专利名称：从粘质沙雷氏菌分离的s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列及表达重组菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和酶工程领域，更具体地，本发明涉及一种粘质沙雷
氏菌(5"err^ia历arcMce/7s)S-腺苷甲硫氨酸合成酶(metK)及其编码基因， 以及表达metK酶的重组菌株。
背景技术：
群体感应(Quorum sensing)这个术语，是由Fuqua等1994年首先提出的。 其定义是当细菌的数量达到一定的密度(quorum)时才能发生的感应现象 (sensing)。当一个特定的环境中细菌的数量急剧增加时，由细菌所分泌的信 息分子的浓度也会相应的升高。通过扩散性信号小分子(又称为自诱导物)与转 录活化蛋白的相互作用而打开与细胞群体密度有关的基因表达。这些信号分子 从细菌细胞扩散到环境中， 一旦达到一个临界浓度(或者说达到某一特定的群 体密度)，这些信号分子就可诱导调节一系列目标基因的转录，从而在菌群范 围内控制其行为。群体感应在细菌中广泛存在，胞间交流可发生在细菌种内和
种间，细菌和其真核宿主间。在革兰氏阴性菌中，自诱导物通常是f酰基高丝 氨酸内酯(AHLs)，它可调节的功能包括抗生素合成、毒性因子产生、胞外多 糖合成、细菌丛集、质粒结合转移、生物膜形成、接合、孢子形成、生物发光 和稳定期进入等。
粘质沙雷氏菌能产生多种具工业应用潜力的物质，如壳质酶、蛋白酶、脂 酶、核酸酶、抗生素、表面活性剂等；并可发酵产生大量内消旋2,3-丁二醇， 灵菌红素；可利用碳源广，如单糖、蔗糖、甘油、纤维二糖等；是丙酮酸、琥 珀酸等有潜力的高产菌种；是兼性厌氧菌，在厌氧条件下，作为发酵工业菌株 具有节能优势。Rob Van Houdt等人利用粘质沙雷氏菌MGl QS突变株，通过检 测2，3-丁二醇的前体-乙偶姻，论证了 QS在2，3-丁二醇代谢合成中的生理作 用。结果表明，在邵71突变株中，2，3-丁二醇以及前体联乙醯和乙偶姻产量 都会大大降低。当添加C4-HSL和3-oxo-C6-HSL时，突变株中三种化合物的产量水平能够恢复到与野生型菌株一样。突变株的发酵结果和突变株
比较一致。QS系统的失活导致了在指数生长末期和稳定期酸性化合物的不断产 生，并且在利用糖发酵时，会引起早期生长停滞。Rice等人建立的在基本培养 基中添加葡萄糖和酪素考察生物膜变化的模型也说明了 QS系统对沙雷氏菌的 代谢调节功能。尽管QS系统调控2，3-丁二醇合成的精确机制还不清楚，但是 QS系统方面的工作对于研究细菌代谢将会有很重要的意义。
群体感应系统对粘质沙雷氏菌的次级代谢也具有重要的调控作用。很多沙 雷氏菌菌株产生灵菌红素，灵菌红素是一种次级代谢的红色抗生素，它的生物 合成是由一个涉及高丝氨酸内酯群体感应系统和p&基因簇的复杂网络调控， 同时，这个调控网络至少有两个单独的双组分信号转导系统和大量的其它调节 因子。Sarah等人将5)^274的/7/g基因簇导入不产色素的粘质沙雷氏菌12 (5"历a 12)中，结果5fej 12产生了红色素，并且是受自身aHSL-QS和7i/; S系统的调 节。反过来将aHSL-QS调节基因座从5"历a 12导入5"历a 274发现，6)z/a 274表现 出由aHSL控制的一系列生理行为，包括红色素的产生。QS调控系统、复合调 节网络以及环境信号对灵菌红素合成的影响被广泛的研究。
在沙雷氏菌S 39006中，灵菌红素和碳(杂)青霉烯是由以BHL和冊L为信 号分子的S/^I/R型的QS系统调控的，在沙雷氏菌SS-1中，灵菌红素的合成、 核酸酶的分泌以及游动性是由^p/7lR型的QS系统调节的。在不产生色素的MG1 菌株中，游动性、蛋白酶的分泌和生物膜的形成受aHSL-QS控制。5"历aluxS突 变株表现出了灵菌红素产量减少、溶血和致病性降低，这都是由代谢缺陷引起 的，由此说明Zd/W在激活甲基循环中具有代谢功能。在S/ra 12 突变体 中，甲壳酶的分泌、细菌素的生成以及溶血活性都是由QS控制的。在S历a 12 的调控体系中，S历3R的作用有待进一步确认。 一些学者认为，5历aR结合所有 它调节的基因的启动子； 一些人则认为5历aR依赖阻抑和aHSL型脱阻抑有关的 保守调节子发挥作用。这种调节蛋白具有保守的启动子元件，在aHSL存在时， 5"历sR能结合它，阻止转录。还有一些理论认为在QS系统控制下的多效调节子 调控灵菌红素和碳(杂)青霉烯的合成，例如在菌株S 39006中，Rap受QS控制， 从而影响代谢。
尽管目前本领域对于粘质沙雷氏菌在工业上的用途有所了解，然而还需要 进一步清楚地研究其生理或代谢功能，找到一些对于调节生理或代谢有用的基 因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来自于粘质沙雷氏菌的s-腺苷甲硫氨酸合成
酶(MetK)及其编码基因，含有所述编码基因的载体以及含有所述载体的重组菌 株。
本发明的目的还在于提供一种从粘质沙雷氏菌的基因组中分离S-腺苷甲 硫氨酸合成酶编码基因的方法。
在本发明的第一方面，提供一种分离的s-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，该多
肽选自下组
(a) 具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b) 将SEQ ID N0:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或
添加而形成的，且具有合成s-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。
在另一优选例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的分子量为41850道尔顿。 在另一优选例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶来源于粘质沙雷氏菌。 在另一优选例中，该多肽是具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列， 该核苷酸序列选自下组
(a) 编码所述多肽的多核苷酸；
(b) 与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO: l所示的序列。 在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。 在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。
在本发明的第五方面，提供所述的多肽的制备方法，该方法包含 (a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。
在本发明的第六方面，提供一种从粘质沙雷氏菌基因组中分离s-腺苷甲硫
氨酸合成酶的编码基因的方法，所述的方法包括
(1) 用限制性内切酶HindIII消化粘质沙雷氏菌基因组DNA，从消化产物中 分离3-5kb的DNA片段，并使这些DNA片段自身环化连接，形成自身环化分子；
(2) 以步骤(l)获得的自身环化分子为模板，以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物进行PCR扩增，收集分子量约1155士50bp的扩增产物；
(2)对步骤(2)获得的扩增产物进行测序验证，获得含有完整阅读框的
基因，即为s-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因。
在另一优选例中，在步骤(1)中，自身环化连接的温度是12'C。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图1显示了利用简并引物扩增的Met基因的部分片段，泳道M为标准DNA 分子量，自上向下的条带分别为(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。
图2显示了鹏"基因的反向PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳，其中泳道 CK为阴性对照；泳道M为标准DNA分子量，自上向下的条带分别为(kb): 23. 13， 9.416， 6.557， 4.361， 2.322， 2.027， 0.564， 0.125。
图3显示了历etvf基因的Southern Blot鉴定。
图4显示了历e"结构基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳；泳道M为标准DNA 分子量，自上向下的条带分别为(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。 图5显示了重组质粒pETmetK的图谱。
图6显示了重组质粒pETmetK双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳；M为标准DNA 分子量，自上向下的条带分别为(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。
图7显示了 ￡ co// BL21(DE3)/pETmetK诱导表达后的全菌体SDS-PAGE电 泳图；泳道M为标准蛋白分子量，自上向下的条带分别为(kDa): 94.0， 66.2， 45.0， 35.0， 24.0， 20.0， 14.4。
具体实施例方式
本发明人经过长期的研究和反复的试验，首次从粘质沙雷氏菌中分离获得 一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MetK)基因，经鉴定MetK是粘质沙雷氏菌QS系统 关键酶。该MetK酶的获得通过设计特殊的引物，通过对粘质沙雷氏菌基因组 DNA进行特殊的处理，以及通过常规PCR和反向PCR相结合的方法而克隆获得。 在此基础上完成了本发明。
更具体的，本发明的提供了一种从粘质沙雷氏菌中分离的MetK酶及其结 构基因、重组质粒和转化重组菌体。同时本发明提供了一种方法，即通过分子 生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其他受体菌，由其他菌株或在其他 培养条件下产生本发明涉及的MetK酶。
本发明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因是从粘质沙雷氏菌中分离获 得的，分离方法如下
(1) 用限制性内切酶HindIII消化粘质沙雷氏菌基因组DNA，从消化产物中 分离3-5kb的DNA片段，并使这些DNA片段自身环化连接，形成自身环化分子；
(2) 以步骤(l)获得的自身环化分子为模板，以SEQIDN0: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物进行PCR扩增，收集分子量约1155土50bp的扩增产物；
(2)对步骤(2)获得的扩增产物进行测序验证，获得含有完整阅读框的 基因，即为S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因。
在上述方法中，限制性内切酶的选择是重要的，本发明人发现，选择 HindIII酶以外的其它限制性内切酶消化粘质沙雷氏菌基因组DNA无法获得量 较多的3-5kb的DNA片段，获得从酶切产物中无法良好地扩增获得S-腺苷甲硫 氨酸合成酶。
并且，在酶切后，将自身环化连接的温度设置为12°C，该温度可获得连接 较好的自身环化分子，用于后续作为PCR扩增的模板。而采用常规的连接温度 如16"C，自身环化连接的效果不够理想。
上述方法中，采用SEQIDNO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物进行PCR 扩增，该PCR扩增为反向PCR扩增。
在本发明的实施例中，本发明人利用PCR技术(反向PCR和普通PCR)和分 子杂交相结合的方法成功克隆了粘质沙雷氏菌QS系统关键酶基因i/etf，同时
8利用pET28a")表达载体，表达分析了这一个基因，蛋白分子量的大小与预测的 分子量基本一致。^e"关键酶基因的克隆为深入研究QS调控系统遗传特点以 及研究QS系统在代谢中的功能奠定了基础。
如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然 的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸 和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在 的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，"分离的s-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白或多肽"是指s-腺苷甲
硫氨酸合成酶多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物
质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化s-腺苷甲硫氮酸合成酶
蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。s-腺苷 甲硫氨酸合成酶多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本 发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从 原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。 根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖 基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
在本发明中，"S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守性变异多肽"指与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多l个氨基酸被性 质相似或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组 DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编 码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO: l所示的编码区序列相同 或者是简并的变异体。如本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具 有SEQ ID NO: 2的蛋白质，但与SEQ ID NO: l所示的编码区序列有差别的核酸 序列。
编码SEQ ID NO: 2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序 列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选 的附加编码序列)以及非编码序列。术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以 是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序 列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发 生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替 换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改 变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至
少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本
发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指(1)
在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如O. 2XSSC， 0. 1%SDS， 60°C;或 (2)杂交时加有变性剂，如50呢(v/v)甲酰胺,0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll， 42 。C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发 生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO: 2所示的成熟多肽 有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段" 的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸， 最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定
和/或分离编码s-腺苷甲硫氨酸合成酶的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR 扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公 开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库 或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关 序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增 出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通 常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中 分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。 通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，己经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或 其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA
分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序 列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki， et al. Science 1985; 230: 1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的 cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根
据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常 规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或S-腺 苷甲硫氨酸合成酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生 本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science, 1984; 224: 1431)，可利用本发明的 多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。 一般来说有 以下步骤
(1) .用本发明的编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的多核苷酸，或用含有该多核 苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3) .从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体 中。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植 物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明 中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg, et al. Gene, 1987, 56: 125);在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans, J Bio Chem. 263: 3521, 1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆 状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以 用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译 控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含S-腺苷甲硫氨酸合成酶编码
11DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA 技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook， et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1989)。 所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。 这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；入噬菌体PL启动子； 真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启 动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其 病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终 止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择 转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗 性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于 转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞； 或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。原核细胞的代表性例子如大肠杆菌。
作为本发明的最优选方式，提供了一种转化重组大肠杆菌BL21/pETmetK， 该重组大肠杆菌含重组质粒pETmetK，插入的该质粒DNA片段的大小为6. 4kb， 该质粒pETmetK中含有序列表中SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。利用该重组
大肠杆菌可良好地表达s-腺苷甲硫氨酸合成酶。
重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主 为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCh。如 果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的函A 转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装 等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根 据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主 细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的 方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离 和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包 括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透 破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、 高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从粘质沙雷氏菌中分离出 的。其序列如SEQIDNO: 1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1155个碱基， 编码全长为384个氨基酸的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SEQ ID N0: 2)，该重组酶 的分子量为41850道尔顿。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例l粘质沙雷氏菌基因组DNA的提取
按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit (Biodev， 北京)抽提处于对数生长期的粘质沙雷氏菌H30(购自ATCC)的基因组DNA，并 用0. 8%琼脂糖凝胶电泳对获得的细菌基因组进行检测。
实施例2 MetK酶基因的克隆和重组菌构建
1、简并引物扩增
根据已报道其它种类的细菌///e"基因的序列，运用Genefisher软件设计 简并弓l物/z;et/i7禾口历"￡ ，引物序列为(其中，N=A/T/G/C， Y=C/T， D=A/G/T， R=A/G):
历etA7: 5， 一AACAAAATCCATGGCATCGAYRCNGTNGT—3， (SEQ ID NO: 3);禾口历eZ^么5' -TGCCGCCATAGGTATCCACDATDATYT丁-3'(SEQ ID NO: 4); 以实施例1获得的粘质沙雷氏菌的基因组DNA为模板，扩增沙雷氏菌基因 片段。
PCR扩增体系为基因组DNA2u 1，引物历e^7和历ez^ 各2u 1，dNTP2u 1， 10X7"ag缓冲液5ul， TAKARA Tag聚合酶lul， ddH20 38 ul。
PCR反应程序为95°C预变性5min， 94°C变性30s， 59°C退火30s， 72°C延伸30s，循环30次，72。C延伸lOmin。
将扩增条带切胶后用博大泰克公司柱式割胶回收试剂盒回收，连接于 TaKaRa公司pMD-T载体上并转化大肠杆菌DH5 a 。通过在氨苄青霉素LB平板 上进行蓝白斑筛选结合菌落PCR扩增，鉴定出阳性克隆，并在上海英骏生物技 术公司进行序列测定。测序之后，设计反向PCR所需特异引物metK3和metK4: 5， —CAGCGAGATGTCTTCTGAGTGC-3，(SEQ ID NO: 5);禾口
历"昆5， -TGGCTGACGGCGGGCACCAAAT-3，(SEQ ID NO: 6)。
2、 粘质沙雷氏菌基因组DNA的酶切
取10 u L基因组DNA用限制性内切酶#i/7d III消化12h后，用0. 8%琼脂 糖凝胶对消化后细菌基因组进行电泳分离，用割胶回收试剂盒回收大小在3-5 kb的片段，溶解于无菌水中。
3、 酶切片段的自身环化
取8"L回收的基因组DNA片段，用TaKaRa自身环化连接试剂盒进行自身 环化连接反应。连接酶切片段时，注意反应条件要有利于形成自身环化分子。 反应体系为8uLDNA片段，lwL连接缓冲液，1PL连接酶；在12。C条件下 连接过夜，低于常规的连接温度16"C。
4、 反向PCR扩增
用博大泰克公司DNA清洁试剂盒对连接反应液进行清洁处理，并将DNA洗 脱到20n L无菌的去离子水中，然后利用引物metK3和metK4进行反向PCR。
反向PCR扩增体系为基因组DNA2ul，弓|物历etvf/和历efy^各2u 1， dNTP 2ul， 10X7i^缓冲液5ul， TAKARA Tag聚合酶ddH20 38 ul。
反向PCR反应程序为95°C预变性5min， 94°C变性30s, 58°C退火30s，72°C延伸5min，循环30次，72°C延伸10min。
5、 反向PCR扩增产物的Southern杂交鉴定
为了确保反向PCR扩增产物含有核心区，在测序之前对反向PCR扩增产物 的特异性先进行鉴定，将反向PCR扩增产物在0.8y。琼脂糖凝胶上电泳。随后参 照Amersham Pharmacia的《分子克隆》第二版(科学出版社出版时间 1999. 10.01)进行凝胶的变性、中和、转膜及杂交鉴定。
6、 反向PCR扩增产物的测序
再次电泳分离反向PCR产物后，根据Southern杂交鉴定成阳性的条带的 大小，切胶后，用博大泰克公司柱式割胶回收试剂盒回收，连接于TaKaRa公 司pMD-T载体上并转化大肠杆菌DH5 a 。通过在氨苄青霉素LB平板上进行蓝白 斑筛选结合菌落PCR扩增，鉴定出阳性克隆，并在上海英骏生物技术公司进行 序列测定。将测得全长序列在GenBank数据库中进行分析，并借助NCBI的ORF Finder程序(http:〃爾.ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)确定其中的完 整阅读框，同时设计结构基因引物FpEXmetKl和RpEXmetK2:
FpEXmetKh 5， -GGAATTCCATATGATGGCTAAACACCTCTTCACG-3， (SEQIDN0: 7);和
RpEXmetK2: 5, -CCCAAGCTTTCGGGGCTTATTTCAGGC-3，(SEQ ID NO: 8)。
7、 /z/e"基因的表达
利用pET28a(+)质粒(Novagen)，构建表达载体，表达目的基因，进一步确 认克隆基因的正确性。
7. "结构基因的扩增
根据反向PCR扩增产物序列的拼接结果，设计FpEXmetKl和RpEXmetK2表 达引物。以基因组DNA为模板，扩增出历e"的完整结构基因。
PCR扩增体系为基因组DNA 2u 1,引物FpEXmetKl和RpEXmetK2各1， dNTP 2ixl， 10X7ag缓冲液5ul， TAKARA Tag聚合酶lul， ddH20 38 ul。
PCR反应程序为95°C预变性5min， 94°C变性30s， 57°C退火30s， 72°C延伸75s，循环30次，72°C延伸lOmin。
15并用DNA清洁试剂盒对扩增产物进行清洁处理。 7.2限制性酶切反应，纯化及连接反应
经纯化后的PCR产物，用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的酶进行 酶切反应。本实验中，所用的酶是A^el和氾/7d III。酶切体系为PCR产物或 质粒溶液20 ul， Wellul，历'77dlIIlul， IOX缓冲液3ul， ddH20 5 ul， 总体积30 u 1。
由于所选用的两个酶切位点在pET28a(+'空质粒上相距很近(约30bp)，因 此，酶切之后的PCR产物和质粒载体只需经过PCR清洁试剂盒即可达到纯化的 目的。
经酶切纯化后的PCR产物和质粒载体，可以用于连接反应。连接反应体系 为酶切纯化的PCR产物lOu 1，酶切纯化的质粒3til，T4连接酶lul，10X 连接酶缓冲液2ul， ddH20 4 "1。连接后获得重组质粒pETmetK，其主要结 构如图5所示。
7. 3质粒制备与转化
质粒抽提采用质粒提取试剂盒制备，参照生产商的说明书进行操作。 质粒转化细胞使用氯化钙法。具体操作如下
7.3.1大肠杆菌感受态细胞的制备
(1) 从新鲜的大肠杆菌培养平板上接种一单菌落于5ml LB液体培养基， 37X培养过夜。
(2) 按0. 5-1%的比例转接于100ml LB液体培养基，37T培养2-4个小时， 当菌液0D,约为0.3。
(3) 将菌液转移到预冷的50ml离心管中，冰浴30分钟，4000rpm离心 10分钟。
(4) 去上清，沉淀悬浮于5ml预冷的0. 1M的CaCl2溶液中，冰浴15分钟， 4000rpm离心10分钟。
(5) 去上清，沉淀悬浮于2ml预冷的0. 1M的CaCl2溶液中，冰浴10分钟， 4000rpm离心10分钟。
(6) 去上清，沉淀悬浮于lml预冷的0. 1M的CaCl2溶液中，加入高压灭菌的甘油至终浓度15%。
(7)取200 u 1分装于1.5ml tip管中，于-70。C保存，备用。
7. 3. 2重组质粒pETmetK的转化
(1) 取0. 1-1 g重组质粒pETmetK DNA于200u 1感受态细胞中，冰浴 30分钟。
(2) 42°C水浴热激90秒，快速置于冰上1-3分钟。
(3) 加入新鲜LB液体培养基800u 1,于37。C振荡培养45分钟。
(4) 取200y 1菌液涂布于选择性LB固体培养基表面。37°C培养12-16 个小时至单菌落出现。
7.3.3重组子的鉴定
将阳性菌落接种于含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中进行培养并 提取质粒，按照"7.2限制性酶切反应，纯化及连接反应"中的酶切体系和条 件用Ndel和氾/^ III重组质粒进行双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电 泳，结果见图6，说明获得的重组质粒是正确的。
经电泳结果证实，该阳性克隆菌落有DNA片段插入质粒pETmetK，含此重 组质粒pETmetK的重组大肠杆菌，即为转化的重组大肠杆菌BL21/pETmetK。测 序结果显示插入片段含有一个长H55bp的开放阅读框架。
本发明的重组大肠杆菌BL21/pETmetK可用于研究MetK基因的功能，以及 对QS系统合成信号分子的调控作用。同时也是研究QS系统调控微生物代谢的 重要工程菌。
实施例3 MetK酶的诱导表达
本发明的重组大肠杆菌BL21/pETmetK表达的条件为37°C培养，IPTG诱 导；获得的重组菌￡ cWiBL21(DE3)/pETmetK的菌体悬于磷酸缓冲液(pH7)中， 利用超声波破碎细胞，离心上清液为可溶性目标蛋白。
将重组大肠杆菌BL21/pETmetK接种于添加适当抗生素的LB液体培养基中 (LB培养基组成为酵母粉O. 5%、胰蛋白胨1%、 NaCl 1%， pH7. 0) ， 37'C摇床 培养过夜；再以5%的接种量转接到装有30mLLB培养基的250 mL摇瓶中，37°C 摇床培养4小时，加入IPTG诱导(终浓度lmM)，然后继续培养6小时后，离心收集菌体。将收集的菌体进行全菌SDS-PAGE电泳，结果如图7所示，表明基 因工程菌表达出了 MetK，图中泳道M为标准蛋白分子量(自上向下的条带分别 为97.4, 66.2， 43， 31， 20.1， 14. 4 kDa)。在43kD左右出现了一条明显的蛋 白条带，酶已成功表达。
经验证，所获得的MetK酶具有良好的合成S-腺苷甲硫氨酸的功能，酶活 性很高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，
本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。序列表
<110〉 华东理工大学
<120>从粘质沙雷氏菌分离的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列及表达重组菌株
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cccaagcttt cggggcttat ttcaggc 2权利要求
1. 一种分离的S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有合成S-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。
2. 如权利要求l所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO: 2所 示氨基酸序列的多肽。
3. —种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸 序列选自下组(a) 编码如权利要求l所述多肽的多核苷酸；(b) 与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4. 如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQID N0: 2所示氨基酸序列的多肽。
5. 如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQIDNO: l所示的序列。
6. —种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7. —种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8. 权利要求l所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a) 在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b) 从培养物中分离出s-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。
9. 一种从粘质沙雷氏菌基因组中分离S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因 的方法，其特征在于，所述的方法包括(1) 用限制性内切酶HindIII消化粘质沙雷氏菌基因组DNA,从消化产物中 分离3-5kb的DNA片段，并使这些DNA片段自身环化连接，形成自身环化分子；(2) 以步骤(l)获得的自身环化分子为模板，以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物进行PCR扩增，收集分子量约1155土50bp的扩增产物；(2)对步骤(2)获得的扩增产物进行测序验证，获得含有完整阅读框的基因，即为s-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，自身环化连 接的温度是12'C。
全文摘要
本发明属于生物技术和酶工程领域，公开了一种从粘质沙雷氏菌分离的S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽或将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有合成S-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。本发明还公开了所述酶的编码基因，含有所述编码基因的载体，以及含有所述载体的宿主细胞。本发明还公开了从粘质沙雷氏菌中分离S-腺苷甲硫氨酸合成酶编码基因的方法。
文档编号C12N9/00GK101429498SQ20071004801
公开日2009年5月13日 申请日期2007年11月9日 优先权日2007年11月9日
发明者周文瑜, 孙建安, 张燎原, 虎 朱, 杨云龙, 沈亚领, 昱 邱, 魏东芝 申请人:华东理工大学