专利名称：一种改良的人α型干扰素复合体的生产方法和用途的制作方法
本文涉及一种改良的重组复合型生物药，该药物主要由改良的α型干扰素+聚合物组成，属于生物制品生产方法及用途领域。本发明的药物主要用于丙型肝炎的治疗。
丙型肝炎是常见的严重的病毒感染性肝脏疾病，丙型肝炎病毒感染是全球性的。在美国估计有2.7百万人受感染，其中部分病人已发展为慢性肝炎，肝硬化和肝癌。在中国则有更多的感染病人。该病的严重性在于(1)大多数的感染者会发展为慢性肝炎，肝硬化和肝癌；(2)目前没有特别有效的治疗药物。
目前治疗丙型肝炎较为有效的药物主要是α型干扰素，但目前生产和使用的α型干扰素在人体内停留的时间比较短，会很快被机体清除。因此为确保疗效，需要大剂量，长时间地给药。这往往导致病人因无法忍受药物的副作用而停止治疗。因此研发一种能较长时间不被机体清除，而又活性高的α型干扰素，就能减少给药剂量，减低给药频率，从而减轻α型干扰素给机体带来的副作用，而得到较好的治疗效果。此种药物正是广大医生和病人所渴望的。基于这种目的，本人经过对现有的α型干扰素进行大范围的改造，筛选，从而发现了一种复合型的药物改良的α型干扰素+聚合物。它们能较长时间地置留在体内而不被机体所清除，并具有活性高，能有效地清除丙型肝炎病毒的优点。改良型α型干扰素的制备1.人白细胞文库cDNA的建立人白细胞文库含有100个18-40岁成人的白细胞混合物。这些人均为HIV，HBV，HCV阴性的正常人。
2.改良的干扰素PCR引物的设计5′-3′引物ACAAACCCACAGCCTGGGTA5′-3′引物ASTCATTCCTIACTTCTTATACTTTC3.以人白细胞cDNA文库为底物，用上述改良的干扰素PCR引物，在下列条件下扩增α型干扰素●10x扩增缓冲液10ul●dNTP 1.25/L 16ul●引物A(溶于5ul水)●引物AS(溶于5ul水)●人白细胞cDNA2ug以上材料加灭菌双蒸水至总体积100ul。
*10x扩增缓冲液的配制●500mM/LKCI●100mM/L Tris.CH，PH8.3●15mM MgCl2●0.1％明胶
*扩增条件为· 95℃4Mins · 72℃10Mins所得PCR扩增物长度经1.8％凝胶电泳分析为486bp4.将486bp长的PCR扩增物插入pT7表达载体(该表达载体T7 promoter+ATG+6xHis+EK recognition site+GAT CCA ACC CTT PCR AGGG+Ampicillin resistance gene)CTA GGT TGG GA Product TTCCC1)新鲜PCR产物2ul盐溶液 1ulpT7载体1ulT4 ligase 1ul共计 5ul将上述溶液混合后置于常温下5分钟。
2)从以上混合溶液中取2ul，加入30ul One Shot Chemically Competent E-Coli中轻轻混合。将其放置于冰上30分钟，然后进行42℃水浴30秒。再加入SOC溶液250ul，放入37℃振荡培养箱2小时。
3)取100ul上述培养物均匀涂于含50-100ug/ml ampicillin的LB+Agarose培养皿表面，放入37℃ C CO2培养箱12小时后，可见大约100个该细菌。
4)抽提质粒DNA取10个上述细菌，分别放入10个含5ml LB培养液+100ug/ml ampicillin的15ml试管内，在37℃下振荡培养12小时，然后4000rpm离心5分钟，所得沉淀物即为所需的细菌。
按照QIAGEN公司QIAprep Miniprep Handbook说明书抽提质粒DNA，具体步骤如下A.将10个试管中所收集的细菌分别溶解于250ul的P1溶液中并转入1.5ml离心试管内。
B.分别加入250ul P2溶液与其混合，再加入350ul N3溶液，混合后14000rpm离心10分钟。
C.将上清液分别加入离心柱。
D.12000rpm离心30秒.
E.加入0.5ml B溶液到离心柱12000rpm离心30秒。
F.加入0.75ml PE溶液到离心柱12000rpm离心3分钟。
G.将离心柱分别转入清洁1.5ml试管，再加入50ul dd H2O 12000rpm离心1分钟。
所得的离心液即为纯化的含有插入改良干扰素的质粒。
5.应用引物5′-＞3′GATCCAACCCTTCAAACCC测序插入改良的α-干扰素我们选择的核苷系列为1 gatccaaccc ttcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag61 atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac ttgactttgg atttccccag121 gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc181 cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc241 ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata301 cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg361 aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg421 gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt481 ataagaagta aggaatga其编码的蛋白质的氨基酸序列如下DPTLQTHSLG SRRTLMLLAQ MRRISLFSCL KDRLDFGFPQEEFGNQFQKA ETIPVLHEMI QQIFNLFSTK DSSAAWDETLLDKFYTELYQ QLNDLEACVI GGVGVTETPL MNEDSILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAW EVVRAEIMRS FSLSTNLQES IRSKE6.含有改良型α型干扰素在BL细菌中表达将步骤5经测序确定的质粒10ng DNA加入30ul BL细胞轻轻混合，冰上放置30分钟后置于42℃水箱内30秒。增加250ul 50C培养液37℃震荡(200rpm)培养2小时，增加10ml含100ug/ml ampicillin的LB培养液37℃培养12小时。
将10ml上述培养液加入4L含100ul/ml ampicillin的LB培养液振荡培养OD600为0.5时加入IPTG至终浓度为0.5mM。继续培养约12小时，离心4000rpm(4℃)5分钟，收集细菌，储存于-80℃冰箱。
7.改良型α型干扰素蛋白质的纯化1)将上述收集的细菌(储存于-80℃冰箱)拿出置于冰上15分钟后溶于裂解溶液(50mMNaH2PO4，PH8.0；300mM NaCl；10m Mimidazole)2)增加Lysozyme 1mg/ml，放于冰上30分钟。
3)声波裂解细菌在4℃条件下，用200-300W声波裂解(Sonicator)裂解细菌10秒，重复6次。
4)在4℃条件下，离心10000g，30分钟。除去细胞碎片，保留上清液。
5)每4ml上清液加入1ml 50％Ni-NTA凝胶(QIAGEN公司生产)混合，在4℃条件下搅拌30分钟。
6)离心8000rpm 5分钟，除去上清，加入清洗溶液(50mM NaH2PO4PH8.0；300mM NaCl；20mM Imidazole)，混合后离心8000rpm 5分钟。
7)除去上清，加入1ml稀释溶液(50mM NaH2PO4PH8.0；300mM NaCl；250mM imidazole)，离心8000rpm 5分钟，收集上清液，重复4次，共得4ml上清液，加入Enterokinase50u后置于37℃水浴30分钟即制得改良的α-型干扰素。
8)将上述4ml溶液加入透析袋，在4L透析液(0.01M Sodium borate，PH9；0.1％SDS)中透析24小时，更新透析液，重复透析三次。
8.聚合物与改良的α-型干扰素分子结合将改良的α-型干扰素加入Polyoxyethylated glycerol(POG)-ester glurate-N-hydrooxysucciminide，该物质分子结构为 其中n≈38时，分子重量为5000dalton。我们选择的分子重量范围为350-30000dalton。
将制备纯化的改良α-型干扰素按1mg/ml浓度溶于(0.01M Sodium borate，PH9；0.1％SDS)溶液，在22℃条件下，按照2克POG-ester glurate-N-hydrooxysucciminide比1克纯化的改良α-型干扰素的比例混合后搅拌45分钟，然后调节PH值到5.0[实例二]改良的α-型干扰素+聚合物药物半衰期的测定选用重量在200克至250克之间的雄性大白鼠(SD)共计40只，每20只为一组，分为两组。
第一组尾静脉注射改良α-型干扰素+聚合物(100ug/kg)后，在选择性时间(1小时，24小时，48小时，200小时)收集血样本放入含有肝素的试管中，通过离心收集血小板，血小板的体积通过秤重而决定。存放于-70℃冰箱内直至使用。
第二组尾静脉注射市场使用的α-型干扰素50万单位后，在选择性时间(1小时，24小时，48小时，200小时)收集血样本放入含有肝素的试管中，通过离心收集血小板，血小板的体积通过秤重而决定。存放于-70℃冰箱内直至使用。
使用前将血小板放于三倍体积的血小板稀释液中测定药物浓度，详细方法见参考文献(1)Le Maire et al，Anal，Biochem 1986，154，525-535；(2)Le Maire et al，Anal biochem 1980106，12-21。试验结果分析方法详细说明见参考文献Dunne，A 1985，20，269-275。实验结果见表普通α-型干扰素，改良α-型干扰素及改良α-型干扰素+聚合物的半衰期对照药物类别 药物半衰期普通α-型干扰素30分钟改良α-型干扰素30分钟改良α-型干扰素+聚合物350 60分钟改良α-型干扰素+聚合物500 100分钟改良α-型干扰素+聚合物1000 120分钟改良α-型干扰素+聚合物2000 200分钟改良α-型干扰素+聚合物3000 260分钟改良α-型干扰素+聚合物4000 350分钟改良α-型干扰素+聚合物5000 400分钟改良α-型干扰素+聚合物10000460分钟改良α-型干扰素+聚合物20000500分钟改良α-型干扰素+聚合物30000520分钟[实例三]改良α-型干扰素+聚合物治疗慢性丙型肝炎感染大白鼠的效果研究选择200只慢性感染丙型肝炎病毒的雄性大白鼠(重量约100-150克)，随机分成四组，每组50只。
第一组，每周一次静脉注射安慰剂，连续治疗6个月后收集大白鼠全血。
第二组，每周一次静脉注射1.5ug/kg改良α-型干扰素+聚合物(5000 dalton)，连续治疗6个月后收集大白鼠全血。
第三组，每周一次静脉注射3ug/kg改良α-型干扰素+聚合物(5000dalton)，连续治疗6个月后收集大白鼠全血。
第四组，每周三次静脉注射3万unit/kg自然α-型干扰素(市场销售)，连续治疗6个月后收集大白鼠全血。
丙型肝炎病毒的检测1.引物的设计A5’-GTC TAG CCA TGG CGT TAG TA-3’AS5’-CTC CCG GGG CAC TCG CAA GC-3’该设计的引物能放大220bp丙型肝炎病毒片段而不放大大白鼠的核酸片段。2.血液RNA的分离每个标本取全血0.25ml与一清洁消毒1.5ml试管内，加入0.75ml Trizol LS试剂(GIBCO BRL公司，Cat NO.10296)。充分混合后在室温下放置15分钟，增加0.2ml氯仿，使其充分混合后，于4℃条件下离心14000rpm 15分钟。转移上清与一清洁消毒1.5ml试管内，加入等量的Isopropyl alcohol后在室温下放置15分钟，于4℃条件下离心14000rpm 15分钟。
除去上清，加入0.75ml 100％乙醇，0.25ml DEPC水。于-20℃条件下放置30分钟后，离心8000rpm 8分钟。除去上清，沉淀干燥后即为总体RNA。最后将RNA溶于20ul水中，放入-80℃冰箱保存。3.cDNA的合成cDNA的含成参照GIBCO BRL公司cDNA Synthesis System(Cat No.18267013)第一链cDNA的合成在DEPC消毒处理的1.5ml试管内加入5x First Strand Buffer10ul10mM dNTP Mix 25ulOligo(dT)12-185ul总RNA 10ul(5ug)0.1M DTT 5ulDEPC处理的水 15ulM-MLV RT 2.5ul最后反应的组成为50mM Tris-HCL(PH8.3)75mM KCL3mM MgCl2500uM each dATP，dCTP，dGTP&dTTP50ug/ml Oligo(dT)12-18100ug/ml RNA10000units/mlM-MLV RT将上述反应物放入37℃水浴约1-2小时后放入-20℃冰箱4.PCRPCR参照GIBCO BRL公司说明书(Cat No.10342-020)10xPCR buffer200mM Tris-HCL(PH8.4)500mM KCLPCR.各组成成分如下总体积为100ul10x PCR buffer10ul10mM dNTP 2ul50mM MgCl23ul引物A 100pmol引物AS100pmolTaq DNA酶(5u/ul) 0.5ulcDNA 1-20ul(50ng-200ng)消毒ddH2o至 100ul于Perkin Elmer公司生产的GeneAmp PCR Systrm9600机器上，按照下列条件扩增94℃ 5分钟 72℃ 10分钟 延伸最后于-20℃冰箱保存。6.分析PCR产物agarose胶电泳阳性对照阴性对照Ethidium bromide染色UV光下观察7.结果分组HCVPositive Negative第一组(安慰剂对照) 50只 -(50只)第二组(1.5ug/kg)40只 10只(50只)第三组(3ug/kg) 36只 14只(50只)第四组(2万单位/kg) 48只 2只(50只)序列表《110》耿东进《120》一种改良的人α型干扰素复合体的生产方法和用途《140》02110839.0《141》2002-02-09《160》1《210》1《211》498《212》DNA《213》一种改良的人α型干扰素《400》11 gatccaaccc ttcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag61 atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac ttgactttgg atttccccag121 gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc181 cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc241 ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata301 cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg361 aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg421 gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt481 ataagaagta aggaatga《400》2gat cca acc ctt caa acc cac agc ctg ggt agc agg agg acc ttg atgAsp Pro The Leu Gln The His Ser Leu Gly Ser Arg Arg The Leu Met1 5 10 15ctc ctg gca cag atg agg aga atc tct ctt ttc tcc tgc ttg aag gacLeu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30aga ctt gac ttt gga ttt ccc cag gag gag ttt ggc aac cag ttc caaArg Leu Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45aag gct gaa acc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag atc ttcLys Ala Glu The Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct gct tgg gat gag acc ctcAsh Leu Phe Ser The Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu The Leu65 70 75 80cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac cag cag ctg aat gac ctg gaaleu Asp lys Phe Tyr The Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp leu Glu81 85 90 95gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg aca gag act ccc ctg atg aagAla Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Val The Glu The Pro Leu Met Asn100 105 110gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa tac ttc caa aga atc act ctcGlu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile The Leu115 120 125tat ctg aaa gag aag aaa tac agc cct tgt gcc tgg gag gtt gtc agaTyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140gca gaa atc atg aga tct ttt tct ttg tca aca aac ttg caa gaa agtAla Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser The Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160ata aga agt aag gaa tgaIle Arg Ser Lys Glu ***165《211》165《212》PRT《213》一种改良的人α型干扰素《400》3Asp Pro The Leu Gln The His Ser Leu Gly Ser Arg Arg The Leu Met15 10 15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg Leu Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu The Ile pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60Asn Leu Phe Ser The Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu The Leu65 70 75 80leu Asp lys Phe Tyr The Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp leu Glu81 85 90 95Ala Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Val The Glu The Pro Leu Met Asn100 105 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile The Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser The Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160Ile Arg Ser Lys Glu165《211》165《212》PRT《213》一种改良的人α型干扰素
权利要求
一种改良的重组复合型生物药，其特征为
1.该药物主要由改良的α型干扰素+聚合物组成；
2.在第一项中所提及的改良的α型干扰素，其编码的蛋白质的氨基酸序列如下DPTLQTHSLG SRRTLMLLAQ MRRISLFSCL KDRLDFGFPQEEFGNQFQKA ETIPVLHEMI QQIFNLFSTK DSSAAWDETLLDKFYTELYQ QLNDLEACVI GGVGVTETPL MNEDSILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAW EVVRAEIMRS FSLSTNLQES IRSKE其中以下氨基酸的设计在原有α型干扰素氨基酸的基础上加以改良第一位由Cys(半胱氨酸)改良为Asp(天冬氨酸)，第二位由Pro(脯氨酸)改良为Asp(天冬氨酸)，第三位由Leu(亮氨酸)改良为Thr(苏氨酸)，第四位由Pro(脯氨酸)改良为Leu(亮氨酸)，第三十四位由His(组氨酸)改良为Leu(亮氨酸)，第一百二十一位由Leu(亮氨酸)改良为Ile(异亮氨酸)；
3.第一项中所说的聚合物的分子式为 分子重量范围为500-30000daltons其中n值不同，分子重量不同，例如n≈38，分子重量为5000。
全文摘要
本发明涉及一种重组的复合型生物药(改良的重组α型干扰素复合体)及其制备方法和用途；属于生物制品生产方法及用途领域。此生物药是由人α型干扰素基因经人工改造，并将含其cDNA序列表达的载体在细菌中表达的蛋白质经纯化后附着于一聚合物而形成。该药物的组合为改良的α型干扰素+聚合物。本发明的药物主要用于丙型肝炎的治疗。与现有的α型干扰素基因工程药物相比，具有活性及稳定性更高，副作用更小及不易被机体清除等优点。
文档编号A61P31/00GK1436570SQ02110839
公开日2003年8月20日 申请日期2002年2月9日 优先权日2002年2月9日
发明者耿东进 申请人:耿东进