专利名称：赤霉素的制备及糖尿病用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及被称为赤霉素的一组化合物及其衍生物用于制备用于治疗糖尿病及相关病症的药物组合物的用途，及通过将赤霉素和/或其药物可接受的盐或酯给药以治疗这些和其它病症的方法，其药物可接受的酯包括糖苷酯、活化酯或内酯。此外，本发明涉及用于治疗糖尿病及其相关病症的药物的制备和用途。此外，赤霉素及其衍生物的应用，特别是当通过口服、注射、经皮贴片或吸入给药时，可用作胰岛素、和/或其片段衍生物、和/或IGFs(类胰岛素生长因子)治疗的替代物，或用来与胰岛素、其片段衍生物、IGF、生长因子或其它药物可相容的抗糖尿病药剂一起作为治疗糖尿病及相关病症的组合治疗的选择。
背景技术：
本发明涉及赤霉素在兽医学及人类医学上的新应用。本发明特别涉及含有赤霉素的药物制剂及其用于治疗包括1型糖尿病和2型糖尿病在内的糖尿病、其并发症及相关病症的用途，其并发症及相关病症包括肥胖症、微血管和大血管疾病、肾病、神经病、眼疾、糖尿病性溃疡等。
赤霉素是一系列天然化合物，其被称为植物生长调节剂并广泛地应用于植物领域[1]。它们也可从某些微生物如赤霉菌(Gibberella fujikuroi)的代谢物中分离得到[2]。赤霉素特别是赤霉酸(赤霉素A3)及其与赤霉素A4和/或赤霉素A7的混合物商业上可得到，并已被广泛地用于农业中用来加快某些水果(草莓和葡萄)及蔬菜(番茄、卷心菜及花椰菜)的生长，并也在大麦麦芽形成中作为食物添加剂[3]。.J.MacMillian，et al.“Isolation and Structure of Gibberellin FromHigher Plants”.Adv.Chem.Ser 28，18～24，(1961)..
(a)P.J.Curtis et al.Chem.&Ind.(London)1066，(1954).
(b)B.E.Cross，J.Chem.Soc.4670，(1954).
(c)P.W.Brian et al，U.S.2,842,051.
(d)C.T.Calam et al，U.S.2,950,288.
(e)A.J.Birch et al，U.S.2,977,285..
(a)M.Devlin，Plant Physiology，New York，Reinhold，(1966).
(b)P.W.Brian et al，Plant Physiol，5，669(1955).
(c)A.K Mehta et al，J.Hostic Sci 4，167(1975).
(d)R.J.Weavor，Adv.Chem.Ser 28，89(1961).
(e)F.G.Gustafson，Plant Physical 35，521(1960).
(f)Fed.Reg.25，2162(1960).
赤霉素A3及其与赤霉素A4和/或A7的混合物可通过微生物如赤霉菌的发酵得到。可分离并纯化粗制的化合物以提供高纯度的结晶产品。通过文献记载的半合成方案或全合成方案可得到赤霉素的其它衍生物[4]。.
(a)The Merck Index，12，4426，literatures cited herein.
(b)Furber M.，et al.，“New Synthesis Pathways From Gibberellins toAutheridiogens Isolated From the Fern Genus Anemia”，J.of Org.Chem.vol55，No.15，4860～4870(1990).
(c)Mander L.N.，et al.，“C-18 hydroxylation of Gibberellins”，J.C.S.，Perkin Trans.1(17)，2893～2894(2000).
(d)Pour M.et al.，“Synthesis of 3，12-Dihydroxy-9，15-CycloGibberellins”，Tetrahedron 54(45)，13833～13850(1998).
(e)Liu J.P.et al.，“A General Protocol For the Hydroxylation of C-14in Gibberellins Synthesis of 14-Beta-Hydroxy-Gibberellin A1Methyl Ester”，Tetrahedron 54(38)，11637～11650(1998).
(f)Pour M，et al.，“Synthetic and Structural Studies on NovelGibberellins”，Pure and Applied Chemistry 70(2)，351～354(1998)；“Synthesis of 12-Hydroxy-9，15-Cyclo-Gibberellins”，Tetrahedron Letters，39(14)，1991～1994(1998)；Australian J.of Chemistry 50(4)，289～299(1997).
(g)King G.R.et al.，“A New and Efficient Strategy for the TotalSynthesis of Polycyclic Diterpenoids-The Preparation of Gibberellins(+/-)-GA103and(+/)-GA73”，J.Am.Chem.Soc.119(16)，3828～3829(1997).
(h)Mander L.N.，“Synthesis of 12-Hydroxy-C-20-Giebberellin fromGibberellin A3”，T etrahedron 53(6)，2137～2162(1997)and literatures citedherein.
此外，从不同植物、苗、果实和种子中萃取和分离不同的赤霉素也已被大量公布[5]。.
(a)Pearce D.W.，et al.，Phytochemistry，59(6)，679～687(2002).
(b)Chang S.T.，et al.，Physilogia Plantarum，112(3)，429～432(2001).
(c)Nakayama M.et al.，Phytochemistry，57(5)，749～758(2001)；48(4)，587～593(1998).
(d)Blake P.S.，et al.，Phytochemistry，55(8)，887～890(2000)；53(4)，519～528(2000).
(e)Koshioka M.，et al.，J.of the Japanese Society for HorticulturalScience，68(6)，1158～1160(1999)；67(6)，866-871(1998).
(f)Mander L.N.et al.，Phytochemistry，49(8)，2195～2206(1998)；49(6)，1509～1515(1998).
(g)Wynne G.et al.，Phytochemistry，49(7)，1837～1840(1998).
以前赤霉素已被用于抗炎症、治疗前列腺炎及牛皮癣、治疗肿瘤、用于溃疡和伤口愈合[6]..
(a)U.S.4424232 1/1984 Parkinson(b)French 2597339 10/1987(c)U.S.5487899 1/1996 Davis(d)U.S.5580857 12/1996 Oden(e)AUS.695054 11/1998 Wu(f)U.S.6121317 9/2000 Wu现在我们已经发现赤霉素或其衍生物用于治疗包括1型糖尿病和2型糖尿病在内的糖尿病及其相关病症的应用。
发明揭露现在在我们的实验室中已经发现赤霉素具有类哺乳动物生长因子(如IGF、EGF)的性质。
实验结果(实施例3和实施例4)表明由植物和微生物制得的赤霉素可作为与一系列生长因子受体结合的广谱结合剂。它们不同于在动物中发现的生长因子，动物中的每个生长因子对特定的受体具有较高亲合力。这是进化的结果。与更复杂的生命形式如动物相比，植物和微生物的生物系统可产生作用于更广泛(较低特异性)基部的生物物质。
由于赤霉素是比生长因子更小的分子，所以赤霉素与生长因子的结合也许更弱。在较低生长因子水平下，赤霉素与空的生长因子受体结合以刺激细胞生长和其它功能。在这种条件下赤霉素发挥生长因子的功能。在正常生长因子水平下，由于生长因子对受体部位较高的亲合力，所以生长因子与其受体结合更容易。生长因子的大物理体积没有为赤霉素可结合的受体部位留下空间或者空间非常小。这导致当具有足够结合力的生长因子以足够量存在时赤霉素是无效的。由于过量赤霉素的存在不干扰生长因子的正常功能，所以这种机理对于赤霉素充当包括IGF在内的生长因子的替代物或激活剂提供了非常好的前景。
糖尿病是一种表现为高血糖症及变化的脂质和蛋白质代谢的慢性疾病。根据美国糖尿病协会称在美国有超过13,000,000的人患有糖尿病，而且每年又出现约650,000的新病例。胰岛素和磺酰尿的引入是糖尿病治疗的重要里程碑。类胰岛素生长因子-1(IGF-1)是与胰岛素结构同源的分子，其有本身的特定受体1型IGF受体，通过1型IGF受体IGF-1可引起多种与胰岛素相似的代谢效果。对于起类胰岛素分子功能的人类生长因子活性区域的发现已导致新的抗糖尿病肽药剂的发展。此外，生长因子是可调节细胞复制、分化和代谢平衡的多肽。它们可提高神经细胞的生长和/或存活。在治疗各种包括糖尿病性神经病在内的各种神经系统疾病的预临床实验中，IGF-2可提高神经再生的速率。此外，升高的c-AMP细胞内浓度可加强从胰腺β细胞来的葡萄糖相关的胰岛素分泌物。已经发现赤霉素可提高腺苷酸环化酶和gryanylate环化酶的活性，从而通过赤霉素的给药可提高c-AMP和c-GMP的细胞内浓度，然后加强从胰腺β细胞来的葡萄糖相关的胰岛素分泌物。由此可看出赤霉素有治疗糖尿病的应用。
动物实验结果(实施例5和实施例6)表明用5mg/kg的赤霉素A3或A3与A4或A7的混合物治疗的大鼠其血清葡萄糖水平和体重返回到正常水平。这表明赤霉素对于治疗糖尿病是有效的。
赤霉素A3对哺乳动物的毒性极低。据报道急性口服LD50对大鼠和小鼠而言分别是6.3g/kg[7a]和＞15g/kg[7b]，在喂养90天的实验中，对于大鼠和狗不起作用的水平是＞1g/kg/天[7b]，并且对于皮肤和眼睛没有刺激[7b]，没有发现其致癌作用[7c]。分类WHO毒性分类表5(WHO ToxicityClass Table 5)(最低危险类产品，在正常使用中不可能存在急性危险)；EPA毒性分类(EPA Toxcity class)III(次低危险品类别)。.
(a)NTP Chemical Repository，http//ntpserver.niehs.nih.gov/htdocs/CHEM_H&S/NTP_CHEM7/Radian77-06-5.html(b)The Agrochemicals Handbook，Royal Society of Chemistry，August1991.
(c)Gold L.S.，Slone T.H.，Ames B.N.(2001)，Pesticide Residues inFood and Cancer RiskA Critical Analysis，Publications from theCarcinogenic Potency Project，in Handbook of Pesticide Toxicity，SecondEdition，(R.Krieger，ed.)，Academic Press.
由此本发明一个方面涉及式(1)化合物(赤霉素)或其衍生物用于治疗糖尿病、其并发症及相关病症的用途，其并发症及相关病症包括肥胖症、微血管和大血管疾病、肾病、神经病、眼疾、糖尿病性溃疡等。本发明的另一方面，提供用于治疗糖尿病及相关病症的药物制剂，其并发症及相关病症包括肥胖症、微血管和大血管疾病、肾病、神经病、眼疾、糖尿病性溃疡等，所述的药物制剂包括赤霉素和/或其药物可接受的盐或酯。
赤霉素具有下面的通式 式(1)其中R1是H，或者是基团-O-R20，其中R20是H、糖酸苷醚基(glycosylic ethergroup)(糖苷醚)、C1～6烷基，或者R1和R2或R10形成键(分别是C1-C2或C1-C10双键)；R2是H，或者是基团-O-R21，其中R21是H、糖酸苷醚基(糖苷醚)、或者和R4形成键(内酯)，或者R2和R1或R3形成键(分别是C1-C2或C2-C3双键)；R3是H、＝O、或者是基团-O-R22，其中R22是H或糖酸苷醚基(糖苷醚)，或者R3和R2形成键(C2-C3双键)；R4是OH，或者是-OR23，其中R23是未取代或取代的C1～20烷基、烯丙基、芳基、芳烷基、脒、-NR24R25、或含有一个或多个选自氮、氧及硫的杂原子的不饱和或饱和环；R24和R25可以相同也可以不同，可以是氢、C1～20烷基、烯丙基、芳基、芳烷基、或含有一个或多个选自氮、氧及硫的杂原子的不饱和或饱和环；或者R4和R21或R28形成键(内酯)；R5是H，或者是糖酸苷酯(糖苷酯)基，或者是未取代或取代的(例如卤代)C1～20烷基酯、烯丙基酯、芳基酯、芳烷基酯、活性酯(如苯乙酮酯、新戊酯)；R6是H，或者是OH，或者和R7形成键(C11-C12双键)；R7是H、＝O、或者是-OR26，其中R26是H或者是糖酸苷醚基(糖苷醚)，或者R7和R6形成键(C11-C12双键)；R8是H、羟基、巯基、或者是卤素(例如F、Cl)、氨基、叠氮基、NR24R25、未取代或取代的(例如卤代)C1～20烷基、烯丙基、芳基、芳烷基、或OR27，其中R27是糖酸苷醚基(糖苷醚)；R9是H，或者是OH，或者和R15形成键(C9-C15键)；R10是H、CH3、CHO、COOH、所述COOH的糖酸苷酯(糖苷酯)、CH2O-R28或-OR28，其中R28是H或者和R4形成键(内酯)，或者R10和R1形成键(C1-C10双键)；R11是H，或者是OH，或者不存在；R12是CH3、CH2OH、COOH或所述COOH的糖酸苷酯(糖苷酯)；R13是亚甲基、二价杂原子或者是NR29，其中R29是NHR30或OR30，其中R30是H、C1～20烷基、芳基或烷芳基；且当R11不存在时在C16和R13之间存在双键；或者R13是H、OH、CH3、CHO、CH2X，其中X是卤素(例如F、Cl)；当R11是H或者是OH时为CHNR29，其中R29是NHR30或OR30，其中R30是H、C1～20烷基、芳基或烷芳基；条件是如果R11是OH，R13不是OH；R14是H或者是OH；R15是H，或者和R9形成键(C9-C15键)；包括内酯、酯及盐在内的式(1)化合物的药物可接受衍生物包括其碱金属盐(例如Na+、K+)、碱土金属盐(例如Ca2+、Mg2+)、金属盐(例如Zn2+、Al3+)、铵盐、有机碱(如利度卡因盐酸盐(lidocaine)、或NR16R17R18R19，其中R16、R17、R18、R19是氢、C1～20烷基、烷醇、芳基，并且可以相同也可以不同)。
点线和实线表明双键可以位于通过点线和实线连接的三个碳原子的两个之间，条件是如果R11是OH，双键不存在。
由于式(1)遵守标准的价键规则，从而导致如下进一步的条件如果R10和R1和/或R2和R3形成键，那么R1和R2不能形成键；如果R10和R23形成键，那么R10和R1不能形成键；如果R4和R21形成键，那么R2和R1或R2和R3不能形成键。
在赤霉素A3的情况下，R1和R2形成键(C1-C2双键)；R3是β-OH，R4和R28形成键(内酯)；R5、R6、R7和R9是氢，R8是OH，R11不存在；R12是甲基；R13是亚甲基，在C16和R13间存在双键；R14和R15是氢。
最容易获得的赤霉素是从赤霉菌发酵得到的赤霉素A3及其与赤霉素A4和/或赤霉素A7的混合物。尽管包括溶剂萃取和色谱在内的赤霉素分离和纯化方法在提到的发明背景中已有公布，但是仍然需要简单有效的分离和纯化方法。在本发明中提供了用于大规模生产赤霉素A3的实用方法，包括如下步骤在发酵培养基中培养可产生赤霉素的菌株直到赤霉素的浓度到约3000μg/ml培养基，然后(a)将发酵培养基的pH调节至pH为6.5～7.0并过滤以得到微生物菌丝体的滤饼和滤出液；(b)用水洗滤饼并合并洗液和滤出液以形成水溶液；(c)浓缩该水溶液；(d)在5～10℃的温度下混合该水溶液和有机溶剂并将混合物的pH调节至小于2.0；(e)使混合物分离成水相和第一有机相，并除掉第一有机相；(f)用有机溶剂再次萃取来自步骤(f)的水相以得到第二有机相；(g)合并第一有机相和第二有机相并浓缩以形成浓缩的有机溶液；(h)在60-70℃下加热浓缩的有机溶液3～4小时，同时搅拌，直到固体物质的沉淀终止；(i)将浓缩的有机溶液冷却至室温并过滤以得到沉淀物；(j)用冷的有机溶剂洗涤沉淀物并干燥以得到灰白色的固体，其含有约80％的赤霉素A3、约4％的赤霉素A4和约4％的赤霉素A7。
可选择地，本发明还包括如下步骤
(k)在32.6％的甲醇、2.2％的水和65.2％的丙酮混合液中溶解灰白色固体以得到赤霉素溶液；(l)用有机溶剂和水为10∶1的混合液稀释赤霉素溶液；(m)过滤稀释的赤霉素溶液并真空蒸发浓缩滤出液；(n)在60-80℃下加热浓缩物2～3小时，同时搅拌，冷却至室温并过滤以得到固态结晶沉淀物；用冷乙酸乙酯洗涤沉淀物并干燥以得到纯度＞95％的赤霉素结晶。
此外，公开了制备赤霉素盐和酯的方法。本发明特别包括得到赤霉素钠盐的方法，包括如下步骤(a)在甲醇中溶解赤霉素A3；(b)将赤霉素溶液加到等摩尔的NaHCO3水溶液中；(c)将混合溶液蒸发至干以得到固体残渣；(d)在水中溶解该残渣并冷冻干燥以得到赤霉素A3钠盐。
本发明还包括得到赤霉素锌盐的方法，还包括如下步骤在水中溶解赤霉素A3的钠盐，使该溶液通过装有锌离子交换树脂的柱子，用水洗涤柱子，收集并合并流出液和洗液并除掉水以得到赤霉素A3锌盐。
本发明还包括得到赤霉素乙酯的方法，包括如下步骤(a)在50∶1比例的丙酮和水混合液中溶解赤霉素A3；(b)混合赤霉素A3溶液和等摩尔的三乙胺、氯甲酸乙酯及十分之一摩尔量的N-甲基吗啉，并在-15℃下搅拌20分钟；(c)用无水乙醇稀释得到的混合物并在室温下搅拌；(d)将稀释的混合物蒸发至干，并在6∶1比例的乙酸乙酯和水中分配残渣；(e)分离乙酸乙酯层，用2％HCl洗，然后用水洗，然后用5％NaHCO3洗，然后用水，并减压蒸发至干以得到赤霉素A3乙酯。
下文中提及的式(1)化合物包括式(1)化合物及其药物可接受的衍生物，包括其盐、酯及内酯。
通过将式(1)化合物与一种或多种其它的活性成分混合也可形成用于治疗糖尿病及相关病症的式(1)化合物的药物可接受组合物，例如与胰岛素、类胰岛素多肽、胰岛素片段衍生物、IGFs、IGF片段、生长因子或其它药物可相容的抗糖尿病药剂混合。
式(1)化合物具有与用于治疗糖尿病、其并发症及相关病症的胰岛素及类胰岛素激动剂和/或激活剂一样的活性，其并发症及相关病症包括肥胖症、微血管和大血管疾病、肾病、神经病、眼疾、糖尿病性溃疡等。由此在本发明另一方面式(1)化合物用作治疗糖尿病及相关病症的活性治疗药剂。
在本发明另一方面提供一种制备药物组合物的方法，包括将式(1)化合物和/或其衍生物与药物可接受的载体混合。
在本发明另一方面提供一种治疗包括人类在内的动物中的糖尿病及相关病症的方法，包括将有效量的式(1)化合物给药。
在本发明另一方面也提供式(1)化合物用于制备用于治疗糖尿病及相关病症的药物组合物的用途。
在糖尿病及相关病症的治疗中所需要的式(1)化合物的量随着给药的速率、受治疗疾病的性质及包括人类患者在内的动物的年龄和条件而变化，并且最终取决于兽医或医生的判断。
一般而言，适合的剂量为约0.1□g～100mg/kg体重/天，优选为50□g～20mg/kg/天。
优选在糖尿病发生之后或发生时开始治疗并在需要时持续治疗。也可能使用式(1)化合物作预防治疗。
适合的治疗是每天1～4次，并在需要时持续治疗。可选择地，在使用定时释放制剂时，可以每两天或每一周治疗一次。
所需要的剂量可以以单剂量给药或在适合的时间间隔以分剂量给药，例如每天以两次、三次、四次或更多次的分剂量给药。
式(1)化合物可方便地以单位剂量形式给药，例如每单位剂量形式含有0.1～500mg的活性成分。尽管在用于治疗时式(1)化合物可以粗化学药品给药，但优选以药物制品提供活性成分。
由此本发明还提供药物制剂，其包括式(1)化合物或其药物可接受的衍生物、一种或多种药物可接受的载体及可选择的其它治疗性和/或预防性成分。载体必须是“可接受的”是指其可与制剂的其它成分相容而对其接受体无害。
药物制剂包括适于口服给药、直肠给药、鼻孔给药、局部给药(包括口腔和舌下)、阴道给药或肠胃外给药(包括肌肉内、皮层内、皮肤下及静脉内给药)的制剂，或适于胃肠道形式给药的制剂，或适于呼吸道(包括鼻通道)形式给药的制剂，例如通过吸入或吹入，或适于皮层内或皮下植入或适于经皮贴片的制剂。适合时制剂可以以分散的剂量单位形式供给，并可以通过药剂学领域公知的任何方法制备。所有的方法都包括如下步骤将相关的活性化合物和液体载体或精细分离的固体载体或者两者混合，然后如果需要将产物成型成所需要的制剂。
适于口服给药的药物制剂可以以分散的单位供给，如胶囊、药包或片剂，每一种含有预定量的活性成分；或以粉末或颗粒供给；或以溶液、悬浮液或乳状液供给。活性成分也可以以大丸药、舐剂或软膏供给。用于口服的片剂和胶囊可以含有常规的赋形剂，如粘合剂、填充剂、润滑剂、分解质或润湿剂。片剂可用本领域公知的方法包上糖衣。口服液体制剂可以是例如水或油悬浮液、溶液、乳状液、糖浆或药酒的形式，或可以以干产品供给并在使用前加水或其它适合的载体。这种液体制剂可以含有常规的添加剂，如悬浮剂、乳化剂、非水载体(包括食用油)或防腐剂。
式(1)化合物也可以被制成肠胃外给药(例如注射，例如大丸药注射，或连续灌输)，可以以针剂、预填充注射器、小体积灌输的单位剂量形式供给，或以含有防腐剂的多剂量容器供给。这些组合物可以是油或水载体的悬浮液、溶液或乳状液的形式，并可含有制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，活性成分可以是从杀菌固体的无菌分离物得到或从溶液中冻干得到的粉末形式，并在使用前加入适合的载体，例如杀菌的无热原水。
对于给药至表皮的局部给药，式(1)化合物可以制成药膏、护肤霜或洗液或经破贴片。例如药膏和护肤霜可以以水或油为基材制成并加有适合的增厚和/或胶凝剂。洗液可以以水或油为基材制成，并一般也含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增厚剂或着色剂。
对于在口中的局部给药，式(1)化合物可以制成在香味基材中的含有活性成分的止咳糖，香味基材经常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶；在惰性基材中含有活性成分的锭剂，惰性基材如凝胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶；在适合的液体载体中含有活性成分的濑剂。
对于阴道给药，制剂可以以阴道栓剂、止血垫、护肤霜、凝胶、软膏、泡沫或喷雾供给，除活性成分之外其含有本领域公知的适合载体。
对于直肠给药，优选单位剂量的栓剂，其中载体是固体。适合的载体是可可油和本领域通用的其它材料，通过混合活性化合物和可软化或可熔化的载体然后在模具中冷却并成型可方便地制得栓剂。
对于呼吸道给药(包括鼻内给药)，式(1)化合物可以以给药至呼吸道领域所用的任何方法和制剂给药。
这样通常式(1)化合物可以以溶液或悬浮液形式或干粉末形式给药。
溶液和悬浮液优选是水溶液，例如仅从水中制得或从水和生理上可接受的共溶剂(例如乙醇、丙二醇、聚乙二醇如PEG 400)中制得。
这种溶液或悬浮液还可含有其它的赋形剂例如防腐剂(氯化苯甲烷铵)、增溶剂/表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如Tween 80、Span 80、氯化苯甲烷铵)、缓冲剂、等渗压调节剂(例如氯化钠)、吸收增强剂和粘度增强剂。悬浮液还含有悬浮剂(例如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠)。
溶液或悬浮液可以按常规方式直接施用于鼻腔，例如用滴管、吸液管或喷雾器。制剂也可以以单剂量或多剂量形式供给。在后者情况下，需要提供剂量定量的方法，在滴管或吸液管的情况下，可通过将适合的预定体积的溶液或悬浮液给药至患者来实现，在喷雾器的情况下，例如可通过使用定量喷雾器泵来实现。
气溶胶制剂也可以用于呼吸道给药，其中式(1)化合物在带有适合推进剂的加压包内，推进剂如含氯氟烃(CFC)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，或者是二氧化碳或其它适合的气体。气雾剂通常也可含有表面活性剂，如卵磷脂。药物的剂量可通过设置定量阀控制。
可选择地，式(1)化合物可以以干粉末的形式供给，例如在适合粉末基材中的化合物粉末混合物，粉末基材如乳糖、淀粉、淀粉衍生物，如羟丙甲基纤维素及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。方便地是粉末载体在鼻腔内可形成凝胶。粉末组合物可以以单位剂量形式供给，例如是白明胶的胶囊或药筒或从其中可通过吸入器以给药粉末的起泡药包(blister packs)。
在欲呼吸道给药的制剂中，包括鼻内制剂，化合物通常有较小的颗粒大小，例如5微米或更小。这种颗粒大小可通过本领域公知的方法得到，例如通过微粉化方法。
对于胃肠道给药，式(1)化合物或药物可接受的衍生物可以以给药至胃肠道领域所用的任何方法和制剂给药。
当需要时，可以应用可持续释放活性成分的制剂。
式(1)化合物也可以与其它的治疗药剂组合使用，例如抗糖尿病药剂，如胰岛素、IGF或止痛剂、抗高血压药剂、镇静剂、催眠药、降脂药、抗传染药等。由此本发明另一方面也提供一种组合物，其含有式(1)化合物或其药物可接受的衍生物及另一种治疗性活性药剂。
方便地是，上述的组合物能够以药物制剂的形式供给，由此本发明另一方面提供包含上述组合物及其药物可接受载体的这种制剂。
在分离或组合的药物制剂中，这种组合物的单个组分可连续或同时给药。
当在糖尿病及相关病症的治疗中式(1)化合物和第二种治疗性活性药剂一起使用时，每个化合物的剂量可与单独使用每个化合物时的剂量相同或不同。适合的剂量对于本领域所属技术人员是容易理解的。
式(1)化合物及其药物可接受的衍生物可通过类似结构化合物制备领域的任何公知方法来制备。
本发明可由下面的实施例进一步说明，实施例只是说明性的而不是用于限制本发明。
实施例1赤霉素的发酵、分离和纯化(a)发酵在28℃下于含有100g葡萄糖、100g蔗糖、2.5g NH4NO3、0.25g KH2PO4、0.2g MgSO4、0.01g FeSO4·7H2O、0.03g ZnSO4·7H2O、0.1gKCl、10g胨、3g CaCO3、1000ml H2O的培养基中培养赤霉素A3、A4和A7的制备性赤霉素菌株3～4天并使其生长。然后将其转移到含有1000g葡萄糖、100g胨、24g NH4NO3、100g KH2PO4、20g MgSO4·7H2O、20gFeSO4·7H2O、1.5g Na2B4O7·10H2O、8g CuSO4·7H2O、0.7g(NH4)6Mo7O24·4H2O、20升H2O的培养基中，并在pH 4.5下于28℃培养8～10天。当赤霉素产量到达最高时(～3000□g/ml培养基)时停止发酵。
(b)分离用10％NaOH将发酵培养基(18升)调节至pH 6.5～7.0，然后过滤掉培养基。滤饼(菌丝体)用4L H2O洗。合并滤出液和洗液，并真空蒸发至2L。浓缩物在5～10℃下和乙酸乙酯(5L)一起搅拌，并用6N HCl调节至pH为1.5。然后分成两层。下面的水溶液层再次用乙酸乙酯(2L)萃取。合并有机萃取物，并用水(2L)洗，然后蒸发至400ml。搅拌浓缩物并在60～70℃下加热3～4小时直到不再生成沉淀。冷却至室温后，过滤悬浮液。固体用冷乙酸乙酯洗涤并干燥，得到赤霉素A3和A4/A7混合物，灰白色固体(45g)。此混合物含有～80％A3、～4％A4和～4％A7。
(c)纯化将上述的10g赤霉素A3和A4/A7的混合物溶解在15ml甲醇、1ml H2O、30ml丙酮的混合液中。溶液用含有10ml H2O的100ml乙酸乙酯稀释。过滤混合液。滤出液真空蒸发至约80ml。混合液在60～80℃下加热搅拌2～3小时，然后冷却至室温，过滤。固体用冷乙酸乙酯洗涤并干燥，得到赤霉素A3，白色结晶(6.3g)，纯度＞95％。
MS391(M-1+2Na)+369(M+23)+329(M+1-H2O)+实施例2赤霉素A3的盐和酯的制备(a)赤霉素A3钠盐的制备在1.5ml的甲醇中溶解346mg(1mmole)的赤霉素A3，并将所得溶液加到NaHCO3(84mg，1mmole)的2ml H2O溶液中。减压蒸发全部混合液至干。然后将残渣溶解在水中(2ml)，并冷冻干燥，按定量产率得到赤霉素A3钠盐，白色固体。
(b)赤霉素A3锌盐的制备在10ml水中溶解100mg赤霉素A3的钠盐，然后使其通过Dowex 50锌离子形式树脂的柱子。用30ml H2O洗涤柱子。合并洗脱液和洗液，并真空蒸发至较小体积，冷冻干燥，按定量产率得到赤霉素A3锌盐，白色固体。
(c)赤霉素A3乙酯的制备346mg(1mmole)的赤霉素A3溶解在丙酮(10ml)和水(0.2ml)的混合液中。在-20℃下向混合液中加入三乙胺(100mg，1mmole)、N-甲基吗啉(10mg，0.1mmole)、氯甲酸乙酯(108mg，1mmole)。混合物在-15℃下搅拌20分钟，然后用无水乙醇(10ml)稀释。在室温下搅拌混合物过夜，然后蒸发至干。在乙酸乙酯(30ml)和水(5ml)中分配残渣。分离有机层，用2％HCl(5ml)、水(5ml)、5％NaHCO3(5ml×2)、水(5ml)洗涤，减压蒸发至干，得到赤霉素A3乙酯，无色固体(319mg，85％)，MS375(M+1)+。
实施例3(a)在体外比较EGF与赤霉素A3对细胞生长的作用使用角化细胞培养基进行人类皮肤细胞培养实验。每个孔种入1,500个细胞。在37℃下培养5天。实验如下
实验3.1和3.3表明EGF(表皮生长因子)是细胞生长的关键。实验2表明EGF和赤霉素A3的存在对细胞生长速率没有相加效应。实验4表明赤霉素A3单独就可刺激细胞生长，其功效和EGF一样。
(b)用IGF-1代替EGF进行(a)中所述的细胞培养实验，以比较IGF与赤霉素A3对细胞培养生长的作用。结果与(a)中的结果相似。
实施例4在体外比较IGF-1与赤霉素A3和赤霉素A4和/或A7混合物对细胞生长的作用。结果与实施例3(b)中的结果相似。
实施例5赤霉素A3对糖尿病大鼠的作用方法雄性Wistar大鼠(290g～330g)被称重并轻微麻醉(4％氟烷，2∶1O2/N2O)，从而可通过尾部静脉样品利用精确Q.I.D葡萄糖仪测量血糖水平。然后通过简单的尾部静脉注射链脲霉素(STZ，60mg/kg)引发糖尿病，链脲霉素需要在使用前立即用柠檬酸盐缓冲液(50mM柠檬酸和50mM柠檬酸三钠，pH 4.5)溶解。将等体积的柠檬酸盐缓冲液注射进同龄对照大鼠中。
实验中将大鼠分成两组生长。动物生长温度保持在20℃(±2℃)并12小时亮/暗循环，大鼠可自由吸取食物和水。
从药理动物道德委员会(Pharmacology Animal Ethics Committee)取得对所有实验的道德核准。
药物给药和每天监测方案用STZ(60mg/kg)给药48小时后，提取血糖样品，血糖水平≥16mM的动物被认为患有糖尿病。然后将大鼠随机分成组。
使用慢性Lente Monotard胰岛素，并且需要时补加在使用前立即用蒸馏水溶解的赤霉素钠盐。
在每三天给药后获取2小时或5小时的血糖记录。结果如下
实施例6赤霉素A3和A4/A7混合物对糖尿病大鼠的作用实验方案和实施例5的相同，但是赤霉素A3和A4/A7混合物用来代替赤霉素A3。结果与实施例5的结果没有不同。
权利要求
1.一种治疗糖尿病、其并发症及相关病症的方法，包括将式(1)化合物(赤霉素) 式(1)其中R1是H，或者是基团-O-R20，其中R20是H、糖酸苷醚基(糖苷醚)、C1～6烷基，或者R1和R2或R10形成键(分别是C1-C2或C1-C10双键)；R2是H，或者是基团-O-R21，其中R21是H、糖酸苷醚基(糖苷醚)、或者和R4形成键(内酯)，或者R2和R1或R3形成键(分别是C1-C2或C2-C3双键)；R3是H、＝O、或者是基团-O-R22，其中R22是H或糖酸苷醚基(糖苷醚)，或者R3和R2形成键(C2-C3双键)；R4是OH，或者是-OR23，其中R23是未取代或取代的C1～20烷基、烯丙基、芳基、芳烷基、脒、-NR24R25、或含有一个或多个选自氮、氧及硫的杂原子的不饱和或饱和环；R24和R25可以相同也可以不同，可以是氢、C1～20烷基、烯丙基、芳基、芳烷基、或含有一个或多个选自氮、氧及硫的杂原子的不饱和或饱和环；或者R4和R21或R28形成键(内酯)；R5是H，或者是糖酸苷酯(糖苷酯)基，或者是未取代或取代的C1～20烷基酯、烯丙基酯、芳基酯、芳烷基酯、活性酯；R6是H，或者是OH，或者和R7形成键(C11-C12双键)；R7是H、＝O、或者是-OR26，其中R26是H或者是糖酸苷醚基(糖苷醚)，或者R7和R6形成键(C11-C12双键)；R8是H、羟基、巯基、或者是卤素、氨基、叠氮基、NR24R25、未取代或取代的C1～20烷基、烯丙基、芳基、芳烷基、或OR27，其中R27是糖酸苷醚基(糖苷醚)；R9是H，或者是OH，或者和R15形成键(C9-C15键)；R10是H、CH3、CHO、COOH、所述COOH的糖酸苷酯(糖苷酯)、CH2O-R28或-OR28，其中R28是H或者和R4形成键(内酯)，或者R10和R1形成键(C1-C10双键)；R11是H，或者是OH，或者不存在；R12是CH3、CH2OH、COOH或所述COOH的糖酸苷酯(糖苷酯)；R13是亚甲基、二价杂原子或者是NR29，其中R29是NHR30或OR30，其中R30是H、C1～20烷基、芳基或烷芳基；且当R11不存在时在C16和R13之间存在双键；或者R13是H、OH、CH3、CHO、CH2X，其中X是卤素；当R11是H或者是OH时为CHNR29，其中R29是NHR30或OR30，其中R30是H、C1～20烷基、芳基或烷芳基；条件是如果R11是OH，R13不是OH；R14是H或者是OH；R15是H，或者和R9形成键(C9-C15键)；和/或其药物可接受衍生物施用给需要这种治疗的患者，所述的药物可接受衍生物包括式(1)化合物的内酯、糖苷、酯、活性酯及盐。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述糖尿病的并发症及相关病症是肥胖症、微血管和大血管疾病、肾病、神经病、眼疾及糖尿病性溃疡中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的赤霉素是赤霉素A3。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的赤霉素是赤霉素A3与赤霉素A4和/或赤霉素A7的混合物。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述的药物可接受衍生物是盐，包括碱金属盐、碱土金属盐、金属盐、铵盐或有机碱。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述的有机碱是利度卡因盐酸盐、或NR16R17R18R19，其中R16、R17、R18、R19是氢、取代或未取代的C1～20烷基、烷醇或芳基并且可以相同也可以不同。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述的药物可接受衍生物是内酯、糖苷、酯或活性酯。
8.一种治疗糖尿病及相关病症的方法，包括将有效量的式(1)化合物(赤霉素)和其药物可接受衍生物给药至需要这种治疗的患者。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述的赤霉素是赤霉素A3。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述的赤霉素是赤霉素A3与赤霉素A4和/或赤霉素A7的混合物。
11.一种治疗糖尿病及相关病症的方法，包括将式(1)化合物(赤霉素)或其药物可接受的衍生物与选自胰岛素、其片段衍生物、IGFs、生长因子、其它药物可相容的抗糖尿病药剂或其混合物的物质混合来给药。
12.一种治疗糖尿病及相关病症的方法，包括将式(1)化合物(赤霉素)或其药物可接受的衍生物与选自止痛剂、抗高血压药剂、镇静剂、催眠药、降脂药、抗传染药或其混合物的其它可相容的治疗性药剂混合来给药。
13.如权利要求1所述的方法，用于治疗1型糖尿病及其相关病症。
14.如权利要求1所述的方法，用于治疗2型糖尿病及其相关病症。
15.如权利要求1所述的方法，用于治疗抵抗胰岛素的糖尿病。
16.如权利要求1所述的方法，用于治疗糖尿病相关并发症及相关病症，包括肥胖症、微血管和大血管疾病、肾病、神经病、眼疾及糖尿病性溃疡。
17.一种用于治疗糖尿病及相关病症的药物组合物，包括作为活性成分的式(1)化合物和/或其衍生物及药物可接受的载体。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述的制剂是适于用施药器给药的药物。
19.一种用于治疗糖尿病及相关病症的药物组合物，包括作为活性成分的式(1)化合物及药物可接受的载体或赋形剂，其中所述的组合物是慢性释放的组合物。
20.如权利要求17所述的组合物，其中所述的制剂用于口服给药。
21.如权利要求17所述的组合物，其中所述的制剂用于吸入给药。
22.如权利要求17所述的组合物，其中所述的制剂用于经皮给药。
23.如权利要求17所述的组合物，其中所述的制剂用于肠胃外给药。
24.如权利要求17所述的组合物，其中所述的制剂用于局部给药、直肠给药或阴道给药。
25.如权利要求17、18或19任一项所述的药物组合物，其中所述的式(1)衍生物选自内酯、酯、碱金属盐、碱土金属盐、金属盐、铵盐及有机碱。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述的衍生物是式(1)的钠盐。
27.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述的衍生物是式(1)的锌盐。
28.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述的衍生物是式(1)的乙酯。
29.式(1)化合物和/或其衍生物在制备用于治疗糖尿病及相关病症的药物组合物中的用途。
30.一种制备如权利要求17所述的药物组合物的方法，包括将式(1)化合物和/或其衍生物与药物可接受的载体混合。
31.一种制备含有赤霉素A3的赤霉素的方法，包括如下步骤(a)在发酵培养基中培养可产生赤霉素的微生物菌株；(b)将发酵培养基的pH调节至pH为6.5～7.0并过滤以得到微生物菌丝体的滤饼和滤出液；(c)用水洗滤饼并合并洗液和滤出液以形成水溶液；(d)浓缩该水溶液；(e)在5～10℃的温度下混合该水溶液和有机溶剂并将混合物的pH调节至小于2.0；(f)使混合物分离成水相和第一有机相，并除掉第一有机相；(g)用有机溶剂再次萃取来自步骤(f)的水相以得到第二有机相；(h)合并第一有机相和第二有机相并浓缩以形成浓缩的有机溶液；(i)在60-70℃下加热浓缩的有机溶液3～4小时，同时搅拌，直到固体物质的沉淀终止；(j)将浓缩的有机溶液冷却至室温并过滤以得到沉淀物；(k)用冷的有机溶剂洗涤沉淀物并干燥以得到灰白色的固体，其含有约80％的赤霉素A3、约4％的赤霉素A4和约4％的赤霉素A7。
32.如权利要求31所述的方法，还包括如下步骤(1)在32.6％的甲醇、2.2％的水和65.2％的丙酮混合液中溶解灰白色固体以得到赤霉素溶液；(m)用有机溶剂和水为10∶1的混合液稀释赤霉素溶液；(n)过滤稀释的赤霉素溶液并真空蒸发浓缩滤出液；(o)在60-80℃下加热浓缩物2～3小时，同时搅拌，冷却至室温并过滤以得到固态结晶沉淀物；(p)用冷乙酸乙酯洗涤沉淀物并干燥以得到赤霉素结晶。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述的可产生赤霉素的微生物菌株是赤霉菌。
34.如权利要求31所述的方法，其中在步骤(d)和(h)中的溶液浓缩是通过真空蒸发实现的。
35.如权利要求31所述的方法，其中所述的有机溶剂是乙酸乙酯。
36.如权利要求32所述的方法，其中所述的有机溶剂是乙酸乙酯。
37.如权利要求32所述的方法，还包括如下步骤(q)在甲醇中溶解赤霉素A3；(r)将赤霉素溶液加到等摩尔的NaHCO3水溶液中；(s)将混合溶液蒸发至干以得到固体残渣；(t)在水中溶解该残渣并冷冻干燥以得到赤霉素A3钠盐。
38.如权利要求37所述的方法，还包括如下步骤在水中溶解赤霉素A3的钠盐，使该溶液通过装有锌离子交换树脂的柱子，用水洗涤柱子，收集并合并流出液和洗液并除掉水以得到赤霉素A3锌盐。
39.如权利要求32所述的方法，还包括如下步骤(q)在50∶1比例的丙酮和水混合液中溶解赤霉素A3；(r)混合赤霉素A3溶液和等摩尔的三乙胺、氯甲酸乙酯及十分之一摩尔量的N-甲基吗啉，并在-15℃下搅拌20分钟；(s)用无水乙醇稀释得到的混合物并在室温下搅拌；(t)将稀释的混合物蒸发至干，并在6∶1比例的乙酸乙酯和水中分配残渣；(u)分离乙酸乙酯层，用2％HCl洗，然后用水洗，然后用5％NaHCO3洗，然后用水，并减压蒸发至干以得到赤霉素A3乙酯。
全文摘要
本发明涉及式(1)化合物(赤霉素)及其衍生物用于制备用来治疗糖尿病、其并发症及相关病症的药物组合物或药物的用途，其并发症及相关病症包括肥胖症、微血管和大血管疾病、肾病、神经病、眼疾、糖尿病性溃疡等。本发明使得血清葡萄糖水平和其它生理条件正常化。
文档编号A61K35/74GK1543343SQ02816012
公开日2004年11月3日 申请日期2002年8月12日 优先权日2001年8月31日
发明者彼得·詹姆士·詹金斯, 米纳·吴, 大卫·夏因·吴, 吴, 夏因 吴, 彼得 詹姆士 詹金斯 申请人:澳大利亚生物医学公司