专利名称：中华绒螯蟹卵巢发育相关基因ej01编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域。
由于中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1在GenBank数据库中尚无同源基因，本发明人对该基因的结构和功能研究成果全都是开创性的。美国国家生物技术情报中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)已正式接受该基因为GenBank的新成员，接受号为AY185917。GAGAGTATCT GGAGTCTTAG ACCTGAACAT ACGGACGAGA TGTGGTGCAG TATCTTGCTG60GCGGCAGTGA TGGTGGCGGT GGCGGGCGGC CAGAGTCGAT TTAGTTATGA TGGGACGCCC 120CTGGCTGACG ACGTTGTAGT TGGGTCAGGA CAGCGTCAGC AGTTCTTTGC GTCCCGACAG 180CCCCGGCCAC AACAGCTGTT TGTACAGGAG CGGCCCCAGC AGGTCTTCGT CCAGCAGCAG 240CCTCAGCCAC CGGTGTTTGT GCAGCCTGAG CCACAGCAGG TGTTTGTGCA GCCCCAGCCA 300CGCCCCATGT TCCAGATGCT CCCCTCGTTC TCACAGCAGG CGGCGGTGAT CCAGAGCGTC 360CAGCCGCAAG TGTCTTCCGC CTGTCCGGCC ACTTACTCCC TGGTCCACAC CACCTACCAA 420GGCCGAGTCT ACCACTCCTC CTGGTGCAAC CTGCCCGGCC ACCGTTTCTC CCAGTCCGCC 480GCCAGAGACT ACTGCCGCGG CCTCGGCGAG GTAACAGTGA TGAACCGACG CGGCAGCTTT 540GACCTATACA GCGTCGATCG CACTACTGAT TTCGATTACT TCTTCGAGCT GCTCCTCCAG 600CACCAAATCC CCTCCGTCTG GACCAGGGAC CTTGCCTCCA CCGCGCCCTA TGAAATCCGC 660GGCTCCATCA CCAGGTCCGG GGACTCTACG GCTGGCCAAG ACTGCCTCTC GCTGGAGGCT 720TCCACAGACG GCCTCTTCCT CCTCCAGGAC TCTTGCTCCG ACCGGAAGGC CGCCGTCTGC 780GTGGCTCATT GGCAGTAGAT GAGTTTGTCA ATAACCTGCT TATCATTGTG TAAATAAATG 840TGCTCCTACA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 876中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1的cDNA序列Met Trp Cys Ser Ile Leu Leu Ala Ala Val Met Val Ala Val Ala Gly Gly Gln Ser Arg16 11 16Phe Ser Tyr Asp Gly Thr Pro Leu Ala Asp Asp Val Val Val Gly Ser Gly Gln Arg Gln21 26 31 36Gln Phe Phe Ala Ser Arg Gln Pro Arg Pro Gln Gln Leu Phe Val Gln Glu Arg Pro Gln41 46 51 56Gln Val Phe Val Gln Gln Gln Pro Gln Pro Pro Val Phe Val Gln Pro Glu Pro Gln Gln61 66 71 76Val Phe Val Gln Pro Gln Pro Arg Pro Met Phe Gln Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala81 86 91 96Ala Val Ile Gln Ser Val Gln Pro Gln Val Ser Ser Ala Cys Pro Ala Thr Tyr Ser Leu101 106 111 116Val His Thr Thr Tyr Gln Gly Arg Val Tyr His Ser Ser Trp Cys Asn Leu Pro Gly His121 126 131 136Arg Phe Ser Gln Ser Ala Ala Arg Asp Tyr Cys Arg Gly Leu Gly Glu Val Thr Val Met141 146 151 156Asn Arg Arg Gly Ser Phe Asp Leu Tyr Ser Val Asp Arg Thr Thr Asp Phe Asp Tyr Phe161 166 171 176Phe Glu Leu Leu Leu Gln His Gln Ile Pro Ser Val Trp Thr Arg Asp Leu Ala Ser Thr181 186 191 196Ala Pro Tyr Glu Ile Arg Gly Ser Ile Thr Arg Ser Gly Asp Ser Thr Ala Gly Gln Asp201 206 211 216Cys Leu Ser Leu Glu Ala Ser Thr Asp Gly Leu Phe Leu Leu Gln Asp Ser Cys Ser Asp221 226 231 236Arg Lys Ala Ala Val Cys Val Ala His Trp Gln Glx241 246 251中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1编码蛋白的氨基酸序列本发明的目的鉴于中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1是本发明人发现的全新基因，目前人类对此基因的认识和了解仅限于本发明人所做的研究，且该基因是中华绒螯蟹卵巢发育过程中的差异表达基因，因此该基因很可能具有调节卵巢发育的功能。本发明拟通过对EJO1基因功能的研究，从基因工程技术角度寻找解决河蟹性早熟这一问题的方法，为发展河蟹养殖业服务。EJO1基因的研究可用于1、通过制备该基因的融合蛋白，用于研究该基因与中华绒螯蟹卵巢发育的关系。
2、制备抗体中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1编码蛋白抗体的制备，可用于免疫组织化学染色、ELISA、免疫电镜、免疫共沉淀等根据免疫学原理设计的检测方法，也可用于该基因编码蛋白在组织细胞中的定位和定量研究。该抗体有可能用于中华绒螯蟹雌性性早熟个体的早期鉴别。
3、将根据该基因制备的融合蛋白作用于雌性性早熟个体，有可能通过剂量的控制，减缓雌性性早熟个体卵巢的发育速度。本发明技术方案1、中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1的融合蛋白的制备以中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1开放阅读框的核苷酸序列与质粒pDESTTM15制备成GST-EJO1-pDEST15表达质粒，在无NaCL的LB中30℃培养到OD600为0.5，经0.3MNaCL诱导，超声粉碎后经GST亲和层析柱纯化，得到纯化的融合蛋白。
2、中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1编码蛋白特异性多克隆抗体将融合蛋白与载体蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Lncomplete Freund’s Adjuvant)等量混合，免疫新西兰兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激发注射一次，共三次，于3个月后取血分离血清。以免疫前动物血清作为对照做ELISA，测定各免疫兔血清中抗体滴度。筛选高滴度血清，进一步用抗原作竞争抑制免疫试验确定抗体的特异性。根据ELISA结果确定其用于免疫组织化学染色的稀释倍数1∶200～500。
3、中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1的融合蛋白用于控制卵巢发育通过注射法或浸泡法将不同剂量的中华绒螯蟹卵巢发育相关基因EJO1的融合蛋白送入中华绒螯蟹的幼体内，观察卵巢发育情况；并通过融合蛋白对雌性性早熟个体卵巢发育的影响实验，确定能够抑制雌性个体性早熟的合适剂量。
权利要求
1.一种中华绒螯蟹卵巢发育相关基因(EJO1)克隆制备的融合蛋白，其特征是EJO1基因全部开放阅读框编码的氨基酸，序列为Met Trp Cys Ser Ile Leu Leu Ala Ala Val Met Val Ala Val Ala Gly Gly Gln Ser Arg16 11 16Phe Ser Tyr Asp Gly Thr Pro Leu Ala Asp Asp Val Val Val Gly Ser Gly Gln Arg Gln21 26 31 36Gln Phe Phe Ala Ser Arg Gln Pro Arg Pro Gln Gln Leu Phe Val Gln Glu Arg Pro Gln41 46 51 56Gln Val Phe Val Gln Gln Gln Pro Gln Pro Pro Val Phe Val Gln Pro Glu Pro Gln Gln61 66 71 76Val Phe Val Gln Pro Gln Pro Arg Pro Met Phe Gln Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala81 86 91 96Ala Val Ile Gln Ser Val Gln Pro Gln Val Ser Ser Ala Cys Pro Ala Thr Tyr Ser Leu101 106 111 116Val His Thr Thr Tyr Gln Gly Arg Val Tyr His Ser Ser Trp Cys Asn Leu Pro Gly His121 126 131 136Arg Phe Ser Gln Ser Ala Ala Arg Asp Tyr Cys Arg Gly Leu Gly Glu Val Thr Val Met141 146 151 156Asn Arg Arg Gly Ser Phe Asp Leu Tyr Ser Val Asp Arg Thr Thr Asp Phe Asp Tyr Phe161 166 171 176Phe Glu Leu Leu Leu Gln His Gln Ile Pro Ser Val Trp Thr Arg Asp Leu Ala Ser Thr181 186 191 196Ala Pro Tyr Glu Ile Arg Gly Ser Ile Thr Arg Ser Gly Asp Ser Thr Ala Gly Gln Asp201 206 211 216Cys Leu Ser Leu Glu Ala Ser Thr Asp Gly Leu Phe Leu Leu Gln Asp Ser Cys Ser Asp221 226 231 236Arg Lys Ala Ala Val Cys Val Ala His Trp Gln Glx241 246 251
2.根据权利要求1所述，针对EJO1基因开放阅读框编码的氨基酸序列制备的多克隆抗体，其特征是融合蛋白与完全和不完全佐剂混合后，免疫新西兰兔制备多克隆抗体；
3.根据权利要求1所述，针对EJO1基因开放阅读框编码的氨基酸序列制备的融合蛋白，其特征是可用于解决养殖过程中雌性中华绒螯蟹的性早熟问题。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，所述的中华绒螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)卵巢发育相关基因EJO1的cDNA全长为876 bp，开放阅读框为759 bp，编码252个氨基酸，GenBank接受号为AY185917。该基因在中华绒螯蟹的卵巢发育过程中存在表达差异，查阅基因库，该基因为新基因。本发明利用EJO1基因克隆制备融合蛋白，并利用该蛋白免疫动物制备多克隆抗体，同时将该蛋白用于解决养殖过程中雌性中华绒螯蟹的性早熟问题。
文档编号A61P15/08GK1431224SQ0311270
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月17日 优先权日2003年1月17日
发明者周开亚, 马长艳 申请人:南京师范大学