专利名称：全血灌流吸附治疗用吸附剂的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学材料领域，涉及一种全血灌流吸附治疗用吸附剂及制备方法。
重症肌无力(myasthenia gravis，以下简称MG)是一种主要累及神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体由乙酰胆碱受体抗体介导的细胞免疫依赖性补体参与的自身免疫性疾病，乙酰胆碱受体抗体主要为免疫球蛋白G(IgG)。MG是一个临床进展较为恶略的疾病，不积极治疗会引起严重后果，未经治患者10年内死亡率可高达20-30％。胆碱酯酶抑制剂、胸腺切除、免疫抑制剂、静脉内注射免疫球蛋白、血液净化为目前MG的主要治疗方法。比较而言血液净化因能直接清除患者血液中的致病抗体，即刻改善MG的症状，能使危重病人转危为安，是目前几种治疗方法中最为积极、见效最快的方式。
自1976年Pinching AJ首先报道血浆交换治疗使MG病人症状得以缓解之后，以血浆交换为基础的直接清除MG患者血液中的致病抗体的血液净化治疗方法不断改进。首先人们认识到血浆交换需补充正常人体血浆，不仅给患者带来经济负担，且存在血制品的污染问题。为克一种专用于制备全血灌流吸附治疗用吸附剂的方法，它是经过以下步骤制成的(1)吸附剂载体的活化用抽滤瓶抽干蒸馏水反复冲洗后的载体，按照琼脂球或纤维素球重量(克)∶1M氢氧化钠体积(毫升)∶环氧氯丙烷体积(毫升)＝1∶2-4∶1-2的比例，向载体中加入氢氧化钠和环氧氯丙烷，将其置入25-28℃恒温摇床中，振荡反应2小时，用蒸馏水淋洗净；(2)偶联配基按照载体重量∶L-色氨酸pH8.5-11的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶1.5-4的比例，置反应器中混合并于25-37℃摇床振荡反应18-24小时，停止反应后用蒸馏水淋洗净，测定反应前L-色氨酸饱和溶液及淋洗液L-色氨酸含量，计算载体L-色氨酸的固定率；(3)用乙醇胺或氢氧化钠溶液封闭未结合配基的载体上的环氧基团；(4)以压力1kg/cm2，时间20分钟高压灭菌。
一种全血灌流吸附治疗用吸附剂的用途，它是用于临床全血灌流治疗自身免疫性疾病，吸附患者血液中的致病免疫球蛋白G。其中可用于全血灌流治疗重症肌无力，吸附患者血液中的乙酰胆碱受体抗体。
本发明的有益效果是本发明是一种安全、有效、造价低适于全血灌流治疗的吸附剂，它制备方法简单，材料来源广泛，生产成本低，血液相容性好。在本发明的应用中，由于以色氨酸为配基的吸附剂在吸附治疗中的吸附机制在于其疏水作用力，而一些自身免疫性疾病，如MG、多发性硬化、急性感染性多发性神经炎、慢性感染性脱髓鞘性多发性神经根神经病等其致病主要抗体均为免疫球蛋白G，IgG上疏水基团较多。所以，以球形纤维素或琼脂凝胶为载体色氨酸为配基的吸附剂可通过其疏水力在这些疾病的治疗中发挥作用。尤其是吸附剂对MG患者体内乙酰胆碱受体抗体具有较高的亲和吸附能力，在MG的治疗中具有广阔的应用前景。
应用球形纤维素或琼脂凝胶为载体色氨酸为配基的吸附剂，进行血液相容性和疗效观察取得了满意的结果本发明用于健康家兔，验证其血液相容性；用于MG动物模型验证其治疗效果。
1，吸附剂血液相容性观察实验结果是灌流治疗后血细胞、电解质没有明显变化。以球形纤维素为载体的吸附剂白蛋白损失率为3.1％，球蛋白损失率为23.9％。以琼脂凝胶为载体的吸附剂白蛋白损失率为4.8％，球蛋白损失率为26.9％。因此，以球形纤维素或琼脂凝胶为载体色氨酸为配基吸附剂具有较好的血液相容性。
2，吸附剂与乙酰胆碱受体抗体阳性重症肌无力病人血清体外静态吸附实验实验结果是静态吸附2小时，以球形纤维素为载体色氨酸为配基吸附剂对乙酰胆碱受体抗体吸附率为44.79％，以琼脂凝胶为载体色氨酸为配基吸附剂对乙酰胆碱受体抗体吸附率为34.53％。因此，以球形纤维素或琼脂凝胶为载体色氨酸为配基吸附剂对乙酰胆碱受体抗体有较高的吸附能力。
3.吸附剂全血灌流亲和吸附治疗MG模型动物的观察实验结果是一次治疗2小时，抗体最大吸附率为46.84±3.17％。临床无力症状明显改善，重复神经电刺激实验复合动作电位衰减率从25.88±5.97(3Hz)、26.88±7.44(5Hz)和29.38±6.98(10Hz)恢复到18.63±4.90(P＜0.05)、20.13±7.51和21.38±8.57；单纤维肌电图平均颤抖值也从23.00±3.87(3Hz)、27.25±3.53(5Hz)和30.88±4.73(10Hz)明显地减少到16.38±3.12(P＜0.05)、19.25±3.86(P＜0.05)和22.38±4.92(P＜0.05)。因此，以球形纤维素为载体色氨酸为配基的吸附剂能有效清除MG体内致病抗体，并相应改善临床症状，提高神经肌肉电传导功能。
1-4-1.按照球形纤维素载体重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应18小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为47.1％。
1-4-2.按照球形纤维素载体重量∶L-色氨酸pH11的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应18小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为49％。
1-4-3.按照球形纤维素载体重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应20小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为47.8％。
1-4-4.按照琼脂凝胶载体重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应18小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为38.7％。
1-4-5.按照琼脂凝胶载体重量∶L-色氨酸pH11的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应24小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为42.5％。
1-4-6按照琼脂凝胶载体重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应20小时。实施例1.吸附剂制备1-1制备球形纤维素载体(1)制备碱化精制棉将19％氢氧化钠溶液800ml倒入100克精制棉中，使棉花完全浸没于氢氧化钠溶液中，室温静置碱化2小时，挤去碱液，将碱化后的棉花称重(365克)并置于2500ml锥型瓶中，25℃恒温密闭老化三天。
(2)制备纤维素黄原酸酯粘胶液向已老化的精制棉中加入50ml二硫化碳，充分混匀后密封，于28℃水浴中静置5小时至棉花纤维呈橙红色，向其加入6％氢氧化钠溶液885ml，充分混匀后于28℃水浴摇床振荡反应5小时至棉花呈晶亮橙红色的粘胶状的黄原酸酯。室温存放。
(3)制备球形纤维素载体将装有电子继电器和电动搅拌器的500ml三颈瓶置于水浴锅中，并向其中加入氯苯360ml，四氯化碳60ml，油酸钾0.7克，电子继电器维持水浴温度25℃，低速搅拌至油酸钾完全溶解，向其中缓慢加入120ml黄原酸酯粘胶液，调整搅拌速度至粘胶液分散成大小适宜的液滴，继续搅拌约30分钟，待液滴分散均匀后，缓慢升高水浴温度(2℃/分钟)至90℃，继续原速度搅拌2小时使液滴固化，撤去水浴，搅拌下使其自然冷却，倾倒出上层有机溶剂，用大量自来水冲洗合成的载体至无氯苯气味，再用蒸馏水淋洗数次，筛选20-40目球形纤维素，4℃湿态保存。1-2制备6％琼脂凝胶载体将装有电子继电器和电动搅拌器的500ml三颈瓶置于60℃水浴锅中，并向其中加入甲苯145ml，三氯甲烷55ml，2ml吐温80，搅拌均匀并保温。将装有6％琼脂混悬液的锥型瓶置高压灭菌锅中，1kg/cm2高压20分钟，使琼脂溶化成棕黄色的粘稠液体，将溶化后的琼脂溶液缓慢倒入三颈瓶中，调整搅拌速度使琼脂溶液在甲苯和三氯甲烷中分散成大小适宜的液滴。待分散均匀后撤去水浴，继续搅拌至反应体系自然冷却。倾倒出上层有机溶剂，用大量自来水冲洗琼脂球，筛选20-40目球体，用蒸馏水反复淋洗，4℃湿态保存。1-3吸附剂载体的活化抽滤瓶抽干蒸馏水反复冲洗后的载体，按照琼脂球或纤维素球重量∶1M氢氧化钠体积∶环氧氯丙烷体积＝1∶2∶1的比例，向装有载体的锥型瓶中加入氢氧化钠和环氧氯丙烷，将锥型瓶置入25℃恒温摇床中，振荡反应2小时，用蒸馏水淋洗。1-4偶联配基使L-色氨酸固定量在35-50％范围。
1-4-1.按照球形纤维素载体重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应18小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为47.1％。
1-4-2.按照球形纤维素载体重量∶L-色氨酸pH11的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应18小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为49％。
1-4-3.按照球形纤维素载体重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应20小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为47.8％。
1-4-4.按照琼脂凝胶载体重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应18小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为38.7％。
1-4-5.按照琼脂凝胶载体重量∶L-色氨酸pH11的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应24小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为42.5％。
1-4-6.按照琼脂凝胶载体重量∶L-色氨酸pH9.2的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶2的比例置反应器中混合并于37℃摇床振荡反应20小时。停止反应后用蒸馏水淋洗致未结合的氨基酸洗净(270nm光密度＜0.02)。计算L-色氨酸固定量为41.6％。1-5未结合配基载体环氧基团的封闭将与配基反应后的带有环氧基团的载体与2倍体积的pH9.0的1M乙醇胺溶液室温下振荡反应6小时，停止反应后在垂凝漏斗中用大量蒸馏水、生理盐水淋洗至洗脱液pH值为中性。1-6高压灭菌将吸附剂置高压灭菌锅灭菌，压力1kg/cm2，时间20分钟。1-7灭菌后的吸附剂湿态低温(4℃)保存。
权利要求
1一种全血灌流吸附治疗用吸附剂，其特征在于吸附剂以纤维素或琼脂为载体以L-色氨酸为配基制成。
2按照权利要求1所述的吸附剂，其特征在于所说的纤维素或琼脂为20-40目球形。
3一种专用于制备权利要求1全血灌流吸附治疗用吸附剂的方法，其特征在于经过以下步骤制备(1)吸附剂载体的活化用抽滤瓶抽干蒸馏水反复冲洗后的载体，按照琼脂球或纤维素球重量(克)∶1M氢氧化钠体积(毫升)∶环氧氯丙烷体积(毫升)＝1∶2-4∶1-2的比例，向载体中加入氢氧化钠和环氧氯丙烷，将其置入25-28℃恒温摇床中，振荡反应2小时，用蒸馏水淋洗净；(2)偶联配基按照载体重量∶L-色氨酸pH8.5-11的碳酸盐饱和溶液体积＝1∶1.5-4的比例，置反应器中混合并于25-37℃摇床振荡反应18-24小时，停止反应后用蒸馏水淋洗净，测定反应前L-色氨酸饱和溶液及淋洗液L-色氨酸含量，计算载体L-色氨酸的固定率；(3)用乙醇胺或氢氧化钠溶液封闭未结合配基的载体上的环氧基团；(4)以压力1kg/cm2，时间20分钟高压灭菌。
4一种权利要求1全血灌流吸附治疗用吸附剂的用途，其特征在于用于临床全血灌流治疗自身免疫性疾病，吸附患者血液中的致病免疫球蛋白G。
5按照权利要求4所述的吸附剂的用途，其特征在于用于临床全血灌流治疗重症肌无力，吸附患者血液中的乙酰胆碱受体抗体。
全文摘要
本发明是一种全血灌流吸附治疗用吸附剂，一种制备该吸附剂的方法，以及该吸附剂的用途。这种吸附剂以纤维素或琼脂为载体以L－色氨酸为配基制成，用于临床全血灌流治疗重症肌无力，吸附患者血液中的乙酰胆碱受体抗体。本发明安全、有效、造价低、适于全血灌流吸附治疗。吸附剂制备方法简单，材料来源广泛，生产成本低。在神经内科MG的治疗中具有广阔的应用前景。尤其是吸附剂对MG患者体内乙酰胆碱受体抗体具有较高的亲和吸附能力，而又较少破坏患者血液内的有形成分和血浆中的有益物质，且有良好的血液相容性。另外还可以在治疗神经内科其他自身免疫性疾病，如多发性硬化、急性感染性多发性神经炎、慢性感染性脱髓鞘性多发性神经根神经病中发挥作用。
文档编号A61P25/00GK1408442SQ02129389
公开日2003年4月9日 申请日期2002年9月9日 优先权日2002年9月9日
发明者杨丽, 程焱, 只达石, 俞耀庭, 周广喜 申请人:天津医科大学总医院, 南开大学