专利名称：治疗用粘质沙雷氏菌菌苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用粘质沙雷氏菌制备的药物及其用途。
本研究室从蜚蠊内脏中分离纯化出一株粘质沙雷氏菌S311株。该菌株为革兰氏阴性杆菌，周身鞭毛，有动力，无荚膜及芽胞，该菌在一般需氧条件下，37℃普通培养基上生长良好，在普通琼脂平板上，菌落光滑湿润，凸起，边缘整齐，呈圆形，生化反应能发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇、苦杏仁甙，产酸不产气。不发酵鼠李糖、阿拉伯糖、密二糖。能产生胞外脱氧核糖核酸酶。菌种编号CGMCCNO.0744，分类命名粘质沙雷氏菌Serratia marcescens.
粘质沙雷氏菌具有抗肿瘤作用，采用分离动物肠道细菌，对有抑瘤作用的细菌比较筛选发现，肠道菌中粘质沙雷氏菌有直接杀伤肿瘤细胞的作用。粘质沙雷氏菌灭活后的菌苗仍然保持有中等的直接细胞毒。粘质沙雷氏菌苗或者粗提物(细胞膜性结构及其核糖体等)可以制成抗肿瘤的免疫调节剂。用粘质沙雷氏菌制备的治疗药物或免疫制剂的治疗范围包括抗肿瘤、治疗癌性胸腹水、免疫调节、辅助放化疗治疗、升高白细胞、治疗牛皮癣、治疗尖锐湿疣、治疗红斑狼疮发热及皮肤红斑、治疗白塞氏综合症。
1.粘质沙雷氏菌苗是很好的免疫诱导剂1.1对脾脏的激活作用S311菌苗主要对网状内皮系统有免疫促进作用，能引起免疫小鼠脾脏肿大。小鼠腹腔一次性给药250亿/kg(8mg/kg)，3天起脾指数开始增加，7-14天达最高峰，(见表1)。
表1 S311菌苗免疫天数与脾指数的关系免疫天数 脾重(mg)/体重(g) 脾指数P对照组实验组3 5.75±0.538.52±0.751.48 ＜0.057 3.87±0.428.05±0.632.08 ＜0.0510 4.75±0.679.35±0.881.97 ＜0.0514 4.08±0.586.65±0.551.63 ＜0.0520 4.50±0.686.22±0.721.38 ＜0.051.1.2 对巨噬细胞吞噬功能的作用S311菌苗可以增强小鼠巨噬细胞吞噬功能。按125亿/kg(4mg)/kg体重，腹腔一次给药，7天后C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力增加6.31倍，与对照组比较呈非常显著性差异(P＜0.01)，不同给药剂量与吞噬指数的关系见表2。
表2 S311对C57BL/6小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响药物剂量 动物数腹腔巨噬细胞数细胞吞噬剂量吞噬指数亿/kg(只) ×104/ml ug/5×104细胞NS 0.5ml10102.0±25.3 0.118±0.196S31131.2510120.0±27.8 0.370±0.175**3.14S31162.5 10143.5±32.1 0.540±0.196**4.58S311125 10178.1±29.9 0.745±0.177***6.31S311250 10168.0±25.1 0.660±0.180***5.59注释与对照组比较**P＜0.05***P＜0.011.2诱导肿瘤坏死因子(TNF)的作用S311菌苗可以体外诱导小鼠巨噬细胞TNF-α的产生。在C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液中加入5×106菌数/ml，诱导TNF杀伤活性最高，与基因重组TNF-α样品比较，相当于2000U/ml剂量范围。经S311菌苗刺激3小时的巨噬细胞上清液即可测出TNF的杀伤活性，12小时产生的活性最高，以后随时间增加活性不再增加，反而逐渐下降，见
图1。
1.3诱生小鼠干扰素的结果S311菌苗具有较强的诱导小鼠脾细胞产生干扰素的能力。体内试验，将S311菌苗免疫4天的小鼠脾细胞体外培养，干扰素活性出现，免疫7天达高峰(7.47log2U±0.31log2U/ml)，以后逐渐下降。体外试验，正常小鼠脾细胞体外培养，加0.1亿菌苗/ml，12小时可以测出干扰素活性，48小时达到高峰(8.23log2U/ml±0.30log2U/ml)。
1.4 对造血系统影响的研究小鼠升白试验按中国生物制品规程2000年版暂行规定，第20页金黄色葡萄球菌滤液制剂制造及检定规程附录3《升白细胞试验》进行。结果环磷酰胺对照组与正常对照组比较白细胞下降，统计学有非常显著性差异，S311菌苗给药组与环磷酰胺对照组比较，给药组白细胞上升，统计学有非常显著性差异，连续2批小白鼠试验结果一致。
2 粘质沙雷氏菌苗有抗肿瘤作用2.1 抑瘤试验
2.1. 体外肿瘤细胞增殖抑制试验对人体肠癌M7609、小鼠白血病P388、人体肺腺癌LAX、髓性白血病K562、人体卵巢癌ao10/17，IC剂量(半数致死剂量)分别为3.94亿(126μg/ml)、3.3亿(105.55μg/ml)、5.5亿(176.63μg/ml)、5.2亿(168.68μg/ml)、及7.8亿(250.4μg/ml)。结论粘质沙雷氏菌苗对肿瘤细胞有中等疗效的直接细胞毒作用。
2.2.1 体内抑瘤试验粘质沙雷氏菌苗按62.5亿/kg、125亿/kg、187.5亿/kg三个剂量隔日给药5次，三种瘤谱的三次重复试验结果如下2.1.2 对艾氏腹水癌的抑制生命延长率分别为46.28％±2.83％；54.17％±5.66％；57.71％±6.02％。按死亡抑制率计算，腹腔给药的抑制率为90％。静脉给药抑瘤效果不显著。
2.1.3 对P388白血病腹水癌的抑制腹腔给药生命延长率为48.72％±8％；60.00％±11.4 4％；61.3 6％±4.74％。静脉给药效果不显著。
2.1.4 对B16黑色素瘤肺转移的抑制；腹腔给药生命延长率分别为46.08％±5.27％；51.68％±6.00％；57.73％±3.18％。静脉给药生命延长率分别为50.39％±6.51％；58.25％±8.01％；65.03％±7.48％。
2.1.5 腹腔内给药对小鼠肝癌HCA脾接种肝转移生命延长率分别为42.6％、49％、56.8％。
2.1.6 小鼠取脾接种HCA肝癌细胞，采用定量逆转录-聚合酶链反应技术(reverse transcriptase-polymerase chain reaction RT-PCR)检测粘质沙雷氏菌苗给药组与生理盐水对照组nm23基因、Tiam-1基因的表达水平。结果粘质沙雷氏菌苗可明显抑制小鼠肝癌HCA肿瘤转移相关基因nm23-1和Tiam-1的表达。S311菌苗给药组与生理盐水对照组小鼠比较，肿瘤原发灶及转移灶nm23-1癌转移相关基因表达的抑制率分别为45.2％、46.1％。Tiam-1基因表达的抑制率分别为29.1％、28.7％。表明粘质沙雷氏菌苗对小鼠HCA肝转移的抑制作用与nm23-1、Tiam-1癌基因的表达抑制有关。
3、临床研究3.1 由上海医科大学附属肿瘤医院、江苏省肿瘤医院、浙江省肿瘤医院、天津室肿瘤医院、北京市肿瘤医院、中山医科大学附属肿瘤医院、北京胸部肿瘤医院开展的粘质沙雷氏治疗癌性胸水250例临观察，有效率92.1％，高于目前现有治疗癌性胸水的药物。
3.2 南京鼓楼医脑外科采用Omaya化疗囊瘤内注射粘质沙雷氏菌苗的治疗恶性神经胶质瘤的人体实验证明，采用粘质沙雷氏苗苗疗效非常显著，随访术后1～4年的18例患者，13例存活，其中3例存活3.5年，4例存活4.5年，其中恶性程度很高的9例II～III级和IV级患者，随访8例存活，而同等级同期对照组肿瘤患者1年内无一例存活(附图)。恶性神经胶质细胞是一种常见的预后不良的严重疾病，防治效果难以令人满意，死亡率高。粘质沙雷氏菌苗的局部应用，为恶性神经胶质细胞瘤的治疗提供了一种新的提高手术存活率的有效方法。
3.3 南京鼓楼医院化疗介入科用粘质沙雷氏菌苗治疗癌性腹水10例，有效率(CR+PR)8例。治疗后9例病人KPS评分升高，生活质量得到改善。其中5例病人腹腔化疗失败者，经S311抗癌菌苗治疗后1例CR，1例PR。用粘质沙雷氏菌苗瘤内注射治疗实体瘤9例，肿瘤完全消退1例，肿瘤缩小50％以上4例，肿瘤缩小50％以内2例。
3.4 上海中医大学附属岳阳医院肿瘤科，用粘质沙雷氏菌苗治疗晚期肿瘤病人16例，有效率7例，其中一例病人肺癌肝转移灶5枚2枚消失。
3.5 海军401医院用粘质沙雷氏菌苗治疗银屑病42例，总有效率90.5％，治疗前后IgG、IgA、IgM有显著差异。结果表明，粘质沙雷氏菌苗治疗银屑病与免疫功能增强有关。
3.6 湖北荆门第二人民医院血免科，用粘质沙雷氏菌苗治疗红斑狼疮56例，证明粘质沙雷氏菌苗有消退红斑狼疮皮肤红斑和治疗红斑狼疮高热的作用。并且在治疗干燥综合症及白塞氏综合症上取得疗效。
3.7 海宁市性病检测中心用粘质沙雷氏菌苗治疗尖锐湿疣10例，痊愈有8例，有效2例，总有效率100％。目前南京中科院皮肤病研究所用粘质沙雷氏菌苗做免疫诱导剂，正在探讨粘质沙雷氏菌苗治疗尖锐湿疣的机理。
本发明具有创新性，其特点是该项研究成果获得国家生物制品一类新药证书，编号国药证字(2000)S-05号。
用粘质沙雷氏菌苗研究成功治疗癌性胸腹水及肿瘤的药物，产品具有创新性。治疗用粘质沙雷氏菌菌苗对银屑病、红斑狼疮皮肤红斑、红斑狼疮性高热、尖锐湿疣、白塞氏综合正、干燥综合症有治疗作用，该研究结果，不仅为上述疾病的治疗提供了新方法，而且为这些疾病的研究提供了新思路。
粘质沙雷氏菌苗生产工艺简单。该研究结果除了部分已经发表论文外，大部分内容没有公开发表。
权利要求
1.治疗用粘质沙雷氏菌制备的药物或免疫制剂，水针剂主要成分为粘质沙雷氏菌菌苗和溶剂或溶液；冻干粉针剂主要成分为粘质沙雷氏菌菌苗和赋形剂，其特征是药物中含粘质沙雷氏菌。
2.根据权利要求书1所述，其特征是给药途径包括注射、口服、滴鼻。
3.根据权利要求书1所述，其特征是用途包括治疗癌性胸腹水、肿瘤、升高白细胞、辅助放化疗治疗、可以作为免疫调节剂，治疗银屑病、尖锐湿疣、白塞氏综合症、干燥综合症、感冒、红斑狼疮皮肤损害和发热。
全文摘要
本发明治疗用粘质沙雷氏菌菌苗，用于抗肿瘤及调节免疫功能。该药物可以治疗癌性胸腹水和肿瘤，对一些免疫性疾病有辅助的治疗作用。粘质沙雷氏菌是一种具有抗肿瘤作用的菌种，其抗肿瘤作用诱导内原性抗肿瘤免疫因子，菌种本身对肿瘤细胞有中等强度的直接细胞毒。研究资料提供了粘质沙雷氏菌菌苗治疗与免疫功能密切相关的一些疾病疗效，粘质沙雷氏菌抗原有抗过敏作用，有提高细胞免疫及体液免疫的功能，有广泛药用开发前景。
文档编号A61K35/74GK1465353SQ0211199
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月5日 优先权日2002年6月5日
发明者靳小青, 何晓文, 钮燕, 陆翠琴 申请人:靳海, 中国人民解放军海军医学研究所, 靳 海