专利名称：熊果酸在制备抗癌药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物化学技术领域。具体涉及熊果酸制备抗癌药中的应用。
背景技术：
熊果酸(Ursolic acid)是山茱萸、夏枯草、山楂等中药材的鉴别成份，亦是六味地黄丸、七味都气丸、山楂化滞丸等中成药的有效成份之一(中国药典2000年版一部)。
祖国医药早已证实熊果酸有抗菌、消炎、调节免疫、降低血清转氨酶等药理活性，近年日、美、法、英、韩等国还发现熊果酸对肾癌、黑色素瘤(Z.Naturforsch，56(1-2)45-8，2001)，结肠癌、卵巢癌、中枢神经系统癌、人非小细胞肺癌(Planta Med，66(5)485-6，2000)，人表皮样瘤(Anticancer Res.20(6B)4563-70，2000)、人肝癌、卵巢癌(ArchPharm Res，23(2)155-8，2000)，人急性早幼粒细胞白血病(PharmacolToxicol，86(2)53-8，2000)及畸胎瘤(Planta Med，64(5)468-70，1998)等癌细胞有一定的细胞毒效应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究熊果酸在制备抗癌药中的应用。
本发明用MTT法亦证明熊果酸对人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(ZR-75-30)、人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)、人慢性髓性白血病细胞(K-562)、人淋巴瘤细胞(Jurkat)、人成淋巴细胞白血病细胞(Molt-4)和人急性成淋巴细胞白血病细胞(CCRF-CEM)都有细胞毒效应。
MTT法是现代检测细胞存活率最经典的基本方法。该法利用活细胞具酶活性而死细胞无酶活性的原理设计。由于黄色的四氮唑[MTT，3-(4.5-dimethylthiazol-2-y’)-2.5-diphenyltetrazolium bromide]能接受脱氢酶给予的氢原子而转变为蓝紫色的甲次(formazan)；活细胞因具脱氢酶，故能被染成蓝紫色。死细胞无活性脱氢酶，故不呈蓝紫色。
进一步在细胞培养液中加入二甲亚砜(DMSO)，可使蓝紫色的甲次溶出。培养液中活细胞越多，蓝紫色越深，在一定波长(595nm)下用酶标仪可测得其光密度值(A值)，根据其与对照组A值相比，可定量折算相对抑瘤率 结果发现，熊果酸即使在微量浓度下(10-40μM)对人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(ZR-75-30)、人淋巴瘤细胞(Jurkat)及人急性成淋巴细胞白血病细胞(CCRF-CEM)、人成淋巴细胞白血病细胞(Molt-4)、人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)及人慢性髓性白血病细胞(K562)等都有一定的抑制效应，且抑制强弱与药物浓度和作用时间呈正相关。即熊果酸浓度越高，药物作用时间越长，抑制率越高。熊果酸在20μM浓度下，作用1天，其对人肝癌细胞(HepG2)的抑制率为42％；作用3天，抑制率上升到78％；熊果酸浓度升至40-80μm时，作用1天，抑制率为85-95％，作用3天，熊果酸对肝癌细胞的抑制率上升到99-100％(表1)；又如人乳腺癌细胞当在含40μM浓度的熊果酸的培养基内培养1天时，细胞成活率为43％，培养3天时成活率下降到16％；熊果酸浓度提高到60μM时，培养1天成活率为15％，培养3天时成活率降至5.8％，即94％以上细胞被熊果酸所抑制。
本发明通过下列实施例进一步阐述本发明。
具体实施例方式
实施例一 熊果酸对人乳腺癌细胞的毒杀效果1.细胞培养取人乳腺癌细胞株ZR-75-30(ductal carcinoma，CRL-1504)接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco BRL公司产品)中，每3天更换培养基，待细胞长满培养皿底壁后倒去培养基，用37℃无菌的磷酸缓冲液(pH7.2)涮洗，再加0.25％胰蛋白酶，37℃酶解使细胞脱壁，取1/3的细胞用于传代，实验前共传代4次。
2.接种及加药将酶解后单个悬浮的ZR-75-30细胞用相应的完全培养基调细胞浓度为1×104个/ml，然后接种于96孔板中。每孔接种50μl(5×103/孔)每块板上留3孔加入不含细胞的培养基(50μL/孔)作为空白对照。接种后，96孔板置于37℃，含5％CO2培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度的熊果酸(用DMSO溶解)，每孔50μL。继续在相同条件下培养1至5天。每个浓度用3孔作为平行对照。另用含相同浓度的DMSO作为无药对照。
3.MTT法测定活细胞数在实验终止前4小时，加入每孔10μL MTT的PBS溶液(5mg/ml)，并继续在37℃，5％CO2的条件下孵育至实验结束。然后，每孔加入100μL DMSO，终止反应，然后在酶标仪(BIO-RADMicroplate Reader，Model 550)上以655nm作为参考波长，在595nm下读出A值，扣除无细胞孔的空白对照值，即为测定值。
4.细胞存活率和相对抑制率以无细胞的孔读数作为无细胞存活，未加熊果酸的细胞培养孔读数作100％细胞存活，从加药孔的A值计算其细胞存活率或用下述公式计算相对抑制率。
细胞存活率％＝样品孔平均A值÷空白对照孔平均A值×100％结果熊果酸能使培养的人乳腺癌细胞成活数明显减少，其减少数与药物浓度及药物作用时间相关，即药物浓度越高，作用时间越长，细胞成活数越少。如人乳腺癌细胞在含熊果酸20、40、60、80μM培养液中培养1天，其成活率分别为96.0、43.7、15.2、8.5和5.1％，即熊果酸在20、40、60、80μM浓度下对人乳腺癌细胞的相对抑制率分别为4.0、56.3、84.8和91.5％。在相同药物浓度下凡细胞接触药物时间越长，其活细胞数亦越少。人乳腺癌细胞在40μM熊果酸浓度下培养1天细胞存活率为43.2％，培养2天为18.6％，培养3天活细胞仅为16.1％，其它浓度亦类似(表1)表1 熊果酸对人乳腺癌细胞的毒杀效果(MTT法)
实施例二 熊果酸对人肝癌细胞的毒杀效果取保存在液氮罐中的肝癌细胞HepG2(Hepatocellulas carcinoma，HB-8065)解冻后，移入含10％胎牛血清的完全MEM培养基(Minimum Essential Medium，Gibco BRL公司产品)中，每3天更换培养基，待长满培养皿底壁后用37℃无菌PBS涮洗，然后用少量0.25％胰蛋白酶酶解脱壁，取1/3的细胞传代。实验前共传代3次。
将上述酶解后单个悬浮的HepG2细胞用MEM完全培养基调整细胞浓度为1×104个/ml，然后接种于96孔板中。每孔接种50μL(5×103/孔)。与实施例一相同，每块板上留3孔加入不含细胞的培养基(50μL)作为空白对照。置96孔板于37℃，CO2培养箱中培养24小时，然后加入10-80μM浓度的熊果酸，继续培养1至5天。每个浓度用3孔作为平行对照。另用含相同浓度的DMSO作为无药对照。在实验终止前4小时，每孔加入10μl的MTT溶液，并继续在37℃，5％CO2的条件下孵育至实验结束。然后，每孔加入100μl的溶剂(10％SDS，含0.01ml/L的HCL)，37℃孵育过夜。在595nm下测各孔A值。扣除无细胞孔的空白对照值后，即得各试验孔的A值。以未接种细胞的培养孔A值作为无活细胞，未加熊果酸的细胞培养孔A值作为100％存活。从各药物孔的A值折算成细胞相对成活率和抑制率，结果在20μM-80μM熊果酸浓度下作用24hr，肝癌细胞的抑制率为42.2～95.4％；作用3天的抑制率为73.7～99.7％；作用5天的抑制率为78.1～100％(表2，
图1)表2 熊果酸对肝癌细胞(HepG2)的毒杀效应(MTT法)
实施例三 熊果酸对人淋巴瘤细胞及人急性成淋巴细胞等白血病细胞的毒杀效应1.细胞株人淋巴瘤细胞株Jurkat(TIB-152)，人急性成淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM(CCL-119)，人急性早幼粒白血病细胞株HL-60(CCL-240)，人成淋巴细胞白血病细胞株Molt-4(CRL-1582)，人慢性髓性白血病细胞株K562(CCL-243)，上述细胞均购自ATTC。括号中为ATCC编号。
2.细胞培养将上述悬浮生长的5株白血病细胞分别培养于含10％胎牛血清的完全RPMI 1640培养基中，每毫升培养基另加青霉素、链霉素各100单位，在37℃，5％CO2培养箱中培养，每3天数取1/3-1/4的细胞定期传代以保持在对数生长期内。
3.接种及加药将悬浮的Jurkat、HL-60、CCRF-CEM、Molt-4及K562细胞分别用完全培养基调整细胞密度为2×105个/ml，然后接种于96孔板中，每孔接种50μl，孵育过夜。然后加不同浓度的熊果酸(50μl/孔)。继续培养1、3、5天。
4.MTT法测定活细胞数按实施例一相同方法加MTT，在595nm下测各孔吸光值(A值)，计算各自的平均抑制率。按下式求出IC50值。
结果熊果酸即使在2.5-15μM的低浓度下对人淋巴瘤细胞及几种急、慢性白血病细胞都有一定的抑制效应。不同类型的白血病细胞对熊果酸敏感度略有差异。在15μM浓度下熊果酸对HL-60、Molt-4和K562的抑制率为38.9、33.2和56.2％，但对人淋巴瘤细胞(Jurkat)和人急性成淋巴细胞白血病(CCRF-CEM)的抑制率高达83.9和98.8％(表3)。
表3 熊果酸对Jurkat等5种白血病细胞的抑制率
上述试验结果表明低浓度(15μM)的熊果酸对人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(ZR-75-30)、人淋巴瘤细胞(Jurkat)、人成淋巴细胞白血病(Molt-4)、人急性成淋巴细胞白血病细胞(CCRF-CEM)、人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)及人慢性髓性白血病细胞(K562)都有细胞毒效应。熊果酸对上述癌细胞的抑制活性可随药物浓度和作用时间增加而加强。
权利要求
1.一种熊果酸在制备抗癌药中的应用
2.根据权利要求1所述的一种熊果酸在制备抗癌药中的应用，其特征在于其中所述的熊果酸在15μM低浓度情况下对人肝癌、乳腺癌、淋巴瘤、成淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性早幼粒白血病和慢性髓性白血病都有细胞毒效应，并且熊果酸浓度越高，与细胞作用时间越长，细胞毒效果越强。
全文摘要
本发明属于药物化学技术领域。本发明公开了熊果酸在制备抗癌药中的应用。通过试验表明熊果酸对人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人淋巴瘤细胞、人成淋巴细胞白血病和人急性成淋巴细胞白血病、人急性早幼粒白血病及人慢性髓性白血病都有细胞毒效应。
文档编号A61K31/56GK1589799SQ0315071
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月1日 优先权日2003年9月1日
发明者杨晓彤 申请人:太平保健药业(蛇口)有限公司