ii==3,m==5;^f艮据式n的肽，其中n==2，m==4。和8.根据权利要求7所述的主链环化的aMSH类似物，其中n^2,且m=2。9.根据权利要求1所述的主链环化的aMSH类似物，其具有如下通式(III):<formula>seeoriginaldocumentpage3</formula>式(ni)其中n表示从l至8的整数。10.根据权利要求9所述的主链环化的aMSH类似物，其中n表示从2至6的整数。11.根据权利要求10所述的主链环化的aMSH类似物，其中n表示选自2、3、4和6的整数。12.根据权利要求1所述的主4连环化的aMSH类似物，其具有如下通式(IV):<formula>seeoriginaldocumentpage4</formula>式(IV)其中n表示从1至8的整数。13.根据权利要求12所述的主链环化的aMSH类似物，其中n表示从2至6的整数。14.根据权利要求13所述的主链环化的aMSH类似物，其中n表示选自2、3、4和6的整数。15.—种药物组合物，其包括作为活性成分的主链环状的肽，所述肽包括引入至少一个结构单元的4至12个氨基酸的aMSH类似物，所述结构单元包括与桥基相连的肽主链中的一个氮原子，所述桥基包括二硫化物、酰胺、硫醚、石克代酸酯、亚胺、醚或烯桥，其中至少一个结构单元经由所述桥基连接于选自第二结构单元、所述肽序列氨基酸残基的侧链和n末端氨基酸残基组成的组的部分以形成环状结构；所述组合物进一步包括药学上可接受的载体。16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述桥基是具有如下通式(VII)的化学连接体<formula>seeoriginaldocumentpage4</formula>式(VII)其中m和n分别独立地为1至8的整数；M选自二硫化物、酰胺、硫醚、硫代酸酯、亚胺、醚或烯桥组成的组；并且Z不存在或为包括两个羧基的分子残基。17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述肽具有如下通式I(SEQIDNO:2):<formula>seeoriginaldocumentpage5</formula>式(1)其中R为氨基酸的侧链，X为OH、NH2或酯，m表示从1至8的整数，且n表示从1至8的整数。18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中m表示从2至5的整数，且n表示从2至6的整数。19.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述肽具有如下通式II(SEQIDNO:3):<formula>seeoriginaldocumentpage5</formula>式(II)其中m表示从1至8的整数，且n表示从l至8的整数。20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中m表示从2至5的整数，且n表示从2至6的整数。21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述肽选自以下肽组成的组根据式II的肽，其中n=2,m=2;根据式n的肽，其中n=3,m=3;根据式II的肽，其中11=3，=2;根据式II的肽，其中n=3,m=5;和根据式II的肽，其中n=2，m=4。22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中n=2，且m=2。23.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述肽具有如下通式III:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(III)其中n表示从1至8的整数。24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中n表示从2至6的整数。25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中n表示选自2、3、4和6的整数。26.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述肽具有如下通式IV:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>CO-Phe-DPhe-Arg-Trp-N-CH2-C-NH2式(iv)其中n表示从1至8的整数。27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中n表示从2至6的整数。28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中n表示选自2、3、4和6的整数。29.根据权利要求15所述的药物组合物，其经配制用于口服施用。30.—种用于治疗或预防与黑皮质素-4受体活性关耳关的疾病或病症的方法，其包括向需要其的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的主链环状的肽，所述肽包括引入至少一个结构单元的4至12个氨基酸的aMSH类似物，所述结构单元包括与桥基相连的肽主链中的一个氮原子，所述桥基包括二硫化物、酰胺、硫醚、硫代酸酯、亚胺、醚或烯桥，其中至少一个结构单元经由所述桥基连接于选自第二结构单元、所述肽序列氨基酸残基的侧链和N末端氨基酸残基组成的组的部分，以形成环状结构。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述桥基是具有如下通式(VII)的化学连接体式(VII)-Z-(CH2)m-M-(CH2)n-其中m和n分别独立地为1至8的整数；M选自二碌u化物、酰胺、石克醚、硫代酸酯、亚胺、醚或烯桥组成的组；并且Z不存在或为包括两个羧基的分子残基。32.根据权利要求30所述的方法，其中所述肽具有如下通式I(SEQIDNO:2):<formula>seeoriginaldocumentpage7</formula>(式I)其中R为氨基酸的侧链，X为OH、NH2或酯，m表示从l至8的整数，且n表示从1至8的整数。33.根据权利要求32所述的方法，其中m表示从2至5的整数，且n表示从2至6的整数。34.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽具有如下通式II(SEQIDNO:3):<formula>seeoriginaldocumentpage8</formula>式(II)其中m表示从1至8的整数，且n表示从l至8的整数。35.根据权利要求34所述的方法，其中m表示从2至5的整数，且n表示从2至6的整数。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述肽选自以下肽组成的组根据式II的肽，其中n^2，m二2;根据式II的肽，其中n二3,m二3;才艮据式II的肽，其中n二3,m二2;根据式II的肽，其中n-3,m-5;和才艮据式II的肽，其中n-2,m-4。37.根据权利要求36所述的方法，其中n二2,m二2。38.才艮据权力要求30所述的方法，其中所述肽具有如下通式III:<formula>seeoriginaldocumentpage8</formula>式III)其中n表示从1至8的整数。39.根据权利要求38所述的方法，其中n表示从2至6的整数。40.根据权利要求39所述的方法，其中n表示选自2、3、4和6的整数。41.根据权利要求30所述的方法，其中所述肽具有如下通式IV:<formula>seeoriginaldocumentpage9</formula>其中n表示从l至8的整数。42.根据权利要求41所述的方法，其中n表示从2至6的整数。43.根据权利要求42所述的方法，其中n表示选自2、3、4和6的整数。44.根据权利要求30所述的方法，其中所述病症为代谢紊乱。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述代谢紊乱为肥胖症。46.根据权利要求44所述的方法，其中所述代谢紊乱为糖尿病。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述糖尿病为II型冲唐尿病。48.根据权利要求30所述的方法,其中所述药物组合物经配制用于口月l施用。49.根据权利要求30所述的方法，其中所述活性成分的量的范围为约10jig/kg至1000|ig/kg。50.—种主链环化的aMSH类似物在制备用于治疗或预防与黑皮质素_4受体活性关联的疾病或病症的药物中的用途，其中所述类似物包括引入至少一个结构单元的4至12个氨基酸的肽序列，所述结构单元包括与桥基相连的肽主链中的一个氮原子，所述桥基包括二硫化物、酰胺、硫醚、石危代酸酯、亚胺、醚或烯桥，其中至少一个结构单元经由所述桥基连接于选自第二结构单元、所述肽序列氨基酸残基的侧链和N末端氨基酸残基组成的组的部分，以形成环状的结构。全文摘要公开了新的主链环化的肽，其为α-促黑皮质素激素(αMSH)类似物(α-melanocortinstimulatinghormone(αMSH)analogs)并具有改善的黑皮质素-4受体激动剂活性。所公开的主链环化的肽类似物具有独特的且优于其它类似物的性能，如代谢稳定性、提高的口服生物利用度、改善的肠渗透性和体内药理活性。还公开了包括所述主链环化的αMSH类似物的药物组合物以及使用这样的组合物来治疗包括肥胖症的代谢紊乱的方法。文档编号C07K7/00GK101203527SQ200680018722公开日2008年6月18日申请日期2006年5月31日优先权日2005年5月31日发明者亚尼弗·林德,塞缪尔·海斯,暗嫩·霍夫曼,柴姆·吉伦申请人:耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司