专利名称：：一种产碱杆菌的培养及用于腈水解制备羟基乙酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一株产碱杆菌及其用途，尤其是用于制备羟基乙酸的方法。
背景技术：
：羟基乙酸(HOCH2COOH)是最简单的a-羟基酸，广泛地应用于日化、纺织和医药等行业，不仅可以作为家用和工业用的清洗剂，还可以用作粘接剂、焊接剂、破乳剂和涂料的配料及合成多种农药、医药和化学助剂，市场需求量大。水解法合成羟基乙酸的方法有两种化学法和生物法。生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶；腈水解酶能将腈水解生成相应的羧酸和氨，具有选择性好、反应条件温和及产品纯度高等优点，明显优于化学法水解。美国专利U.S.P.3，940,316和U.S.P6,037，155利用而/zra6她rNSSC104，5acz7/ws，5acten'w附，_S/"ev/6acfen'M/w，AZ/crococa/5:及^fn'ovon3xspp.将羟基乙腈水解合成羟基乙酸。日本专利JP61，277,649报道i/odococcws/7cxioc/wowsATCC33025菌株禾口GoratowateweMA-1菌株會巨将羟基乙腈水解为羟基乙酸，其转化率接近100%。专利U.S.P.6,416,980利用J"Wovorax72W及变异株的腈水解酶合成羟基乙酸，野生菌有酰胺生成，变异株转化的产物浓度可以累积达lM。中国专利CN1772912A报道的乳酪短杆菌(5rev/to"en'wmcase/)CGMCCNo.0887经过长期的诱变育种，酶活力单位可以达到10万单位/mL发酵液。这些酶法合成羟基乙酸所显示的优越性，为替代化学法展示了良好的应用前景。但是现有的腈水解酶对羟基乙腈耐受性比较差，筛选新的腈水解酶菌株成为当务之急。
发明内容本发明需要解决的技术问题是提供一种产碱杆菌及其制备羟基乙酸的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。发明人从华东理工大学校园内的土壤中，经初筛、复筛及分离纯化得到一株腈水解酶菌株，经过表型鉴定和16SrDNA鉴定，该菌株为产碱杆菌j/ca"gewessp.，编号为X/ca/z'ge"essp.ECU0401。本发明所说的产碱杆菌^/ca/^""sp.ECU0401是一种属于产碱杆菌属的菌种，该菌株己于2007年4月27日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.2009，已申请专利CN200710040563.3(申请号)。筛选方法包括如下步骤采集了不同环境条件下400份土壤样品，利用羟基乙腈为唯一氮源进行两轮液体富集培养，筛选腈水解酶产生菌。通过反复筛选，分离得到一株高活力的腈水解酶产生菌。本发明的菌种具有如下的微生物学特征1.形态特征(1)细胞的形态球形(2)细胞的大小0.51.2x0.52.6pm;(3)掷胞子的形成无；2.在各种培养基上的生长状态(1)牛肉浸膏明胶穿刺培养(2(TC，6天)不液化明胶；(2)牛肉浸膏琼脂平板培养(30'C，2天)菌落的形态圆形，白色，菌落表面隆起平滑、有光泽、菌落粘稠；菌落的大小24mrn;3.生理生化特征(1)硝酸盐利用(28'C，5天):利用；(2)对氧的需求好气；(3)胞外类淀粉化合物产生不产生；(4)尿素水解阳性；(5)甲基红试验阴性；(6)碳源同化阳性麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、甘油、淀粉和肌醇；阴性乳糖；(7)碳源发酵不发酵碳源；(8)生长pH范围4.0-9.0;(9)生长最适宜温度2050°C。根据"伯杰细菌鉴定手册"提供的鉴定方法和上述的试验结果表明，该菌种属于产碱杆菌(^/o^ge"Msp.)。但又与以前报道的产碱杆菌有明显的不同，其主要不同之处在于催化羟基乙腈具有较高的活性和转化率。经16SrDNA鉴定，确认该菌株为产碱杆菌04/^%6"^sp.)，编号为y4/c"//ge"essp.ECU0401本发明的产碱杆菌^/cfl/扭""sp.ECU0401可以用于催化羟基乙腈生产羟基乙酸，包括如下步骤1.菌株的培养摇瓶培养将所说的产碱杆菌^/^//伊"^sp.ECU0401采用本领域常规的方法，在发酵培养基中进行扩增培养2436h，温度2045。C;再以该培养液做为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1~10%(v/v)，接种至200mL发酵培养基中，在2050。C下100160rpm的摇床上培养2448h,离心、洗涤得到静息细胞；发酵罐扩大培养在5L发酵罐中加入适量(50-70。/。，v/v)的发酵培养基，基于发酵培养基体积的接种量为l10n/。(v/v)，接种至5L发酵罐中，通气量1:0.11:1(vvm)，搅拌转速200~400rpm，温度2045。C，时间18~120h，离心、洗涤得到静息细胞。所说的发酵培养基可采用常规的培养基，其组分和含量如下乙酸铵5~15g，蛋白胨520g，酵母膏5~20g，KH2P041~10g，NaCl0.1~2g，MgS040.1~2g，诱导剂I0.011g,生长素G0.01-0.1g，水1000mL，pH4.0~9.0。所述的诱导剂(I)包括但不限于a-氨基丙腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈、乙腈、丁腈、4-氯-3-羟基丁腈、2，3-二氰基吡嗪，羟基乙腈、苯乙腈或/和己内酰胺；所述的生长素(G)包括但不限于CaCl2、CoCl26H20、CuS04、FeS047H20、MgS04、MnS04H20、Na2Mo042H20、NiS047H20、ZnS04'7H20、生物素、泛酸钙、叶酸、半胱氨酸、甘氨酸、肌醇、尼克酸、核黄素、维生素B,、对氨基苯甲酸钠或/和盐酸吡哆醛。2.静息细胞催化羟基乙腈水解生产羟基乙酸将收获的静息细胞，以1~100g湿重/L悬浮于pH为4.08.0的磷酸钾缓冲溶液中，加入羟基乙腈，使其浓度为10200mM，在20~50。C和100~160rpm的恒温摇床上振荡反应224h,羟基乙酸的含量用HPLC进行分析。腈水解酶的活力单位定义每分钟水解羟基乙腈产生lMmol羟基乙酸所需要的酶量。3.海藻酸钠固定化细胞催化羟基乙腈水解生产羟基乙酸将海藻酸钠固定化细胞，以1~200g湿重/L悬浮于pH为4.08.0的Tris-HCl缓冲溶液中，加入羟基乙腈，使其浓度为10200mM，在20~50。C和100160rpm的恒温摇床上振荡反应224h，羟基乙酸的含量用HPLC进行分析。图l是利用」/ca/^朋Msp.ECU0401静息细胞催化羟基乙腈生产羟基乙酸的反应进程曲线；图2是固定化细胞催化的多批反复水解反应的结果。符号说明附图2中，^游离细胞，O固定化细胞。具体实施例方式通过下述典型的实施例将有助于理解本发明，但不能限制本父母的内容。实施例l微生物摇瓶培养将从土壤中分离并保藏的产碱杆菌^^//伊"^sp.ECU0401(保藏号CGMCCNo.2009)接种至50mL种子培养基(甘油10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH2P042g，NaCl1g，MgS040.2g，水1000mL，pH8.0)中预培养15h，以该培养液做为种子液，以5%的接种量接种至200mL发酵培养基(乙酸铵15g，蛋白胨10g，酵母膏6g，KH2P042g，NaCl2g，MgSO40.4g，生长素FeSO47H2O0.5g，诱导剂苯乙腈0.2g，水1000mL，pH8.0)中，在30。C下160rpm摇床上培养48h。实施例2腈水解酶菌株活性比较将分离得到的爿/^//^""sp.ECU0401与及/joJococcuseo^ra/oto1.2362、//jocfococcw5Wzocfoc/woMSECU1201和及/zoJococcwsn/6er4.1187的腈水解酶菌株活性进行比较。将上述的四株菌的静息细胞分别悬浮于lOOmL磷酸钾缓冲溶液中，加入羟基乙腈，终浓度分别为20mM，在30。C和160rpm的恒温摇床振荡反应30min，立即在上清液中加入2MH2SO4酸化至pH为1.02.0终止反应，将反应液以10，000xg离心15min，除去细胞，HPLC检测分析，发！U/c^ge""sp.ECU0401腈水解对羟基乙腈活性较高。利用离子色谱分析反应液，没有发现可能出现的副产物乙醛酸、甲酸及草酸，产物羟基乙酸没有被代谢。表l腈水解酶菌株活性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3利用」/ca//gewessp.ECU0401生长细胞催化羟基乙腈水解生产羟基乙酸配制种子培养基(甘油10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，KH2P042g，NaCllg，MgSO40.2g，水1000mL，pH8.0)，在lL摇瓶中装入200mL种子培养基，培养种子液。再配制发酵培养基(乙酸铵15g，蛋白胨10g，酵母膏6g，KH2P042g，NaC12g，MgSO40.4g，生长素FeS(V7H200.5g，诱导剂苯乙腈0.2g,水1000mL,pH8.0)。在5L发酵罐中装入3L发酵培养基，消毒后接入5%的种子液，进行发酵培养24h，加入IOOmM羟基乙腈，不同时间取样HPLC分析，当羟基乙酸分析得率为96%时继续补加经过氢氧化钠中和处理的羟基乙腈溶液IOOmM和10g的乙酸铵，当产物羟基乙酸累积浓度达到3M左右时，停止补料，继续反应使底物羟基乙腈消耗完，当底物残留浓度<0.02%，终止反应。整个培养及反应过程时间为64h，转化率>99.0%，羟基乙酸浓度3.05M，羟基乙酸产率>98.0%。实施例4利用j/ca//gewessp.ECU0401静息细胞催化羟基乙腈生产羟基乙酸将实施例l得到的细胞进行离心(10,000xg，15min)，称取湿重10g的静息细胞，将静息细胞悬浮于1000mL磷酸钾缓冲溶液中，分别加入羟基乙腈，终浓度为200mM，在30。C和160rpm的恒温摇床振荡反应，将反应液以10，000xg离心15min，除去细胞，HPLC检测分析。发酵优化后，腈水解酶活性明显地提高，转化200mM的羟基乙腈，反应8h后羟基乙酸的分析得率>99.0%，可J^4/cfl/扭w"sp.ECU0401能耐受较高的底物浓度。其反应进程曲线如图l所示。实施例5利用固定化细胞催化羟基乙腈生产羟基乙酸在底物羟基乙腈浓度为100mM(0.41%w/v)的1000mL反应体系中，加入海藻酸钠固定化细胞100g，在30。C、160rpm的条件下反应8h，重复操作36次，以游离细胞为对照。结果如图2所示，固定化催化剂可反复回用36次以上，达到了令人满意的效果，具有潜在的工业应用价值。实施例6腈水解酶蛋白序列本发明的腈水解酶经过纯化后对其蛋白进行测序，结果如下MQTRKIVRAGAVQAASPNYDLATGVDKTIELARQARDEGCDLIVFGETWLPGYPFHVWLGAPAWSLKYSARYYANSLSLDSAEFqRIAQAARTLGIFIALGYSERSGGSLYLGQCLIDDKGQMLWSRRKLKPTHVERTVFGEGYARDLIVSDTELGRVGALWEHLCKSPLSCYALYSQHEAIHIAAWPSFSLYSEQAHALSAKVNMAASQIYSVEGQCFTIAASSVVTQETLDMLEVGEHNASLLKVGGGSSMIFAPDGRTLAPYLPHDAEGLIIADLNMEEIAFAKA腦PVGHYSKPEATRLVLDLGHREPMTRVHSKSVIQEEAPEPHVQSTAAPVAVSQTQDSDTLLVQEPS。权利要求1.一种生物催化产生羟基乙酸的方法，其特征在于通过腈水解酶催化羟基乙腈水解得到羟基乙酸，包括如下步骤(1)将产碱杆菌Alcaligenessp.ECU0401在发酵培养基中进行扩增培养，经过离心得到静息细胞；(2)将收获的静息细胞作为生物催化剂，悬浮于pH为4.0～8.0的磷酸钾缓冲溶液中，加入羟基乙腈，在25～50℃反应2～24h，然后从反应产物中收集羟基乙酸；所述的腈水解酶是通过培养一株保藏号为CGMCCNo.2009的产碱杆菌Alcaligenessp.ECU0401而得到。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的产碱杆菌J/ca紐e"essp.ECU0401CGMCCNo.2009的培养获得腈水解酶的条件如下(1)培养基组成乙酸铵515g，蛋白胨5~20g，酵母膏5~20g，KH2PO4l~10g，NaC10.12g，MgSO40.1~2g，诱导剂0.01~1g，生长素0.01~0.1g，水1000mL，pH4.09.0;(2)发酵条件通气量1:0.11:1(vvm)，搅拌转速200~400rpm，温度2045。C，时间18120h。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的诱导剂包括但不限于a-氨基丙腈、丙烯腈、亚氨基二乙腈、乙腈、丁腈、4-氯-3-羟基丁腈、2，3-二氰基吡嗪，羟基乙腈、苯乙腈或己内酰胺。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的生长素包括但不限于CaCl2、CoCl2'6H20、CuS04、FeS047H20、MgS04、MnS04.H20、Na2Mo04'2H20、NiS04'7H20、ZnS047H20、生物素、泛酸转、叶酸、半胱氨酸、甘氨酸、肌醇、尼克酸、核黄素、维生素Bi、对氨基苯甲酸钠或盐酸吡咳醛。5.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的羟基乙腈的浓度为10200mM。6.如权利要求l所述的方法，其特征在于，磷酸钾缓冲溶液中的静息细胞含量为1-100g湿重/L。7.将培养得到的^/c"/扭w"sp.ECU0401的静息细胞进行海藻酸钠固定化，将得到的固定化细胞作为生物催化剂水解羟基乙腈。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，羟基乙腈的浓度为10200mM。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，海藻酸钠固定化细胞在Tris-HCl溶液中的含量为1-200g湿重/L，在25~50。C反应224h，然后从反应产物中收集羟基乙酸。10.如权利要求1和权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的生物催化剂中腈水解酶由300400个氨基酸序列组成。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的腈水解酶由下述氨基酸序列组成MQTRKIVRAGAVQAASPNYDLATGVDKT正LARQARDEGCDLIVFGETWLPGYPFHVWLGAPAWSLKYSARYYANSLSLDSAEFQRIAQAARTLGIFIALGYSERSGGSLYLGQCLIDDKGQMLWSRRKLKPTHVERTVFGEGYARDLIVSDTELGRVGALWEHLCKSPLSCYALYSQHEAIHIAAWPSFSLYSEQAHALSAKVNMAASQIYSVEGQCFTIAASSVVTQETLDMLEVGEHNASLLKVGGGSSMIFAPDGRTLAPYLPHDAEGLIIADLNMEEIAFAKAINDPVGHYSKPEATRLVLDLGHREPMTRVHSKSVIQEEAPEPHVQSTAAPVAVSQTQDSDTLLVQEPS。全文摘要本发明涉及一株新近从土壤中分离的腈水解酶产生菌Alcaligenessp.ECU0401的培养及其用于催化羟基乙腈水解制备羟基乙酸的方法。该方法以羟基乙腈为起始原料，以通过在发酵培养基中进行扩增培养得到的产碱杆菌Alcaligenessp.ECU0401细胞为生物催化剂，在一定条件下进行羟基乙腈水解反应，得到产物羟基乙酸。本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。文档编号C12P7/42GK101186933SQ200710048010公开日2008年5月28日申请日期2007年11月9日优先权日2007年11月9日发明者何玉财,张志钧,许建和申请人:华东理工大学