神经胚活素的多聚体偶联物及其应用方法

专利名称：神经胚活素的多聚体偶联物及其应用方法
技术领域：
本发明通常涉及多肽尤其是修饰的神经营养性多肽以及这些修饰性多肽的使用方法。
背景技术：
神经营养因子(Neurotropic factor)是可促进神经元细胞和组织生存，维持表型分化，防止退化以及增强其活性的天然蛋白。神经营养因子是从神经组织和由神经系统支配的非神经组织分离得来的，已根据功能和结构分成了相关的数个组，也称为家族，超家族或亚家族。在这些神经营养因子超家族中有成纤维细胞生长因子，神经营养蛋白以及转化生长因子β(TGF-β)超家族。每种神经营养因子在生理结构，与其相关受体之间的作用和对各种类型神经细胞的作用方面都有所不同。神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)的配体归类为TGF-β超家族，所述配体包括GDNF，persephin(PSP)以及neurturin(NTN)。
GDNF超家族的配体都能通过RET受体酪氨酸激酶诱导信号传导。GDNF超家族的这三种配体在它们对神经营养性受体，GFRα受体家族的相对亲和性方面不同。
近来提及的神经营养因子是“神经胚活素(neublastin)”或称“NBN”。神经胚活素因其与其它GDNF配体有同源区，能结合并活化RET，因此被归类于GDNF超家族。与其它GDNF配体不同，神经胚活素对GFRα3-REF受体复合物有高度的选择性。另外，NBN在其氨基酸序列中包含独特的亚区。
遗憾的是，神经胚活素可被身体迅速清除。这种快速清除作用影响了神经胚活素在治疗方面的应用。因此，有必要寻找到生物利用率提高的神经胚活素变体。
发明简述本发明是部分基于新形式神经胚活素的发现，该神经胚活素显示体内药物动力学特性和生物利用率特性提高。这些新形式包括与多聚体分子偶联的神经胚活素多肽变体。
一方面，本发明的特征是神经胚活素多肽变体，或神经胚活素多肽突变蛋白，其包括在成熟神经胚活素二聚体暴露于溶剂的位置有一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列。本发明的取代导入到天然神经胚活素多肽的一个或多个位点，在这些位点一些物质，如天然或合成的多聚体可与所述多肽偶联以提高其溶解性，并因此提高其体内的生物利用率。优选，本发明的多肽变体包括与SEQ ID NO1的氨基酸8-113至少70％相同的氨基酸序列。这种神经胚活素多肽变体包括一个或多个氨基酸取代，依照SEQ ID NO1的多肽序列对氨基酸的位置进行编号时，在多肽变体的氨基酸序列的第14位一个氨基酸取代了精氨酸，在多肽变体氨基酸序列的第39位，一个氨基酸取代了精氨酸，在多肽变体的第68位一氨基酸取代了精氨酸或在多肽变体的第95位一氨基酸取代了天冬酰胺。
本发明所用“野生型神经胚活素”或“wt-NBN”是指天然存在的或天然的神经胚活素多肽序列，如大鼠、小鼠或人的神经胚活素的天然序列(参见，例如SEQ ID NO2，3或4)。具体的神经胚活素多肽变体在本发明中是指“NBN-X1N1X2或X1N1X2-NBN”，其中X1是指野生型神经胚活素多肽的氨基酸，N1是指X1氨基酸在序列中的编号位置，该编号是根据SEQ ID NO1进行的。X2是指在序列的指定编号位置上取代野生型氨基酸的氨基酸。例如，NBN-N95K就是指在95位上天冬酰胺被赖氨酸取代的神经胚活素多肽变体。
神经胚活素多肽变体可以作为多聚体多肽提供。例如其可以作为其中至少包括一个神经胚活素多肽变体的二聚体提供。在优选实施方案中，所述二聚体是神经胚活素多肽变体的同二聚体。在另一些实施方案中，所述二聚体是其中包括一个神经胚活素多肽变体和一个野生型神经胚活素多肽的异二聚体。其它的二聚体可以包括二个不同的神经胚活素多肽变体形式。
在优选实施方案中，神经胚活素多肽变体除氨基酸8-113之外还包括SEQ ID NO1的氨基酸1-7。
在优选实施方案中，当所述神经胚活素多肽变体二聚化时，其与GFRα3结合。在另一些优选实施方案中，当所述神经胚活素多肽变体二聚化时，其自身或与GFRα3结合时，刺激RET多肽的酪氨酸磷酸化。
在另一些优选实施方案中，所述神经胚活素多肽变体二聚化时，可有助于(enhance)神经元的存活，例如有助于感觉神经元的存活。。
在另一些优选实施方案中，所述神经胚活素多肽变体二聚化时，可使神经元，如感觉神经元的病理改变恢复正常。
在另一些优选实施方案中，所述神经胚活素多肽变体二聚化时，可促进神经元，例如自主神经元或多巴胺能神经元的存活。
在一些实施方案中，所述多肽变体包括2个，3个或多个选自下组的氨基酸取代在多肽变体氨基酸序列第14位精氨酸由氨基酸取代，在多肽变体氨基酸序列的第39位精氨酸由氨基酸取代，在多肽变体氨基酸序列的第68位精氨酸由氨基酸取代或在多肽变体氨基酸序列的第95位天冬酰胺由氨基酸取代。
在优选实施方案中，在位置14，39，68和95之中的一个或多个位置的氨基酸是赖氨酸。
优选，神经胚活素多肽变体的8-94位氨基酸和96-113位氨基酸与SEQ ID NO1的8-94位氨基酸和96-113位氨基酸至少90％相同。更优选95％相同。最优选，神经胚活素多肽变体的氨基酸序列在神经胚活素多肽变体的氨基酸8-94和氨基酸96-113的位置包括天然大鼠，人或小鼠神经胚活素多肽。例如，神经胚活素多肽变体的氨基酸8-94和96-113包括SEQID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸8-94和氨基酸96-113的氨基酸序列。
本发明还提供融合蛋白或多肽，包括神经胚活素多肽变体或野生型神经胚活素多肽，或二个神经胚活素融合蛋白的二聚体蛋白。神经胚活素融合蛋白在体内也具有增强的药物动力学和生物利用率特性。
另一方面，本发明提供了一种编码神经胚活素多肽变体的核酸分子。编码神经胚活素多肽变体的核酸分子优选在载体中，例如在表达载体中提供。神经胚活素变体核酸或包含该核酸的载体可在细胞中提供。该细胞可以是哺乳动物细胞系，真菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞或细菌细胞。优选的哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(“CHO”细胞)。
本发明还提供通过在允许神经胚活素多肽变体表达的条件下培养包含编码神经胚活素变体的核酸的细胞。然后如需要，回收所述神经胚活素多肽变体。本发明还包括由细胞制备的神经胚活素多肽变体。本文同时公开了本发明融合蛋白(如神经胚活素血清白蛋白融合蛋白)的类似的核酸，载体，宿主细胞和多肽的制备方法。
本发明还提供了包括神经胚活素多肽或与非天然多聚体偶联的神经胚活素多肽变体的组合物。该组合物中的神经胚活素多肽变体在包括一个或多个选自下组的取代的情况下，其优选包括与SEQ ID NO1的氨基酸8-113至少70％相同的氨基酸序列在多肽变体氨基酸序列第14位精氨酸由氨基酸取代，在多肽变体氨基酸序列的第39位精氨酸由氨基酸取代，在多肽变体的第68位精氨酸由氨基酸取代或在多肽变体的第95位天冬酰胺由氨基酸取代(其中，氨基酸的位置是依照SEQ ID NO1的多肽序列编号的)。
在优选实施方案中，多聚体包括聚亚烷基二醇半分子，例如聚乙二醇半分子(PEG)。
在优选实施方案中，聚亚烷基二醇半分子与神经胚活素多肽的氨基偶联，或与神经胚活素多肽变体中的赖氨酸偶联。
偶联可以通过N-羟基琥珀酰亚胺(NNS)活性酯来进行。该活性酯可以是，例如PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)，琥珀酰亚胺丁酸酯(SPB-PEG)或琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)。
所述聚亚烷基二醇半分子可以是，例如，羧甲基-NHS，正亮氨酸-NHS，SC-PEG，tresylate，醛，环氧化物，羰基吲哚或PNP碳酸盐。
在一些实施方案中，聚亚烷基二成半分子与神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的半胱氨酸基团偶联。例如所述偶联可以通过马来酰亚胺基团，乙烯基砜(vinylsulfone)基团，卤代乙酸(haloacetate)基团和巯基来完成。
在一些实施方案中，组合物中的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体是糖基化的。但神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体被糖基化后，多聚体可偶联到糖基化的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的糖部分。例如，糖基化的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的腙基或氨基氧化后，或者多聚体的反应基团氧化后，多聚体可偶联到糖基化的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体。
在各种实施方案中，神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体包含一个，二个，三个或四个PEG半分子。
在优选实施方案中，神经胚活素多肽，神经胚活素多肽变体或多聚体偶联物的血清半寿期比没有多聚体的多肽或多肽变体的血清半寿期长。
在优选实施方案中，在复合物中的神经胚活素多肽，神经胚活素多肽变体或多聚体偶联物有选自如下的生理活性结合GFRα3，活化RET，使神经元的病理改变正常化或有助于神经元存活。
“使神经元的病理改变正常化”是指本发明的偶联物可诱导结构蛋白表达水平、神经营养因子受体表达水平、离子通道表达水平和神经传导物表达水平中的一种或多种细胞参数的变化，或者可诱导细胞形态的改变，在每种情况下，使所述参数基本恢复到未受疾病，退化，伤害(insult)或损伤影响时相同或类似表型的神经元所处的水平。神经元病理改变的正常化可用免疫组化法监测，或通过检测分泌的或脱落的细胞产物水平的变化监测，或通过体内评估生理上属于受影响神经元的功能的行为方面的变化。例如，在病理改变与神经病性疼痛综合征(neuropathic pain syndrome)有关的情况下，可监测疼痛行为，如痛觉过敏，痛觉减退或异常性疼痛。
“促进神经元存活”是指延长受影响神经元的存活，使其存活时间超过对受同一类型疾病，病症，伤害或损伤影响，但没有经过本发明的神经胚活素偶联物或融合蛋白治疗的相应神经元所观察到的存活时间。
在一些实施方案中，多聚体在神经胚活素的N末端位点与多肽相偶联。在一些实施方案中，多聚体在神经胚活素多肽或神经胚活素变体的非末端氨基酸的位点与多肽偶联。
在优选实施方案中，多聚体与神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的暴露于溶剂的氨基酸偶联。
在优选实施方案中，多聚体在选自如下的残基处与神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体偶联多肽变体的氨基末端氨基酸，神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的氨基酸序列的第14位氨基酸，神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的氨基酸序列的第39位氨基酸，神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的氨基酸序列的第68位氨基酸或神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的氨基酸序列的第95位氨基酸。
本发明也提供了药物组合物，其包含生理上可接受的载体，其中包含有或分散有神经胚活素多肽，神经胚活素多肽变体或本发明偶联物。
另一方面，本发明包括稳定的，水溶性的偶联型神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的复合物，该复合物包括与聚乙二醇半分子偶联的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体，其中的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体通过不稳定的键与聚乙二醇半分子偶联。在一些实施方案中，这种不稳定的键可通过生化水解作用，蛋白裂解作用切断，或通过裂解巯基切断。在优选实施方案中，该不稳定的键可在体内条件下断裂。
本发明通过提供神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体，以及通过将该多肽或修饰的神经胚活素多肽变体与非天然多聚体半分子偶联，从而形成偶联的多聚体神经胚活素多肽组合物，来提供制备体内、体外活性比野生型神经胚活素延长的修饰性神经胚活素多肽的方法。
另一方面，本发明还通过给药有此需要的受试者治疗有效量的神经胚活素多肽变体、包含与多聚体偶联的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的组合物、包含稳定的、水溶性的偶联型神经胚活素多肽的复合物或包含与聚乙二醇半分子偶联的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的神经胚活素多肽变体复合物，来治疗或预防受试者(如人)的神经系统疾病的方法。
优选，所述神经系统疾病是周围神经疾病，如周围神经病或神经病性疼痛综合征。人是优选进行治疗的受试者。
给药可以是，例如，全身的或局部的。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语与该发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同。尽管在实践或检验本发明时可以使用与本文所述类似或等同的方法和材料，但本文以下还是对适当的方法和材料进行了描述。本文所涉及的所有出版物、专利申请、专利和其它文献在此全文引入作参考。在发生冲突时，以本说明书为准。另外，本发明的材料、方法和实施例仅用以描述，而非旨在对本发明进行限制。
本发明的其它特征和优点在以下详细的说明和权利要求中是非常明显的。
发明详述本发明提供能被修饰以提高其药物动力学和生物利用率特性的新的神经胚活素多肽变体。优选的神经胚活素多肽变体具有改变的氨基酸序列，该序列可促使与多聚体试剂如聚亚烷基二醇聚合物偶联。
神经胚活素多肽变体本发明提供了具有针对野生型神经胚活素多肽序列而言改变的氨基酸序列的神经胚活素多肽。人和小鼠的神经胚活素多肽的氨基酸序列公开于WO00/01815。依照本发明的神经胚活素多肽变体的实例在表1列举。
优选，选择神经胚活素多肽变体中改变的残基以促进在经修饰的氨基酸部位与多聚体如聚亚烷基二醇聚合物偶联。神经胚活素多肽的修饰的优选位点是神经胚活素多肽的溶剂可接近的区域。这些位点可根据对相关神经营养因子、GDNF的晶体结构的观察而选择(它们的晶体结构描述于Nat.Struct.Biol.4435-38，1997))。这样的位点也可以基于persephin/神经胚活素嵌合蛋自提供的结构-功能信息来选择。这些嵌合体描述于J.Biol.Chem.2753412-20，2000。通过上述方法学而鉴定的溶剂可接近的神经胚活素氨基酸或暴露于表面的神经胚活素氨基酸的实例如表2所示。
本发明还包括含有与SEQ ID NO1的氨基酸8-113有至少70％相同的氨基酸序列的神经胚活素多肽变体，它们列举于表1。在一些实施方案中，在所述多肽氨基酸序列的第14位、第39位、第68位的精氨酸，或第95位的天冬酰胺被除精氨酸或天冬酰胺以外的其它氨基酸取代。优选，野生型氨基酸被赖氨酸或半胱氨酸取代。
表11 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRF 人AGTRSSRARTTDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRF 小鼠AGTRSSRARATDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRF 大鼠ag---srar---argcrlrsqlvpv-alglgh-sdel-r共有序列41RFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC 人RFCSGSCRRARSQHDLSLASLLGAGALRSPPGSRPISQPC 小鼠RFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRSPPGSRPISQPC 大鼠rfcsgscrrars-hdlslasllgagalr-ppgsrp-sqp共有序列81CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVTDRLSATACGCLG 人(SEQ ID NO2)CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG 小鼠(SEQ ID NO3)CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG 大鼠(SEQ ID NO4)crptryeavsfmdvnstwrtvd-lsatacgclg 共有序列(SEQ ID NO1)
共有序列AlaGlyXaa1Xaa2Xaa3Ser Arg AlaArg Xaa4Xaa5Xaa6Ala Arg Gly CysArgLeuArgSer GlnLeu Val ProVal Xaa7Ala Leu Gly Leu Gly His Xaa8SerAspGluLeuXaa9ArgPhe Arg PheCys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Xaa9SerXaa10HisAsp LeuSer Leu AlaSer LeuLeu Gly Ala Gly Ala Leu ArgXaa11ProProGly SerArg Pro Xaa12Ser GlnPro Cys Cys Arg Pro Thr ArgTyrGluAlaVal SerPhe Met AspVal LysSer Thr Trp Arg Thr Val AspXaa13LeuSerAla ThrAla Cys GlyCys LeuGly其中Xaa1是Gly或ThrXaa2是Pro或ArgXaa3是Gly或SerXaa4是Ala或ThrXaa5是Ala或ThrXaa6是Gly或AspXaa7是Arg或SerXaa8是Arg或SerXaa9是Val或IleXaa10是Pro或GlnXaa11是Pro或SerXaa12是Val或IleXaa13是Arg或His
表2提供了人神经胚活素中预测为暴露于表面的残基和其编号表。暴露于表面的残基通过检测由A链和B链(PDB编码1AGQ)形成的大鼠GDNF二聚体的结构，并检测残基是否是在该结构表面来确定。将该结构与GDNF和神经胚活素进行序列对比(Baloh等，21卷，1291页，1998)以确定神经胚活素中的适当残基。表1显示了编号图。
表21Ala n/a 40Phe - 79Pro -2Gly n/a 41Arg + 80Cys -3Gly n/a 42Phe + 81Cys -4Pro n/a 43Cys - 82Arg -5Gly n/a 44Ser + 83Pro -6Ser n/a 45Gly + 84Thr +7Arg n/a 46Ser + 85Arg +47Cys - 86Tyr +8Ala n/a 48Arg + 87Glu +9Arg n/a 49Arg + 88Ala +10Ala n/a 50Ala - 89Val +11Ala n/a 51Arg + 90Ser +12Gly + 52Ser + 91Phe -13Ala - 53Pro + 92Met +14Arg + 54His - 93Asp +15Gly + 55Asp - 94Val +16Cys - 56Leu + 95Asa +17Arg + 57Ser - 96Ser+18Leu + 58Leu - 97Thr +19Arg + 59Ala + 98Trp +20Ser + 60Ser + 99Arg +21Gln + 61Leu - 100Thr +22Leu + 62Leu + 101Val -23Val - 63Gly + 102Asp +24Pro + 64Ala + 103Arg +25Val - 65Gly + 104Leu -26Arg + 66Ala + 105Ser -27Ala + 67Leu - 106Ala -28Leu - 68Arg n/a 107Thr +29Gly + 69Pro n/a 108Ala +30Leu + 70Pro n/a 109Cys -31Gly + 71Pro n/a 110Gly +32His + 72Gly + 111Cys -33Arg + 73Ser + 112Leu +34Ser - 74Arg n/a 113Gly35Asp + 75Pro n/a n/a36Glu + 76Val -37Leu + 77Ser -38Val - 78Gln +39Arg +
n/a表示这些残基不存在于GDNF结构中。这或是因为构建体的设计，可弯曲的区域，或是因为在相对于GDNF的神经胚活素中的插入子(残基68-71)。
-表示被掩藏的、不是在表面的残基，或者是参与二硫键形成的半胱氨酸残基。因该蛋白是半胱氨酸结(knot)，所以大部分残基都在表面。
+表示该残基在GDNF结构中是暴露于表面的，所以尽管包含残基66-75的环仅在一个GDNF单体(可能是可弯曲的)中是可见的，但推测该残基在神经胚活素中是暴露于表面的。该环在相对于GDNF的神经胚活素中还包含4个残基的插入子。
本文所用的“同一性”和“同源性”可互换使用，它们都是指两个多肽，两个分子或两个核酸之间序列的相似性。当两个相对比序列的同一位置被同一碱基或氨基酸单体亚单位占据时(例如，如果在两个DNA分子的同一位置都被腺苷酸占据，或者在两个多肽的同一位置都被赖氨酸占据)，那么这两个分子在这一位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列的吻合数或共有的同源位置数除以所有的位置数乘以100所得的函数。例如在两个序列中10个位置中的6个是吻合的或同源的，那么这两个序列是60％同源。依照这一实例计算，CTGACT和CAGGTT DNA序列之间的同源性是50％(总数为6的位置中有3个位置是吻合的)。通常，当两个序列进行对比给出最大同源性时才进行比较。这种对比可如下进行，即使用例如Needleman等，J.Mol Biol.48443-453(1970)的方法，常规执行计算机程序如Align程序(DNAstar，Inc.)而进行。“类似的”序列是对比时有相同或相似氨基酸残基的那些序列，其中所述类似的残基是指对所对比的参考序列中的相应的氨基酸残基进行了保守取代的残基或“被允许点突变”的残基。所述参考序列中残基的“保守取代”是指物理学或功能方面类似于相应参考残基的残基对参考残基的取代，例如所述残基有类似的大小，形状，电荷，化学特性，包括形成共价键或氢键的能力等等。因此，“保守取代的变体”序列是指与参考序列或野生型序列不同的序列，即存在一个或多个保守取代或允许的点突变的序列。
在优选实施方案中，本发明的多肽与SEQ ID NO1的8-113位氨基酸85％，85％，90％，95％，98％或99％相同。在一些实施方案中，神经胚活素多肽变体的氨基酸序列包括大鼠，人或小鼠的天然神经胚活素多肽1-94位氨基酸和神经胚活素多肽变体96-113位氨基酸的氨基酸序列，例如，所述多肽在这些位置含有氨基酸序列SEQ ID NO1，2，3或4。
在序列方面与SEQ ID NO1-4所公开的序列不同的神经胚活素多肽变体可包括一个或多个保守的氨基酸取代。或者，或另外地，神经胚活素多肽变体通过一个或多个非保守氨基酸取代，或通过缺失或插入而发生改变。优选，这种取代，插入或缺失不破坏分离的蛋白的生物活性。
保守取代通常包括一个氨基酸被另一个具有类似特性的氨基酸所取代，如以下所述的取代缬氨酸，丙氨酸取代甘氨酸；亮氨酸，缬氨酸取代异亮氨酸；天冬氨酸取代谷氨酸；天冬酰胺取代谷氨酰胺；丝氨酸，半胱氨酸取代苏氨酸；赖氨酸取代精氨酸；苯丙氨酸取代酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)包括天冬氨酸和谷氨酸。以上提及的极性，碱性或酸性氨基酸组中的一个成员被同一组中另一成员的取代被认为是保守取代。
其它取代可由本领域技术人员很容易地鉴定。例如，对于丙氨酸而言，可以用D丙氨酸，甘氨酸，β-丙氨酸，L-半胱氨酸和D-半胱氨酸中的任何一个进行取代。对于赖氨酸而言，可以用D-赖氨酸，精氨酸，D-精氨酸，同型＝精氨酸，蛋氨酸，D-蛋氨酸，鸟氨酸或D-鸟氨酸取代。通常，在重要功能区域进行的、推测可导致所分离的多肽的特性发生变化的取代是这样的一些取代，其中(I)极性残基，例如丝氨酸或苏氨酸被疏水性残基，例如亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸或缬氨酸所取代；(ii)半胱氨酸残基被其它残基所取代；(iii)侧链带正电荷的残基，例如赖氨酸，精氨酸或组氨酸被侧链带负电荷的残基，例如谷氨酸或天冬氨酸所取代；或(iV)侧链大的氨基酸，例如苯丙氨酸被没有此类侧链的氨基酸例如甘氨酸所取代。一个前述非保守取代改变蛋白功能特性的可能性也与该蛋白重要功能区域中所发生取代的位置相关一些非保守取代可能对功能特性有极小或没有影响。
本发明也提供了包括神经胚活素多肽变体的多聚体多肽。该多聚体多肽优选作为纯化的多聚体多肽提供。多聚体复合物的实例包括，例如，二聚体复合物。多聚体复合物可以作为异聚体(heteromeric)或同聚体(homomeric)复合物来提供。因此，多聚体复合物可以是包含一个神经胚活素多肽变体和一个非神经胚活素变体的异二聚体复合物，或者是包含二个或多个神经胚活素多肽变体的异二聚体复合物。
在一些实施方案中，神经胚活素多肽变体结合GFRα3。优选，神经胚活素多肽变体的结合刺激RET多肽的磷酸化。为确定该多肽是否结合了GFRα3，可进行WO00/01815中所描述的检测。例如神经胚活素在CHO细胞系培养上清中的存在可用Sanicola等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，946238)所描述的四聚体复合物检测法的修改形式来指示。在这种检测中，GDNF样分子的能力可用通过其介导RET胞外区与各种共同受体，RET的GFRα1，GFRα2和GFRα3的结合的能力来评估。可制备RET的可溶形式和共同受体的融合蛋白。大鼠RET胞外区和胎盘碱性磷酸酶(RET-AP)之间形成的融合蛋白，大鼠GFRα-1胞外区(在1997年11月27日公开的申请WO9744356中公布，在此引入本文作参考)和人IgG1的Fc区(rGFR(α1-Ig)之间形成的融合蛋白已有描述(Sanicola et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，946238)。
在一些实施方案中，神经胚活素多肽变体能促进神经元的存活，或使神经元的病理改变正常化或这两种功能都具备。检测多肽是否能促进神经元的存活，或是否能使神经元的病理改变正常化的方法在例如WO00/01815中描述。优选，所述神经元是感觉神经元，自主神经元或多巴胺能神经元。
神经胚活素多肽变体的合成和分离神经胚活素多肽变体可用本领域已知的方法分离。天然的神经胚活素多肽可用标准的蛋白纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织中分离。或者，神经胚活素多肽变体用标准的肽合成技术化学合成。短氨基酸序列的合成方法在肽领域中已相当成熟。参见，例如，Stewart，et al.，Solid Phase PeptideSynthesis(2d ed.，1984)。
在另一实施方案中，神经胚活素多肽变体通过重组DNA技术制备。例如，将编码神经胚活素多肽变体的核酸分子插入到载体，再将该核酸导入到细胞。适当的细胞包括，例如，哺乳动物细胞(如人细胞或中国仓鼠卵巢细胞)，真菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞和细菌细胞。但在重组细胞中进行表达时，该细胞优选在允许神经胚活素多肽变体表达的条件下培养。如需要，该神经胚活素多肽变体可从细胞悬液中回收。所谓“回收”是指多肽变体从回收之前其所存在的细胞或培养基的那些成分中分离出来。回收过程包括一个或多个重折叠或纯化步骤。
神经胚活素多肽变体可用本领域已知的多种方法中的任何一种方法来构建。一种这样的方法是定点突变，其中特定核苷酸(或如需要，数个特定核苷酸)被改变以改变所编码的神经胚活素多肽中的单个氨基酸(或如需要，数个预先确定的氨基酸残基)。本领域技术人员知道定点突变是一种常规和广泛应用的技术。实际上，许多定点突变试剂盒可以从商业渠道购买。一种这样的试剂盒是Clontech Laboratories(Palo Alto，Calif.)出售的“TransformerSite Directed Mutagenesis Kit”。
如果不另加说明，实践本发明所应用的是本领域范围内的细胞生物学，细胞培养，分子生物学，微生物学，重组DNA，蛋白质化学和免疫学的常规技术。这些技术在文献中有描述。参见，例如，Molecular CloningALaboratory Manual，2ndedition.(Sambrook，Fritsch and Maniatis，eds.)，ColdSpring harbor Laboratory Press，1989；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Golver，ed)，1985；Oligonucleotide Synthesis，(M.J.Gait，ed.)，1984；U.S.PatentNo.4,683,195(Mullis dt al.，)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Haines and S.J.Higgins，eds.)，1984；Transcription and Translation(B.D.Hames and S.J.Higgins，ed.)，1984；Culture of Animal Cells(R.I.Freshney，ed).Alan R.Liss，Inc.，1987；Immobilized Cells and Enzymes，IRL Press，1986；A Practical Guideto Molecular Cloning(13.Perbal)，1984；Methods in Enzymology，Volumes 154and 155(Wu et al.，eds)，Academic Press，New York；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos，eds.)，1987，Cold Spring HarborLaboratory；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayerand Walker，eds.)，Academic Press，London，1987；Handbook of ExperimentImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.)，1986；Manipulating and Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1986.
神经胚活素融合蛋白变体如需要，神经胚活素多肽变体可以作为融合蛋白提供。本发明蛋白的融合蛋白衍生物也包括保持生物活性的原始蛋白的各种结构形式。此处所用“融合”是指两个或多个蛋白或其片段通过它们各自的肽骨架，最优选通过编码这些蛋白的同一读框中多核苷酸分子的基因表达而实现共同的线性连接，共价连接。优选所述蛋白或其片段来自不同的来源。因此，优选的融合蛋白包括神经胚活素多肽变体或与非神经胚活素变体的第二个半分子共价相连的片段。优选，所述第二个半分子来源于以单体形式存在的多肽，而且其可足以对神经胚活素多肽赋予提高的可溶性和/或生物利用率特性。
例如，“神经胚活素变体/人血清白蛋白融合体”是一种包含本发明神经胚活素多肽变体的蛋白，或其片段，它们的N末端或C末端在读框内和人血清白蛋白多肽连接(参见Syed er al，Blood，1997，893243 and Yeh et al.，P.N.A.S.USA 1992，891904和美国专利号5,876,969和5,302,697)。术语“融合蛋白”还包括通过相同的(homo-)或不同的(hetero-)功能分子与第二个半分子化学连接的神经胚活素变体，所述半分子不是神经胚活素蛋白变体，它是如下所述从纯化的蛋白中重新制备的。
神经胚活素血清白蛋白融合体可利用本领域已知的方法构建。许多包含相应氨基酸反应基团和巯基(thiol)反应基团的交联剂中的任何一种都可以用于连接神经胚活素与血清白蛋白。适当的连接剂的实例包括插入了巯基反应性马来酰亚胺的氨基反应交联剂。这些交联剂包括，例如，SMCC，AMAS，BMPS，MBS，EMCS，SMPB，SMPH，KMUS或GMBS。其它适合的连接剂插入了巯基反应性卤代乙酸基团。这样的连接剂包括，例如，SBAP，SIA，SIAB，为与巯基反应而提供了被保护或未被保护的硫醇以产生可还原连接的连接剂是SPDP，SMPT，SATA或SATP，所有这些连接剂都可以商购(例如，Pierce Chemicals)。本领域技术人员同样能想象出连接神经胚活素N末端和血清白蛋白的其它策略。
也可以想象本领域技术人员能制备出与血清白蛋白的偶联物，该偶联物不是以NBN的N末端或血清白蛋白的硫醇半分子处为靶点的。如需要，NBN-血清白蛋白可用基因工程技术制备，其中NBN在其N末端，C末端或在两端与血清白蛋白基因融合。
人们还可以考虑用类似的策略制备能在动物体内(包括人)产生半寿期长的产物的任何NBN偶联物。
神经胚活素变体的其它衍生物包括神经胚活素变体或其片段与其它蛋白或多肽，如通过在重组培养基中合成为额外的N末端或C末端而形成的共价或聚集的偶联物。例如，所述偶联的多肽可以是蛋白N末端区的信号(前导)肽序列，在翻译的同时或翻译后引导蛋白从其合成的部位转移到细胞膜或细胞壁的内部或外部的功能部位(例如，酵母α因子前导肽)。神经胚活素受体蛋白可包含所添加的肽以促进对神经胚活素的纯化或鉴定(例如，组氨酸/神经胚活素融合体)。神经胚活素的氨基酸序列也可以与肽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)连接(Hopp et al.，Biotechnology61204，1988.)。后者具有高度抗原性，能提供可与特异性单克隆抗体可逆性结合的表位，从而使所表达的重组蛋白快速检测和易于纯化。
这一序列也可以被牛粘膜肠激酶在紧接Asp-Lys对之前的残基处特异性地切割。
神经胚活素蛋白变体与聚合物偶联如需要，可将单个聚合物分子用于同神经胚活素多肽偶联，尽管也考虑到一个以上的多聚体分子也能偶联。本发明偶联的神经胚活素组合物在体内及体外的应用中都可以找到效用。另外，人们可发现偶联的多聚体可利用对最终应用适合的任何其它基团，半分子或所偶联的其它种类的物质。这样的实例如，在某些应用中使多聚体与可赋予该多聚体UV降解抗性，抗氧化性或其它特性或特征的功能半分子共价连接可能是有利的。另一个实例是，在某些应用中本质上赋予多聚体反应或可交叉连接的职能，以提高偶联物整体的各种特性或特征可能是有利的。因此，为了其所达到的目的，多聚体可以包含任何功能(functionality)，重复的基团，连接或其它不妨碍偶联的神经胚活素突变蛋白组合物的效力的组成结构。
对获得上述所需特性有用的聚合物的实例在本文以下例证性反应方案中说明。在共价连接的肽的应用中，可以赋予多聚体以功能，然后再将其与肽的游离氨基酸偶联以形成不稳定的键。
在一些实施方案中，神经胚活素多肽通过多肽上的末端反应基团与多聚体连接。或者，或另外，神经胚活素多肽可通过内部的赖氨酸残基，例如，被导入到天然神经胚活素多肽氨基酸序列中的赖氨酸残基的侧链氨基进行连接。因此偶联物也可以从非末端反应基团分支。本文设计了具有反应基团的多聚体作为“活化的多聚体”。该反应基团选择性地与蛋白上的游离氨基或其它反应基团反应。
连接可发生在活化的聚合物中，在任何可利用的神经胚活素的氨基基团部位，如赖氨酸残基或导入到神经胚活素多肽或其变体的氨基酸序列中的残基的α氨基或的ε氨基部位。游离的羧基，适当活化的羧基，羟基，胍基，咪唑基，氧化的糖半分子和神经胚活素的含巯基的基团(如果可利用的话)也可以用作连接位点。
通常，每摩尔蛋白(取决于蛋白的浓度)使用大约1.0摩尔-大约10摩尔的活化的多聚体。最终的量是当最小化对产物的非特异性修饰时的最大化的反应程度，与同一时间最优化(如果可能)蛋白的半寿期时，同一时间维持最佳活性所限定的化学之间的平衡。优选，蛋白至少约50％的生物活性得到维持，最优选近100％的生物活性得到维持。
上述反应可以通过用于使生物活性物质与惰性多聚体反应的任何适当的方法来完成，优选在约pH5-8，例如，5，6，7或8时，如果反应基团是在N末端的α氨基上。通常该方法涉及制备活化的多聚体并因此使蛋白与活化的多聚体反应以产生适合制成制剂的可溶性蛋白。上述修饰反应可通过数种方法(其可涉及一个或多个步骤)来进行。
可以将多聚体用本领域已知的方法偶联到神经胚活素多肽变体上。例如，在一个实施方案中，多聚亚烷基二醇半分子被偶联到神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的赖氨酸基团上。与赖氨酸基团的连接可以用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯如PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)来进行。适当的多聚亚烷基二醇半分子包括，例如，羧甲基-NHS，正亮氨酸，NHS，SC-PEG，treslate，醛，环氧化物，羰基吲哚和PNP碳酸盐。
另外的氨基反应PEG连接物可替代琥珀酰亚胺半分子。它们包括，例如异硫氰酸盐，碳酸硝基苯，环氧化物和碳酸苯并三唑。对条件进行优选以使选择性、程度和反应最大化。线性或分支形式的PEG以及其他烷基形式都可以使用。PEG的长度可以改变。最常用的大小是2K-100K。当本发明的实例报告在N末端所靶向的PEG化不影响药物动力学特性时，所得物质保持了生理功能的事实表明在本发明所公开的位点进行的修饰没有破坏性。所以，在制备能够提供通过插入赖氨酸残基进行连接的额外位点的NBN突变形式时，可考虑接受的结果是这些形式可在赖氨酸和N末端被PEG化。
如果需要，神经胚活素多肽变体可包含标记，例如能随后通过蛋白裂解而释放的标记。因此，可通过首先使his标记变体与低分子量连接物如Traut′s试剂(Pierce)(其既可以与赖氨酸反应又可以与N末端反应)反应，然后再释放所述his标记来选择性地修饰赖氨酸半分子。那么该多肽便包含游离的SH基，该SH基能用包含巯基反应性的头部基团如马来酰亚胺基团，乙烯基砜基团，卤代乙酸基团或游离的或被保护的SH来选择性修饰。
Traut′s试剂可用将为PEG的附着建立特异性位点的任何连接剂来替换。这方面的实例有，Traut′s试剂可用SPDP，SMPT，SATA或SATP(所有这些都可以在Pierce得到)替换。同样，人们可以使蛋白与插入了马来酰亚胺(例如SMCC，AMAS，BMPS，MBS，EMCS，SMPB，SMPH，KMUS或GMBS)，卤代乙酸(SBAP，SIA，SIAB)，或乙烯基砜基团的氨基反应性连接剂反应，且可以使产生的产物与包含游离SH的PEG进行反应。对所使用的连接剂大小的唯一限制是其不能妨碍随后除去N末端标记。
因此，在其它实施方案中，半分子与神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的半胱氨酸基团偶联。用例如马来酰亚胺基团，乙烯基砜基团，卤代乙酸基团和巯基完成上述偶联。
神经胚活素多肽上的一个或多个位点可偶联多聚体。例如，可将一个，二个，三个，四个或五个PEG半分子与多聚体连接。在一些实施方案中，PEG半分子可在氨基末端和/或如表1所示命名的神经胚活素多肽的氨基酸14，39，68和95处连接。
在优选实施方案中，组合物中的神经胚活素多肽变体相对于没有多聚体的多肽变体的血清半寿期要长。或者或额外地，组合物中的神经胚活素多肽变体结合GFRα3，活化RET，使神经元的病理改变正常化，或促进神经元的存活，或表现为这些生理功能的组合。
在一些实施方案中，提供的这种组合物可以是稳定的，水溶性的偶联型神经胚活素多肽或包含神经胚活素多肽或与聚乙二醇半分子偶联的神经胚活素多肽变体的神经胚活素多肽变体复合物。如需要，所示神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体可通过不稳定的键与聚乙二醇偶联。该不稳定的键可在例如生化水解，蛋白裂解，或巯基裂解过程中被裂解。例如所述键可在体内(生理)条件下被裂解。
包含神经胚活素变体-多聚体偶联物的药物组合物本发明也提供了包含神经胚活素变体-多聚体偶联物的药物组合物。此处所用“药物组合物”定义为包含本发明神经胚活素蛋白或偶联物，其被分散在生理可接受的载体中，任选还包括一种或多种其它的生理上相容的成分。因此药物组合物可包含赋形剂如水，一种或多种矿物质，糖，清洁剂(detergent)，和一种或多种载体如惰性蛋白(例如，肝素或白蛋白)。
可给药本发明的多聚体-神经胚活素偶联物本身和其药学可接受的酯，盐以及其它生理功能衍生物。在这样的药物制剂中，神经胚活素变体偶联物优选与一种或多种药学上可接受的载体以及任选地和任何其它治疗成分共同应用。
所述载体必须是在与制剂的其它成分相容的意义上的药学上可接受的，且不能对其赋形剂产生不应有的损害。神经胚活素变体可以，如本文所述，以对获得所需药学效果或有益的医药效果有效的量提供，且所提供的量在体内剂量和浓度的情况下应适合获得所需的生物利用率。
这些制剂包括那些适合肠胃外给药和非肠胃外给药的制剂，以及特定的给药形式包括口服，直肠，口腔(buccal)，局部，鼻腔，眼部，皮下，肌肉内，静脉内，经皮，鞘内，动脉内，蛛网膜，器官，淋巴腺，阴道以及子宫内给药的制剂。适合气雾剂和肠胃外给药的制剂，局部以及全身的都是优选的。
当神经胚活素变体用于包含液体溶液的制剂中时，该制剂优选口服给药，气管给药或肠胃外给药。当神经胚活素用于液体悬浮制剂或以粉末用于生物相容性载体制剂中时，该制剂优选口服给药，直肠给药或气管给药。或者，将神经胚活素粉末放入载体气体中形成粉末的气体扩散物，使患者从包含适当喷雾器设备的呼吸循环器将其吸入。
包含本发明蛋白的制剂可方便地以单位剂量形式存在，且可通过制药领域已知的任何方法制备。所述方法通常包括使活性成分和构成一种或多种辅助成分的载体组合。
通常，制剂如下制备使活性成分与液体载体，微细的固体载体或它们两者均一且紧密地结合在一起，然后，如需要，将该产物制成所需制剂的剂量形式。
适合口服的本发明制剂可以分开的单位存在，如胶囊，扁胶囊，片剂或锭剂(每种包含作为粉末或颗粒的活性成分的预先确定的量)；或在水溶液或非水溶液中的悬浮剂，如糖浆，酏剂，乳剂或饮剂(drought)。
适合肠胃外给药的制剂通常包括活性偶联物无菌的水制剂，其优选与接受者的血液等张(例如，生理盐溶液)。这样的制剂可包括悬浮剂和增稠剂或其他所涉及的将化合物靶向血液成分或一个或多个器官的微颗粒系统。这些制剂可以单剂或多剂形式存在。
鼻腔喷雾制剂包含纯化的活性偶联物的水溶液和防腐剂与等张剂。优选将这些制剂调整到与鼻粘膜相容的PH和等张状态。
直肠给药的制剂可以作为与适当载体如可可脂，氢化脂，或氢化脂肪酸形成的栓剂来提供。眼用制剂如眼滴剂由与鼻喷雾剂类似的方法制备，除了优选调整PH和等张因素以使其与眼的状况相吻合。
局部给药制剂包含在一种或多种介质中溶解或悬浮的本发明偶联物，所述介质如矿物油，石油(petroleum)，多羟基醇，或其他用于局部药物制剂的碱。
除了前述的成分外，本发明的制剂还包括一种或多种选自如下的辅助成分溶剂，缓冲液，调味剂，分解剂，表面活性剂，增稠剂，润滑剂，防腐剂(包括抗氧化剂)，等等。前述考虑还可应用于本发明的神经胚活素融合蛋白(例如，神经胚活素-HSA融合蛋白)。
因此，本发明考虑到提供适当的融合蛋白用于体外稳定溶液中的神经胚活素变体偶联物，作为优选的本发明的例证性的应用。该融合蛋白可应用于例如增强神经胚活素多体变体对酶降解的抗性，并提供延长保存期限，改善室温稳定性等的方法。可以理解，前述考虑也可用于本发明的神经胚活素-血清白蛋白融合蛋白(包括人神经胚活素-人血清白蛋白融合蛋白)。
处理方法神经胚活素多肽变体以及融合蛋白或其偶联物可用于治疗或缓解活动物的紊乱或疾病，所述动物优选其疾病可对神经营养制剂的活性有反应的哺乳动物，更优选包括人的灵长类动物。本发明的组合物可通过，例如注射，植入或消化的药物组合物来治疗对神经胚活素多肽反应的病理状况。该组合物可应用于缓解包括人的活体动物的紊乱或疾病，其紊乱或疾病对神经营养性制剂有反应。所述紊乱或疾病尤其是由外伤，手术，缺血，感染，代谢性疾病，营养缺陷，恶性肿瘤，毒性制剂以及遗传或自发性疾病的过程。
所述损伤尤其发生在感觉神经元或视网膜神经节细胞，包括脊髓背根神经节的神经元或以下组织中的神经元膝神经节，岩神经节，结状神经节；第八对脑神经的前庭声学复合物；三叉神经节的上下颌叶的腹侧极以及中脑三叉神经核。
在本发明方法的优选实施方案中，神经退化性疾病涉及损伤(lesioned)和创伤性(traumatic)神经元，如外周神经，延脑和/或脊髓的创伤，脑缺血性神经损伤，神经病尤其是外周神经病，外周神经创伤或损伤，缺血性休克，极性脑损伤，极性脊髓损伤，神经系统肿瘤，多发性硬化，神经毒素的接触，代谢性疾病如糖尿病或肾功能障碍和由感染因子导致的损伤，神经退化性疾病包括阿尔茨海默病，亨廷顿氏病，帕金森氏病，Parkinson-Plus综合征，进行性核上麻痹(Steele-Richardson-Olszewski综合征)，橄榄红核小脑性萎缩(Olivopontocerebellar Atrophy)(OPCA)，Shy-Drager综合征(多系统萎缩)，Guamanian帕金森氏痴呆综合征，肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)或任何其它先天或神经退化性疾病，以及与痴呆有关的记忆减退。
在优选实施方案中，可处理感觉和/或自主系统神经元。尤其是，感受伤害的(nociceptive)神经元以及机械感受(mechamoreceptive)神经元 ，尤其是δ纤维和C纤维神经元。另外，可治疗自主神经系统的交感神经元和副交感神经元。
在另一实施方案中，可治疗运动神经元疾病如肌萎缩性侧索硬化(“ALS”)和脊柱肌肉萎缩。在另一优选实施方案中，本发明的神经胚活素分子可用于改善创伤后的神经恢复。或者，或另外，具有含神经胚活素多肽变体或神经胚活素多肽变体融合体或偶联物基质的神经引导通道(nerve guidance channel)也可以用于本文所述方法中。这样的神经引导通道已在如美国专利5,834,029，中公开，并已纳入本文作参考。
在优选实施方案中，本发明所公开的组合物(包含其药物组合物)可用于治疗外周神经病。在外周神经病中，用本发明分子治疗的是创伤诱导的神经病，例如，由物理创伤或疾病引起的神经病，对脑的物理损伤，对脊髓的物理损伤，与脑损伤有关的休克以及与神经退化有关的神经疾病。包括在本发明中的还有继发于感染，中毒，药物接触之后的那些神经病。继发于全身或代谢性疾病的那些神经病也包括在本发明中。本发明的组合物也可应用于治疗化疗所导致的神经病(如由运送化疗药物，如taxol或cisplatin所导致的那些神经病)；毒素诱导经病，药物诱导的神经病，维生素缺乏诱导的神经病；自发性神经病；以及代谢性神经病。参见，例如，美国专利5,496,804和5,916,555，它们都纳入了本文作参考。
可用本发明组合物治疗的其它疾病是单一神经病(mono-neuropathies)，单一的多发性神经病(mono-multiplex neuropathies)以及多神经病(poly-neuropathies)包括，轴突的神经病和脱髓鞘性神经病，它们可用本发明所述组合物治疗。
在另一优选实施方案中，本发明组合物(包含其药物组合物)可用于眼睛各种疾病的治疗，包括患黄斑变性，色素性视网膜炎，青光眼以及类似疾病的患者视网膜中的光感丧失。
本发明进一步以下列非限制性实例作进一步详细描述。
实施例1N末端PEG化的神经胚活素的生物利用率如果向大鼠静脉给药，可观察到CHO细胞衍生的重组人神经胚活素被快速从循环中清除。皮下给药之后，在血清中没有检测到该蛋白。为增加神经胚活素的生物利用率，构建神经胚活素的PEG形式。
因在NBN序列中没有赖氨酸，所以氨基特异性的PEG化学将产生NBN多肽氨基末端的PEG化。因此，对每种神经胚活素二聚体而言，应该连接有二个PEG半分子。因此，PEG形式首先通过氨基特异性化学直接靶向N末端。令人吃惊的是，即使连接了二个20K PEG的PEG化对半寿期仍几乎没有提高，这表示，基于清除途径的机制不能如所期望的那样通过PEG化来提高半寿期。
实施例2PEG化的神经胚活素N95K突变体的构建检测在内部氨基酸残基处被PEG化的NBN突变体形式的生物利用率。设计在位置14，39，68和95处取代天然残基的四个突变体，以在该序列的选择位点上插入赖氨酸。这些赖氨酸将为PEG的连接提供不同的位点。用GDNF的晶体结构(Nat.Struct.Biol.4435-8，1997)作为构架结构选择这些位点以鉴定表面残基，并对persephin/神经胚活素嵌合体作诱变研究(J.Biol.Chem.2753412-20，2000)以鉴定该结构中应该避开的重要功能区域。
根据表面阳电荷分布，在能代表肝素结合位点的区域进行二个突变(R39和R68)，该蛋白的特性可能有助于其快速清除。第三个位点靶向N95，即野生型NBN的天然糖基化位点。该位点在天然状态下被复合的糖结构修饰。所以，在该位点进行的修饰预计不会影响功能。在不被任何其它修饰所占据的区域选择第四个位点(R14)。从该位点的突变体中，选择在位置95的天冬酰胺残基被赖氨酸取代(N95K突变体)用于本发明所公开的研究。
构建在大鼠神经胚活素多肽野生型序列中包含一个或多个改变的四种大鼠神经胚活素突变体。这些突变体包含具有单一的N95K的突变蛋白和包含在大鼠神经胚活素氨基酸序列其它位点上的单一取代R14K；R68K和R39K的突变蛋白。在“X1N1X2”通式中，X1是指野生型神经胚活素多肽的氨基酸，N1是指序列中X1氨基酸根据SEQ ID NO1编号的编号位置。X2是指在该序列指定编号位置上取代了野生型氨基酸的氨基酸。
为构建大鼠N95K神经胚活素突变，在编码野生型大鼠神经胚活素的质粒pCMB020上进行定点诱变。野生型大鼠神经胚活素核酸和由其编码的多肽的氨基酸序列表示如下1ATGGAACTGG GACTTGGAGA GCCTACTGCA TTGTCCCACT GCCTCCGGCC51 TAGGTGGCAA CCAGCCTTGT GGCCAACCCT AGCTGCTCTA GCCCTGCTGA101 GCAGCGTCAC AGAAGCTTCC CTGGACCCAA TGTCCCGCAG CCCCGCCTCT151 CGCGATGTTC CCTCGCCGGT CCTGGCGCCC CCAACAGACT ACCTACCTGG201 GGGACACACC GCACATCTGT GCAGCGAAAG AGCCCTGCGA CCACCGCCGC251 AGTCTCCTCA GCCCGCACCC CCACCACCGG GTCCCGCGCT CCAGTCTCCT301 CCCGCTGCGC TCCGCGGGGC ACGCGCGGCG CGTGCAGGAA CCCGGAGCAG351 CCGCGCACGG GCTACAGATG CGCGCGGCTG CCGCCTGCGC TCACAGCTGG401 TGCCGGTGAG CGCTCTCGGC CTGGGCCACA GCTCCGACGA GCTGATACGT451 TTCCGCTTCT GCAGCGGTTC GTGCCGCCGA GCACGCTCCC CGCACGATCT501 CAGCCTGGCC AGCCTGCTGG GCGCCGGGGC CCTGCGGTCT CCTCCCGGGT551 CCCGGCCGAT CAGCCAGCCC TGTTGCCGGC CCACTCGCTA TGAGGCAGTC601 TCCTTCATGG ACGTGAACAG CACCTGGAGA ACCGTGGACC ATCTCTCCGC651 CACCGCCTGC GGCTGTCTGG GCTGA (SEQ ID NO5)1MELGLGEPTA LSHCLRPRWQ PALWPTLAAL ALLSSVTEAS LDPMSRSPAS51 RDVPSPVLAP PTDYLPGGHT AHLCSERALR PPPQSPQPAP PPPGPALQSP101 PAALRGARAA RAGTRSSRAR ATDARGCRLR SQLVPVSALG LGHSSDELIR151 FRFCSGSCRR ARSPHDLSLA SLLGAGALRS PPGSRPISQP CCRPTRYEAV201 SFMDVNSTWR TVDHLSATAC GCLG*(SEQ ID NO4)
用寡核苷酸KD2-310和KD3-211对pCMB020进行诱变得到质粒pCMB027KD2-3105′-GTATCTTTCATGGACGTAAAGTCTACATGGAGAACCGTAGATCATCTATCTGCAACC-3′(SEQ-ID-NO6)KD2-3115′-GGTTGCAGATAGATGATCTACGGTTCTCCATGTAGACTTTACGTCCATGAAAGATAC-3′(SEQ-ID-NO7)在pCMB027中，在位置95处编码天冬酰胺的密码子已经被编码赖氨酸的密码子所取代。
在pCMB020的神经胚活素编码序列中，将位置14处编码精氨酸的密码子用编码赖氨酸的密码子取代，得到R14K神经胚活素突变体。用寡核苷酸KD3-254和KD3-255对pCMB020进行定点诱变KD3-2545′-GCTGGAACTCGCAGCTCTCGTGCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCG-3′(SEQ-ID-NO8)KD2-2555′-CGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGCACGAGAGCTGCGAGTTCCAGC-3′(SEQ-ID-NO9)所得构建体命名为pCMB029。
pCMB020的神经胚活素编码序列中，将位置68处的编码精氨酸的密码子用编码赖氨酸的密码子取代，形成R68K神经胚活素突变体。用寡核苷酸KD3-258和KD3-259对pCMB020进行定点诱变KD3-2585′-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCGGGATCTAGACC-3′(SEQ-ID-NO10)KD3-2595′-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3′(SEQ-ID-NO11)所得构建体命名为pCMB030。
pCMB020的神经胚活素编码序列中，将位置68处的编码精氨酸的密码子用编码赖氨酸的密码子取代，形成R39K神经胚活素突变体。用寡核苷酸KD3-256和KD3-257对pCMB027进行定点诱变KD3-2565′-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3′(SEQ-ID-NO12)KD3-2575′-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3′(SEQ-ID-NO13)为表达和纯化，编码大鼠NBN N95K突变体的质粒在大肠杆菌中表达为带组氨酸标签的融合蛋白，该融合蛋白在紧靠近成熟的113位氨基酸的NBN序列的起始处有肠激酶裂解位点。将大肠杆菌培养在500L发酵液中并获取冷冻的细胞团(paste)。在Manton Gaulin Press中裂解这些大肠杆菌，并从不溶性的洗涤过的沉淀(pellet)级分中回收大鼠NBN NK。
从沉淀中用盐酸胍提取NBN，再进行重折叠，并用肠激酶除去组氨酸标签。所得产物在镍NTA琼脂糖(Qiagen)和Bakerbond WP CBX阳离子交换树酯上层析。
肠激酶处理带组氨酸标签的产物得到在成熟序列第7位精氨酸处蛋白质的异常裂解。所产生的des1-7NBN产物在KIRA ELISA中具备完全活性，且在结构上在其对胍诱导的变性方面不同于成熟形式，因此用来作后续的工作。
大鼠NBN N95K用分子量为10,000Da的羧甲基聚(乙二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)作为反应物以每分子平均3.3个PEG半分子的比例进行PEG化。对所得PEG化产物进行进一步定性，包括用SDS-PAGE分析，分子大小排阻层析(PEC)分析，反向HPLC分析，基质辅助的激光解吸/离子化质谱分析(MALD/IMS)，肽图分析，KIRAELISA法进行活性检测以及内毒素含量的检测。PEG化之前NBNN95K产物的纯度通过SDS-PAGE和SEC检测为高于95％。在非还原条件下NBN N95K产物以二聚体形式迁移，这与对其所预计的结构相一致。PEG化后，由一系列修饰的加合物(adduct)(其中5％的产物每分子2个PEG，60％的产物每分子3个PEG，30％的产物每分子4个PEG和少量的数个更高质量的形式)组成。在PEG化的样品中，没有聚集的证据。在产物中剩余的没有修饰的NBN的水平在数量限制以下。材料中内毒素的含量常规低于1EU/mg。PEG化的NBN的比活性用KIRAELISA测定是10nM。PEG化的产物以1.1mg/mL与PBS pH6.5制成制剂。在效力方面与野生型NBN类似的该材料可以作为-70℃储存的冷冻液体提供。
R14K，R39K和R68K突变体在大肠杆菌中表达并用如上对N95K-NBN所述的同样的方法纯化，PEG化和功能评估。
PEG化的NBN的制备在大肠杆菌中制备出230ml重折叠的大鼠NBN N95K(2.6mg/mL)并储存在4℃5mM的磷酸钠pH6.5中，用77ml水，14.4mL 1M HEPES pH7.5和2.8g(终浓度为10mg/ml)的PEG SPA 10.000Da(Shearwater Polymers，Inc.)稀释100mM NaCl。样品在室温避光温育4小时，然后用5mM的咪唑(终浓度)处理，过滤，并4℃储存过夜。分两批制备产物，一批包含130mL NBN N95K的体积，另一批包含100mL的体积。PEG化的NBN在Fractogel EMDSO3-(M)(EM Industries)上从反应混合物中纯化。柱层析在室温进行。制备的所有的缓冲液都无热原。将NaCl加入到反应混合物中至终浓度87mM，然后将样品加样至45mL的Fractogel柱上(5cm内径)。
用一个柱体积的5mM的磷酸钠pH6.5，80mM NaCl洗柱，然后用三个柱体积的包含50mM NaCl的5mM磷酸钠洗柱。将树酯转移到2.5cm直径的柱中并用10ml包含5mM磷酸钠pH6.5，400mM NaCl的液体洗脱6次，包含500mL NaCl的液体洗脱3次，包含600mM NaCl的液体洗脱6次。用280nm处的吸光度值来分析蛋白的含量，然后用SDS-PAGE分析修饰的程度。汇集所选择的级分，用0.2μm的滤膜过滤。将最终的物质分成等份并-70℃储存。
纯化的PEG化的NBN NK的UV谱对纯样本进行PEG化的NBN NK的UV谱(240-340nm)分析。该样本作平行三份的分析。在275-277nm处PEG化的样本显示最大的吸光度，在247-249nm处显示最小的吸光度。该结果与从未经修饰的NBN大体积的中间物所观察到的一致。使用消光系数∑2800.1％＝0.50从所述谱值来估测PEG化产物的蛋白浓度。PEG化的大分子的蛋白浓度是1.1mg/mL。因在320nm处没有吸收，证明该样品中不存在混浊(turbidity)。
用SDS-PAGE对PEG化的NBN NK进行定性将包含3，1.5，0.75和0.3μg产物的PEG化的NBN的等份样品在4-20％的梯度胶(Owl)上进行SDS-PAGE电泳。用考马氏亮蓝R-250对该胶染色。同时进行电泳的还有分子量标记物(GIBCO-BRL)。
在非还原条件下对PEG化的NBN NK进行的SDS-PAGE分析显示了对应于具有2，3，4和4个以上PEG/分子的修饰物的一系列条带。具有98kDa表观分子量的主条带包含3个PEG/分子。在纯化后的PEG化产物中没有检测到未经修饰的NBN。MALDI质谱分析证实存在连接有2，3和4个PEG的产物的混合物。包含2，3和4个PEG的产物的比例用密度计量法来测定，所测定的结果分别为占总量的7％，62％和30％。
用大小排阻层析对PEG化白NBN进行定性在分析性的Superose 6HR10/30 FPLC层析柱上，用5mM MES pH6.5，300mM NaCl作为流动相对PEG化的NBN进行大小排阻层析。流速是20mL/小时。洗脱的级分在280nm处监测吸光度。PEG化的NBN作为单一的峰洗脱，表观分子量为约200kDa，这与PEG的大流体动力学体积相一致。没有观察到聚集物的证据。表观分子量为约30kDa的游离NBN在制剂中没有检测到。
用反相HPLC分析PEG化的NBN在Vydac C4(5μm，1×250mm)层析柱上进行反相HPLC。用60mm的梯度从40％到60％B(缓冲液A0.1％TFA，缓冲液B75％乙腈/0.085％TFA)展开层析柱。在214nm处监测流出液的吸光度，并收集级分用于后续分析。在C4层析柱上用反相HPLC将PEG化的NBNNK分级分离成其不同的2个PEG化的组分(60.5mm)，3个PEG化的组分(63.3mm)和4个PEG化的组分(67.8mm)。所述峰的相对强度提示各组分的比例分别是5.4％，60.5％和30.1％。用MALDI-MS证实各峰的身份。没有证据证明在产物中有非PEG化的NBN NK(在5-15mm处洗脱)。
质谱分析PEG化的NBN在C4 Zip Tip上对PEG化的NBNNK脱盐，并在Voyager-DE STR(PerSeptive Biosystems)基质辅助激光解吸/离子化时间飞行(matrix-assistedlaser desorption/isoization time-of-flight)(MALDI-TOF)质谱仪上用介子酸作为基质进行质谱分析。将0.5μL纯化的蛋白和0.5μL基质在靶板上混合。对PEG化的NBN的质谱分析显示了三种加合物的单电荷和双电荷形式。所观察到的43803Da，54046Da和64438Da的质量与2，3和4个PEG/分子的修饰物相一致。
通过作肽图对PEG化的NBN进行分析通过对肽作图来测试PEG化反应的特异性。将PEG化的NBN分离成2分子，3分子和4分子PEG化的组分，然后将其还原，烷基化，并进一步在C4层析柱上通过HPLC分离成它们的单链组分。这些组分和作为对照的还原型和烷基化的未修饰的NBN NK用Asp-N蛋白酶消化，所得到的消化片段用反相HPLC在Vydac Cis(5μm，1×250mm)层析柱上用60mm梯度从0到60％B(缓冲液A0.1％TFA，缓冲液B75％乙腈/0.085％TFA)进行分级分离。在214mm处监测层析柱的流出液的吸光度。
大鼠NBN序列包含四个内部的半胱氨酸，因此当用内蛋白酶Asp-N消化时期望会产生单一的裂解图。来自对大鼠NBN NK的Asp-N消化的所有峰已用质谱法和/或Edman N末端测序鉴定，因此肽图可以用作简单的工具通过峰的存在与否探询修饰的位点。对各种峰的鉴定总结于以下的表3。
表3

(M)失去一个质子的(monolostopic)质量*由于MALDI时包含在肽中的蛋氨酸的氧化因为NBN是以同二聚体存在，所以大鼠NBN NK产物包含四个潜在的PEG化位点，其中两个来自每一条链的N末端氨基，另外两个是通过基因工程引入到构建体中的N95K位点。在PEG化的链的肽图中，仅包含具有NK突变的肽的峰经过PEG修饰而改变。因此，肽图的数据提示所述PEG半分子是与该肽特异性连接的，而不与任何所筛选的其他肽连接。第二个潜在的连接位点，即N末端是在肽上，其仅仅三个氨基酸长，在肽图上没有被检测出来。优选另外的PEG连接是发生在该位点。与此相吻合的是，没有被截短的大鼠NBN NK只占少量的百分比，且包含成熟的Ala-1序列。该肽在30μm处洗脱，且可见于来自非PEG化的消化物的肽图中，但不存在于PEG化的NBN NK消化物中。
实施例3用ELISA评估内部PEG化的神经胚活素在激酶受体活性(KIRA)方面的效力PEG化的大鼠NBN的效力用NBN依赖的活性/作为NBN受体的c-Ret的磷酸化活性利用ELISA检测，所述ELISA是特异性针对磷酸化的RET的存在的。NB41A3-mRL3细胞，一种表达Ret和GFRa3的粘附性的小鼠神经母细胞瘤细胞系，以2×105细胞/孔铺板于含补充有10％胎牛血清的达氏修正依氏培养基(Dulbecco′s modified eagle medium)(DMEM)的24孔板中，37℃和5％CO2条件下培养18小时。
用PBS洗涤细胞，然后对NBN在37℃和5％CO2条件下在0.25mLDMEM中进行连续稀释10分钟。对每一样品进行平行双份分析。用1mLPBS洗涤细胞，然后在4℃用0.30mL的10mM Tris HCl，pH8.0，0.5％NonidetP40，0.2％脱氧胆酸钠，50mM NaF，0.1mM Na3VO4，1mM苯甲基磺酰氟，轻轻摇动培养板裂解该细胞。反复用吸量管混匀裂解物，取0.25mL样品转移至在4℃已用含5μg/mL of抗-Ret mAb(AA.GE7.3)的50mM碳酸盐缓冲液pH9.6包被了18小时的96孔ELISA板中，在室温用封闭缓冲液(20mMTris HCl pH7.5，150mM NaCI，0.1％Tween-20(TBST)，其中含1％正常小鼠血清和3％牛血清白蛋白)封闭1小时。
室温下温育2小时后，用TBST洗涤各孔6次。磷酸化的Ret如下检测在室温下用含2g/mL的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗磷酸酪氨酸4G10抗体的封闭缓冲液温育2小时，用TBST洗涤6次，然后在450nm用比色检测试剂检测HRP的活性。检测用裂解物或用裂解缓冲液处理的各孔的吸光度值，并将背景校正信号作为活化混合物中存在的NBN浓度的函数做图。在KIRA ELISA中的PEG化NBN的效力是10nM，其与NBN NK起始物质的效力不同。两次冻融循环对效力没用影响，而且该处理后对样品的浑浊度没有明显增加，这提示样品在用于研究时融化是安全的。在对分别含三个和四个10kDa PEG/分子的产物的活性进行评估的独立研究中，确定了含3个PEG的加合物是具有完全活性的，而含有四个PEG的产物的活性有所降低。
实施例4内部PEG化的大鼠神经胚活素在大鼠和小鼠体内的药物动力学研究对各种PEG化的和非PEG化的NBN产物在大鼠和小鼠体内的药物动力学特征都进行了检测。
所得数据显示，大鼠NBN NK用3.3，10000Da PEG进行的PEG化能对神经胚活素的半衰期和生物利用率产生明显的影响。血管内给药SpragueDawley大鼠1mg/kg后，3000ng/mL的PEG化的NBN的峰水平在7分钟后检测出来，而700ng/mL的水平在24小时后检测出来，200ng/mL的在48小时后检测出来，100ng/mL的在72小时后检测出来。相反，在静脉内给药非PEG化的NBN 1mg/kg后7分钟检测到1500ng/mL的水平，但3小时后该水平迅速降至70ng/mL，7小时后降至不能检测到的水平。在皮下给药PEG化的NBN治疗的动物中PEG化所带来的效果更明显。
皮下给药1mg/kg 24小时后PEG化的NBN的循环水平达到200ng/mL的最大值，并且在三天研究期间都持续在该水平。相反，在给药未经修饰的NBN后的任何时间点都没观察到可检测的NBN。
对PEG化的NBN样品的分析由于存在每个分子包含2个，3个和4个PEG的加合物而变得复杂，这些加合物中每个加合物都呈现不同的PK图。在早期PK研究中，用小鼠来筛选各种侯选物和给药途径。从小鼠的研究发现，各种侯选物的生物利用率有显著差异。但当在大鼠中评价3.3 10K PEG加合物时发现，在大鼠中的生物利用率比在小鼠中的生物利用率低。在生物利用率方面的这种差异在腹膜内给药后尤其明显。在7小时后，在小鼠中的水平即达到1600ng/mL，且24小时后仍保持在400ng/mL。相反，大鼠的水平在4到48小时期间维持在100ng/mL。
在STZ糖尿病大鼠神经病模型中，野生型大鼠神经胚活素(wt-NBN)和在第95位有Asn变为Lys的取代的神经胚活素(NK-NBN)都进行重折叠并被纯化至95％以上以用于效力测试。Wt-NBN配制成制剂后直接进行动物测试，而NK-NBN需要用10kDa的PEG-SPA进行PEG化。为实现重折叠和纯化的目的，需建立利用大小排阻层析(SEC)的重折叠方法，该方法使来自大肠杆菌包涵体的NBN大量且高浓度复性。除SEC之外，NiNTA和CM硅石柱层析步骤用来增加最后的蛋白纯度。对蛋白进行深入定性，包括用如下方法进行分析SDS-PAGE，大小排阻层析，ESMS，用KIRA ELISA进行活性评估，以及检测内毒素的含量。对最终蛋白产物进行SDS-PAGE和SEC证明其纯度在95％以上。每种产物的内毒素水平小于0.2EU/mg。在KIRAELISA中两种蛋白的比活性都约为10nM。用磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)pH6.5将Wt-NBN配制成1.0mg/ml的浓度，NK-NBN配制成2.6mg/ml的浓度。将wt-NBN按每管15ml等分并-70℃冰冻保存。而NK-NBN要首先PEG化，然后再等分和冰冻。
实施例5野生型神经胚活素和N95K神经胚活素突变体的重折叠将两种形式的NBN作为带His标签的融合蛋白在大肠杆菌中表达。该蛋白在成熟的113位氨基酸序列的紧靠近起点的位置有肠激酶切割位点。用Gaulin press在2升PBS中裂解表达Wt-(1.8kg细菌团)或NK-NBN(2.5kg细菌团)的细菌。离心(10,000rpm)以沉淀包涵体，弃去每次制备过程中的上清液。用缓冲液(0.02M Tris-HCI pH8.5，0.5mM EDTA)洗涤包涵体沉淀两次，然后用包含Triton X-100(2％，v/v)的同一缓冲液洗涤两次，之后再用无洗涤剂的另外两种缓冲液洗涤。将两种沉淀用6M盐酸胍，0.1M Tris pH8.5，0.1M DTT和1mM EDTA溶解。为辅助溶解过程，将每一种沉淀用polytron匀浆机均化，然后室温过夜搅拌。通过离心澄清溶解的蛋白，再用Superdex200(用0.05M甘氨酸/H3PO4pH3.0和2M盐酸胍平衡过的5.5升层析柱)以每分钟20ml进行变性层析。
用SDS-PAGE鉴定变性的NBN。汇集包含Wt-NBN或NK-NBN的级分，用Amicon 2.5升搅拌型细胞浓缩仪浓缩至约250mL。过滤除去任何沉淀，浓缩后的蛋白用0.1M Tris-HCl pH7.8，0.5M盐酸胍，8.8mM还原型谷胱甘肽和0.22mM氧化型谷胱甘肽平衡过的Superdex 200进行依大小的复性层析。用0.5M盐酸胍以每分钟20mL展开层析柱。包含复性后的wt-NBN或NK-NBN的级分用SDS-PAGE鉴定，汇集，并4℃保存直至需要除去His标签时用Ni-NTA层析柱对NBN进行的浓缩(TR5919-138)在进行纯化以促进NBN单体之间形成二硫键之前4℃保存复性的NBN至少24小时。这期间，所形成的沉淀用0.2μPES滤膜过滤去除。为减少非特异性结合，在上样至用层析柱缓冲液(0.5M胍和20mM咪唑)以每分钟50ml平衡的100ml Ni-NTA(Qiagen)层析柱之前，将蛋白溶液与20mM咪唑接触。上样后，用同一缓冲液洗涤层析柱至基线。用包含0.5M盐酸胍和0.4M咪唑的洗脱缓冲液约300ml从树脂中将NBN洗脱出来。洗脱后，室温下用10体积的5mM HCI对NBN透析过夜(用10kDa的透析管)。透析可促进污染的物质水解，并将盐酸胍和咪唑的浓度分别降低到0.05M和0.04M。
Lysyl内肽酶或肠激酶对His标签的切割第二天，过滤除去透析过程中形成的任何沉淀物。加入5M的原液将蛋白样品配制成0.1M NaCI溶液，使最终的盐浓度(包括剩余的盐酸胍)约为150mM。这一浓度用传导仪来确定。另外，加入1M HERPES pH8至最终浓度为25mM。为切除标签，将lysyl内肽酶加入wt-NBN，肠激酶加入到NK-NBN中，它们的蛋白酶与NBN的比例都约为1∶300。由于在突变蛋白的Lys95处存在另外的蛋白酶切割位点，对于NK-NBN需用肠激酶代替lysyl内肽酶。室温下搅拌样品2小时并用SDS-PAGE监测消化情况。
用Ni-NTA除去His标签将蛋白酶处理后的NBN上样至用0.5M盐酸胍和20mM咪唑以每分钟50mL平衡过的100mL Ni-NTA层析柱上。用同样的缓冲液洗涤层析柱至基线。汇集从层析柱上洗下来的任何蛋白和包含无His标签的NBN蛋白的流出液(flowthrough)。
CM硅层析Ni-NTA层析后，用CM硅树脂直接对蛋白进行进一步的纯化。用上样缓冲液(5mM磷酸盐pH6.5，150mM NaCI)平衡20mL CM硅层析柱，然后以每分钟20mL上样NBN。用20个柱体积的洗涤缓冲液(5mM磷酸盐pH6.5，400mM NaCI)洗涤层析柱，用包含5mM磷酸盐pH6.5和1M NaCI洗脱缓冲液洗脱蛋白。所洗脱的蛋白只针对磷酸盐进行过夜透析，使盐浓渡对NK-NBN而言为100nM，对wt-NBN而言为150mM。两种样品通过0.2μPES滤膜过滤，用SDS-PAGE分析，并贮存在4℃直至进一步鉴定和/或PEG化。
对Wt-NBN和NK-NBN进行UV谱分析以评估它们在280纳米处的吸光度。用微量石英测试管和单独缓冲液的空白对照，利用Beckman分光光度计从230至330nm连续筛选wt-NBN或NK-NBN。在该分析的基础上测得的Wt-NBN的浓度为1.1mg/ml，NK-NBN的浓度为2.6mg/ml(A280nm-E 1％＝0.5用于每种蛋白)。基于330nm处的吸光度鉴定的沉淀物在1％以下。为评估两种蛋白制品的纯度，用16/30 Superdex 75层析柱对每一样品(0.5mg)进行大小排阻层析。层析柱用包含400mM NaCI的5mM磷酸盐pH6.5平衡，用每分钟1.5mL的流速展开。基于280nm处的吸光度，wt-和NK-NBN都迁移为具有预计分子量为(23-24kDa)单峰，且不包含任何明显的蛋白污染。
将wt-和NK-NBN在2.5M盐酸胍，60mM Tris pH.8.0和16mM DTT中还原。然后将还原后的样品通过短的C4柱脱盐，并用三相四极仪(triplequadrupole instrument)用ESMS在线分析。将ESMS的原始数据用MaxEnt程序进行重叠合(deconvolute)以产生质谱。该方法可是多个电荷信号重叠成直接对应于以千道尔顿(kDa)表示的分子量的一个峰。wt-NBN的重叠合质谱显示占绝对优势的物质的分子量是12046kDa，这与对113个氨基酸形式的蛋白所预测的分子量一致。还观察到一种极少的组分(12063kDa)，这提示氧化产物的存在。在NK-NBN样品中鉴定到三个峰。其中主要成分的表观分子量为11345kDa，与对106个氨基酸形式的蛋白所预测的分子量相一致。其他两个峰的质量为11362和12061kDa，这分别提示NK-NBN的氧化和113个氨基酸形式的存在。
在NK-NBN制品中存在106和113个氨基酸的形式归因于肠激酶的消化。这种来自Biozyme的蛋白酶是纯化自小牛肠粘膜的天然酶制品，并据报道其包含少量的胰蛋白酶污染(每微克肠激酶含0.25ng胰蛋白酶)。所以胰蛋白酶可能作用于NK-NBN的羧基末端Arg7处，产生大多数的106个氨基酸的形式。另一方面，用于切割Wt-NBN的Lysyl内肽酶具有单一蛋白酶活性，作用于包含在His标签内羧基末端赖氨酸残基，产生成熟的113个氨基酸的NBN形式。106和113氨基酸形式的NBN在所有试验检测中有同样的活性，且在盐酸胍稳定性检验中的表现相似。
NBN的活性由其刺激NB41A3-mRL3细胞中c-Ret磷酸化能力，通过实施例3所述的KIRA ELISA检测。Ret的磷酸化如下检测使俘获的受体与HRP偶联的磷酸化的酪氨酸抗体(4G10；0.2μg每孔)一起温育(2小时)。温育后，各孔用TBST洗涤6次，用比色计在450nm检测HRP的活性。检测裂解物或只有裂解缓冲液处理的各孔的吸光度值，进行背景校正后，将所得数据作为活性混合物中存在的神经胚活素浓度的函数做图。这些数据表明纯化的NBN可导致磷酸化的RET的出现，这表明纯化的NBN在该试验中是有活性的。
实施例6血清白蛋白神经胚活素偶联物的制备含野生型大鼠神经胚活素1mg/ml的PBS溶液用1mM硫-SMCC(Pierce)处理并脱盐以除去过多的交联剂。因为野生型NBN蛋白在N末端仅包含一个氨基，并没有巯基，所以预计与SMCC的反应会导致NBN的位点特异性的修饰，SMCC连接到NBN的N末端。
将60μg的NBN-SMCC偶联物与120μg的牛血清白蛋白共同温育并用SDS-PAGE分析交联的程度。BSA包含一个游离的巯基，因此预计与NBN-SMCC的反应会通过SMCC上的马来酰亚胺对该位点产生修饰。在这些条件下即可观察到具有较高分子量的另外的两条带，它们与用一个BSA半分子和用二个BSA分子修饰的NBN的分子量相一致，因为每个NBN分子都包含两个可以反应的N末端，从而产生上述情况。由于上述那些条带同时形成，所以NBN-SMCC和BSA条带的密度都下降了。根据剩余的NBN条带的密度推测反应已经完成了70-80％。
从反应混合物中纯化单个取代的产物如下进行基本按照以上PEG化研究中所讨论的方法，使物质经过阳离子交换层析和在Superdex 200层析柱(Pharmacia)上的大小排阻层析。用SDS-PAGE分析来自凝胶过滤的层析柱级分，在280nm处通过吸光度分析包含单个取代产物的那些级分中蛋白的含量。因为BSA的质量约为神经胚活素的两倍，所以表观浓度应被因数3相除才能等于NBN的量。用KIRA ELISA分析该级分的功能。野生型NBN和BSA-偶联的NBN的IC50值都是3-6nM，这表示与BSA偶联不损害功能。
用BSA进行这些最初的研究时发现，来自大鼠和人的相应的血清白蛋白也包含游离的SH。所以可以用类似的方法来制备大鼠血清白蛋白-大鼠NBN偶联物，用于进行大鼠和人血清白蛋白-人NBN的PK和效力研究，以进行临床试验。类似地，SMCC可用在一端包含氨基反应基团，另一端包含巯基反应基团的多种交联剂中的任何一种来替换。插入巯基反应性马来酰亚胺的氨基反应基团的实例是AMAS，BMPS，MBS，EMCS，SMPB，SMPH，KMUS或GMBS，插入巯基反应基团的是SBAP，SIA，SIAB以及为与巯基反应以产生可还原性连接而提供的保护性或非保护性巯基是SPDP，SMPT，SATA或SATP，所有这些都可以从Pierce得到。这些交联剂仅仅为了举例，可以预测还有许多连接NBN N末端与血清白蛋白的其他策略。本领域技术人员也可以制备不是靶向NBN N末端或血清白蛋白巯基半分子的血清白蛋白偶联物。当NBN与血清白蛋白在其N末端，C末端或两端融合时，预计用基因工程制备的这些NBN血清白蛋白融合体也是具有功能的。
序列表<110>比奥根公司(Biogen，Inc.)Sah.Dinah W.Y.
Pepinsky.Blake RBorjack-Sjodin，Paula AnnMiller.Stephan SRossomando，Anthony<120>神经胚活素的多聚体偶联物及其应用方法<130>00689-506-061<140>待定<141>2002-01-23<150>60/266,071<151>2001-02-01<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述共有序列<220>
<221>VARIANT<222>(3)<223>其中Xaa是Gly或Thr<220>
<221>VARIANT<222>(4)<223>其中Xaa是Pro或Arg<220>
<221>VARIANT<222>(5)<223>其中Xaa是Gly或Ser<220>
<221>VARIANT<222>(10)<223>其中Xaa是Ala或Thr<220>
<221>VARIANT<222>(11)<223>其中Xaa是Ala或Thr<220>
<221>VARIANT<222>(12)<223>其中Xaa是Gly或Asp<220>
<221>VARIANT
<222>(26)<223>其中Xaa是Arg或Ser<220>
<221>VARIANT<222>(33)<223>其中Xaa是Arg或Ser<220>
<221>VARIANT<222>(38)<223>其中Xaa是Val或Ile<220>
<221>VARIANT<222>(51)<223>其中Xaa是Val或Ile<220>
<221>VARIANT<222>(53)<223>其中Xaa是Pro或Gln<220>
<221>VARIANT<222>(69)<223>其中Xaa是Pro或Ser<220>
<221>VARIANT<222>(76)<223>其中Xaa是Val或Ile<220>
<221>VARIANT<222>(103)<223>其中Xaa是Arg或His<400>1A1a Gly Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Xaa Xaa Xaa Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Xaa Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Xaa Ser Asp Glu Leu Xaa Arg Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg35 40 45Ala Arg Ser Xaa His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly50 55 60Ala Leu Arg Xaa Pro Pro Gly Ser Arg Pro Xaa Ser Gln Pro Cys Arg65 70 75 80Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp85 90 95Arg Thr Val Asp Xaa Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105 110<210>2<211>113
<2l2>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala50 55 60Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys65 70 75 80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85 90 95Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu100 105 110Gly<210>3<211>113<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>3Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala50 55 60Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys65 70 75 80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85 90 95Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu100 105 110Gly<210>4<211>113<212>PRT
<213>褐家鼠(rattus norvegicus)<400>4Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala50 55 60Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys65 70 75 80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85 90 95Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu100 105 110Gly<210>5<211>675<212>DNA<213>褐家鼠(rattus norvegicus)<400>5atggaactgg gacttggaga gcctactgca ttgtcccact gcctccggcc taggtggcaa 60ccagccttgt ggccaaccct agctgctcta gccctgctga gcagcgtcac agaagcttcc 120ctggacccaa tgtcccgcag ccccgcctct cgcgatgttc cctcgccggt cctggcgccc 180ccaacagact acctacctgg gggacacacc gcacatctgt gcagcgaaag agccctgcga 240ccaccgccgc agtctcctca gcccgcaccc ccaccaccgg gtcccgcgct ccagtctcct 300cccgctgcgc tccgcggggc acgcgcggcg cgtgcaggaa cccggagcag ccgcgcacgg 360gctacagatg cgcgcggctg ccgcctgcgc tcacagctgg tgccggtgag cgctctcggc 420ctgggccaca gctccgacga gctgatacgt ttccgcttct gcagcggttc gtgccgccga 480gcacgctccc cgcacgatct cagcctggcc agcctgctgg gcgccggggc cctgcggtct 540cctcccgggt cccggccgat cagccagccc tgttgccggc ccactcgcta tgaggcagtc 600tccttcatgg acgtgaacag cacctggaga accgtggacc atctctccgc caccgcctgc 660ggctgtctgg gctga 675<210>6<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD2-310寡核苷酸<400>6gtatctttca tggacgtaaa gtctacatgg agaaccgtag atcatctatc tgcaacc57<210>7
<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-211寡核苷酸<400>7ggttgcagat agatgatcta cggttctcca tgtagacttt acgtccatga aagatac57<210>8<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-254寡核苷酸<400>8gctggaactc gcagctctcg tgctcgtgca acggatgcaa aaggctgtcg50<210>9<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD2-255寡核苷酸<400>9cgacagcctt ttgcatccgt tgcacgagca cgagagctgc gagttccagc50<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-258寡核苷酸<400>10ggagccggag cactaaaatc tccccgggat ctagacc 37<210>11<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-259寡核苷酸<400>11ggtctagatc ccgggggaga ttttagtgct ccggctcc 38
<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-256寡核苷酸<400>12gacgaattaa ttaagtttcg tttttgttca gg 32<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-257寡核苷酸<400>13cctgaacaaa aacgaaactt aattaattcg tc 3权利要求
1.一种神经胚活素多肽变体，其包含与SEQ ID NO1中的氨基酸8-113至少70％相同的氨基酸序列，条件是该神经胚活素多肽变体包括选自如下的一个或多个氨基酸取代在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置14处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置39处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置68处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置95处除了天冬酰胺以外的氨基酸，其中，所述氨基酸的位置是根据SEQ ID NO1的多肽序列编号的。
2.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体进一步包括SEQ ID NO1的氨基酸1-7。
3.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体二聚化时与GFRα3结合。
4.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体二聚化时刺激RET多肽的酪氨酸磷酸化。
5.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体二聚化时提高神经元的存活。
6.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体二聚化时提高感觉神经元的存活。
7.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体二聚化时使神经元的病理改变正常化。
8.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体二聚化时使感觉神经元的病理改变正常化。
9.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体二聚化时提高自主神经元的存活。
10.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体二聚化时提高多巴胺能神经元的存活。
11.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述变体多肽包括选自如下的二个或多个氨基酸取代在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置14处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置39处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置68处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置95处除了天冬酰胺以外的氨基酸。
12.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述变体多肽包括选自如下的三个或多个氨基酸取代在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置14处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置39处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置68处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置95处除了天冬酰胺以外的氨基酸。
13.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述变体多肽包括在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置14处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置39处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置68处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置95处除了天冬酰胺以外的氨基酸。
14.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中在所述神经胚活素多肽变体的位置95处的氨基酸不是天冬酰胺。
15.权利要求14的神经胚活素多肽变体，其中在所述神经胚活素多肽变体的位置95处的氨基酸是赖氨酸。
16.权利要求14的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体进一步包含选自如下的取代在位置14处除了精氨酸以外的氨基酸；在位置39处除了精氨酸以外的氨基酸，以及在位置68处除了精氨酸以外的氨基酸。
17.权利要求16的神经胚活素多肽变体，其中在位置14，39或68处的所述取代是赖氨酸。
18.权利要求14的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体进一步包含选自如下的二个取代在位置14处除了精氨酸以外的氨基酸；在位置39处除了精氨酸以外的氨基酸，以及在位置68处除了精氨酸以外的氨基酸。
19.权利要求18的神经胚活素多肽变体，其中所述二个取代是赖氨酸。
20.权利要求14的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体进一步包括如下的三个取代在位置14处除了精氨酸以外的氨基酸；在位置39处除了精氨酸以外的氨基酸，以及在位置68处除了精氨酸以外的氨基酸。
21.权利要求20的神经胚活素多肽变体，其中所述3个取代是赖氨酸。
22.权利要求15的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体的氨基酸8-94和96-113与SEQ ID NO1的氨基酸8-94和96-113至少90％相同。
23.权利要求15的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体的氨基酸8-94和96-113与SEQ ID NO1的氨基酸8-94和96-113至少95％相同。
24.权利要求22的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体的氨基酸序列包括所述神经胚活素多肽变体的氨基酸8-94和96-113的大鼠，人或小鼠天然神经胚活素多肽氨基酸序列。
25.权利要求23的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体的氨基酸8-94和96-113选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ IDNO4的氨基酸8-94和96-113的氨基酸序列。
26.权利要求15的神经胚活素多肽变体，其中所述多肽包括SEQ IDNO2的氨基酸8-113。
27.权利要求1的神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽变体是融合蛋白。
28.权利要求27的神经胚活素多肽变体，其中所述融合蛋白包括与所述神经胚活素多肽变体框内融合的人血清白蛋白序列。
29.一种融合蛋白，包含与人血清白蛋白可操作连接的神经胚活素多肽。
30.一种核酸分子，其编码权利要求1的神经胚活素多肽变体。
31.包含权利要求30的核酸的载体。
32.权利要求30的载体，其中所述载体是表达载体。
33.包含权利要求32的载体的细胞。
34.权利要求33的细胞，其中所述细胞选自哺乳动物细胞，真菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞以及细菌细胞。
35.权利要求34的细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
36.一种制备神经胚活素多肽变体的方法，该方法包括在允许神经胚活素多肽变体表达的条件下培养权利要求33的细胞。
37.权利要求36的方法，其进一步包括回收所述神经胚活素多肽变体。
38.由权利要求36的方法制备的神经胚活素多肽变体。
39.一种核酸分子，其编码权利要求28的神经胚活素多肽变体。
40.包含权利要求39的核酸的载体。
41.权利要求40的载体，其中所述载体是表达载体。
42.包含权利要求41的载体的细胞。
43.权利要求42的细胞，其中所述细胞选自哺乳动物细胞，真菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞以及细菌细胞。
44.权利要求43的细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
45.一种制备神经胚活素多肽变体的方法，包括在允许神经胚活素多肽变体表达的条件下培养权利要求42的细胞。
46.权利要求45的方法，其进一步包括回收所述神经胚活素多肽变体。
47.由权利要求46的方法制备的神经胚活素多肽变体。
48.包含权利要求1的神经胚活素多肽变体的多聚体多肽组合物。
49.权利要求48的多聚体多肽组合物，其中所述多聚体多肽组合物是二聚体。
50.权利要求49的多聚体多肽组合物，其中所述多聚体多肽组合物是同二聚体。
51.权利要求48的多聚体多肽组合物，其中所述多聚体多肽组合物是异二聚体。
52.一种组合物，包含与非天然聚合物偶联的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体。
53.依照权利要求52的组合物，其中所述非天然的多聚体通过使所述多肽的暴露于溶剂的氨基酸与该多肽偶联。
54.权利要求52的组合物，其中所述组合物包含神经胚活素多肽变体，该变体包含与SEQ ID NO1的氨基酸8-113至少70％相同的氨基酸序列，条件是该神经胚活素多肽变体包括选自如下的一个或多个氨基酸取代在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置14处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的氨基酸序列中的位置39处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置68处除了精氨酸以外的氨基酸，在所述变体多肽的位置95处除了天冬酰胺以外的氨基酸，其中，所述氨基酸的位置是根据SEQ ID NO1的多肽序列编号的。
55.权利要求52的组合物，其中所述多聚体包含聚亚烷基二醇半分子。
56.权利要求55的组合物，其中所述聚亚烷基二醇半分子是聚乙二醇(PEG)半分子。
57.权利要求55的组合物，其中所述聚亚烷基二醇半分子与所述神经胚活素多肽的氨基偶联，或与神经胚活素多肽变体的赖氨酸或其它氨基偶联。
58.权利要求57的组合物，其中所述聚亚烷基二醇半分子通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯偶联。
59.权利要求58的组合物，其中所述活性酯选自PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)，琥珀酰亚胺丁酸酯(SPB-PEG)或琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)。
60.权利要求57的组合物，其中所述聚亚烷基二醇半分子选自羧甲基-NHS，正亮氨酸-NHS，SC-PEG，tresylate，醛，环氧化物，羰基吲哚或PNP碳酸盐。
61.权利要求55的组合物，其中所述聚亚烷基二醇半分子与所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的半胱氨酸基团偶联。
62.权利要求61的组合物，其中所述聚亚烷基二醇半分子通过选自如下的基团偶联马来酰亚胺基团，乙烯基砜基团，卤代乙酸基团或巯基。
63.权利要求52的组合物，其中所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体是糖基化的。
64.权利要求63的组合物，其中所述多聚体与所述糖基化的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的糖半分子偶联。
65.权利要求64的组合物，其中所述多聚体在氧化所述糖基化的神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的腙(hydrazole)基团或氨基之后，与所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体偶联。
66.权利要求52的组合物，其中所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体包含一个，二个，三个或四个PEG半分子。
67.权利要求52的组合物，其中所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的血清半衰期比没有所述多聚体的所述多肽或多肽变体的半衰期长。
68.权利要求52的组合物，其中所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体二聚化时，具有选自如下的生理活性结合GFRα3，RET活化，使神经元的病理改变正常化以及促使神经元的存活。
69.权利要求68的组合物，其中所述多聚体在多肽的N末端与所述多肽偶联。
70.权利要求68的组合物，其中所述多聚体在多肽的非末端氨基酸部位与所述多肽偶联。
71.权利要求68的组合物，其中所述多聚体与神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体的暴露于溶剂的氨基酸偶联。
72.权利要求68的组合物，其中所述多聚体与所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体在选自如下的残基处偶联所述多肽变体的氨基末端，所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体氨基酸序列的位置14，所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体氨基酸序列的位置39，所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体氨基酸序列的位置68，所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体氨基酸序列的位置95。
73.一种药物组合物，包含分散于其中的生理可接受的载体和权利要求68的组合物。
74.一种稳定的，水溶性的偶联型神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体复合物，包含与聚亚烷基二醇半分子偶联的二聚体型神经胚活素多肽或二聚体型神经胚活素多肽变体，其中所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体通过不稳定的键与聚乙二醇半分子偶联。
75.权利要求74的复合物，其中所述不稳定的键可通过生化水解，蛋白水解或巯基裂解作用裂解。
76.权利要求75的复合物，其中所述不稳定的键在体内条件下是可裂解的。
77.一种制备修饰的神经胚活素多肽的方法，该多肽在二聚化时在体外或体内，相对于二聚化的野生型神经胚活素多肽，具有延长的活性，该方法包括提供神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体；以及将所述多肽或修饰的神经胚活素多肽变体与非天然的多聚体半分子偶联，从而形成偶联的多聚体神经胚活素多肽组合物。
78.一种治疗或预防受试者的神经系统疾病的方法，包括给药有此需要的受试者治疗有效量的包含权利要求1多肽的二聚体，权利要求52的包含所述神经胚活素多肽或神经胚活素多肽变体偶联物二聚体的组合物，权利要求69的药物组合物或权利要求74的复合物。
79.权利要求78的方法，其中所述神经疾病是外周神经的疾病。
80.权利要求78的方法，其中所述疾病是外周神经病。
81.权利要求78的方法，其中所述疾病是神经病的疼痛综合征。
82.权利要求78的方法，其中所述受试者是人。
83.权利要求78的方法，其中所述给药是全身给药。
84.权利要求78的方法，其中所述给药是局部给药。
全文摘要
本发明涉及神经胚活素多体变体，该变体适合形成包含与多聚体偶联的神经胚活素多体变体的偶联物，所述多聚体包含聚亚烷基二醇半分子。本发明所述偶联物具有延长的生物利用率，并且在优选实施方案中，其与未修饰的或野生型的神经胚活素相比，具有延长的生物活性。本发明的偶联物可用于治疗目的，也可用于非治疗目的，例如用于诊断。
文档编号A61P29/02GK1500095SQ02807753
公开日2004年5月26日 申请日期2002年1月25日 优先权日2001年2月1日
发明者黛娜·W·Y·萨, 黛娜 W Y 萨, R·布莱克·佩平斯基, 晨恕づ迤剿够, A 博杰克-斯乔丁, 葆拉·A·博杰克-斯乔丁, S 米勒, 斯蒂芬·S·米勒, 罗索曼多, 安东尼·罗索曼多 申请人:比奥根公司