专利名称：腹膜透析液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗肾腹膜功能衰竭疾病的腹膜透析液。更具体地说，本发明涉及通过在上述透析液中添加的葡萄糖等糖类渗透剂来抑制蛋白质交联的腹膜透析液。
背景技术：
对肾衰竭疾病患者有效的治疗方法之一是腹膜透析法。在腹膜透析法中，于肾衰竭患者的腹腔内置一导管，腹膜透析液从透析液袋通过该导管注入腹腔内，存留一定时间后，通过同一导管排出体外，一日重复该操作数次。
该腹膜透析法与通过人工膜进行的血液透析法不同，由于是通过作为患者自身生物膜的腹膜，可经常连续血液纯化，因此它在生理上比血液透析法更好。而且，患者进行社会活动也容易。由于有这些优点，该方法被广泛采用。
然而，在腹膜透析法中，作为人尿液排出的血液中的过剩水分不能用血液透析法中的在体外血液循环回路和插入了半透膜的膜外部之间给予压力差的方法来除去。因此，在腹膜透析法中，采用在注入腹腔内的透析液中加入渗透剂使透析液的渗透压比血液渗透压更高并另外通过过滤来除水的方法。由于不能用增加电解质盐浓度作为提高渗透压的手段，迄今专用的是葡萄糖。
迄今为止，葡萄糖是生理上最安全的，即使被吸收到体内，也没有代谢上的问题。然而，如果用含有葡萄糖的透析液长期持续腹膜透析，则发现葡萄糖被大量吸收到体内，与体内的氨基酸、肽、蛋白质反应生成了下述的AGE化合物，使腹膜组织内的胶原质合成，进而引起该胶原质等蛋白质分子间的交联，使腹膜硬化和增生，体内剩余水分的除去变得困难，腹膜透析中止。
推测由葡萄糖进行的蛋白质分子间交联的机理是通过下述这样的反应。
如式(1)，葡萄糖等具有羰基的糖类(I)与氨基酸、肽、蛋白质等(II)反应，经过席夫碱(III)、阿马多利(Amadori)化合物(IV)的中间体，生成称为高级糖化最终产物(Advanced Glycation End Products，下称AGE)的反应性强的化合物。它们引起蛋白质分子间的交联。 另外，在作透析液使用时，要用高温高压灭菌处理，该灭菌处理时葡萄糖会发生部分变性，生成了下述那样的各种葡萄糖降解产物(Glucose Degradation Products，下称GDP)乙二醛甲基乙二醛3-脱氧葡糖醛酮上述葡萄糖降解产物是AGE化反应性比糖类更强的物质，如果透析液中含有这样的葡萄糖降解产物，则交联将以只有葡萄糖时速度的数十至数千倍速度进行。
下述式(2)中显示了这些GDP或糖类自身的羰基与蛋白质反应所生成的AGE化合物是与蛋白质构成成分酪氨酸、精氨酸等的氨基结合交联成的蛋白质交联物。 虽然提出了通过改善透析液的灭菌处理方法来减少GDP含量作为解决该问题的一种方法，却不能完全抑制GDP的生成，而且由于不能忽略葡萄糖自身反应引起的蛋白质交联反应，所以在用葡萄糖作为渗透剂的腹膜透析法中，需有抑制交联反应的有效方法。
另外，本发明者提出了回收和浓缩腹膜透析液排出液中洗提的患者自身的血浆蛋白，用其代替全部或部分葡萄糖作为渗透剂使用的方法(日本申请平8-150930和平9-302388)。然而，在这些方法中，使用一部分葡萄糖的情况下同样产生了蛋白质交联的问题。
发明内容
本发明者认为，由葡萄糖和葡萄糖降解产物通过上述机理引起蛋白质交联反应，所以通过添加抑制该反应的化合物能抑制交联反应，为此研究了各种添加剂，结果发现了数种抑制交联反应的化合物。
另外，还发现了即使对于生成交联的蛋白质也显示出使交联离解的效果的化合物。
即，本发明涉及在溶解有电解质盐和糖类渗透剂的水溶液中加入蛋白质交联抑制剂和/或蛋白质交联离解剂的腹膜透析液。另外，本发明还涉及含有不使上述蛋白质交联抑制剂分解的灭菌处理的抑制剂和/或蛋白质交联离解剂的腹膜透析液的制备方法。
具体实施例方式
本发明的腹膜透析液用糖类作为渗透剂。作为所用的糖类可以列举葡萄糖、甘露糖等单糖、蔗糖、果糖等二糖、或低聚物、以及葡聚糖、糊精等聚合物。另外，该透析液中除糖类以外还可含有氨基酸、肽、蛋白质等。
电解质盐是氯化钠、氯化镁、氯化钙、乳酸纳、碳酸氢钠等的混合物，宜接近血清中的组成和浓度。在患者患有并发症而服药使血中钙、镁浓度偏离正常值时，应调节透析液中的这些化合物的浓度。
在本发明中，如果添加已溶解了电解质盐和糖类渗透剂的水溶液中的蛋白质交联抑制剂能抑制AGE化反应的任一阶段且在生理上无害，则任一种都可使用。另外，如果蛋白质交联离解剂能使蛋白质交联在生理环境下离解且其生成物无害，则可以使用。
一般来说，还原剂或抗氧化剂可作为有效的交联(键)抑制剂和蛋白质交联(键)离解剂。
氧化还原电位低的还原剂是有效的，尤其有效的是电位比生理盐水的氧化还原电位(+160mV至+180mV)低的还原剂。
作为属于上述还原剂或抗氧化剂类以及除此之外的化合物，更具体地说，巯基化合物、硫化物、氢硫化物、具有还原性的硫的含氧酸盐(sulfur oxy-acid)、硫脲及其衍生物、具有羟基和/或羧基的环状化合物、黄酮类化合物、含氮杂环化合物、偕腙肼(hydrazil)基化合物或有糖醛酸基的粘多糖类等是有效的蛋白质交联抑制剂。
另外，具有蛋白质交联离解效果的代表性化合物是噻唑衍生物。
作为巯基化合物，是具有巯基(-SH基)的化合物，可以列举半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫赤藓糖醇、N-乙酰基巯基琥珀酸酐等。
作为硫化物、氢硫化物，可列举硫化钠、氢硫化钠等。
作为具有还原性的硫的含氧酸盐，可列举亚硫酸、酸式亚硫酸、硫代硫酸、焦亚硫酸或连二亚硫酸的钠盐、钾盐或其它生理上安全的盐。这些盐宜为亚硫酸氢盐。
作为硫脲及其衍生物，可列举硫脲、二甲基硫脲等。
作为含有羟基和/或羧基的环状化合物，可列举乙酰水杨酸、抗坏血酸或其钠盐等生理上安全的盐。
作为黄酮类化合物，宜是具有两个以上羟基的杂环化合物，可列举栎精二水合物、儿茶素、表儿茶素或它们的水合物等。
作为含氮的杂环化合物，可以使用具有噻唑环、噻唑啉环、噻唑烷环、三唑环、四唑环、吲哚环、咪唑环、吡啶环和嘧啶环的化合物。
作为有噻唑环的化合物，可列举N-(2-噻唑基)磺胺、N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物。在这些具有噻唑环的化合物中，N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物可有效地作为作用于交联生成的蛋白质使交联键离解的蛋白质交联离解剂。另外，作为具有吲哚环的化合物，可列举N-乙酰基色氨酸等。
作为具有三唑环的化合物，可列举4-(1，2，3，4-噻三唑-5-基氨基)酚水合物。
作为具有噻唑啉环的化合物，可列举2-巯基噻唑啉。
作为具有噻唑烷环的化合物，可列举2-氧-4-噻唑烷甲酸。
作为含有偕腙肼基的化合物，可列举氨基胍盐酸盐等。
作为具有糖醛酸基的粘多糖类，可列举肝素。
这些蛋白质交联抑制剂的添加量因抑制剂的种类而异，相对于糖类，宜添加0.1-200％(重量)，更佳的为1-100％(重量)。如果添加量少，则抑制交联的效果不充分，但若过多，则会因溶解性不稳定而变差。另外，糖类渗透剂的浓度，以渗透压(mOsm/l)的单位表示，宜在电解质溶液除外的5-300mOsm/l范围内。如果糖类渗透剂的量太少，则除水不充分，若太多，则糖尿病症状恶化，引起很多副作用。
另外，透析液中可含有糖类渗透剂以外的胶质渗透剂作为渗透剂。作为胶质渗透剂，可用高分子量物质、其溶液表现出可确认的渗透压的化合物，可用代表性的白蛋白、球蛋白等化合物。这些胶质渗透剂不局限于市售的制剂或血浆分级制剂，可用从患者自身腹膜透析排出液中回收的蛋白质成分的混合物。作为该方法，可用本发明者以前提出的日本申请平8-150930、平9-302388中记载的纯化方法，用半透膜浓缩排出至体外的回收的腹膜透析液，然后在其中加入水或电解质溶液稀释并重复该方法；或在浓缩液中加入酸，随后用靠半透膜进行水透析的脱酸处理法使蛋白质等电点析出，与上清液分离后再溶解到新的透析液中，将其用作胶质渗透剂。另外，也可新添加胶质渗透剂。通过用非糖类胶质渗透剂置换糖类渗透剂，可减少糖类渗透剂的用量，这样可抑制糖类的存在所引起的蛋白质交联。在使用含胶质渗透剂的渗透剂场合，胶质渗透剂的浓度宜在0.1-30g/dl范围内。
本发明的腹膜透析液通过在溶解有电解质盐和糖类渗透剂的水溶液中添加混合蛋白质交联抑制剂或/和蛋白质交联离解剂而得到。腹膜透析液必须进行灭菌处理。灭菌处理通常在110以上的高温下进行，且为了防止葡萄糖变性，将pH降低至5.0-5.8。在添加交联抑制剂后在这样的条件下进行灭菌处理时，抑制剂或离解剂中有易分解或变性的化合物，所以在添加抑制剂前分别灭菌，在使用前添加抑制剂。另外，当化合物在高温下的稳定性低时，不能在高压高温下进行灭菌，希望用纳米滤膜等半透膜进行过滤除菌。
本发明中使用的糖类渗透剂以葡萄糖为主，它具有多个还原性末端基团，高温除菌处理下容易引起变性。在高压灭菌器中高温加热除菌时，使亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、硫化物、氢硫化物等在高温下稳定的还原剂与糖类渗透剂一同经受灭菌，即使是象葡萄糖这样具有还原性末端基团的糖，葡萄糖的变性反应也能被抑制。而在生成降解产物后，添加混合抑制剂的效果更好，通过该方法可维持透析液所含葡萄糖降解产物浓度在检测极限以下。
实施例通过以下实施例具体说明本发明的效果。在实施例中，蛋白质交联键程度利用AGE化蛋白质交联键而发出荧光的现象通过测定荧光强度来测定。(参考文献LeeK.W.等人“A systematic approach to evaluate the modication of lens protein byglycation-induced crosslinking”Biochim.Biophys.Acta.1453(1)141-151 1999年1月6日)(通过测定荧光值来测定蛋白质交联键的抑制效果) 为了灵敏地测定对蛋白质交联的抑制效果，使用乙二醛作为模型化合物。它是AGE化促进作用明显比葡萄糖高的葡萄糖降解产物(变性物)。将其以20mM/l的浓度溶解在含有50mg/ml人白蛋白的磷酸缓冲液中，添加表1记载的含巯基化合物20mM/l，37℃下培育2周。用日本分光社制的荧光强度计在激发波长370nm、测定波长440nm下测定白蛋白交联键发出的荧光值，将与培育前的荧光值相比的增加值表示成相对值(以不含抑制剂的对照例(比较例1)作为100)。结果示于表1。
除了不添加实施例1中的抑制剂之外，与实施例1一样测定荧光值。结果示于表1。
用甲基乙二醛代替实施例1中作为葡萄糖降解产物的乙二醛，用亚硫酸氢钠和亚硫酸钠作为交联抑制剂，与实施例1一样测定荧光强度，求出相对于下述比较例2的荧光强度的相对值。结果示于表2。
不添加实施例2中的交联抑制剂，仅在人白蛋白中加入甲基乙二醛，和实施例2一样测定荧光强度。结果示于表2。
用乙酰水杨酸和抗坏血酸代替实施例2中的交联键抑制剂，和实施例2一样测定与比较例2相比增加的荧光值的相对值。结果示于表2。
用栎精二水合物、儿茶素水合物、表儿茶素代替实施例2中采用的交联抑制剂，将其溶解在二甲基亚砜中后，以1∶3的比例加入磷酸缓冲液，与实施例2一样测定与比较例2相比增加的荧光值的相对值。结果示于表2。
用肝素代替实施例2中的交联键抑制剂，和实施例2一样测定与比较例2相比增加的荧光值的相对值。结果示于表2。
用氨基胍盐酸盐代替实施例2中的交联键抑制剂，和实施例2一样测定与比较例2相比增加的荧光值的相对值。结果示于表2。
用N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物代替实施例4中的交联键抑制剂，将其溶解在甲醇磷酸缓冲液为1∶1的混合溶剂中至20mM/l，和实施例4一样测定与比较例2相比增加的荧光值的相对值。结果示于表2。
用N-(2-噻唑基)磺胺、2-巯基-4-甲基-5-噻唑乙酸、4-(1，2，3，4-噻三唑-5-基氨基)酚水合物、2-氧-4-噻唑烷甲酸和2-巯基噻唑啉代替实施例7中的抑制剂，将它们分别溶解在DMSO磷酸缓冲液1∶3的混合溶剂中至20mM/l，和实施例7一样测定与比较例2相比增加的荧光值的相对值。结果示于表2。
将胶原IV型、甲基乙二醛以及表6所记载的任一化合物溶于磷酸缓冲液，37℃培育7日。与实施例1一样，以单独添加甲基乙二醛时(比较例3)的荧光强度增加值为100，用相对值表示荧光强度的增加值。结果和各抑制剂的氧化还原电位一同示于表3。
*Sigma Aldrich公司制造的NaHSO3和Na2S2O5的混合物表3记载的任一化合物均是已知的还原剂，它们的氧化还原电位显示出远低于蒸馏水或生理盐水的+160mV至+180mV电位的水平。因此知道氧化还原电位比生理盐水的氧化还原电位低的还原剂可有效地作为本发明的腹膜透析液的蛋白质交联抑制剂。
(通过氧化还原电位差滴定测定GDP量)[实施例10、比较例4]使含有氯化钠和葡萄糖的溶液在高压灭菌器中125℃下加热处理45分钟，然后用氧化还原电位差滴定法(硫代硫酸钠0.1M/l标准液)定量测定葡萄糖降解产物(GDP)。其结果示于表4。
(蛋白质交联离解剂的效果)[实施例11]将50mg/ml人白蛋白溶解在磷酸缓冲液中，在其中添加浓度为50mM/l的3-脱氧葡糖醛酮(3-DG)作为葡萄糖降解产物，37℃下培育7日，测定荧光强度。然后用磷酸缓冲液充分透析除去残余的3-DG，将20mM/l N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物溶解在甲醇磷酸缓冲液为1∶1的混合溶剂中，进一步在37℃下培育7日，测定第14日的荧光强度，求出自第7日的荧光强度减少率。结果示于表5。
将表儿茶素和儿茶素二水合物以20mM/l溶解于DMSO磷酸缓冲液1∶3的混合溶剂而得到的液体，以代替实施例11中N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物的甲醇磷酸缓冲液，与实施例9一样再培育7日，测定第14日的荧光强度，求出自第7日的荧光强度的减少率。结果示于表5。
从表3可以明白，靠3-DG作用形成的白蛋白的交联键可通过添加N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物等的键离解剂来离解。
(腹膜组织的AGE化抑制效果的测定)[比较例5]
在7周龄大鼠(体重300±15克)的腹腔内注入表6记载的溶液(A)，每日15毫升，5日后取壁层腹膜，冷冻切片，用AGE抗体处理，观察显色状态。结果如表7所示。
水溶液∶甲醇比例9∶1[比较例6]在比较例5中所用的混合液(A)中加入甲基乙二醛制得溶液(B)，与比较例5同样，观察通过大鼠腹膜切片的AGE抗体的显色状态。结果示于表7。
在比较例6中的溶液(B)中添加20mM/l的N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物得到溶液(C)，用该溶液进行与比较例5一样的大鼠腹膜切片的AGE抗体染色试验。结果示于表7。
继续与比较例6同样的实验，用溶液(A)将该大鼠腹腔反复洗净。然后，每日注入在溶液(A)中添加了20mM/l的N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物的溶液(D)15毫升共5日，进行与比较例3同样的大鼠腹膜切片的AGE抗体染色实验。结果示于表7。
○没有发现有AGE抗体显色×发现有AGE抗体显色从表7的结果知道，不含GDP的透析液(A)不引起腹膜组织的AGE化，在注入含有GDP的透析液(B)的场合，腹膜组织中清楚地发现AGE化部位。然而，在含GDP的溶液中预先添加了N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物的溶液(C)完全没有发现AGE化。
另外，即使是AGE化的腹膜组织，如果注入含有N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物的透析液(D)，也没有发现有AGE化，从而表明通过添加N-苯甲酰甲基噻唑鎓溴化物使蛋白质交联键离解。
实际利用的可能性由于腹膜透析法在生理上更好，患者容易进行社会活动，它是治疗肾衰竭的优良方法。在腹膜透析法中，为了靠渗透压除去过剩水分，在透析液中加入渗透剂，该渗透剂(葡萄糖或葡萄糖降解产物)引起蛋白质交联反应，因而存在由于腹膜硬化等原因腹膜透析不能继续的问题。本发明通过在腹膜透析液中加入阻止交联反应的化合物，抑制了蛋白质的交联反应，并能使形成了的交联离解。通过使用这样的腹膜透析液，可以长期进行腹膜透析治疗而不会引起腹膜硬化症，而且在腹膜已有一定程度硬化的场合，可以提供恢复正常状态和脱水功能的透析液。因此，本发明的腹膜透析液作为使治疗继续进行而没有问题的手段是极为有用的。
权利要求
1.一种腹膜透析液，其特征在于，在溶解了电解质盐和糖类渗透剂的水溶液中添加了蛋白质交联抑制剂和/或蛋白质交联离解剂。
2.根据权利要求1所述的腹膜透析液，其特征在于，蛋白质交联抑制剂是还原剂或抗氧化剂。
3.根据权利要求2所述的腹膜透析液，其特征在于，还原剂是氧化还原电位比生理盐水的电位低的还原剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的腹膜透析液，其特征在于，蛋白质交联抑制剂是巯基化合物、硫化物、氢硫化物、具有还原性的硫的含氧酸盐、硫脲及其衍生物、具有羟基和/或羧基的环状化合物、黄酮类化合物、含氮杂环化合物、偕腙肼基化合物或有糖醛酸基的粘多糖类。
5.根据权利要求4所述的腹膜透析液，其特征在于，巯基化合物是N-乙酰基半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、谷胱甘肽、S-乙酰基巯基琥珀酸酐。
6.根据权利要求4所述的腹膜透析液，其特征在于，具有还原性的硫的含氧酸盐是亚硫酸、酸式亚硫酸、硫代硫酸、焦亚硫酸或连二亚硫酸的钠盐、钾盐或其它生理上安全的盐。
7.根据权利要求4所述的腹膜透析液，其特征在于，具有羟基和/或羧基的环状化合物是乙酰水杨酸、抗坏血酸或其生理上安全的盐。
8.根据权利要求4所述的腹膜透析液，其特征在于，黄酮类化合物是栎精、儿茶素、表儿茶素或其它的杂环化合物中有两个以上羟基的化合物。
9.根据权利要求4所述的腹膜透析液，其特征在于，含氮的杂环化合物是有噻唑环、噻唑啉环、噻唑烷环、三唑环、四唑环、吲哚环、咪唑环、吡啶环或嘧啶环的化合物。
10.根据权利要求9所述的腹膜透析液，其特征在于，有噻唑环、噻唑啉环、噻唑烷环或三唑环的化合物是N-(2-噻唑基)磺胺、噻唑鎓溴化物、2-巯基噻唑啉、2-氧-4-噻唑烷甲酸或4-(1，2，3，4-噻三唑-5-基氨基)酚水合物。
11.根据权利要求9所述的腹膜透析液，其特征在于，具有吲哚环的化合物是N-乙酰基色氨酸。
12.根据权利要求4所述的腹膜透析液，其特征在于，含有偕腙肼基的化合物是氨基胍盐酸盐。
13.根据权利要求4所述的腹膜透析液，其特征在于，具有糖醛酸基的粘多糖类是肝素。
14.根据权利要求1-13任一所述的腹膜透析液，其特征在于，它含有胶质渗透剂作为渗透剂。
15.一种腹膜透析液的制备方法，其特征在于，在添加抑制剂前先在高温高压下灭菌处理腹膜透析液，然后加入分开灭菌的权利要求1-13任一项所述的抑制剂。
16.一种腹膜透析液的制备方法，其特征在于，使含有糖类渗透剂的溶液和权利要求1-13任一项所述的还原剂在高温高压下灭菌，再与分开灭菌的电解质盐混合。
全文摘要
尽管葡萄糖已经被主要用于治疗肾衰竭的的腹膜透析法，但有一个问题是蛋白质由于葡萄糖的氧化和变性而发生交联，从而使腹膜组织硬化，导致腹膜透析不能继续进行。为了解决该问题，提供了含有蛋白质交联抑制剂或使一旦形成的蛋白质交联离解的试剂的腹膜透析液。作为蛋白质交联抑制剂或一旦形成的蛋白质交联的离解剂，还原剂或抗氧化剂是有效的。这些腹膜透析液的制备方法是在加入抑制剂前高温高压灭菌处理腹膜透析液，然后加入分开灭菌的抑制剂。
文档编号A61M1/14GK1458850SQ01815509
公开日2003年11月26日 申请日期2001年9月7日 优先权日2000年9月13日
发明者酒井旭, 中山昌明 申请人:科学技术振兴事业团