专利名称：含有东北贯众素药物制剂及其新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有东北贯众素药物制剂及其新用途，特别是涉及一种含有东北贯众素药物制剂及在抗肿瘤和在免疫活性调节的新用途，属于药物领域。
背景技术：
东北贯众素(dryocrassin)为东北贯众的主要有效成份。东北贯众具有广泛的药理作用，东北贯众具有抗病原微生物作用、贯众尚有抑菌作用；对于痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等抑制作用较强，对金黄色葡萄球菌也有抑制作用；尚具有驱虫作用。对于东北贯众素的药理活性报道不是很多，到目前为止还没有有关东北贯众素对抗肿瘤的作用并制成药剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种东北贯众素的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种东北贯众素的药物制剂在抗肿瘤方面的新用途。
本发明的再一个目的在于提供一种东北贯众素的免疫活性调节作用，即东北贯众素明显促进脾NK细胞活性，东北贯众素能提高细胞免疫功能。
本发明的再一个目的在于提供一种东北贯众素(dryocrassin)在制备能促进THP-1细胞产生TNFα的药物中的应用。
本发明的再一个目的在于提供一种东北贯众素(dryocrassin)在制备能促进IL-8产生的药物中的应用。
本发明的药物制剂是以治疗有效量的东北贯众素为活性成份，加入或不加入常规的药用赋形剂或含有具有协同作用的成分，制备成临床常用药剂。用传统工艺进行提取分离及纯化或者用超临界萃取二氧化碳方法制得东北贯众素，取东北贯众药材放入萃取器并将二氧化碳输入到萃取器升压和定温，其提取条件是萃取压力为0.5-70MPa，萃取温度为15-80℃，萃取时间为0.5-20小时。取上述东北贯众素1000克，与500克药用淀粉充分混匀，装入胶囊，每粒0.3克。取上述东北贯众素1000克，与药用淀粉200克，糊精60克，充分混匀，制粒后，用压片机制成片剂，每片重0.25克。
其中本发明药物制剂可以含有0.1-99.9％的东北贯众素和0.1-99.9％的赋形剂或0.1-99.9％具有协同作用的成分。
本发明药物制剂优选含有1-99％的东北贯众素和1-99％的赋形剂或1-99％具有协同作用的成分。
本发明药物制剂优选含有10-90％的东北贯众素和10-90％的药用赋形剂或10-90％具有协同作用的成分。
本发明药物制剂优选含有30-80％的东北贯众素和20-70％的药用赋形剂或20-70％具有协同作用的成分。
本发明药物制剂优选含有50-70％的东北贯众素和30-50％的赋形剂或30-50％具有协同作用的成分.
本发明药物制剂最好含有80％的东北贯众素和20％的有辅助或协同作用的其他活性成分或辅料。
本发明药物制剂中的赋形剂可以是常规的药物赋形剂，如填充剂、溶剂，崩解剂、防腐剂、色素等。按照常规的制药工艺，可以将东北贯众素，制备成任何一种临床药用剂型、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、注射剂、气雾剂、滴丸剂等。
东北贯众素的药物制剂在抗肿瘤方面的新用途及其在免疫活性调节作用，即能促进THP-1细胞产生TNFα，能促进IL-8产生的药物中的应用；东北贯众素明显促进脾NK细胞活性，东北贯众素能提高细胞免疫功能。
本发明的积极效果在于东北贯众素的药物制剂在抗肿瘤方面和在免疫活性调节方面具有良好效果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述本发明药物制剂具有抗肿瘤作用，可以通过下述的实施例得以证实。
实施例1东北贯众素抗肿瘤作用研究材料和方法动物P388腹水型、S180实体肉瘤、肝癌肿瘤腹水传代小鼠，均购自吉林省肿瘤研究所。昆明种小白鼠，体重18-22g，雌雄各半，购自长春市绿园区科新实验动物养殖场。合格证号吉动质字10-1015。药品东北贯众素由吉林省中医中药研究院提供。方法试验小组随机分为对照组(ig蒸馏水20m1.kg-1)，取接种7-10天的荷瘤动物，脱颈椎处死，在无菌条件下，消毒腹部皮肤，抽取乳白色瘤液，以生理盐水按1∶2比例稀释，然后给正常动物接种，每只0.2ml，腹水型接种于雌性动物腹腔，实体型接种于雄性动物腋窝皮下，接种后次日开始分组给药，观察对腹水型的生命延长率及对实体型的抑瘤率，结果用统计学t检验处理。见下表。表1东北贯众素对动物移植性肿瘤P388的影响组别与剂量 动物数 存活天数 生命延长率mg/kg n (天；X±SD) ％荷瘤对照组 10 8.3±1.25东北贯众素 200 10 11.6±3.92*39.76100 10 13.2±2.94***59.04荷瘤对照组 10 8.6±1.34东北贯众素 200 10 13.2±3.11**53.49100 10 11.6±4.16 34.88荷瘤对照组 10 9.9±3.75注*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001以下同略表2东北贯众素对动物移植性肿瘤S180的影响组别与剂量动物数 瘤 重 抑瘤率mg/kg n (g；X±SD) ％荷瘤对照组10 2.28±1.03东北贯众素300 10 0.8±0.30***64.04200 10 0.76±0.48**66.67100 10 2.02±0.1843.86荷瘤对照组10 2.02±0.18东北贯众素200 10 0.54±0.13***73.27荷瘤对照组 101.83±0.68东北贯众素 200100.88±0.48**52.05表3东北贯众素对动物移植性肿瘤Hep-A-22的影响组别与剂量 动物数 存活天数 生命延长率mg/kg n(天；X±SD)％荷瘤对照组 1017.0±2.00东北贯众素 200 1022.2±7.5630.59100 1018.0±6.505.56荷瘤对照组 1012.7±0.82荷瘤对照组 108.3±1.83东北贯众素 200 1012.1±1.79***45.78我们的离体试验研究证明东北贯众素在100-0.1μg/ml剂量范围内对人宫颈癌(HeLa)细胞株的增殖均有明显的抑制作用。在低剂量(0.1μg/ml)时，较4种阳性药物(硫酸长春新碱；甲氨蝶呤；顺铂；盐酸阿霉素)的抗癌活性还强。对A549和HepG2等细胞株在本品高剂量时对细胞的增殖有抑制作用。本试验研究表明东北贯众素(200mgkg-1)和(100mg kg-1)对小鼠S180肉瘤和P388腹水均具有明显的抑制作用，对Hep-A-22腹水型也有一定的抑制作用。综上所述，东北贯众素无论在整体或离体条件下，均具有抗肿瘤作用。
实施例2东北贯众素对肿瘤细胞株增殖的抑制作用实验目的采用MTT比色法，检测受试药物对离体癌细胞的增殖抑制作用，比较药物的抗癌活性。本试验按照中药新药研究指南的规定，受试样品分5个剂量组，与不同作用机理的阳性对照药进行抗癌活性比较。仪器和试剂Eagle′s MEM培养基(Gibco，USA)；胰蛋白酶(Trypsin)(Gibco，USA)；96孔培养板(Costar，USA)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma，USA)；酶标光度计(CliniBio 128C，EC)；胎牛血清(中国医学科学院血液研究所，批号200004)；CO2培养箱(SANYO，MCO-175M，Japan)，其余试剂均为国产AR。阳性对照药硫酸长春新碱(白色冻干粉)，广州明兴制药厂；批号010701。甲氨蝶呤(白色冻干粉)淅江万马药业有限公司；批号010301。顺铂(白色冻干粉)，山东省德州制药厂，批号010914。盐酸阿霉素(桔红色冻干粉)，深圳万乐药业有限公司，批号0111E1。肿瘤细胞株人宫颈癌细胞株(HeLa，ATCC)购自武汉大学菌种保藏中心。受试样品东北贯众素，淡黄色结晶由吉林省中医中药研究院提供，加入8％二甲基乙酰胺助溶，药物充分溶解在培养液中，过滤除菌备用。细胞培养常规传代培养。
实验方法取生长状态良好的上述细胞各一瓶，制成细胞悬液，以1×104/孔100μl接种在96孔培养板中，同时加入受试样品20μl，10倍稀释成5个不同浓度，阴性对照组加入不含样品的培养液20μl，溶剂对照组加入与样品组等体积的含8％二甲基乙酰胺的培养液20μl。阳性对照组加入不同作用机理的抗癌药物20μl，并稀释成5个剂量浓度。样品与细胞在含5％CO2，37℃饱和湿度下孵育48h。加入MTT溶液(1mg/ml)20μl，继续培养4小时，吸弃培养液，加入100％二甲基亚砜100μl，经微量混合振荡器振荡10分钟后，酶标仪测定各孔光密度值(0D)。λ测量＝550nm，λ参考＝620nm。数据经“t”显著性检验。实验结果表4.东北贯众素对HeLa细胞株增殖活性的影响x分组 剂量 x±SD(0D值) 抑制率n＝4 μg/ml(％)阴性对照组 - 0.069±0.002阳性对照组长春新硷 1000.047±0.004***31.8810 0.056±0.007* 18.841.00.063±0.003 8.700.10.066±0.003 4.35氨甲蝶呤 1000.038±0.002** 44.9310 0.039±0.001** 43.481 0.039±0.004** 43.480.10.052±0.002* 24.64顺铂 1000.000±0.000 100.0010 0.000±0.000 100.001 0.031±0.008*** 55.070.10.054±0.002* 21.74阿霉素1000.000±0.000 100.0010 0.000±0.000 100.001 0.019±0.006*** 72.460.10.063±0.007 8.69东北贯众素1000.004±0.001*** 94.2010 0.025±0.011*** 63.771 0.044±0.008**36.230.10.049±0.007**28.99溶剂对照组1 0.054±0.009* 21.742 0.071±0.003 0.003 0.072±0.004 0.004 0.065±0.002 5.70各加药组分别与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表4结果表明，样东北贯众素对人宫颈癌细胞的增殖有显著的抑制作用，剂量在0.1μg/ml时对细胞在增殖仍有显著的抑制作用(P＜0.01)。溶剂对照组在最高浓度时对细胞的增殖有一定抑制作用，浓度降低其抑制作用消失。顺铂和阿霉素在高剂量时，HeLa细胞不能增殖，在1.0μg/ml对细胞的增殖有显著抑制作用，而0.1μg/ml时抑制作用降低。长春新硷在高剂量时对细胞增殖有抑制作用，低剂量时作用下降。氨甲蝶呤在不同浓度时，对HeLa细胞的增殖均有抑制作用。
实施例3东北贯众素对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠脾NK细胞活性药品与试剂细胞培养试剂Eagle MEM培养基(Gibco，UAS)；胰蛋白酶(Gibco，USA)；胎牛血清(中国医学科学院血液研究所提供)；曲拉通(Triton X-100，Sigma)；还原型辅酶I(CoI，NADH，Sigma)；丙酮酸钠(上海生化试剂厂)；环磷酰胺(CY，上海第十二制药厂)。阳性对照药人参茎叶皂苷，黄色粉沫，纯度为95％，由白求恩医科大学提供。实验设备与材料CO2培养箱(SANYO，MCO-175M，Japan)；超净工作台(CJ-1，苏州长桥净化设备厂)；紫外线光度计(TU-1221，北京瑞利分析仪器厂)自动酶标光度计(clincbio，EC-128C)
倒置显微镜(CK40-F200，日本奥林巴斯公司)；96孔培养板(Costar，USA)离心机(LD5-2A，北京医用离心机厂)。动物、细胞株昆明种小白鼠，封闭群，实验动物购于国家动管会认证颁发实验动物合格证的单位大连市药品检定所动物实验基地购进。白血病细胞株(K562，购于上海细胞生物研究所)。小鼠纤维母细胞系(L-929，卫生部药品生物制品检定所提供)。小鼠脾脏NK细胞，自备。实验方法(一)、实验分组实验分六组，每组10只小鼠，雌雄各半。生理盐水组每只小鼠每天腹腔注射生理盐水0.2ml，连续15天；环磷酰胺组(CY)每只小鼠每5天腹腔注射环磷酰胺30mg.Kg-1，共3次；东北贯众素环磷酰胺同上给药，同时每天腹腔注射东北贯众素10mg.Kg-1和5mg.Kg-12个剂量组，连续15天；人参茎叶皂苷组环磷酰胺同上给药，同时每天腹腔注射人参茎叶皂苷5mg.Kg-1，连续15天；溶剂对照组环磷酰胺同上给药，同时每天腹腔注射等体积助溶剂二甲基乙酰胺(800μl/Kg)，连续15天。各加药组给药体积均为0.2ml。(二)、小鼠脾细胞的制备方法1、小鼠眼球放血，拉颈处死，浸75％C2H5OH1分钟。
2、无菌取脾，放置在无血清的MEM培养液中。
3、将脾剪成小块，放置在培养皿中，注射器芯研磨至单个细胞，过200目尼龙网，1000rpm离心5分钟。
4、弃上清液，轻轻叩松细胞沉淀。
5、加6ml双蒸水轻轻振荡30秒。
6、加2ml双倍生理盐水(3.6％NaCl)。
7、1500rpm离心2分钟，加红细胞洗涤液，再滤过一次。
8、离心后用EagleMEM制备成脾细胞悬液，1×107细胞/ml；L929配成2×105细胞/ml。(三)、东北贯众素对小鼠脾NK细胞杀伤活性的影响－MTT法测定1、把靶细胞(L929)细胞悬液加入96孔平底培养板中，0.1ml/孔，37℃，5％CO2，至少培养1小时。
2、待靶细胞成一单层细胞，每孔加0.1ml效应细胞(效靶比10∶1)，每个样品5孔，靶细胞对照孔加培养液0.1ml。
3、混合后的细胞，放置37℃，5％CO2，孵育48小时。
4、弃上清，用生理盐水(37℃)轻轻灌满各孔，反复3次，滤纸吸于各孔。
5、每孔加入MTT孵育4小时，终止反应，100％二甲基亚砜。
6、酶标仪492nm测OD值，参考波长450nm。(四)、东北贯众素对小鼠脾NK细胞活性的影响－胞浆乳酸脱氢酶(LDH)释放法1、各实验组脾细胞为效应细胞，每管取效应细胞0.1ml(1×106细胞/管)，加靶细胞(YAC-1)悬液0.1ml(2.0×105细胞/管)加小牛血清0.1ml，补加1640培养液至1ml，每组设5个平行样。
2、自然释放管YAC-1细胞悬液0.1ml，小牛血清0.1ml，补加培养液0.8ml。
3、最大释放管YAC-1细胞悬液0.1ml，小牛血清0.1ml，1％Triton-100 0.8ml。
上述各试验组置37℃，5％CO2的培养箱中，饱和湿度孵育18h，1000r/min离心5min，取全部上清。加LDH反应液3ml，用分光光度计以340nm，32℃恒温测定吸光度值，每15s测1次共2min。实验结果表5.东北贯众素对小鼠脾NK细胞杀伤活性的影响－MTT法.分组 剂量x±SD(OD值) 杀伤率n＝10 μg/ml (％)阴性对照组0.000.172±0.016 0.00±0.00CY(模型组)30mg/Kg 0.112±0.005 30.55±0.38CY+东北贯众素 10mg/Kg 0.091±0.021*50.00±1.49*5mg/Kg 0.092±0.015*41.30±0.84*CY+人参皂苷 5mg/Kg 0.045±0.008***79.60±0.64***CY+溶剂对照 800μl/Kg 0.120±0.015 26.30±1.02各加药组与模型组比较*P＜0.05，***P＜0.001.结果表明东北贯众素和人参茎叶皂苷对小鼠脾NK细胞杀伤活性与模型组比较有显著性差异。表6.东北贯众素对小鼠脾NK细胞活性的影响－胞浆乳酸脱氢酶(LDH)释放法分组 剂量LDH x±SD(OD值)n＝10 μg/ml (IU) NK细胞毒指数(％)阴性对照组 0.0014.21±1.70 38.70±7.53。CY 30mg/Kg 11.65±1.58 27.29±7.02CY+东北贯众素 10mg/Kg 14.85±1.59 41.57±6.99*5mg/Kg 19.20±1.88**60.42±8.63***CY+人参皂苷 5mg/Kg 17.57±1.80*53.99±8.0**CY+溶剂对照 800μl/Kg 12.91±0.77 32.31±3.40各加药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01.***P＜0.001结果表明东北贯众素5-10mg/Kg对小鼠脾NK细胞杀伤活性与模型组比较差异显著，5mg/Kg作用更明显(P＜0.001)。人参茎叶皂苷与模型组比较差异显著(P＜0.01)。实验结论东北贯众素对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠脾NK细胞活性影响，采用MTT法和胞浆乳酸脱氢酶(LDH)释放法两种实验方法。实验结果表明东北贯众素对免疫功能低下小鼠脾NK细胞活性有明显促进作用(P＜0.05，P＜0.001)，两种方法结果一致。东北贯众素能提高免疫功能低下小鼠细胞免疫功能，在免疫低下性疾病(如肿瘤)的治疗中有重要意义。
权利要求
1.一种含有东北贯众素药物制剂及其新用途，其特征在于用超临界萃取二氧化碳方法制得东北贯众素，取东北贯众药材放入萃取器并将二氧化碳输入到萃取器升压和定温，其提取条件是萃取压力为0.5-70MPa，萃取温度为15-80℃，萃取时间为0.5-20小时。
2.一种含有东北贯众素药物制剂及其新用途，其特征在于药物制剂中含有0.1-99.9％的东北贯众素和0.1-99.9％的赋形剂或有协同作用的其它活性成分。
3.根据权利要求1的含有东北贯众素药物制剂及其新用途，其特征在于所述的东北贯众素药物制剂中含有50-70％的东北贯众素和30-40％的赋形剂或有协同作用其它活性成分。
4.根据权利要求1的含有东北贯众素药物制剂及其新用途，其特征在于所述的东北贯众素药物制剂中含有80％的东北贯众素(dryocrassin)。
5.根据权利要求1的含有东北贯众素药物制剂及其新用途，其特征在于所述的东北贯众素(dryocrassin)在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求1的含有东北贯众素药物制剂及其新用途，其特征在于所述的东北贯众素在制备能促进胞细胞NK细胞活性的药物中的应用。
7.根据权利要求1的含有东北贯众素药物制剂及其新用途，其特征在于所述的东北贯众素(dryocrassin)在制备能促进THP-1细胞产生TNFα的药物中的应用。
8.根据权利要求1的含有东北贯众素药物制剂及其新用途，其特征在于所述的东北贯众素(dryocrassin)在制备能促进细胞免疫功能的药物中的应用。
9.根据权利要求1的含有东北贯众素药物制剂及其新用途，其特征在于所述的东北贯众素(dryocrassin)在制备能促进IL-8产生的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种含有东北贯众素药物制剂及其新用途，特别是涉及一种含有东北贯众素药物制剂及在抗肿瘤方面的新用途和对免疫活性调节的新用途，属于药物领域。用传统工艺或超临界二氧化碳萃取方法制得东北贯众素，其药物对抗肿瘤和对免疫活性调节方面有良好的效果。
文档编号A61P35/00GK1413581SQ02132688
公开日2003年4月30日 申请日期2002年7月26日 优先权日2002年7月26日
发明者徐雅娟, 徐暾海, 姚金福, 徐东铭, 司云珊 申请人:吉林省中医中药研究院