专利名称：银耳多糖，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明公开一种银耳多糖，同时提供了其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，属于中药有效成分提取物应用技术领域。
背景技术：
本发明所称的银耳(Tremella fuciformis Berk)又称白木耳(简称TF)，从古自今我国民间作为具滋补保健作用的药食真菌佳品，银耳孢子(简称TFS)为固体培养获得。
在我国市场上已有销售银耳孢子制成的胶囊制剂，银耳保健品更是种类繁多，但均存在着一些不足。1、工艺不合理银耳孢子原料药中含有大量的培养基和不溶物，原料药直接装入胶囊，未经过提取、分离、纯化，对多糖成分来说很难在胃肠道被吸收。银耳子实体的保健品多为水提物，产品不利于长期保存和运输。2、给药途径不合理，在胃肠道吸收速率极低。3、无规范化质量标准由于原料药未经提取、分离，有效成分含量低，影响药品质量的控制。
发明内容
本发明提供一种具有药用价值的银耳多糖。
本发明还提供了从银耳、银耳孢子中提取上述物质的制备方法，适用于工业化生产。
本发明进一步提供了以活性银耳多糖组分为主要药物或与其它药物组方用于增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎的药物。
银耳多糖是通过以下两种提取方法获得的方法1将银耳孢子加水搅拌均匀制成水溶液，离心后取上清液经活性炭过柱两次，其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，湿法装柱，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏24小时，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60％，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80％，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。
方法2取银耳子实体去托盘洗净加水煎煮，过滤取滤液，反复3次，合并滤液，浓缩加乙醇沉淀得银耳多糖粗品，加水配制成水溶液，经活性炭过柱两次，其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，湿法装柱，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏24小时，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60％，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80％，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。
经过药理学实验筛选，上述化合物具有增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎的药理活性。
按药剂学方法，可以将本发明的银耳多糖制备成多种临床药物剂型作为增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎的药物，所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。特别是作为注射用制剂。
本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述化合物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可以接受的载体。
上文的载体是指药学领域常规的药物载体，包括稀释剂、赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体。
本发明可以组合物的形式通过口服、直肠、静脉、肌肉注射或胃肠外给药方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂和注射剂。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物混合，制成所需剂型。
本发明的药物优选含有1％-99％的银耳多糖和99％-1％的赋形剂(包括其它配伍的药物)，优选含有30％-80％的银耳多糖和70％-20％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，最好含有60％-70％的银耳多糖和40％-30％的赋形剂(包括其它配伍用的药物)。
下述的药理实验证实了银耳多糖药物制剂具有增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡等药理活性1、注射用银耳多糖的抑瘤作用1.1注射用银耳多糖对小鼠肝癌H22的生长抑制结果表明，注射用银耳多糖对小鼠肝癌H22具有一定的生长抑制作用，实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为16.10％、20.90％、34.83％，存在剂量效应关系，环磷酰胺20mg/kg的平均抑瘤率为69.205，见表1。
表1注射用银耳多糖对小鼠肝癌H22的生长抑制作用(X±S)组别 剂量 动物数(前/后)瘤重(g)抑瘤率(％)P值对照组 20ml/kg20/18 1.87±1.01-环磷酰胺20mg/kg20/15 0.67±0.4064.2 ＜0.01小剂量组25mg/kg12/11 1.53±0.9318.2 ＞0.05中剂量组50mg/kg12/10 1.58±1.2415.5 ＞0.05大剂量组100mg/kg 12/10 1.21±0.6735.2 ＞0.051.2注射用银耳多糖对小鼠肉瘤S180的生长抑制作用结果表明，注射用银耳多糖对小鼠肉瘤S180具有明显的生长抑制作用，存在一定的剂量效应关系，实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为28.93％、33.03％、42.43％，环磷酰胺20mg/kg的平均抑瘤率为73.77％，见表2。
表2 注射用银耳多糖对小鼠肉瘤S180的生长抑制作用(X±S)组别 剂量动物数(前/后)瘤重(g)抑瘤率(％)P值对照组20ml/kg20/151.94±0.87-环磷酰胺 20mg/kg20/120.58±0.4670.1＜0.001小剂量组 25mg/kg12/111.43±0.9626.3＞0.05中剂量组 50mg/kg12/121.32±0.6731.9＜0.05大剂量组 100mg/kg 12/101.14±0.7641.2＜0.052、注射用银耳多糖对放化疗小鼠的生白作用对环磷酰胺所致小鼠外周血白细胞减少的治疗作用结果表明，ip环磷酰胺100mg/kg3天后可使小鼠外周血白细胞明显降低，一直持续到第12天，与正常对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.001)。注射用银耳多糖50、100mg/kg于给药第3～15天对环磷酸胺所致小鼠外周血白细胞减少均有明显对抗作用，与模型组比较差异显著(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，25mg/kg对环磷酰胺所致小鼠外周血白细胞减少除给药第6天有明显对抗作用外(P＜0.05)，其它时间均无明显影响，见表3。
表3注射用银耳多糖对环磷酰胺所致小鼠外周血白细胞减少的对抗作用组别WBC(109/L，X±S，n＝10)0d 3d 6d 9d 12d15d正常对照组 8.76±2.41 8.56±3.06 8.63±2.82 8.45±1.19 8.92±2.26 8.78±1.61模型组 8.78±2.52 3.75±1.73***2.39±1.60***4.53±1.98***7.03±1.37*7.28±2.26注射用银耳多糖25mg/kg 8.80±2.63 4.96±2.13 4.22±1.28 6.74±3.16 8.69±3.06 9.71±3.3450mg/kg 8.76±2.71 6.29±2.49#5.23±1.92###6.73±2.15#9.57±2.14##11.04±3.87##100mg/kg8.73±2.87 6.93±2.51##5.32±1.97###7.81±1.13###9.73±1.75##10.43±1.32##注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与模型组比较#P＜0.05##P＜0.01，###P＜0.0013、注射用银耳多糖对放射损伤所致小鼠外周血白细胞减少的对抗作用结果表明，小鼠放射损伤后外周血白细胞明显降低，一直持续到第9天，与正常对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。注射用银耳多糖50、100mg/kg于给药第6～15天对放射损伤所致小鼠外周血白细胞减少均有明显对抗作用，与模型组比较差异显著(P＜0.01或P＜0.001)，25mg/kg除给药第6及15天有明显对抗作用外(P＜0.05)，其它时间均无明显影响，见表4。
表4注射用银耳多糖对放射损伤所致小鼠外周血白细胞减少的对抗作用组别 WBC(109/L，X±S，n＝10)0d3d 6d 9d12d 15d正常对照组 7.56±1.617.59±2.34 7.53±1.98 7.58±2.147.82±2.03 8.04±1.87模型组 7.61±1.783.58±1.62***3.19±1.64***5.46±1.82*7.22±1.53 7.00±1.96注射用银耳多糖25mg/kg 7.53±1.474.08±1.18 4.81±1.34#6.74±3.16 8.73±2.11 9.70±2.89#50mg/kg 7.71±2.074.22±1.58 5.31±1.43##8.84±1.70###11.91±3.93##11.82±3.03###100mg/kg7.82±2.154.48±1.41 5.69±1.50##9.55±2.02###11.76±2.35###12.73±2.92###注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与模型组比较#P＜0.05##P＜0.01，###P＜0.0014、注射用银耳多糖对葡萄糖所致高血糖的影响240只小鼠分为6组，每组40只，第1，2组sc生盐水10ml/kg，第3组sc胰岛素2u/kg，4，5，6组sc TF 200mg，100mg及50mg/kg，每天一次共给药7天，末次给药后30min，除第1组外其余各组均iv葡萄糖2g/kg，第1组iv等体积生理盐水5ml/kg，分别于iv葡萄糖后5′，30′，60′及120′每组分别处死10只小鼠，测血糖含量，结果见表5。
表5注射用银耳多糖对葡萄糖所致高血糖的影响(X±SD)剂量 iv葡萄糖后不同时间血糖含量(mg/dl)组别(mg/kg) 5′ 30′ 60′ 120′正 常 139.9±36.25 116.2±13.30 118.7±16.75 141.9±25.07模 型 332.6±51.46△△△209.1±37.09△△△169.41±35.27△△△162.7±28.35胰岛素2u/kg 352.0±54.23 154.1±32.31**133.9±11.58**157.7±19.21多 糖200 254.1±51.37**112.0±27.44***125.2±27.13**119.4±23.14**100 346.9±33.91 147.8±66.19*112.9±18.39**149.6±49.3050377.4±27.51 188.4±59.11 108.70±27.39**105.0±17.63**模型组与正常对照组比较△△△P＜0.001
给药组与模型组比较*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.0015、注射用银耳多糖对免疫的促进作用(1)银耳多糖对免疫器官重量的影响取体重16g左右的昆明种小鼠20只，分对照和给药两组，雌雄各半。给药组腹腔注射银耳多糖，每只2mg×7d，对照组给等量生理盐水，给药结束后次日解剖，用眼眶放血法将小鼠处死。取出脾脏和胸腺并称重，结果见表。
表6注射用银耳多糖对小鼠脾脏和胸腺重量的影响多糖鼠数给药途径 剂量脾指数±SD 胸腺指数±SD对照组 11 ip / 61.30±3.31 44.92±3.52银耳多糖11 ip 100×7 89.56±8.03*40.88±3.61***P＜0.01，**P＞0.05由表6可见，银耳多糖可明显增加小鼠脾脏重量，与对照组比较，脾指数增加0.46倍，但对胸腺的影响不明显。
(2)银耳多糖对巨噬功能的影响取体重18-22g，华北种小鼠20只，由爬片法观察银耳多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响，结果见表7。
表7注射用银耳多糖对腹腔细胞吞噬功能的影响多糖 鼠数 给药途径剂量吞噬百分数±SD吞噬指数±SD对照组10 ip /57.4±2.61.38±0.09银耳多糖 10 ip 100×790.0±1.6*4.37±0.34**P＜0.001由表7可见，银耳多糖可明显增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能，与对照组比较，吞噬指数增加了3.17倍，吞噬百分数增加1.57倍。
6、注射用银耳多糖对机体损伤的修复的保护作用银耳多糖的抗炎作用取体重250-300g威斯塔种大白鼠10只，按文献大白鼠足肿胀法进行实验。用0.1ml 10％鸡蛋清溶液致炎，结果见表8。
表8注射用银耳多糖对抗炎症的作用致炎后肿胀率±SD多糖 鼠数 给药途径剂量1hr 3hr 5hr 7hr对照组5 ip / 54.7±8.7 54.3±2.041.6±6.0 23.8±4.1银耳多糖 5 ip 6030.5±3.8*26.1 ±4.4*14.2±4.6*9.8±3.4*P＜0.05由表8可见，银耳多糖在致炎后1h即表现出较好地对抗炎症的作用。
7、注射用银耳多糖抗溃疡作用对大鼠应激型溃疡的影响将大鼠随机分组，首次灌胃(po)给药后即禁食，次日再给药一次，共2次。末次给药后1h，将大鼠头朝下，四肢绑于木架上。16h后，处死动物，剖腹，结扎幽门，取出全胃，注入10ml生理盐水，结扎贲门。然后将全胃浸泡于1％甲醛溶液中固定。沿胃小弯剪开胃，平展于玻璃板上。按文献方法评定溃疡等级。实验结果见表9。统计表明，二种多糖对大鼠应激型溃疡均有明显抑制作用。
表9银耳多糖对大鼠应激型溃疡的作用剂量 溃疡等级药物 动物数P值mg/kg×dX±SD对照6 4.33±0.5银耳多糖70×2 6 1.66±2.3 ＜0.05银耳孢子多糖70×2 6 1.50±1.6 ＜0.01
8、注射用银耳多糖的抗肝炎作用银耳多糖对甲氯化碳所致大鼠谷-丙转氨酶升高的保护作用将大鼠随机分组。对照组给生理盐水四氯化碳组于实验么3，6，9天ip5％四氯化碳麻油溶液；银耳多糖组均给药9d，并于给药第3，6，9天同时ip5％四氯化碳麻油溶液。第10天断头取血，以常规方法测定谷-丙转氨酶活力单位，见表10。
表10银耳多糖对四氯化碳所致谷-丙转氨酶升高的影响剂量谷转氨酶药物 动物数量 给药途径多糖5％CCL4(unit) P值(mg/kg×d) (mg/100g×d)对照组 8 po 45.56±6.025％CCL47 ip0.5×3 106.08±4.81银耳多糖+5％CCL46 ip 200×9 0.5×3 71.18±2.24 ＜0.01四氯化碳组与对照组比较谷-丙转氨酶升高133％，ip给予银耳多糖加四氯化碳与对照组比较，谷-丙转氨酶升高56％，上述实验均为用银耳孢子及子实体制备的注射用银耳多糖试验取得的结果。
具体实施例方式
实施例1取银耳孢子100g，配成10％的水溶液，搅拌6小时，离心(5000转)20分钟，上清液过活性炭柱二次(其中颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，取150g湿法装柱，用水洗至无色)，滤液经100℃水浴加热20分钟，冷却至室温后冷藏24小时(0-4℃)离心(立式离心机，16000转)，上清液，缓慢加入乙醇至50％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液缓慢加入乙醇至60％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液加入乙醇至80％，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗过滤，滤液分装灭菌，冻干制成成品(13g)。
实施例2取银耳孢子100g，配制5％的水溶液，保持40-60℃充分搅拌6小时，离心(10000转)20分钟，上清液过活性炭柱二次(其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，取150g湿法装柱，用水洗至无色)，滤液经100℃水浴加热20分钟，冷却至室温后冷藏24小时(0-4℃)，离心(立式离心机16000转)，上清液，缓慢加入乙酸至60％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液缓慢加入乙醇至80％，充分搅拌，离心(16000转)，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗过滤，滤液分装灭菌，冻干制成成品(15.6g)。
实施例3取银耳子实体100g，洗净，去托盘、杂质，加60倍量水，煎煮5小时，沙布过滤，反复3次，合并3次煎煮液，浓缩至3000ml，加乙醇至85％，收集沉淀(粗多糖40g)，取粗多糖配成10％的水溶液，搅拌至全部溶解，过活性炭柱二次(其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，取150g湿法装柱，用水洗至无色)，滤液经100℃水浴加热20分钟，冷却至室温后冷藏24小时(0-4℃)离心(立式离心机，16000转)，上清液，缓慢加入乙醇至50％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液缓慢加入乙醇至60％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液加入乙醇至80％，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗过滤，滤液分装灭菌，冻干制成成品(9.6g)。
实施例4取银耳子实体100g，洗净，去托盘、杂质，加60倍量水，煎煮4小时，沙布过滤，反复3次，合并3次煎煮液，浓缩至3000ml，加乙醇至85％，收集沉淀(粗多糖45g)，取粗多糖配成5％的水溶液，搅拌至全部溶解，过活性炭柱二次(其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，取150g湿法装柱，用水洗至无色)，滤液经100℃水浴加热20分钟，冷却至室温后冷藏24小时(0-4℃)离心(立式离心机，16000转)，上清液缓慢加入乙醇至60％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液加入乙醇至80％，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗过滤，滤液分装灭菌，冻干制成成品(10.2g)。
权利要求
1.一种银耳多糖，可由下述两种方法当中的一种制备获得方法1将银耳孢子加水搅拌均匀制成水溶液，离心后取上清液经活性炭过柱两次，其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，湿法装柱，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏24小时，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60％，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80％，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品；方法2取银耳子实体去托盘洗净加水煎煮，过滤取滤液，反复3次，合并滤液，浓缩加乙醇沉淀得银耳多糖粗品，加水配制成水溶液，经活性炭过柱两次，其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，湿法装柱，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏24小时，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60％，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80％，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。
2.银耳多糖在增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎药物中的应用。
3.用于增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎的药物组合物，其中含有治疗有效量的银耳多糖和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求2、3所述的药物，其特征在于所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
全文摘要
本发明提供一种银耳多糖，并提供了其制备方法，将银耳孢子、银耳子实体加水搅拌均匀制成水溶液，离心后取上清液经活性炭过柱两次，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60％，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80％，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。同时提供了以活性银耳多糖组分为主要药物或与其它药物组方，可用于增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎。
文档编号A61K31/715GK1415630SQ02144648
公开日2003年5月7日 申请日期2002年11月27日 优先权日2002年11月27日
发明者高其品, 姜瑞芝, 陈英红 申请人:高其品, 姜瑞芝