专利名称：季胺盐改性的壳聚糖亲核no供体的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种医药工程技术领域的方法，具体是一种季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法。
背景技术：
作为包含有生物信息的天然高分子材料，壳聚糖及其衍生物兼具生物相容性和生物可降解性，可被生物内的溶菌酶分解，应用于相关的医药领域时其安全性较其它合成材料更为可靠。壳聚糖作为生物医用材料的潜力来源于阳离子特征和在溶液中的高电荷密度。壳聚糖的衍生化反应为增强材料的生物活性和改善机械性能提供了新的途径。壳聚糖分子中的羟基和氨基容易进行化学修饰，继而可制成各种类型的膜、凝胶、聚电解质等材料。通过在壳聚糖侧链引入功能基团，破坏结晶区结构，增加非结晶区部分，不但可以改变其溶解性，而且可以改变物化性质。例如N-烷基化壳聚糖降低了溶解性并且可以在烷基链大于5个碳的时候形成胶束团簇，而硫酸化反应则赋予壳聚糖阴离子特性和水溶性，同时获得抗凝血性；经糖基化修饰而成壳聚糖的衍生物易溶于水，表现出高吸湿性和保湿性，对酶降解的敏感性也随着衍生物的取代度的增加而降低。
壳聚糖及其衍生物可以通过影响上皮细胞的通道来提高细胞的通透性，对某些可以使活性物质降解的酶具有抑制作用。又由于其生物粘附性强，可以增强亲水化合物在生物体内的穿透作用，提高跨膜转运能力，因此可作为生物活性物质的促进吸收因子。壳聚糖的季铵盐是一种两性高分子，一般情况下取代度在25％以上季铵盐化壳聚糖可溶于水。壳聚糖的季铵盐也可以分两个类型一类是利用壳聚糖的氨基反应制得，具体方法是用过量卤代烷和壳聚糖反应得到卤化壳聚糖季铵盐，由于碘代烷的反应活性较高，是常用的卤代化试剂。另一类是用含有环氧烷烃的季铵盐和壳聚糖反应，得到含有羟基的壳聚糖季铵盐。许晨等人用环氧丙基三甲基氯化铵和壳聚糖反应，合成了羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，它的水溶性随取代度的增加而增大，完全水溶性产物的10％溶液，可以与乙醇、乙二醇、甘油任意比混合而不发生沉淀。含有[N(O)NO]-官能团的化合物是近几年发展起来的一种最重要的NO供体药物。它既可以在生理条件下自发的释放NO分子；经O2取代后又可以在靶器官和靶细胞中被特定酶脱离，具有靶向性的功能；它还具有良好的可调控性；另外它可以制备成各种形态，根据需要应用于不同的医学领域。大量的体外试验已经证明了它可以有效的预防成型术后再狭窄，提高医疗装置的抗血栓性能，减轻肺部高压和血管痉挛等用途。
经对现有技术的文献检索发现，Smith等人于2002年在美国专利USP6451337，名称“Chitosan-based nitric oxide donor compositions”(“基于壳聚糖的一氧化氮供体合成物”)，提出了将改性壳聚糖作为亲核NO载体，合成出系列壳聚糖-NO加成物。但是对既能提高壳聚糖改性产物同NO的均相反应，又可不经过O2取代就可达到靶向效果的壳聚糖-NO加成物的效果不佳。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法。通过对壳聚糖进行季胺化改性，产生NH亲核位点，同NO反应后，得到一系列以壳聚糖为载体的含有[N(O)NO]-官能团的新型的NO供体。解决了此类亲核NO供体不能直接靶向和不能均相反应的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明具体步骤包括如下(1)取壳聚糖作为反应物，对壳聚糖上的NH2基团进行季胺化改性处理，得到季胺盐改性壳聚糖分子；(2)季胺盐改性壳聚糖分子同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行高压反应，产生[N(O)NO]-基团；将合成产物用甲醇乙醚分别清洗多次，分离提纯，重结晶，室温真空干燥，储存于-20℃的干燥器内。
所述的对壳聚糖上的NH2基团进行季胺化改性处理，通过以下两种方法进行其方法一采用环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)同壳聚糖中的NH2基团进行加成反应，冰丙酮沉淀后用甲醇重新溶解，再用丙酮甲醇(体积比4∶1)溶液沉淀。
所述的方法一，具体是将壳聚糖溶于去离子水中，85℃反应温度下将GTMAC分三次间隔两小时加入到反应溶液中，反应10-24小时后，将透明的黄色反应液加入到冰丙酮溶液中，搅拌后置于冰箱中过夜，第二天弃去丙酮，加入乙醇溶解，再用4∶1体积比丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗涤，最终产物再在60℃真空烘箱中烘干。反应式如下 或其方法二对C2-NH2基团进行羧甲基化，依次与硫酸二甲酯、3-二甲基丙胺和2，3-环氧丙基三甲基氯化铵反应，最后得到在C2-NH2基团上引入两个季胺盐的改性壳聚糖。
所述的方法二，具体步骤如下1)取壳聚糖溶于稀醋酸中，等量乙醛酸分三次加入其中，用5％百分浓度的硼氢化钠进行还原反应，加入乙醇沉淀分离，烘干得产物N-羧甲基壳聚糖(N-CMC)(a)。
2)取N-羧甲基壳聚糖(a)与硫酸二甲酯在溶于二甲亚砜溶液中，反应24h，反应完毕后，用盐酸甲醇溶液分离，真空烘干得N-羧甲基甲酯壳聚糖(b)。
3)取N-羧甲基甲酯壳聚糖(b)和3-二甲基丙胺，溶于甲醇溶液中，0℃下反应4小时，升温至25℃下反应24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖(c)。
4)将上述N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖(c)和2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，室温反应4h后，25℃恒温反应24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到双季胺盐壳聚糖。反应式如下
所述的季胺盐改性壳聚糖分子同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行高压反应，其反应方程是 所述的高压反应，条件是Na+/NH＝1-3，压力为3atm-9atm，室温反应3天-7天。
所述的分离提纯，具体是无水甲醇乙醚分别清洗3次。
所述的季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体采用季胺盐改性产生带正电荷的一个或多个氨基基团(NR3+基团)，将季胺化改性产生的仲胺亲核位点(NH基团)，与NO反应产生[N(O)NO]-官能团，其分子结构式为
其中N[N(O)NO]-基团为NH基团同NO反应形成。而NH基团来自于季胺盐改性的壳聚糖；R为一个或多个季胺盐，包括一个或多个环氧丙基三甲基氯化铵，它来自于环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)与壳聚糖上NH2基团的开环加成反应。
所述的季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体为黄色或蓝白色粉末状固体，储存于-20℃的干燥器内；在室温下能够稳定存在，在酸性或中性水溶液中能够自发分解释放出NO和季胺盐改性壳聚糖。
本发明对壳聚糖上的-C2-NH2基团进行季胺化改性，使其产生能够带正电的稳定的氨基基团，包括一个季胺基团或多个季胺基团。在酸性和中性水溶液中能够自发的释放NO分子，季胺盐的个数决定了它们的靶向性以及它们的释放半衰期和释放速率。
本发明的水溶性壳聚糖在较宽的pH值范围内具有稳定的电正性。这些特点使其在液态介质中可与带负电荷的聚合物、大分子甚至一些聚阴离子相互作用；从生物药剂角度来看，带正电荷的壳聚糖微粒可以附着到黏膜的表面，并能打开上皮细胞的紧密联结。季胺盐改性壳聚糖分子产生的仲胺NH基团同NO气体分子的产生[N(O)NO]-基团，在靶向输送NO方面，具有重要的临床应用价值和应用前景。本发明制备的季胺盐改性壳聚糖亲核NO供体，具有稳定的化学性质和较长的释放半衰期，可广泛的应用于治疗心血管系统疾病，肺部高压，促进伤口愈合，有效的预防成型术后再狭窄，提高医疗装置的抗血栓性能。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1本实施例1是在以下实施条件和技术要求条件下实施的
(1)N-单季胺盐壳聚糖的合成(HTCC)将壳聚糖(6g，37.0mmol)溶于去离子水中(60ml)，85℃反应温度下将GTMAC(7.1ml，111mmol)分三次间隔两小时加入到上述反应溶液中。反应10小时过后，将透明的黄色反应液加入到冰丙酮(200ml)溶液中，搅拌后置于冰箱中过夜。第二天弃去丙酮加入乙醇溶解，再用4∶1丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗涤，最终产物再在60℃真空烘箱中烘干得淡黄色粉末10.23g。
(2)季胺盐改性壳聚糖/NO供体的合成将季胺盐改性壳聚糖1.2g(0.004mol)加入到含有0.43g(0.004mol)甲醇钠的100ml无水甲醇溶液中，在高压釜中与NO反应，维持压力3atm，反应3天，反应结束后分别用无水甲醇和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到黄色粉末约1g。
-官能团最直观和有效地表征方法是在230-280处的紫外特征吸收，合成产物N-单季胺盐壳聚糖一氧化氮供体(HTCC/NO)中[N(O)NO]-官能团的特征吸收在262nm，测定了在磷酸盐缓冲溶液(PBS)缓冲液中其吸光率随时间的变化，通过释放曲线的函数拟合求出其半衰期是31h。
实施例2本实施例2是在以下实施条件和技术要求条件下实施的(1)N-单季胺盐壳聚糖的合成(HTCC)将壳聚糖(6g，37.0mmol)溶于去离子水中(60ml)，85℃反应温度下将GTMAC(7.1ml，111mmol)分三次间隔两小时加入到上述反应溶液中。反应17小时过后，将透明的黄色反应液加入到冰丙酮(200ml)溶液中，搅拌后置于冰箱中过夜。第二天弃去丙酮加入乙醇溶解，再用4∶1丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗涤，最终产物再在60℃真空烘箱中烘干得淡淡黄色粉末10.72g。
(2)季胺盐改性壳聚糖/NO供体的合成将季胺盐改性壳聚糖1.2g(0.004mol)加入到含有0.86g(0.008mol)甲醇钠的100ml无水甲醇溶液中，在高压釜中与NO反应，维持压力6atm，反应5天，反应结束后分别用无水甲醇和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到黄色粉末约1.03g。
紫外光谱测定[N(O)NO]-官能团的特定吸收在260nm。在PBS缓冲液中释放半衰期是33h。
实施例3
本实施例3是在以下实施条件和技术要求条件下实施的(1)N-单季胺盐壳聚糖的合成(HTCC)将壳聚糖(6g，37.0mmol)溶于去离子水中(60ml)，85℃反应温度下将GTMAC(7.1ml，111mmol)分三次间隔两小时加入到上述反应溶液中。反应24小时过后，将透明的黄色反应液加入到冰丙酮(200ml)溶液中，搅拌后置于冰箱中过夜。第二天弃去丙酮加入乙醇溶解，再用4∶1丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗涤，最终产物再在60℃真空烘箱中烘干得黄色粉末11.02g。
(2)季胺盐改性壳聚糖/NO供体的合成将季胺盐改性壳聚糖1.2g(0.004mol)加入到含有1.29g(0.012mol)甲醇钠的100ml无水甲醇溶液中，在高压釜中与NO反应，维持压力9atm，反应7天，反应结束后分别用无水甲醇和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到黄色粉末约1.12g。
紫外光谱测定[N(O)NO]-官能团的特定吸收在260nm。在PBS缓冲液中释放半衰期是37h。
实施例4本实施例4是在以下实施条件和技术要求条件下实施的(1)N-双季胺盐壳聚糖的合成1)N-羧甲基壳聚糖的合成(N-CMC)(a)将一定质量的壳聚糖溶于一定体积的稀醋酸(0.7％v/v；pH＝3)中并置于500ml烧瓶中(室温下)磁力搅拌，将等量乙醛酸分三次加入烧瓶中(间隔25min)，室温下搅拌1h。然后用稀氢氧化钠溶液将反应液pH调制4.5。将稀的硼氢化钠(5％)溶液逐滴加入到上述反应液中，继续搅拌1h，然后加入乙醇沉淀分离。60℃恒温烘箱中烘干，得产物N-羧甲基壳聚糖(a)。
2)在300ml圆底烧瓶中加入5.0g N-羧甲基壳聚糖(N-CMC)，再加入100ml二甲亚砜和20.0ml硫酸二甲酯，45℃下加热24h，反应完毕后，用盐酸甲醇溶液分离，并真空烘干得N-羧甲基甲酯壳聚糖(b)。
3)将3-二甲基丙胺置于150ml圆底烧瓶中(0℃)将30mlN-羧甲基甲酯壳聚糖的甲醇溶液加入圆底烧瓶中，0℃下反应四小时，升温至25℃下反应24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖(c)。
4)先将4.0mmolN-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖(c)，置于150ml圆底烧瓶中，然后向其中加入3.0g 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，搅拌下加入NaOH和另外2.0g 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，反应4h，再升温至25℃反应24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到C2-NH2上带两个季胺盐的改性壳聚糖白色粉末。
(2)季胺盐改性壳聚糖/NO供体的合成方法同实施例3，得蓝白色粉末约1.22g。
紫外光谱测定[N(O)NO]-官能团的特定吸收在260nm。在PBS缓冲液中释放半衰期是45h。
权利要求
1.一种季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法，其特征在于，具体步骤包括如下(1)取壳聚糖作为反应物，对壳聚糖上的NH2基团进行季胺化改性处理，得到季胺盐改性壳聚糖分子；(2)季胺盐改性壳聚糖分子同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行高压反应，产生[N(O)NO]-基团；将合成产物用甲醇乙醚分别清洗多次，分离提纯，重结晶，室温真空干燥，储存于-20℃的干燥器内。
2.如权利要求1所述的季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法，其特征是，所述的对壳聚糖上的NH2基团进行季胺化改性处理，通过以下方法进行其方法一采用环氧丙基三甲基氯化铵同壳聚糖中的NH2基团进行加成反应，冰丙酮沉淀后用甲醇重新溶解，再用以4∶1体积比的丙酮甲醇溶液沉淀；或其方法二对C2-NH2基团进行羧甲基化，依次与硫酸二甲酯、3-二甲基丙胺和2，3-环氧丙基三甲基氯化铵反应，最后得到在C2-NH2基团上引入两个季胺盐的改性壳聚糖。
3.如权利要求2所述的季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法，其特征是，所述的方法一，具体是将壳聚糖溶于去离子水中，85℃反应温度下将环氧丙基三甲基氯化铵分三次间隔两小时加入到反应溶液中，反应10-24小时后，将透明的黄色反应液加入到冰丙酮溶液中，搅拌后置于冰箱中过夜，第二天弃去丙酮，加入乙醇溶解，再用4∶1体积比丙酮乙醇溶液沉淀，抽率洗涤，最终产物再在60℃真空烘箱中烘干。
4.如权利要求2所述的季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法，其特征是，所述的方法二，具体步骤如下1)取壳聚糖溶于稀醋酸中，等量乙醛酸分三次加入其中，用5％百分浓度的硼氢化钠进行还原反应，加入乙醇沉淀分离，烘干得产物N-羧甲基壳聚糖；2)取N-羧甲基壳聚糖与硫酸二甲酯在溶于二甲亚砜溶液中，反应24h，反应完毕后，用盐酸甲醇溶液分离，真空烘干得N-羧甲基甲酯壳聚糖；3)取N-羧甲基甲酯壳聚糖和3-二甲基丙胺，溶于甲醇溶液中，0℃下反应4小时，升温至25℃下反应24h，用丙酮沉淀，真空烘干得N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖；4)将上述N-N，N-二甲基丙胺氨基甲酰壳聚糖和2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，室温反应4h后，25℃恒温反应24h，最后用甲醇沉淀，置于真空烘箱中60℃烘干，得到双季胺盐壳聚糖。
5.如权利要求1所述的季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法，其特征是，所述的季胺盐改性壳聚糖分子同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行高压反应，其反应方程是
6.如权利要求1或5所述的季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法，其特征是，所述的高压反应，其条件是Na+/NH＝1-3，压力为3atm-9atm，室温反应3天-7天。
7.如权利要求1所述的季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法，其特征是，所述的分离提纯，具体是无水甲醇乙醚分别清洗3次。
全文摘要
一种季胺盐改性的壳聚糖亲核NO供体的合成方法，属于医药工程技术领域。具体步骤包括如下(1)取壳聚糖作为反应物，对壳聚糖上的NH
文档编号A61K47/36GK101066460SQ20071004171
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月7日 优先权日2007年6月7日
发明者万锕俊, 孙燕, 李慧丽, 张隐西 申请人:上海交通大学