专利名称：：可注射型盐酸化壳聚糖/磷酸钙骨修复材料的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种可注射型盐酸化壳聚糖/磷酸钙骨修复材料的制备方法。属于生物医学工程领域的骨组织工程材料技术。
背景技术：
：骨是胶原纤维贯穿于羟基磷灰石形成的生物复合材料。骨组织通过破骨细胞代谢，成骨细胞重建构成一种动态平衡体系。工程化骨就是利用种子细胞种植在多孔支架，经体外扩增后，将细胞/支架结构物植入体内，以修复骨缺损；亦可采用生物相容性良好的生物材料植入体内，经生物过程使骨重建。支架即可预先成型，亦可在体内原位形成。壳聚糖是由β(1→4)键合的D-葡糖胺残基和数目不同分布无规的N-乙酰葡糖胺组成的线性多糖，其结构中的N-乙酰葡糖胺亦存在于糖胺聚糖(GAGs)中。由于壳聚糖结构类似于GAGs，故具有多重生物活性。它为溶菌酶降解，其生物相容性良好。壳聚糖修饰聚(L，D-乳酸)可改善材料对成骨细胞的亲和性(KaiyongCai，KangdeYao，YuanluCui，etal，Surfacemodificationofpoly(D，L-lacticacid)withchitosananditseffectsonthecultureofosteoblastsinvitro，J.BiomedMater.Res.，2002，60(3)398-404)。CheniteA等以甘油磷酸盐调控壳聚糖及水分子间相互作用，制备壳聚糖/甘油磷酸盐水溶性组成物，它可以注射方式植入体内，原位凝胶化(CheniteA，ChaputC，WangD，etal，Novelinjectableneutralsolutionsofchitosanformbiodegradablegelsinsitu，Biomaterials，2000；212155-2161)。
发明内容本发明的目的在于提供一种可注射型盐酸化壳聚糖/磷酸钙骨修复材料的制备方法。按此方法制备的支架材料可在体内原位形成，其临床应用方便。为达到上述目的，本发明通过下述技术方案实现的。包括以盐酸化壳聚糖(CH)与β-甘油磷酸二钠(GP)和磷酸钙(TCP)形成三元分散体，制备可注射型盐酸化壳聚糖/磷酸钙骨修复材料的方法。其特征在于采用分子量为15-30万，脱乙酰化度达85％以上壳聚糖为原料，溶于0.5-1wt％乙酸水溶液过滤后，用0.2mol/LNaCl水溶液透析，再用去离子水透析，经冷冻干燥制得的盐酸化壳聚糖；再与β-甘油磷酸二钠和和磷酸钙按10∶3.0-3.5∶5-15比例混合配制形成三元溶液，溶胶-凝胶转变温度范围30-39℃，pH范围7.00-7.40，得到可注射型盐酸化壳聚糖/磷酸钙的溶胶-凝胶转变体系。上述壳聚糖包括壳聚糖衍生物的羧甲基壳聚糖，磷酸化壳聚糖；上述磷酸钙包括β-磷酸三钙，α-磷酸三钙，羟基磷灰石生物活性陶瓷。本发明优点在于采用盐酸化壳聚糖，β-甘油磷酸二钠和β-磷酸三钙制备的温度响应性可注射型壳聚糖/磷酸钙溶胶-凝胶转变体系，通过调控与水分子间相互作用，实现溶胶-凝胶转变的温敏化。复合物体内凝胶化特性可调，能适应不同形状骨缺损的修复。组分的优化使其适于注射应用，按此方法制备的支架材料可通过注射在体内原位形成，不仅保留了壳聚糖/磷酸钙仿生生物材料的生物相容性、生物降解性，且其临床应用方便。壳聚糖结构类似于GAGs，故具有多重生物活性，而磷酸钙是骨无机成分，在盐酸化壳聚糖溶液中加入了磷酸钙形成的溶胶-凝胶转变体系，属于粒子增强型凝胶，同时增强其对骨组织的仿生程度，使此注射型支架材料更适合于骨重建。图1为本发明盐酸化壳聚糖-β-甘油磷酸二钠盐(CH-GP)及盐酸化壳聚糖-β-甘油磷酸二钠盐-β-磷酸三钙(CH-GP-TCP)溶胶-凝胶转变时间的温度依赖性。图2为本发明的CH-GP-TCP原位形成支架材料植入Wistar大鼠皮下一个月后，组织切片H&E染色光学显微镜照片(×100)。具体实施例方式实施例一用分子量20万，脱乙酰度87％的壳聚糖溶于1％的乙酸水溶液，形成1wt％的壳聚糖溶液过滤后，用0.2mol/LNaCl水溶液透析，再用去离子水透析，经冷冻干燥制得盐酸化壳聚糖，产率92％。由红外光谱确认壳聚糖分子吡喃环上的伯氨基(1599cm-1)特征峰消失，而转变成季铵盐。X-衍射图案表明壳聚糖结晶度明显降低，形成无定型态。将盐酸化壳聚糖按1-20mg/mL浓度添加至2T3成骨细胞培养基中，MTT实验结果表明它对成骨细胞的亲和性良好。实施例二取0.10g的实施例一方法制备的盐酸化壳聚糖，加入4.50mL去离子水，完全溶解，冷却至4℃，搅拌情况下逐滴加入0.70g/mLβ-甘油磷酸二钠盐溶液500uL，再加入0.10gβ-磷酸三钙，充分振荡使其均匀混合，形成溶胶-凝胶转化系统。此体系pH值为7.15，在37℃下10分钟即可可转化成凝胶，4℃下可以稳定保存。实施例三取0.10g的实施例一方法制备的盐酸化壳聚糖，加入4.50mg去离子水，完全溶解，冷却至4℃，搅拌情况下逐滴加入0.60g/mLβ-甘油磷酸二钠盐溶液500mL，再加入0.10gβ-磷酸三钙，充分振荡使其均匀混合，形成溶胶-凝胶转化系统。此体系pH值为7.01，在37℃下13分钟即可转化成溶胶体系，4℃下可以稳定保存。实施例四按实施例二的比例制备盐酸化壳聚糖-β-甘油磷酸二钠盐-β-磷酸三钙分散体(其中β-磷酸三钙和实施例一得到的盐酸化壳聚糖γ射线辐射灭菌，β-甘油磷酸二钠盐溶液通过0.20μm的针头滤器过滤灭菌)通过注射器注射到2月龄Wistar大鼠皮下，一个月后取材，10％的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，组织学方法染色。光学显微镜下观察生物相容性良好(参见附图2)。权利要求1.一种可注射型盐酸化壳聚糖/磷酸钙骨修复材料的制备方法，该方法采用包括盐酸化壳聚糖(CH)与β-甘油磷酸二钠(GP)和磷酸钙(TCP)形成三元分散体，主要经过壳聚糖的盐酸化和溶液中分子间的疏水相互作用制备而成，其特征在于将分子量为15-30万，脱乙酰化度达85％以上壳聚糖，溶于0.5-1.0wt％乙酸水溶液过滤后，用0.2mol/LNaCl水溶液透析，再用去离子水透析，经冷冻干燥制得的盐酸化壳聚糖；再与β-甘油磷酸二钠和和磷酸钙按10∶3.0-3.5∶5-15比例混合配制形成三元溶液，溶胶-凝胶转变温度范围30-39℃，pH范围7.00-7.40，得到可注射型盐酸化壳聚糖/磷酸钙的溶胶-凝胶转变体系。2.按权利要求1所述可注射型盐酸化壳聚糖/磷酸钙骨修复材料的制备方法，其特征在于采用的壳聚糖包括壳聚糖的衍生物羧甲基壳聚糖，磷酸化壳聚糖；所述磷酸钙包括β-磷酸三钙，α-磷酸三钙，羟基磷灰石生物活性陶瓷。全文摘要本发明公开了一种可注射型盐酸化壳聚糖/磷酸钙骨修复材料的制备方法，属于生物医学工程领域的骨组织工程材料技术。该方法采用包括盐酸化壳聚糖(CH)与β－甘油磷酸二钠(GP)和磷酸钙(TCP)形成三元分散体，主要经过壳聚糖的盐酸化和溶液中分子间的疏水相互作用制备而成。本发明优点在于制备的温度响应性可注射型壳聚糖/磷酸钙溶胶－凝胶转变体系，通过调控与水分子间相互作用，实现溶胶－凝胶转变的温敏化。组分的优化使其适于注射应用，在体内原位形成，同时增强其对骨组织的仿生程度，使此注射型支架材料更适合于骨重建，且其临床应用方便。文档编号A61L31/04GK1486753SQ03130550公开日2004年4月7日申请日期2003年8月11日优先权日2003年8月11日发明者姚康德,赵立国,尹玉姬,崔元璐申请人:天津大学