重组人干扰素α－2b口腔粘贴片及其制法的制作方法

专利名称：重组人干扰素α－2b口腔粘贴片及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人干扰素α-2b及抗病毒药物。
背景技术：
干扰素是人体细胞在被病毒侵染时，诱导产生的一类蛋白质，具有抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节性。根据抗原特异性和分子结构，干扰素可分为三种类型α、β、γ干扰素，其中α型干扰素可分为三种类型。
通常所称的天然干扰素是用人体细胞进行诱导生产的，其中部分是源自人血的白细胞干扰素，由于原材料来源有限，纯化难度大，因而制备高纯度干扰素的成本高，产量低，而且存在肝炎病素、艾滋病病毒的潜在危险污染，大大限制干扰素的临床应用。1980年，美国成功地用大肠杆菌中表达出有活性的人α干扰素蛋白质分子，而且以基因工程技术生产的人α干扰素表现出与天然干扰素相同的生物学活性和临床疗效，大量的成本低廉的高纯度重组干扰素的生产为临床的广泛应用开辟了道路[参见Tarnowski.S.Jet al.Large-scale purification of RecombinantHuman Leukocyte Interferons.Methods Enzymol VOL119P156，1986]。
近年来，α干扰素已广泛应用于临床，用于治疗多种病毒性疾病和恶性肿瘤，如病毒性肝炎，尖锐湿疣、毛细胞白血病及与艾滋病相关的卡波济氏肉瘤，取得了较好的疗效[参见范中善、杜平编，干扰素的临床应用，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1996]。流行性感冒等上呼吸感染是最常见的多发病，主要由鼻病毒、流感病毒，呼吸道合胞病毒、冠状病毒等多种病毒引起，呼吸道病毒具有种类和型别繁多的特点，一般来说机体对其也无强大、持久的免疫力，迄今尚缺有效防治手段。干扰素以其抗病毒的“广谱性”和“相对无害性”，被认为可能是防治呼吸道感染较为有希望药物。临床上已有用滴鼻，气雾吸入等方法防治流感等上呼吸道感染，取得了一定的疗效[参见戴家熊等.干扰素气雾剂防治小儿呼吸道病毒感染，上海医学，VOL10(1)P14，1987；Merigan，T.C.Inhibitionof Respiratory Virus Infection by Locally Applied Interferon.Lancet.Mar.17.1973p563]。
严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，又名“传染性非典型性肺炎”，目前在很多国家均有发现，呈现出输入性传播的特点。该病传染性强、流行面广、病情严重(死亡率高达5.85％)，严重危害到人类的身心健康，并对社会经济造成了很大的损害。为此，研究该病的发病机理、分离病原分子、建立快速检测技术及发现各种预防或治疗SARS的研究显得尤为迫切。在病毒学专家祝庆余及其“攻关”小组的努力下，现已发现造成这种疾病的病毒为一种冠状病毒(Coronavirus)，香港大学医学院研究人员发现感染人类的冠状病毒至少有6种，现已完成对这类冠状病毒的基因序列测定工作，并初步阐明了其病因学、临床特征以及流行病学特征等，为进一步建立快速检测技术和有关新药的研发奠定了一个良好的基础。在现代医学范畴，SARS是一种从未在人或动物中发现的冠状病毒感染的结果，这种变异冠状病毒与流感病毒有一定的亲缘关系，为冠状病毒科的一种肺炎病毒。它在侵染人体后一般会导致呼吸道感染(包括SARS等)，此外，在巨噬细胞中有时也会检测到它的存在，感染人群一般会出现发烧、干咳、呼吸急迫、头疼以及低血氧浓度等症状，患者体内淋巴细胞数目下降，免疫功能低下，同时出现转氨酶活性逐渐升高的现象，患者将会因肺泡损坏导致呼吸衰竭而死亡，随着病毒株的分离和确认，寻求预防和治疗SARS的方法已成为当务之急。而重组α干扰素由于具有来源正常细胞，诱导抗病毒活性快，活性高，性质稳定，产生中和抗体频率低等优点，因此极有可能成为预防SARS病毒感染的有效药物。而目前在临床上干扰素主要采用肌肉或皮下注射给药，对于白血病、病毒性肝炎等没有病灶边界的疾病，是较佳的给药途径，但因干扰素的半衰期短，在血液中清除率高[参见Bomemann L.D.et al、Intravenous and Intramuscularpharmacokinetics of Recombinant Leukocyte A Interferon.Eur.J.Clin pharmacol、VOL77p469、1985]，能够到达靶细胞并发挥效应的干扰素数量很少，为了维持一定的血药浓度，达到干扰素的疗效，常需使用超大剂量的干扰素。特别是，如应用于上呼吸道感染，用注射给药干扰素通过血液循环扩散到上呼吸道器官十分困难[参见Mandell.G.L.et al Principles and Practice of Infectious Disease.2nd p863.Wiley，New York，1985]。另外全身应用大剂量的干扰素可能会发生一定的副作用，如发热、寒战、疼痛、厌食、乏力、白细胞减少[参见Quesada.J.R et al.clinicalToxility of Interferon in cancer Patinent.J.Clin.Oncol，VOL4p234，1986]等，而且注射给药还存在病人使用不便、费用高等缺点。
鉴于注射给药的缺点，干扰素的其他途径给药的研究非常活跃，其中干扰素通过口腔粘膜给药是研究的热点。
蛋白质药物经口腔粘膜给药已有较深入的研究[参见Haris.D andRobinson，J.K，Drug Delivery via the mucous membranes of the Oral cavity.J.Phatm.Sci.VOL81p1，1992；Masami Ishida et al，New Mucosal Dosage Form of Insulin.Chem.Pharm.Bull，VOL29(3)p810，1981]，一般来说经粘膜给药主要应克服两个屏障，即酶屏障和生理屏障。唾液中含很少的蛋白酶，酶屏障对口腔粘膜给药的影响较小，口腔粘膜无角质层，选用合适的吸收促进剂[10][11]可克服生理屏障，而且通过口腔粘膜给药可以避免肝脏的首过效应。而鼻粘膜给药会对鼻粘膜产生一定的刺激作用，引起鼻腔出血、鼻粘膜损伤。
最近的研究显示，干扰素经口腔粘膜给药的作用途径与肌肉注射有所不同，当干扰素通过口腔粘膜被吸收，可直接进入淋巴循环系统，激活人免疫系统，从而减少了药物用量并提高其治疗效果。
口服含片是常见的经口腔粘膜给药的剂型，但含片在口中一般5分钟左右即溶化，干扰素作为一种大分子物质经口腔膜吸收的速度较慢，在这么短的时间内只有很少量的干扰素能够被吸收利用。

发明内容
本发明的目的是提供一种重组人干扰素α-2b口腔粘贴片及其制法。
本发明的技术方案如下一种重组人干扰素α-2b口腔粘贴片，它是由人干扰素α-2b与辅料羟丙甲纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和卡波姆(carbopol)均匀混合后压制成的片剂。
上述的重组人干扰素α-2b口腔粘贴片可以含有干扰素α-2b 1.0～10×105IU，每片重70～120mg。
一种上述重组人干扰素α-2b口腔粘贴片的制法，它是将干扰素α-2b 1×108IU～10×108IU和70～120g辅料均匀混合后，压片成1000片药片，其中辅料由下列成分组成羟丙甲纤维素(HPMC) 20％-40％羧甲基纤维素纳(CMC-Na) 15％-30％卡波姆(Carbopol) 15-30％
乳糖 15％-30％硬脂酸镁 1％-10％。
上述的干扰素α-2b是干扰素α-2b的冻干粉。
干扰素是生活性物质，温度、机械外力等物理化学因素都对生物活性有很大的影响。为了有利于干扰素活性的保持，我们采用将干扰素冷冻干燥成粉末，然后与其它辅料混合后直接压片。
上述的均匀混合是将干扰素α-2b先与少量辅料混合均匀，再加入混合料的10倍量的辅料混合均匀，再加入二次混合料的10倍量的辅料混合均匀，如此依次混合，直到干扰素α-2b与全部辅料混合均匀。
由于干扰素α-2b在整个配方中所占比例太小，如果直接混合，很难混匀，将造成各片之间干扰素含量差异太大，因此我们采用等量递增法混合，然后直接压片。
本发明的重组人干扰素α-2b口腔粘贴片一般需4小时左右才能缓慢地溶化，使干扰素能充分被吸收利用，并较长时间地发挥作用。本发明的重组人干扰素α-2b 5腔粘贴片的基质是羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠和卡波姆，羟丙甲纤维素水化后形成凝胶层，所以当表层的羟丙甲纤维素，随着水溶液不断渗透进入药片内部，片中的干扰素α-2b逐渐溶解，经过凝胶表层扩散进入溶液。当凝胶层表面的羟丙甲基纤维素被充分水化，则徐徐溶解，或以碎片脱落，其中的药物也随之转入溶液中，羧甲基纤维素钠和卡波姆的粘性很强，能使药片牢固黏附于口腔膜上，可以抵抗舌头运动和吞咽而不脱落。另外，重组人干扰素α-2b口腔粘贴片与口腔膜表面保持充分接触，黏膜与药片间存在着较高的药物浓度梯度，十分有利于干扰素扩散吸收。众所周知，口腔内有舌扁桃体、咽扁桃体和脖扁桃体合称瓦代厄氏扁桃体，是口腔内主要淋巴组织环。从重组人干扰素α-2b口腔粘贴片释放出的干扰素，作为外来抗原与口腔内丰富的淋巴组织作用，从而激活淋巴细胞，激活了的淋巴细胞再通过细胞间信号传递或淋巴细胞迁移，激活更多的淋巴细胞群，起到增强机体免疫性作用。口腔黏膜上还存在干扰素受体，从重组人干扰素α-2b口腔粘贴片中释放出的干扰素可直接与受体结合，增强机体免疫性。因此重组人干扰素α-2b口腔粘贴片用于防治SARS病毒感染是极其可行的。
本发明的重组人干扰素α-2b口腔粘贴片具有如下特性
1.重组人干扰素α-2b溶液无细胞毒性；2.重组人干扰素α-2b溶液能够有效抑制流感病毒标准株和临床分离株在Vero细胞上的增殖。IC50＝0.8-3.3IU/mL，其效果与100ug/mL病毒唑相似，抑制指数为3.14.1；3.重组人干扰素α-2b溶液能有效抑制流感病毒在细胞内的复制；4.重组人干扰素α-2b口腔粘贴片口腔给药对小鼠病毒性肺炎具有显著的保护作用，可以降低肺部病变程度和抑制肺部病毒增殖，肺部病毒滴度显著降低(P＜0.05)，肺病变抑制指数为19.4-36.8％，死亡保护率30-80％，其效果优于病毒唑。
5.对小鼠病毒性肺炎的保护作用试验表明，340IU～680IU/日剂量组效果相近，无剂量效应关系，干扰素可以用量较小。
四

图1重组人干扰素α-2b溶液对H1N1病毒细胞内复制的影响。
五具体实施例方式
实施例1.重组人干扰素α-2b口腔粘贴片的制备材料组成干扰素α-2b(天津华立达生物工程有限公司提供，下同)2×108IU辅料共75克，其中羟丙甲纤维素(HPMC)40％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)15％卡波姆(Carbopol) 24.8％其他 0.2％乳糖 15％硬脂酸镁 5％制备工艺整个过程均在无菌室中进行。
按处方称取各种辅料，先将各种辅料混合均匀，过40目筛，紫外照射灭菌备用。
称取干扰素α-2b，与约4g辅料混合物充分混匀，再加40g辅料混合物，充分混匀，最后加入剩余的辅料混合物混合均匀。
将混匀后的原、辅料混合物用6mm浅凹冲模直接压片，调整片重约75mg，硬度3-4kg，制成1000片，压完后点数，取样检定。
实施例2.重组人干扰素α-2b口腔粘贴片的制备材料组成干扰素α-2b 1×108IU辅料共90克，其中羟丙甲纤维素(HPMC)28％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)30％卡波姆(Carbopol) 15％乳糖 15％硬脂酸镁 12％制备工艺同实施例1，但调节片重为90毫克。
实施例3.重组人干扰素α-2b口腔粘贴片的制备材料组成干扰素α-2b 5×108IU辅料共100克，其中羟丙甲纤维素(HPMC)20％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)15％卡波姆(Carbopol) 23％乳糖 30％硬脂酸镁 12％制备工艺同实施例1，但调节片重为100毫克。
实施例4.重组人干扰素α-2b口腔粘贴片的制备材料组成干扰素α-2b 10×108IU辅料共120克，其中羟丙甲纤维素(HPMC)28％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)15％卡波姆(Carbopol) 30％乳糖 17％硬脂酸镁 10％制备工艺同实施例1，但调节片重为120毫克。
实施例1～4所制得的重组人干扰素α-2b口腔粘贴片除所含干扰素量不同外，其性能基本一致。
实施例5.重组人干扰素α-2b口腔粘贴片的药效试验材料和方法1材料1.1病毒甲型H1N1(A/PR18/40)、H2N2(A/京科/12/64)、H3N3(A/沪防/31/80)及乙型B/Lee/40、丙型标准株，由中国预防医学科学院病毒所流感中心提供；甲、乙型流感病毒临床分离株，甲型Al/京防86-1，乙型乙/沪防91-3，由江苏省防疫站提供；甲型流感病毒肺适应株PR8，由中国预防医学科学院病毒流感中心提供；胚、小鼠反复感染传代，增强毒力。
1.2细胞猴肾传代细胞(Vero)1.3药物试验用的重组干扰素α-2b溶液，干扰素α-2b含量分别为26、13、6.5、3.3、1.6、0.8、0.4IU；病毒唑针剂南京第三制药厂产品；干扰素注射液天津华立达生物工程有限公司产品，用无菌注射用水配制而成。
1.4培养基DME/F12(1∶1)。
1.5动物昆明种小鼠，18～22g，雌雄各半，由中国药科大学动物中心提供。
2.方法2.1流感病毒毒力测定96孔板每孔加入适量的Vero细胞，培养24小时，此时细胞基本长满成单层，分别将甲型、乙型流感病毒液进行10倍递次稀释，将稀释液依次加入96孔板，每浓度4孔，37℃5％二氧化碳培养3天，观察细胞病变(CPC)，测定病毒液滴度，重复两次，结果见表1。
2.2重组人干扰素α-2b溶液对Vero细胞毒性的测定(每个培养瓶中细胞浓度相同)向长成单层的Vero细胞培养瓶中，加入浓度分别为26、13、6.5、3.3、1.6、0.8、0.4、0.2、0IU/mL重组人干扰素α-2b溶液，每浓度三瓶，重复2次，37℃5％二氧化碳培养4天左右，用胰酶消化细胞，台昐蓝染色，于血球计数器内计数活细胞和死细胞，并计算出死亡率，结果见表2。
2.3重组人干扰素α-2b溶液的抗病毒作用A.重组人干扰素α-2b溶液对细胞病变的抑制作用Vero细胞铺满单层的96孔细胞培养板七块，分别感染100TCID50七种病毒液，吸附2小时后，倾出病毒，加入系列2倍稀释的重组人干扰素α-2b重组人干扰素α-2b溶液。每浓度四孔，每日观察细胞病变情况，观察七天，记录结果，实验重复两次，结果见表3、4、5、6、7、8和9。由表可见，重组人干扰素α-2b溶液对流感病毒50％抑制浓度为0.8-3.3IU/mL。
B.重组人干扰素α-2b溶液对流感病毒的抑制指数于96孔单层Vero细胞板上，加10倍稀释的七种病毒液各0.1mL，吸附两小时后，弃去上清液，分空白对照组，实验组，阳性对照组，分别加入培养液、26IU/mL重组人干扰素α-2b溶液和100ug/mL病毒唑，37℃ 5％二氧化碳培养，隔两日换维持液2次，每日观察细胞病变，5日后确定各组的TCID50，每浓度两孔，重复3次，计算抑制指数，结果见表10。抑制指数＝空白对照组lgTCID50-实验组IgTCID50，结果表明26IU/mL重组人干扰素α-2b溶液和100ug/mL病毒唑对甲、乙、丙型流感病毒的抑制效果相似。
C.重组人干扰素α-2b溶液对H1N1感染性增殖的影响在生长成单层的MDCK细胞瓶中，接种0.1mL 1000TCID50的H1N1，37℃吸附1小时后，分为对照组和实验组，分别加入培养液和26IU/ml。重组人干扰素α-2b溶液，37℃培养，从感染6小时起，分次收获培养液(6、12、24、48、72、96小时)，每点四份，-60℃保存，然后在细胞板上滴定其感染滴度，并绘制滴度随时间变化曲线，结果见表11。结果显示空白组病毒滴度持续升高，呈对数生长型；而重组人干扰素α-2b溶液滴度升至一定高度后相对稳定，不再增加，说明重组人干扰素α-2b溶液能有效地抑制流感病毒在细胞内复制，但不直接杀死病毒。
2.4流感病毒鼠肺适应株毒力测量取50只小鼠，体重为18～22g，雌雄各半，随机分为5组，以5个10倍稀释病毒液，即1、10-1、10-2、10-3、10-4，乙醚麻醉小鼠后，滴鼻孔各0.03mL(共0.06mL)，连续观察14日，每天记录动物死亡数，并观察动物表现，记录症状，按Bliss法计算小白鼠感染LD50，结果表明，各组动物滴鼻感染后，第5天开始陆续死亡，10天后动物较少死亡，各组动物死亡数及症状和肺部病变，见表12和13。
2.5重组人干扰素α-2b口腔粘贴片治疗给药抗病毒作用A.重组人干扰素α-2b口腔粘贴片治疗给药对小鼠病毒性肺炎的保护作用取体重18-22g健康小鼠80只，雌雄各半，随机分为8组，即重组人干扰素α-2b口腔粘贴片高、中、低三组(680IU/片、340IU/片、170IU/片)、病毒唑肌注组(0.2mg/只)、病毒唑口服组(0.2mg/只)，干扰素肌注(340IU/只)、阴性对照组、正常对照组(生理盐水)。在乙醚浅度麻醉下流感病毒鼠肺适应株10LD50滴鼻，每孔0.03mL，共0.06mL，24小时后，分别给药，连续给药5天，药片贴在小鼠舌下，即用特制头套固定嘴部，使小鼠的嘴闭合不动，给药4小时后取下，连续观察两周，记录动物死亡数和存活时间，两周后全部处死。解剖观察肺部病变程度，同时检测肺部病毒滴度。重复一次，结果见表14。高、中、低不同含量的重组人干扰素α-2b口腔粘贴片组死亡数目不同，高、中两组存活率较高，低剂量组次之，存活时间也不同。
统计分析表明，各剂量组能明显降低动物病毒性肺炎死亡率(P＜0.05)，高、中剂量组效果相近，不存在剂量效应关系。高、中组略优于干扰素肌注组和病毒唑组，显著高于病毒唑口服组；存活时间也比病毒唑肌注和干扰素肌注长。
解剖结果表明，干扰素贴片组和肌肉注射组肺组织仅有轻度突变和部分炎症细胞，病毒唑口服和肌肉注射组组织大部分，有的甚至全部发生突变，呈深褐色。由此可见，干扰素α-2b粘贴片对病毒性肺炎的保护作用优于病毒唑。
死亡保护率和生命延长率计算方法如下死亡保护＝100×(对照组死亡率-实验组死亡率)％ B.重组人干扰素α-2b口腔粘贴片对小鼠病毒肺炎病变程度的影响实验方法同A，给药5天后，处死动物，解剖，取肺，观察肺病变程度，并称重，计算出肺指数，进而计算出抑制率，同时记录肺病变积分，结果见表15。可以看出，重组人干扰素α-2b口腔粘贴片组抑制率在19.4-36.8％之间，肺病变积分在1.10-2.22之间，高、中剂量组效果相近，优于病毒唑，低剂量组稍差。
肺病变程度以下列标准积分
0分肺组织正常。
1分肺组织出现炎症细胞，肺泡内有少量渗出液。
2分肺泡渗出液增多，部分实间质纤维组织增生。
3分肺组织大部分实质或全部实质。
C.重组人干扰素α-2b口腔粘贴片对肺部病毒感染性增殖的影响实验方法同前，连续给药5天后，处死动物，解剖，取肺，匀浆后加5mL生理盐水，15000rpm离心10分钟；取上清液用血凝法检测病毒滴度。结果见表16。从表中可看出，各给药组对肺部病毒感染均有抑制作用，高、中两剂量组效果相近，优于病毒唑。低剂量组稍差。
表1七种病毒株的滴度(TCID50)病毒名称 1 2 3 XH1N11×1041×1055×1052.7×104H2N21×1051×1055×1061.3×105H3N31×1065×1051×1045.8×104乙型 1×1065×1051×1041.3×105丙型 1×1055×1055×1044.5×104临甲 1×1055×1055×1053.4×104临乙 5×1055×1051×1053.4×104表2重组人干扰素α-2b溶液对Vero细胞毒性


表3重组人干扰素α-2b溶液对H1N1病毒感染细胞病变的抑制

“-”细胞老化或病变小于10％“+”细胞病变25％左右“++”细胞病变50％左右“+++”细胞病变75％左右“++++”细胞病变90％以上表4重组人干扰素α-2b溶液对H2N2病毒感染细胞病变的抑制


表5重组人干扰素α-2b溶液对H3N3病毒感染细胞病变的抑制

表6重组人干扰素α-2b溶液对乙型流感病毒感染细胞病变的抑制

表7重组人干扰素α-2b溶液对丁型流感细胞病变的抑制


表8重组人干扰素α-2b溶液对临床甲分离株病毒感染细胞病变的抑制

表9重组人干扰素α-2b溶液对临床乙分离株病毒感染细胞病变的抑制


表10重组人干扰素α-2b溶液对流感病毒的抑制指数

表11重组人干扰素α-2b溶液对H1N1增殖的影响

表12不同稀释度病毒液所致小鼠肺炎死亡情况

表13用Bliss法计算病毒液LD50及95％可信限

表14干扰素口腔粘贴片对小鼠病毒性肺炎的保护作用


*P＜0.05**P＜0.01表15干扰素口腔粘贴片对小鼠病毒性肺病变程度的影响

*P＜0.05(与阴性对照组比较)**P＜0.01表16干扰素口腔粘贴片对小鼠肺部病毒增殖的影响

抑制指数＝阴性对照组病毒滴度-给药组病毒滴度*P＜0.05**P＜0.0权利要求
1.一种重组人干扰素α-2b口腔粘贴片，其特征是它是由人干扰素α-2b与辅料羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素和卡波普均匀混合后压制成的片剂。
2.根据权利要求1所述的重组人干扰素α-2b口腔粘贴片，其特征是含有干扰素α-2b 1.0×105IU～10×105IU，每片重70～120mg。
3.一种权利要求1所述的重组人干扰素α-2b口腔粘贴片的制法，其特征是将干扰素α-2b 1×108～1×109IU和70～120g辅料均匀混合后，压片而成，其中辅料由下列成分组成羟丙甲纤维素20％-40％羧甲基纤维素钠 15％-30％卡波姆 15-30％乳糖15％-45％硬脂酸镁1％-10％。
4.根据权利要求3所述的重组人干扰素α-2b口腔粘贴片的制法，其特征是干扰素α-2b是干扰素α-2b的冻干粉。
5.根据权利要求3所述的重组人干扰素α-2b口腔粘贴片的制法，其特征是所述的均匀混合是将干扰素α-2b先与少量辅料混合均匀，再加入混合料的10倍量的辅料混合均匀，再加入二次混合料的10倍量的辅料混合均匀，如此依次混合，直到干扰素α-2b与全部辅料混合均匀。
全文摘要
一种重组人干扰素α－2b口腔粘贴片，它是由人干扰素α－2b与辅料羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素和卡波普均匀混合后压制成的片剂，可以用于治疗和预防SARS病毒感染。本发明公开了其制法。
文档编号A61K9/70GK1513548SQ03113449
公开日2004年7月21日 申请日期2003年5月12日 优先权日2003年5月12日
发明者沈子龙, 姚文兵, 高向东, 张陆勇 申请人:中国药科大学