专利名称：含酮康唑和荼替芬的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗真菌性皮肤病的药物制剂，特别是一种含酮康唑和萘替芬的药物组合物。
背景技术：
真菌性皮肤病是一种常见病、多发病，尤其是亚热带潮湿高温地区的发病率更高。目前治疗真菌性皮肤病的外用药多数属于单疗效制剂，且疗效不甚理想。
咪唑类和丙烯胺类药物是近年来常用的新型、高效、安全、低毒的抗真菌药物。它们均可抑制真菌细胞膜麦角固醇的合成，使膜结构破坏从而抑制真菌细胞的生长。但二者影响麦角固醇合成的机制不同。咪唑类药物代表药物有酮康唑、氟康唑、咪康唑等，作用于羊毛类固醇的C-14去甲基化酶，抑制羊毛类固醇向14-去甲基羊毛类固醇的转化，从而抑制麦角固醇的合成，对皮肤癣菌和酵母菌等均有较强的抑菌和杀菌作用。但据有关报道，病原菌对咪唑类药物的耐药性逐渐增加，单用咪唑类药物治疗时出现疗效不佳、易于复发等情况。丙烯胺类主要有特比萘芬和盐酸萘替芬，作用靶位是角鲨烯环氧化酶，抑制角鲨烯转化为角鲨烯环氧化物，最终抑制麦角固醇的生物合成。此外，角鲨烯的堆积会导致细胞膜脆性增加而破裂。丙烯胺类对皮肤癣菌杀菌力强，但对酵母菌的效果较差。
发明内容
本发明的目的是研制一种丙烯胺类药物和咪唑类药物联合应用的制剂，通过不同的作用机理，提供具有协同作用，抗真菌疗效好、具抗耐药性的新型真菌性皮肤病的药物制剂。
本发明提供了一种含盐酸萘替芬和酮康唑作为活性成分的药物组合物，用于治疗真菌性皮肤病。
上述活性成分盐酸萘替芬和酮康唑占组合物总重量的0.625％～5％，其它成分是药物可接受的辅剂，如赋形剂等。
盐酸萘替芬在活性成分中的百分含量是30％～80％(重量)，酮康唑在活性成分中的百分含量是20％～70％(重量)。
其中，两种成分在活性成分中的优选百分含量是盐酸萘替芬80％，酮康唑20％。即优选比例(重量)是盐酸萘替芬∶酮康唑＝4∶1。
其中，所述活性成分盐酸萘替芬和酮康唑在药物组合物中优选以醇溶液形式存在。优选溶剂为丙二醇；优选溶剂为苯甲醇。
经药效学实验证实，本发明的药物组合物对体内外皮肤癣菌和白色念珠菌均有良好的药物活性，证实盐酸萘替芬与酮康唑联合应用具有协同或相加作用，即其药效明显优于单用。
本发明的药物组合物的剂型可以是溶液剂、油剂、乳膏剂、霜剂、粉剂等外用药剂型。
下面结合实施例和试验例对本发明进行更进一步的说明，但应该理解的是，本发明并不仅仅限于这些实施例和试验例。
具体实施例方式一、组合物的制备本发明组合物的制备方法包括以下步骤(1)将盐酸萘替芬、酮康唑分别溶于丙二醇和苯甲醇中。
(2)制备外用药载体或赋形剂。
(3)将(1)与(2)混合均匀。
以实施例1的制备过程为例(1)将盐酸萘替芬1g、酮康唑0.25g分别溶于3g丙二醇和1g苯甲醇中。(酮康唑(KCZ)和盐酸萘替芬(NTF)标准品由重庆华邦制药股份有限公司提供，酮康唑批号20001202；盐酸萘替芬批号010208。)。
(2)将白凡士林7g、液体石蜡4g、单硬脂酸甘油酯3g、十六醇3g加到容器中，加热至70～75℃，搅拌熔融。
(3)将(1)倒入(2)中搅拌均匀。
(4)将吐温-80和蒸馏水加入到容器中，加热至70～75℃，搅拌均匀，将温度保持在70～75℃，搅拌下加入(3)中，乳化均质30分钟，冷凝后即得。
实施例盐酸萘替芬(g)酮康唑(g)110.252373559-158267371-二、生物学实验试验1体外药效学试验试验目的比较酮康唑、盐酸萘替芬及两药联合的体外抗真菌作用，筛选出酮康唑、盐酸萘替芬两药的最佳药物配比。
试验参照以下方法1997年美国国家临床试验标准化委员会(NCCLS)提出的标准①National Committee forclinical laboratory standards reference method for broth clilution antifungal susceptibility testingofyeastapproved Stancland M2fA.National Committee for clinical Laboratony Standards.Villanova.Pa，1996(M27-A方案)，分别应用常量液基稀释法和微量稀释法。
曹永兵、姜远英、王宁微量液基稀释法测定化合物特苄康唑的体外抗真菌活性，中国抗生素杂志2000，3，183-187。
郑玮清、王文莉、李若瑜、微量法检测皮肤癣菌6种抗真菌药物感性，中华皮肤科杂志1999，5，350-352。
刘维杰、王星燕、吴建明，微量稀释法测定皮肤癣菌最低抑菌浓度(MIC)的实验研究，临床皮肤科杂志1997，4，228-229。
试验药物及材料1)药物实施例1-7的药物组合物2)试验菌株18株皮肤癣菌和30株白念珠菌，具体如下(1)表皮癣菌属絮状表皮癣菌×2株(2)小孢子菌属羊毛状小孢子菌×2株石膏样小孢子菌×2株(3)毛癣菌属红色毛癣菌×5株须癣毛癣菌×5株紫色毛癣菌×2株(4)念珠菌属白念珠菌×30株以上菌株均由长征医院皮肤科真菌保藏管理中心隐球菌专业试验室提供，均为鉴定过的临床分离株，并选白念珠菌标准株ATCC76615为质控菌。3)培养基RPMI1640培养液RPMI1640粉10.4g MOPS粉34.53g 双蒸水900ml NaOH调节PH至7.0定容至1000ml；滤器滤过以便除去细菌。-20℃冰箱保存。
改良沙堡氏培养基(SDA)葡萄糖2％蛋白胨1％琼脂2％氯霉素0.05％高压灭菌后浇于培养皿和试管内，低温冰箱保存。
试验步骤1)常量液基稀释法(1)菌悬液的制备将受试的皮肤癣菌接种于SDA上27℃培养10天。取数团(含营养菌丝)受试菌于0.8ml蒸馏水中，经研磨器均匀研磨。用血细胞记数板记数，包括孢子和菌丝，将其浓度调至1-5×106CFU/ml(相当于0.5个麦氏单位)；然后用RPMI1640培养液将菌悬液浓度稀释为0.5-2.5×105CFU/ml(终浓度)。
(2)抗真菌药物的配制将药物用DMSO溶解为51200μg/ml的药物母液，然后再分别稀释为320μg/ml(10倍工作浓度)，按不同质量配比混合后再依次倍比稀释成10个浓度。
(3)液基稀释法取900μl菌悬液接种至100μl含不同浓度药物的试管中(对倍稀释)。丝状真菌27℃培养6～7天，用分光光度计在630nm处测量各试管的吸光度，与生长对照管比较≥80％生长抑制所对应的最低药物浓度为酮康唑、盐酸萘替芬及两药联合的MIC值。
MBC(最小杀菌浓度)的测定将无真菌生长的培养基再分别转种于SDA培养基上，继续培养10-12天，无菌生长的最低浓度即为该药对该菌的MBC值。2)微量稀释法(1)菌悬液的配制将受试白念珠菌菌株接种于SDA上35℃培养48小时后用2ml生理盐水制成菌悬液，用麦氏比浊管调整为0.5个麦氏单位，将悬液于血细胞计数板上计数为1×106-5×106CFU/ml，然后用RPMI1640培养基将菌悬液浓度稀释为1-5×103CFU/ml(稀释1000倍)(2倍工作浓度)。
(2)药液的配制将药物用DMSO溶解为51200μg/ml的药物母液，然后再用RPMI1640培养基分别稀释为256μg/ml(2倍工作浓度)，按不同质量配比混合后再依次倍比稀释为10个浓度。
(3)药敏反应板制备取无菌96孔微量反应板，于1-10孔分别加100μl菌悬液和药液，使各孔的最终药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg/ml；11孔加200μl菌悬液为生长对照；12孔加200μl液体培养基为空白对照。药敏板放置35℃恒温箱培养。
(4)MIC值和MBC值的判定白念珠菌于35℃培养48小时后用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。于生长对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC值。然后将无真菌生长的培养基再分别转种于SDA培养基上，继续培养10-12天，无菌生长的最低浓度即为该药对该菌的MBC值。
当药物的MIC值和MBC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计MIC值和MBC值高于最高浓度128时，计为“≥128”MIC值和MBC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.03”。
上述实验均平行操作2-3次，当MIC值和MBC值均能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值和MBC值；当MIC值或MBC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。3)时间-杀菌曲线实验OscarM，Philippe M，Milippem，Michel PG，et al potent synergism of theCombination of flnconazole and cyclosporine in candida albicans Antimicrobial Agants andchemotherapy by 2000；44，2373-0381.
(1)菌悬液的制备选两株白念珠菌CZ3288及CZ3087为试验菌株.将白念珠菌在SDA培养基上35℃培养48小时后用生理盐水制成1个麦氏单位(1-10×106cfu/ml)的菌悬液。然后用RPMI1640培养液将其稀释成浓度为1-10×104cfu/ml的菌悬液。
(2)药液的配制用RPMI1640培养液将药物配成浓度为MBC的药液，其中酮康唑、盐酸萘替芬及两药联合应用(2/8)的浓度均为128μg/ml。
(3)取1ml菌悬液与9ml药液(对照组为9mlRPMI1640液体培养基)混合置35℃培养48小时。在0、12、24、36、48小时分别取100μl混合液依次10倍级稀释1/10，1/102，1/103，1/104，1/105。然后再取100μl适量浓度的稀释液在SDA培养基上均匀涂布接种(3份)，35℃培养48小时后计算其菌落计数(取3个值的平均值)。根据计数绘制时间-杀菌曲线。见时间一杀菌曲线图。
试验结果1、皮肤癣菌和白念珠菌对酮康唑、盐酸萘替芬及两药联合的MIC值和MBC值的几何均数及分布范围见表1、2、3，质控菌的试验结果均在正常范围内。经秩和检验表明皮肤癣菌对盐酸萘替芬∶酮康唑＝4∶1配比组与其它几组药物的敏感性差异具有统计学意义(P＜0.01)。从表中看出，盐酸萘替芬∶酮康唑＝4∶1配比对皮肤癣菌有良好的药效活性，其MIC峰值在0.03-0.063μg/ml之间(皮肤癣菌)，其MBC峰值也在0.03-0.063μg/ml之间，MIC50及MIC90均为最低，而且其几何均数均明显低于其它几组药物。盐酸萘替芬∶酮康唑＝3∶7、4∶1、5∶5及0∶1配比组对白念珠菌的抑菌效果均较好，经秩和检验表明相互无统计差异，均比2∶8、7∶3及1∶0的效果好，有统计学意义(P＜0.01)。
2、盐酸萘替芬∶酮康唑＝4∶1组对皮肤癣菌和白色念珠菌均显示出协同或相加作用。
3、试验中发现，酮康唑与盐酸萘替芬对白念珠菌的MIC值范围均较大，如酮康唑的MIC值范围为0.125-64μg/ml，盐酸萘替芬的MIC值范围为0.5-128μg/ml。
4、时间-杀菌曲线结果盐酸萘替芬、酮康唑及其联合应用对白念珠菌主要表现为抑菌作用，而且两药联合应用能增强其抑菌作用。
结论体外实验证明盐酸萘替芬与酮康唑联合应用其药效明显优于单用，两药最佳配比浓度为盐酸萘替芬∶酮康唑＝4∶1。试验2豚鼠皮肤真菌感染的药效学试验试验目的评价复方盐酸奈替芬的体内抗真菌作用，筛选出最佳药物浓度。
材料及方法试验药物复方盐酸萘替芬乳膏(CNTF)，由盐酸萘替芬和酮康唑及基质构成，其高(2.5％)、中(1.25％)和低(0.625％)浓度中盐酸萘替芬含量分别为2％、1％和0.5％，酮康唑含量分别为0.5％、0.25％和0.125％。批号分别为010802、010803、010804，2％酮康唑乳膏(KCZ)和1％盐酸萘替芬乳膏(NTF)批号分别为010810和010808，空白乳膏(基质M)批号为010805，均由重庆华邦制药股份有限公司提供。
试验菌株红色毛癣菌(Trichophyton rubrum，Trichophyton purputeatum)，C21251；白色念珠菌(Candida albicans)，C2ATCC76615。
由第二军医大学长征医院皮肤科提供。
接种前先恢复其致病力，并接种于沙堡琼脂(Sabrouraud dextrose agar SDA)斜面试管，26℃培养基中培养10天左右，取菌落备用。
方法参照文献新药(西药)临床前研究指导原则汇编，中华人民共和国卫生部颁发，1994年5月鲍燕燕、凌云、陈沐璞等盐酸萘替芬对豚鼠皮肤镁癣霉的疗效观察，中国抗生素杂志2000，25(2)，145；郭宁如、吴绍熙、沈永卓等特比萘替芬治疗豚鼠皮肤癣菌感染的疗效，新药与临床1996，15(6)，339。
选取健康合格一级豚鼠140只，体重240～270g，雌雄兼用， 由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证医动字第310101019号，环境设施合格证号医动字第310103002号。先喂养观察一周，然后去除背部脊柱两侧毛发(8×4cm)，约为全身面积的1/4。用2#砂纸反复磨擦损伤皮肤，有轻度渗出物为准。将皮肤损伤豚鼠分为两部分(每一部分为70只)，一部分动物反复涂抹红色毛癣菌悬液1ml于皮肤损伤处，另一部分动物反复涂抹白色念珠菌悬液1ml于皮肤损伤处，并反复摩擦1～2min。将感染红色毛癣菌或白色念珠菌的动物分别隔离喂养7～10天，保持室温在28～30℃。于喂养7～10天后，分别检测每只动物皮肤感染真菌模型。以皮肤出现皮疹或鳞屑，经镜检有真菌菌丝则为红色毛癣菌感染；有真菌孢子则为白色念珠菌感染模型。
将70只红色毛癣菌或70只白色念珠菌模型动物分别随机分为复方盐酸萘替芬大、中、小剂量组、2％酮康唑组、1％盐酸萘替芬组及基质组和空白组(B)，每组感染豚鼠10只，红色毛癣菌感染模型动物共计7组，白色念珠菌感染模型动物共计7组。各组动物分别隔离喂养。各组动物分别涂抹相应药物，每只动物每天用药量1g，分两次应用，上午9点和下午4点，连续用药14天。于用药4天开始逐只动物检测药效。
疗效评价于涂抹药物第四天开始，每天镜下检测真菌感染皮肤处皮疹、皮屑、痂皮真菌菌丝或孢子，连续两次镜检为阴性动物则刮取皮屑或痂皮进行真菌培养。治愈标准为皮损消退，两次镜检阴性且真菌培养阴性者。无效则为皮损未退，真菌镜检阳性者。
分别统计和计算各组动物的治愈率。
我们首先对酮康唑和盐酸萘替芬的联合使用进行了研究，进行了一系列一般药理、药效学、急毒、长毒、药动学、局部刺激性等试验，我们发现二者联合使用可以达到很好的抑菌效果，以下实验说明本发明。
复方盐酸萘替芬对结果表明盐酸萘替芬∶酮康唑＝4∶1配比组对皮肤癣菌有良好的药物活性，优于其他配比组；盐酸萘替芬∶酮康唑＝3∶7、4∶1、5∶5及0∶1配比组对白色念珠菌的抑菌效果均较好，均比2∶8、7∶3及1∶0的效果好。盐酸萘替芬与酮康唑联合应用其药效明显优于单用，两药最佳配比浓度为盐酸萘替芬∶酮康唑＝4∶1。
肤癣菌和白色念珠菌均显示出协同或相加作用。
3、试验中发现，酮康唑与盐酸萘替芬对白念珠菌的MIC值范围均较大，如酮康唑的MIC值范围为0.125-64μg/ml，盐酸萘替芬的MIC值范围为0.5-12μg/ml。
4、时间-杀菌曲线结果盐酸萘替芬、酮康唑及其联合应用对白念珠菌主要表现为抑菌作用，而且两药联合应用能增强其抑菌作用。
结论体外实验证明盐酸萘替芬与酮康唑联合应用其药效明显优于单用，两药最佳配比浓度为盐酸萘替芬∶酮康唑＝8∶2。
复方盐酸萘替芬乳膏对豚鼠红色毛癣菌或白色念珠菌感染模型的疗效观察结果，复方盐酸萘替芬大、中剂量组对豚鼠红色毛癣菌感染模型7天疗效优于单用1％盐酸萘替芬乳膏(P＜0.05)，14天疗效与1％盐酸奈替芬和2％酮康唑相比也有差异；对豚鼠白色念珠菌感染模型8天疗效优于单用1％盐酸萘替芬和2％酮康唑乳膏(P＜0.05)，14天疗效与1％盐酸奈替芬相比有差异。实验结果表明复方盐酸萘替芬对红色毛癣菌或白色念珠菌感染均有明显疗效。
复方盐酸萘替芬治疗白色念珠菌，大、中、小剂量组与基质和空白组比较，在治疗第7天以后治愈率均有显著性差异。大、中剂量组疗效相当，在第8天治愈率达80％、第12天治愈率达100％，与1％盐酸萘替芬或2％酮康唑组比较有显著性差异；第14天治愈率为100％，与1％萘替芬组比较仍有差异。小剂量组与1％盐酸萘替芬和2％酮康唑组比较，在整个治疗阶段治愈率均无显著性差异。试验结果显示复方盐酸萘替芬大、中剂量组治疗白色念珠菌感染明显优于1％盐酸萘替芬和2％酮康唑，小剂量组与1％盐酸萘替芬和2％酮康唑疗效相当。复方盐酸萘替芬治疗红色毛癣菌，大、中、小剂量组与基质和空白组比较，在治疗第6天以后治愈率均有显著性差异。大、中剂量组疗效相当，第7天治愈率达80％，第11天治愈率为100％，与1％盐酸萘替芬组或2％酮康唑组比较有显著性差异；第14天治愈率为100％，与1％盐酸萘替芬和2％酮康唑组比较仍有差异。小剂量组与1％萘替芬和2％酮康唑组比较，在整个治疗阶段治愈率均无显著性差异。试验结果显示复方盐酸萘替芬大、中剂量组治疗红色毛癣菌感染明显优于1％盐酸萘替芬和2％酮康唑，小剂量组与1％萘替芬和2％酮康唑疗效相当。此外，达到相同疗效复方盐酸奈替芬所用的时间比单用1％盐酸奈替芬和2％酮康唑更短。
以上试验结果提示，盐酸萘替芬中剂量(1.25％)组抗真菌疗效明显优于1％盐酸萘替芬和2％酮康唑(均为临床用药浓度)，且浓度属较低者，因此，1.25％是复方盐酸萘替芬最佳浓度，是我们推荐用于临床研究的药物浓度。
复方盐酸萘替芬对白色念珠菌或红色毛癣菌感染豚鼠模型均有显著疗效，优于单用1％盐酸萘替芬软膏和2％酮康唑2。
表1药敏实验总结一览表
注几何＝几何均数N＝盐酸萘替芬K＝酮康唑表2 酮康唑、盐酸萘替芬及两药联用对试验菌株的MIC分布
注N＝盐酸萘替芬，K＝酮康唑，NTF＝盐酸萘替芬，KCZ＝酮康唑表3 酮康唑、盐酸萘替芬及其联合用对试验菌株的MBC分布
注N＝盐酸萘替芬，K＝酮康唑，NTF＝盐酸萘替芬，KCZ＝酮康唑
权利要求
1.一种用于治疗真菌性皮肤病的药物组合物，特征为含盐酸萘替芬和酮康唑作为活性成分。
2.根据权利要求1的药物组合物，所述活性成分盐酸萘替芬和酮康唑占组合物总重量的0.625％～5％，其它成分是药物可接受的辅剂。
3.根据权利要求1的药物组合物，其中盐酸萘替芬在活性成分中的百分含量是30％～80％(重量)，酮康唑在活性成分中的百分含量是20％～70％(重量)。
4.根据权利要求3的药物组合物，其中，盐酸萘替芬和酮康唑在活性成分中的优选百分含量是盐酸萘替芬80％(重量)，酮康唑20％(重量)。
全文摘要
本发明涉及一种含酮康唑和萘替芬的药物组合物，用于治疗真菌性皮肤病。本发明的药物组合物中的活性成分盐酸萘替芬和酮康唑占组合物总重量的0.625％～5％，其它成分是药物可接受的辅剂，如赋形剂等。盐酸萘替芬在活性成分中的百分含量是30％～80％(重量)，酮康唑在活性成分中的百分含量是20％～70％(重量)。经药效学实验证实，本发明的药物组合物对体内外皮肤癣菌和白色念珠菌均有良好的药物活性。
文档编号A61K31/496GK1481797SQ0212939
公开日2004年3月17日 申请日期2002年9月9日 优先权日2002年9月9日
发明者潘明欣, 朱学琳, 刘葵, 刘燕, 李娟 申请人:重庆华邦制药股份有限公司