专利名称：重组γ－干扰素预防和治疗奶牛隐性乳房炎的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽药物的技术领域。
根据IFN蛋白的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将IFN分为两类即I型IFN和II型IFN。I型IFN又分为α、β两个亚型，分别由白细胞和成纤维细胞产生，它们作用于同一受体，可抑制病毒DNA和蛋白质合成，活化NK细胞，促进MHC I类分子提呈抗原。II型干扰素又称γ-干扰素或免疫干扰素，主要由T细胞和NK细胞产生，与I型干扰素相比有着多种生物学活性。自八十年代初人的γ-IFN首先被克隆表达后，许多动物如牛、羊、猪、鹿、鼠、犬、兔、海豚的γ-IFN相继被克隆。Cerretti(1986)首先克隆出牛γ-IFN后，国际上对利用基因工程技术生产重组牛γ-IFN(rBoIFN-gamma)的研究开始兴起，先后利用CHO细胞(Hogan，1993)、酿酒酵母(Krupnova，1995)、cos-7细胞(Beyer，1998)、PGEX-5X-1融合蛋白表达系统(Kashima，1999)、巴斯德毕赤氏酵母系统(Weclock，2000)、牛I型疱疹病毒载体(BHV-1)(Raggo，2000)、昆虫细胞和家蚕细胞杆状病毒系统(MuraKami，2001)表达出有生物学活性的rBoIFN-gamma，而且在流产布鲁氏菌病、牛的嗜血杆菌病、大肠杆菌性乳房炎、李氏杆菌病、毛癖菌病、牛白血病、牛病毒性腹泻、牛疱疹病毒感染、立克次氏体病、牛焦虫病等诸多疾病的预防和治疗中显示出一定的效果。Pighetci(1996)证实rBoIFN-gamma作为乳房炎免疫反应的佐剂非常有效，Wedlock(2000)用rBoIFN-gamma乳房内灌注也证实可以激活和增强乳腺中白细胞的杀菌能力，尽管这方面研究报道不多，但在牛乳房炎的预防和控制方面开辟了一条新的途径。目前，国内在对牛rBoIFN-gamma的研究方面几乎空白，奶牛乳房炎和其他一些疾病的控制仅仅依靠药物和疫苗，不仅效果不明显，而且存在耐药性、药物残留、免疫失败等诸多方面的缺陷，因此，利用基因工程技术大量生产rBoIFNgamma，并应用于牛乳房炎的控制和作为疫苗使用的佐剂，不失为一条高效、经济、安全的途径。
本发明的技术方案1.在原核系统中表达奶牛γ-IFN基因，获得具有治疗和预防奶牛隐性乳房炎的细胞活性因子设计合适的引物，从奶牛脾脏淋巴细胞中提取细胞总mRNA，采用RT-PCR技术，扩增出BovIFN-γ成熟肽段cDNA，并克隆进PGEX-6P-1(pharmacia公司)载体质粒中，进而转化宿主菌BL21，经筛选得到阳性克隆，37℃培养和加入0.5mM的IPTG诱导，使γ-IFN基因表达，经SDS-PAGE凝胶电泳分析，分子量16KD，与理论值相符。
将工程菌大量培养并表达γ-IFN，取培养上清用超声波裂解，经0.22μm微孔滤膜过滤后，在VSV-MDBK细胞系统上通过细胞病变抑制试验按常规测定其干扰素抗病毒效价。
将本研究中所获得的rBovIFN-γ，经亲和层析纯化，将纯化产品应用于患隐性乳房炎的奶牛，进行预防和治疗。
本发明的技术方案2.利用真核细胞酵母表达系统高效表达rBovIFN-γ将上述克隆到的BovIFN-γ基因，通过酶切插入酵母高效表达载体PIC9K(Invitrogen公司)，经筛选得到阳性克隆，27℃培养，使γ-IFN基因表达，经SDS-PAGE凝胶电泳分析，分子量16KD，与理论值相符。
将工程菌大量培养并表达γ-IFN，取培养上清用超声波裂解，经0.22μm微孔滤膜过滤后，在VSV-MDBK细胞系统上通过细胞病变抑制试验按常规测定其干扰素抗病毒效价。
将本研究中所获得的rBovIFN-γ，经亲和层析纯化，将纯化产品应用于患隐性乳房炎的奶牛，进行预防和治疗。
本发明的技术方案3.将上述克隆到的BovIFN-γ基因，通过酶切插入pcDNA3(Invitrogen公司)表达载体，经转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆。制备含BovIFN-γ基因的pcDNA3质粒DNA，通过转染成纤维细胞，使γ-IFN基因表达，取培养上清在VSV-MDBK细胞系统上通过细胞病变抑制试验按常规测定其干扰素抗病毒效价。
将表达BovIFN-γ基因的pcDNA3质粒DNA转化大肠杆菌，大量培养，通过碱变性法大量纯化制备质粒DNA。以纯化质粒DNA直接注射奶牛乳腔，使其在乳腺细胞中表达，从而达到预防和治疗作用。
乳房炎的控制的关键是加快乳腺中嗜中性白细胞的吞噬和杀菌能力，加快病原菌的清除，从而减轻炎症反应，避免乳腺腺体组织进一步的损伤。本发明的效果是γ-干扰素具有增强乳腺中白细胞的吞噬力、杀菌力和趋化作用的功能，同时可有效激活巨噬细胞和NK细胞，维持CTL和B细胞的增殖分化，增强MHC II类分子的表达，促进APC细胞向Th细胞递呈抗原，增强乳腺中各种免疫细胞的活性，加快乳腺中病原菌的清除，从而能有效起到预防和治疗乳房炎的作用。
具体实施例方式
1.引物设计及合成上游引物P15，--GGGGAATTCCAGGGCCAATTTTTTAGA--3，含EcoRI酶切位点和3个保护性碱基，下游引物P25，--GCAGGCAGGAGGACCATTACGTTGA--3，P1与P2间横跨整个ORF去除信号肽后的成熟肽编码区，预计扩增片段长度为440bp左右，引物由宝(大连)生物工程公司合成。
2.淋巴细胞的分离培养、诱导及总RNA的提取无菌采集初生犊牛脾脏，按常规制取脾淋巴细胞，并经淋巴细胞分层液分离，然后用含10％小牛血清的DMEM液37℃5％CO2培养1h，弃去贴壁的单核细胞，调整细胞浓度为2.5×106/ml，加入500μg/ml PHA，于41℃5％CO2培养10h后收集细胞，按Gibco公司Trizol试剂提供的程序提取总RNA，取2μl用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，取5μl用于甲醛变性凝胶电泳观察其完整性，其余置于-70℃保存备用。
3.RT-PCR扩增采用Access RT-PCR试剂盒一步法扩增奶牛γ-干扰素基因在DEPC处理PCR管中依次加入无RNAse水11μl、AMV/TFI5×Buffer 5μl、引物P1 1μl(50Pmol)、引物P21μl(50pmol)、25mM MgSO4 1μl，弹匀后瞬时离心，加入AMV反转录酶0.5μl、TFI DNA聚合酶0.5μl、总RNA 5μl，瞬时离心，加入25μlRNAse Free矿物油后进行RT-PCR反应。RT-PCR程序如下48℃反转录45min，94℃2min，然后94℃1min→55℃1min→72℃2min 40个循环，72℃7min，4℃10min，反应结束后取5μl产物琼脂糖凝胶电泳分析。
4.奶牛γ-干扰素基因的克隆和序列测定RT-PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后用QIAquick琼脂糖回收试剂盒进行回收，按常规与Pucm-T Vector进行连接，常规转化大肠杆菌TG1感受态细胞，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落转接种含Amp的LB培养液中37℃摇荡过夜，采用碱裂解法提取质粒，利用Pucm-T Vector外源片段插入位点上游酶切位点具一个EcoRI的特点，用EcoRI单酶切鉴定，挑取反向插入阳性重组质粒，接种半固体LB培养基，培养后直接寄送宝(大连)生物工程公司进行测序。
5.表达质粒的构建及融合蛋白的诱导表达将测序正确的阳性质粒和PGEX-6P-1质粒分别用EcoRI、NotI双酶切，回收后按常规连接，转化宿主菌BL21，通过氨苄青抗性和EcoRI、NotI双酶切筛选阳性质粒。将筛选到的阳性质粒转化BL21，挑取单个菌落接种于含100μg/ml氨苄青的LB中37℃摇震过夜，次日按1∶100转接种于含100μg/ml氨苄青的2×γT培养液中，37℃培养3h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，继续诱导5h，收集诱导后的细菌，经PBS洗涤后悬浮于1/10体积的PBS中，加等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸10min，按常规进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。重组菌诱导离心后进行超声波裂解(300W，3S，180次)，4℃12000g离心15min后各取上清和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳，以确定融合蛋白以何种形式存在，并运用薄层扫描技术对上清中的目的蛋白进行含量分析。
6.重组干扰素抗病毒活性测定取重组菌诱导后的超声裂解上清，经0.22μm微孔滤膜过滤后，在VSV-MDBK细胞系统上通过细胞病变抑制试验按常规测定其干扰素抗病毒效价，步骤如下向生长于96孔板上的MDBK细胞单层加入倍比维持液稀释的裂解上清，每个稀释度两孔，于37℃作用24小时，吸去上清，每孔接种100个TCID50的VSV，37℃吸附2h，弃去病毒液，加入1％维持液继续培养至病毒对照孔出现100％病变，观察各孔细胞病变，以能抑制50％细胞病变的样品的最高稀释度定义为1单位干扰素。
有效剂量105U/乳区动物试验数据患乳房炎的产奶奶牛，四乳区中有一个乳区发生乳房炎，乳汁黄白色，挤出时含絮状物，经多种抗生素和中药反复治疗无效，乳房炎诊断液检测为++++，采用重组γ-干扰素105U乳池内灌注，治疗后14天，明显好转，乳房炎诊断液检测为++。
药效证明判定方法用药前后分别采集2ml乳汁，于平皿内滴加等量乳房炎诊断液(自行配制)，摇晃10s后根据其凝集情况出现与否及凝集程度，并进行前后对比，判断疗效。
权利要求
1.一种重组γ-干扰素的应用，其特征在于以原核表达系统表达BovIFN-γ基因，将BovIFN-γ基因与PGEX-6P-1连接，以其表达融合蛋白作为制备奶牛隐性乳房炎预防和治疗的药物。
2.一种重组γ-干扰素的应用，其特征在于将BovIFN-γ基因克隆到酵母高效表达载体，通过转化酵母细胞，获得阳性克隆，并大量表达基因产物，通过亲和层析纯化，大量制备表达产物，作为制备奶牛隐性乳房炎预防和治疗的药物。
3.一种重组γ-干扰素的应用，其特征在于将BovIFN-γ基因插入到pcDNA3，通过大量制备质粒DNA，以质粒DNA直接注射奶牛乳腔，使其BovIFN-γ基因在乳腺中大量表达，从而制备预防或治疗奶牛隐性乳房炎的药物。
全文摘要
本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽药物的技术领域。应用一步法逆转录—聚合酶链式反应(RT－PCR)技术对奶牛γ－干扰素(BovIFN－γ)基因的cDNA序列进行扩增，从奶牛脾淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段。将BovIFN－γ基因克隆到大肠杆菌表达载体PGEX－6P－1谷光甘肽－S－转移酶的下游，经IPTG诱导后，表达融合蛋白；或将BovIFN－γ基因克隆到酵母高效表达载体，通过转化酵母细胞，获得阳性克隆，并大量表达基因产物；通过亲和层析纯化，大量制备表达产物，通过细胞病变抑制试验证实，表达产物有极好的抑制VSV病毒的活性。或将BovIFN－γ基因插入到pcDNA3，通过大量制备质粒DNA，以质粒DNA直接注射奶牛乳腔，使其BovIFN－γ基因在乳腺中大量表达，从而达到预防或治疗奶牛隐性乳房炎的目的。
文档编号A61P15/08GK1403155SQ0213839
公开日2003年3月19日 申请日期2002年10月8日 优先权日2002年10月8日
发明者秦爱建, 许金俊, 金文杰, 刘岳龙 申请人:扬州大学