专利名称：增强实体癌细胞化疗敏感性的混合制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种能增强实体癌细胞化疗敏感性的混合制剂。
因此，对化疗的敏感与否和化疗副作用的发生程度是影响患者生存时间和生存质量的关键环节。寻找有效的药物组合以提高实体癌细胞的化疗敏感性，降低化疗药物用量以减少副反应发生，是提高实体癌患者生存率以及生存质量的重要手段，也是我们本发明的目的所在。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的能增强实体癌细胞化疗敏感性的混合制剂是将一种影响实体癌细胞周期调控的药物和一种周期特异性化疗药物按照一定的浓度比例混合制得。其中影响实体癌细胞周期调控的药物为生长抑素，周期特异性化疗药物为阿霉素。生长抑素可选用施他宁。
通过实验发现，使用化疗药物阿霉素和生长抑素的混合制剂后，对癌细胞的杀伤效果明显较单用化疗药物提高。
图1B为生长抑素处理后胆囊癌细胞处于分裂周期S期的细胞比例示意图。
图2为体外实验时测试单独使用化疗药物及使用混合制剂对胆囊癌细胞生长影响的实验结果。
图3为体内实验时测试单独使用化疗药物及使用混合制剂对胆囊癌组织生长重量影响的实验结果。
具体实施例方式
本发明增强实体癌细胞化疗敏感性的混合制剂是将一种影响实体癌细胞周期调控的药物和一种周期特异性化疗药物按照一定的浓度比例混合制得。其中影响实体癌细胞周期调控的药物是生长抑素，生长抑素可选用施他宁，周期特异性化疗药物选用阿霉素。临床应用中，两种成份的浓度范围是生长抑素62.5～500μg/ml，阿霉素3.33～33.3μg/ml。
肿瘤被归因为一类细胞周期疾病(cell cycle disease)，恶性肿瘤是正常细胞周期调控系统遭到破坏所造成的失控性生长。生长抑素(Somatostatin)一直作为人体多种激素分泌的调节物应用于临床，它与肿瘤的细胞周期关系密切，能够造成肿瘤细胞生长停滞(GrowthArrest)。我们在体外实验中发现，生长抑素能诱导胆囊癌细胞生长停滞，使分裂周期S期的细胞比例达到31.98％，较对照组明显升高，联合使用S期特异性化疗药物阿霉素后，杀伤效果明显较单用化疗药物提高，影响癌细胞周期G1/S状态能够提高其化疗敏感性。由于阿霉素对人体有很强的毒副作用，可骨髓抑制、消化道反应和和心脏损伤等，单独使用阿霉素时，要达到IC50的指标要求，需要使用阿霉素15μg，而使用混合制剂后，可使得IC50降低至2.20μg/ml，将大大减轻了化疗药物带来的副作用。
我们选择化疗敏感性差的胆囊癌作为实验对象，制备生长抑素和阿霉素的混合制剂，利用生长抑素改变胆囊癌细胞周期的G1/S期(checkpoint)状态，再利用阿霉素选择性杀伤DNA合成期癌细胞的特性，最终改变实体癌细胞对化疗药物的敏感性。下面分别说明本发明体外实验及体内实验的方法及结果。
一.体外实验用于体外实验的混合制剂制备方法为生长抑素和阿霉素药粉溶解于1640培养液(Gibco)，混合制剂的终浓度为生长抑素62.5～500μg/ml，阿霉素3.33～33.3μg/ml。
首先进行细胞培养人胆囊癌细胞株GBC-SD常规用含体积分数15％小牛血清及1％青、链霉素的1640培养液培养，维持在37℃，5％CO2的湿培养箱内，细胞贴壁后，用胰蛋白酶消化后分瓶，按上述方法培养。
测试生长抑素对胆囊癌细胞周期的影响运用流式细胞仪(FACSCalibur，B.D.公司)分析细胞周期，并应用B.D公司CELLQUEST软件处理数据。样品制备0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞；加含15％小牛血清的1640培养液分瓶，各组加生长抑素浓度为200μg/ml，分别培养0.5、1、3和5天，设空白组，共5组；收集1×106新鲜细胞，PBS洗涤两次，离心弃上清，每样品管中加1ml碘化丙啶(PI)，避光染色30分钟后上机。图1B为生长抑素处理后1天的测试结果，其中斜线阴影部分表示S周期的细胞比例为31.98％，图1A所示为空白组的测试结果，其中斜线阴影部分表示S周期的细胞比例为5.69％，可见通过使用生长抑素，处于S周期的细胞数明显较空白对照组提高。
测试单独使用化疗药物及使用混合制剂对胆囊癌细胞生长的影响单用化疗药物的实验采用噻唑蓝比色法(MTT法)绘制胆囊癌细胞的生长曲线0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞；加含15％小牛血清的1640培养基制备单细胞悬液(1×105)，接种96孔板培养过夜；各组分别加阿霉素浓度为0μg/ml、3.33μg/ml、6.66μg/ml、13.32μg/ml、19.98μg/ml和33.30μg/ml，共6组，培养48小时；各组取3瓶制成单细胞悬液，先后加MTT和DMSO后，振荡10分钟；酶标仪(Bio-Rad Model 550，Microplate Reader)490nm波长下观察光吸收值(OD值)，细胞生存率计算公式生存率＝(实验组OD值/空白组OD值)×100％。
混合制剂的实验25％胰蛋白酶消化贴壁细胞后制备单细胞悬液；加入混合制剂，运用MTT法测定其对于癌细胞生长的抑制作用。实验结果如图2所示，联合用药后，癌细胞生存率明显比单独用药时低。
二体内实验用于体内实验的混合制剂制备生长抑素和阿霉素药粉溶解于生理盐水，混合制剂的终浓度为生长抑素1～2mg/Kg，阿霉素2mg/Kg。
培养的GBC-SD细胞系消化后用PBS制成细胞悬液，以5×106个细胞分别接种于裸小鼠右侧腋窝皮下，体积0.2ml；肿瘤长到5×5mm时随机将小鼠分为对照组、生长抑素单用组、阿霉素单用组、混合制剂1组(生长抑素低浓度)和混合制剂2组(生长抑素高浓度)；腹腔给药，单用药组生长抑素1mg/Kg，q.d.×9天；阿霉素2 mg/Kg，q.d.×9天；混合用药1(低浓度)组生长抑素1mg/Kg+阿霉素2mg/Kg，q.d.×9天；2(高浓度)组生长抑素2mg/Kg+阿霉素2 mg/Kg，q.d.×9天；接种细胞24天后处死动物，取肿瘤组织称重。试验结果如下表所示
另请参阅图3，可以看出使用混合制剂比对照组及单独用药的肿瘤组织重量小很多，而且使用高浓度生长抑素的混合制剂比低浓度生长抑素的混合制剂的肿瘤组织重量小。
权利要求
1.一种增强实体癌细胞化疗敏感性的混合制剂，其特征在于该混合制剂是将一种影响实体癌细胞周期调控的药物和一种周期特异性化疗药物按照一定的浓度比例混合制得。
2.如权利要求1所述的混合制剂，其特征在于影响实体癌细胞周期调控的药物是生长抑素，周期特异性化疗药物为阿霉素。
3.如权利要求2所述的混合制剂，其特征在于生长抑素可以是施他宁。
4.如权利要求2所述的混合制剂，其特征在于生长抑素和阿霉素药粉溶解于生理盐水，浓度比例为生长抑素62.5～500μg/ml，阿霉素3.33～33.3μg/ml。
5.如权利要求4所述的混合制剂，其特征在于生长抑素和阿霉素药粉r的优选浓度比例为生长抑素62.5～500μg/ml，阿霉素3.33～13.32μg/ml。
全文摘要
本发明涉及一种能增强实体癌细胞化疗敏感性的混合制剂，该混合制剂是将一种影响实体癌细胞周期调控的药物和一种周期特异性化疗药物按照一定的浓度比例混合制得。其中影响实体癌细胞周期调控的药物是生长抑素，周期特异性化疗药物为阿霉素。通过使用该种阿霉素和生长抑素的混合制剂后，杀伤效果明显比单用化疗药物提高。
文档编号A61K38/31GK1475276SQ0314165
公开日2004年2月18日 申请日期2003年7月17日 优先权日2003年7月17日
发明者全志伟, 李济宇, 张强, 刘建文 申请人:上海第二医科大学附属新华医院