冰片与叶酸共修饰的阿霉素聚酰胺-胺纳米递药系统的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明基于聚酰胺-胺（poly(amidoamine)，PAMAM)树形大分子，通过化学合成 叶酸（Folicacid，FA)介导的、冰片（Borneol，B0)修饰的新型纳米载体（FA-BO-PAMAM)， 并包载抗癌药物（Doxorubicin，D0X)，制备冰片与叶酸共修饰的阿霉素聚酰胺-胺纳米递 药系统。
【背景技术】
[0002] 脑胶质瘤是颅内常见的发生于神经外胚层的恶性肿瘤，近年来发病率提升，每1 万人中有5-10个人，占原发性中枢神经系统肿瘤的40%。目前临床上脑胶质瘤治疗以手术 为主，并结合放疗、化疗等措施综合治疗。然而手术因颅内禁区多难以彻底清除病灶，加之 肿瘤浸润性生长，极易复发；放疗因剂量难以控制，易引起不可逆的颅内损伤及诱发继发性 恶性肿瘤，使得药物治疗日益显得重要。然而，由于血脑屏障的存在，临床上大多数的药物 难以透过入脑。为此研宄者尝试了多种脑靶向策略以增加药物的入脑递送，达到治疗脑部 疾病的作用。另外，脑组织是人体的中枢，药物入脑之后若到达非脑胶质瘤部位，药物浓度 降低的同时还可能产生更严重的中枢系统副作用，因此，开发一种特定的载体既能跨越BBB 又能靶向至肿瘤部位是非常必要的。
[0003] 聚酰胺-胺（PAMAM)是一类合成的、单分散的纳米级大分子化合物，具有高度枝 化，结构可控，单分散性等特点。作为药物载体，PAMAM具有以下几个优点：（1)表面有大量 的官能团可以连接药物分子，靶向分子或者成像剂。（2)内部具有较大的空腔可以包埋药物 分子。（3) PAMAM的粒径较小，是一种纳米材料，近年来纳米材料在肿瘤领域的应用比较广 泛。然而，高代数的PAMAM末端具有大量的氨基，在生理pH下氨基易质子化，有一定的细胞 毒性。采用PEG修饰PAMAM是一种非常常见的方法来减轻细胞毒性。另外，用脂肪酸修饰 PAMAM也可以降低毒性，有报道曾用月桂酰来修饰PAMAM。但是没有报道显示以上修饰在降 低毒性的同时具有促血脑屏障开放的作用，另外这些修饰虽然降低了细胞毒性，但是也减 弱了细胞对药物的摄取能力。
[0004] 冰片是一种传统的中药。中医理论中冰片具有"引药上行"的作用，另外现代研宄 表明冰片与药物共用或者冰片与纳米粒共用具有促进药物入脑递送的作用。这为本项目选 择冰片共价偶联到PAMAM表面达到促血脑屏障开放的作用提供了可能性。叶酸是一种广泛 应用于肿瘤靶向的水溶性维生素，叶酸受体高表达于肿瘤组织，在正常组织中的表达相对 较少，关于叶酸作为肿瘤靶向配体的研宄已十分广泛。从而我们构建了以冰片作为促血脑 屏障开放的功能基，叶酸作为肿瘤靶向分子的新型药物载体FA-BO-PAMAM。大量冰片修饰 PAMAM载体在减轻载体本身表面的氨基浓度降低其细胞毒性的基础上具有促血脑屏障开放 增加脑内皮细胞摄取的作用，同时叶酸的修饰增加了肿瘤细胞的摄取能力，从而达到减轻 药物载体毒性、促血脑屏障开放和靶向至脑胶质瘤的三重作用，构建了 PAMAM作为脑胶质 瘤靶向的新思路。
[0005] 阿霉素是一种蒽环类抗生素，抗肿瘤谱广，在临床上被广泛地应用于乳腺癌、肺 癌、膀胱癌等各种癌症的治疗。但是由于阿霉素对心脏、肾等脏器的毒副作用限制了其进一 步的临床应用，因此研宄者将阿霉素作为模型药物用于考察制剂或给药系统的效果。有研 宄表明，阿霉素能够诱导脑胶质瘤的凋亡，但是由于血脑屏障的存在，阿霉素难以透过入脑 且体内消除快，经全身给药后在肿瘤部位的蓄积量难以达到治疗量，所以对于治疗脑胶质 瘤效果不理想。若能使阿霉素在肿瘤部位的蓄积量达到治疗量，对临床脑胶质瘤治疗具有 一定的前景。因此我们选择阿霉素作为模型药物，制备了冰片和叶酸共修饰的阿霉素聚酰 胺-胺纳米递药系统（FA-BO-PAMAM/DOX)。目前尚没有使用冰片和叶酸共修饰的阿霉素聚 酰胺-胺用于脑部疾病治疗的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种基于聚酰胺-胺树形大分子（PAMAM)，通过化学合成 叶酸（FA)介导的、冰片（BO)修饰的新型纳米载体并包载抗癌药物阿霉素（DOX)的制备方 法，初步研宄此递药系统的血脑屏障开放能力和对脑胶质瘤的治疗作用。
[0007] 为了实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008] 冰片与叶酸共修饰的阿霉素聚酰胺_胺纳米载药系统的合成方法，主要包括以下 步骤：
[0009] (1)冰片丁二酸酐活性酯（BO-SA-NHS)的合成：称取丁二酸酐（Succinic anhydride) 2. 0g溶于50mL无水二氯甲烧中，加入等摩尔的DMAP和三乙胺，另外称取500mg 冰片（Borneol)溶于无水二氯甲烷后，逐滴加入到上述溶液中，室温下油浴反应2天；取反 应所得的产物30mg溶于DMF中，5倍当量的EDC和NHS溶于PBS加入到上述反应液中，室温 下活化反应2h ;反应结束后，通过正己烷多次萃取获得活性酯产物；
[0010] (2) B0-PAMAM的合成：称取10mg PAMAM G5溶液溶于2mL超纯水中，逐滴加入到步 骤（1)合成的活性酯的DMF溶液中，室温过夜反应；反应结束后，将反应液转移到透析袋中， 用超纯水透析24h，将透析完的溶液冻干得到白色固体产物；
[0011] (3) FA-BO-PAMAM的合成：称取叶酸2mg溶于4mL DMF和DMS0的混合溶液中，DMF 和DMS0的体积比为3:1，加入5倍当量的EDC，室温下活化反应3h ;将活化的反应液逐滴加 入到PAMAM的水溶液中，反应24h ;反应结束后，用水透析12h，将透析液冻干得到黄色的固 体产物；
[0012] (4)阿霉素聚酰胺-胺纳米载药系统的制备：准确称取盐酸阿霉素lmg，溶解于2mL DMS0和3倍当量的三乙胺的混合溶剂中，室温搅拌过夜，使盐酸阿霉素脱盐酸成疏水性药 物阿霉素；将上述经预处理的阿霉素混合溶液逐滴加入到含l〇mg步骤3所得FA-BO-PAMAM 的lmL DMS0溶液中，避光反应24h ;反应结束后，向反应液中加入10mL超纯水，再用乙酸乙 酯多次萃取除去游离的阿霉素，冷冻干燥后得到深红色的冻干品。
[0013] 通过1H-NMR验证载体（FA-BO-PAMAM)的合成以及确定连接到PAMAM表面的冰片和 叶酸分子的数目分别为40和5。经透射电镜（transmission electron microscope, TEM) 和纳米粒度-电位分析仪分别对药物载体的形貌、粒径和表面电势的测量，药物载体呈类 球形，大小分布均匀，B0-PAMAM的粒径为（14. 61±4. 14)nm，Zeta电位为（11. 47±0. 46)mV， FA-BO-PAMAM 的粒径为（22. 28±0. 42)nm，Zeta 电位为（7. 6±0. 89)mV。经紫外分光光度 计测定载体复合物的载药量为（6. 64 ±0.09)%，包封率为（64. 58 ±0.85) %。透析法考察 FA-BO-PAMAM/DOX复合物在磷酸缓冲盐（pH 7. 4和pH 5. 5)中的体外释药行为显示其体外 释放相比于原药具有明显的缓释作用且具有一定的pH敏感性。
[0014] 本发明的有益效果体现在：本发明采用冰片和叶酸共修饰的PAMAM载体包载抗肿 瘤药物盐酸阿霉素，制备递药系统（FA-BO-PAMAM/DOX)，可以有效地降低PAMAM表面的毒 性，可以有效的促进D0X跨过BBB模型而提高对脑胶质瘤的抑制作用，对C6脑胶质