专利名称：山楂总酚酸部位的制备工艺和应用的制作方法
技术领域：
本发明属医药领域，具体说是从山楂叶或果实中分离得到总酚酸部位的制备工艺、制剂及在医药及保健食品上的潜在应用。
背景技术：
心脑血管疾病是目前世界各国发病率较高的疾病之一。随着社会经济的发展，人民生活水平的提高，心脑血管疾病的患病率也在逐年增长。据有关资料报道，2001年全球有5600万人死亡。冠心病和卒中两种主要病因分别与700万和550万人的死亡有关。正因为如此，世界各国都非常重视心脑血管疾病的研究和防治。但到目前为止，尽管有许多心脑血管治疗药物在临床应用，对治疗心脑血管疾病发挥了很好的作用，但是并未能控制心脑血管疾病患病率增长的势头，这从一个侧面反映出还需要进行不断努力，开发出更有效的新药，投入到临床应用。同时由于经济发展不平衡，目前心脑血管的治疗费用使不少患者不能得到很好的治疗，也需要开发出能满足广大患者需要的、价格较低的新药，为防治心脑血管疾病作贡献。
山楂为蔷薇科山楂属植物，全世界有该属植物280余种，在中国有19种。其果实为常用中药，也是我国药典品种。据《本草纲目》记载此品“酸甘味温，消食积，补脾”。其果实中含有多种生理活性成分，如黄酮类成分、熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、有机酸、矿物质和微量元素等，具有多种药理功效，是我国重要的生物资源，被国家列为药食兼用品种。自50年代以后，研究人员发现山楂叶也具有多种生理活性。研究较多的为山楂叶总黄酮类成分，目前已有数种山楂叶总黄酮的提取物以及山楂叶总黄酮制剂(如益心酮片及胶囊)，主要用于冠心病、高血脂等症的治疗。
目前认为山楂中发挥药理作用的是其中的总黄酮类成分，也有一些关于山楂总黄酮的分离提取专利(如申请号为01103986.8和申请号为01118628.3)，但是我们经过研究发现，当将山楂总黄酮提取物中的黄酮含量进一步提高以后，活性反而下降。这提示我们山楂中发挥药理作用的可能为山楂中的非黄酮类成分。
发明内容
本发明提供了一种从山植叶或果实中分离得到山楂总酚酸部位的制备方法，及该部位在医药及保健食品中的潜在应用价值。
按照以下方法，我们得到了山楂总酚酸部位。即将山楂叶或果实经含水醇提取，提取液减压浓缩，放置沉淀，上清液经大孔吸附树脂层析，水洗脱部分调节pH值至1～2后，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后以水溶解，再经大孔吸附树脂层析，水洗脱后，续以含水醇或含水丙酮洗脱，洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得到黄色粉末，即为山楂总酚酸部位。
本发明所使用的药材可以为山楂叶或山楂果实，但山楂叶中的总酚酸含量要高于山楂果实，且因为山楂果实中糖分及淀粉含量高，因此，实际使用山楂叶比山楂果实要好。
本工艺所使用的含水醇可以为甲醇，乙醇以及其它的C1～C5的低级脂肪醇。提取所用的含水醇的浓度为50％～90％，洗脱大孔吸附树脂采用20％～60％的含水醇或含水丙酮。
本工艺所采用的大孔吸附树脂包括各种非极性、弱极性、中极性、极性的国产或进口大孔吸附树脂。
上述的有效部位含有咖啡酸、咖啡酰奎宁酸类化合物、咖啡酰苏阿糖酸类化合物等酚酸成分。应用HPLC所认识的化学成分的含量占有效部位的50％以上。
利用该有效部位可制成临床上各种制剂注射针剂、注射用粉针剂、口服片剂、冲剂、胶囊、滴丸、口服液等。
上述制剂可用于预防和治疗各种缺血性心脑血管疾病、老年痴呆、高血脂症方面的应用。
下面的动物实验研究进一步说明了本发明山楂总酚酸部位有效作用
1.急性毒性试验健康昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重18～22g；健康SD大鼠40只，雌雄各半，体重150g左右。
口服给予山楂总酚酸部位，测不出LD50值，故本实验分别测定其对小鼠和大鼠的最大耐受量(MTD)。大小鼠均按最大给药体积灌服给药，上下午各一次。给药前小鼠禁食不禁水5小时，大鼠禁食不禁水12小时。
实验结果表明小鼠一日口服山楂总酚酸部位2.2g/公斤(分两次灌服)，会造成动物自主活动减少，食欲下降，体重增长缓慢等反应，上述反应在两周内恢复，未造成动物死亡。说明小鼠口服山楂总酚酸部位的最大耐受量大于2.2g/公斤(相当于临床剂量的550倍)。
大鼠一日口服山楂总酚酸部位2.8g/公斤(分两次灌服)，会造成动物自主活动减少，食欲下降等反应，上述反应在两周内恢复，未造成动物死亡。说明小鼠口服山楂总酚酸部位的最大耐受量大于2.8g/公斤(相当于临床剂量的700倍)。表明山楂总酚酸部位具有较高的安全性。
2.对大鼠局灶性脑缺血的影响取雄性SD大鼠70只，体重300～400g，按体重随机分为6组，分别为山楂总酚酸高剂量组(8mg/公斤)，中剂量组(4mg/公斤)，低剂量组(2mg/公斤)，阳性对照尼膜同组(1.2mg/公斤)，假手术组及缺血模型对照组(均给以等量0.5％CMC-Na)。
于实验前7d，每天ig 1次，第7天最后一次于缺血前60min给药。采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。大鼠用10％水合三氯乙醛(300mg/公斤)ip麻醉，仰卧恒温手术台上颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将尼龙线经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进20mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了MCA的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。1h后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤，完成MCAO导致局灶性脑缺血-再灌模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞大脑中动脉。术后24h按Bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分。MCAO 24h后，断头处死大鼠，取出全脑，左右脑分别切开，称重。在右脑视交叉及其前后各2mm处，做冠状切片，脑切片于1％TTC溶液中避光37(C孵育25min，分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，计算梗塞百分比。将染色后的脑组织烘干，对照大脑湿重求出脑含水量。
实验结果表明结果显示，大鼠ig山楂总酚酸2、4、8mg/kg后，动物行为变化及梗塞范围与生理盐水对照组比较有明显改善，24h后行为评分分别降低了43.25％(p＜0.01)、60.70(p＜0.001)、63.88(p＜0.001)；脑梗塞面积平均缩小了30.2％(p＜0.01)、47.3(p＜0.01)、50.9(p＜0.001)。高剂量组与尼膜同组作用强度相当。2)对局灶性脑缺血大鼠生化指标的影响取雄性大鼠70只(300～400g)，分组给药，手术方法如前。MCAO 24h后，大鼠断头处死，取脑，去除小脑。将大脑用生理盐水制成10％匀浆，测定大脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)和乳酸(LA)等的含量。实验结果表明山楂总酚酸可使大鼠再灌注损伤的脑组织内的MDA，LA等含量降低，表明组织缺血缺氧和过氧化程度受到明显抑制；同时SOD和GSH含量增加，反映了药物对机体抗氧化能力和清除自由基的能力有提高。
3.对犬心肌缺血的治疗作用及血流动力学影响犬30只，分为6组。冠状动脉左前降支(LAD)假手术生理盐水组，LAD阻断生理盐水组，LAD阻断普萘洛尔组，LAD阻断山楂总酚酸3个剂量组(2、4、8mg/kg)。iv戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，气管插管行人工呼吸，于左第4肋间开胸，分离冠状动脉左旋支根部，放置电磁流量计探头，记录血流量。颈总动脉插管记录颈总动脉血压。从心尖插管至左室测量左室压，并测定左室舒张末期及左室压力变化速率最大值。用心率计测定心率，同时观察II导联心电图。术后稳定10min后，在RM-6000型生理记录仪上述诸指标，为给药前数据。股静脉注射给药，5min后结扎LAD，记录LAD阻断后1，2，5，10，20，30，60，90，120，240，360min时的上述诸指标(药后数据)。于给药前和给药后20，40，60，90，120min从冠状静脉窦及颈总动脉同时取血，用CORNING178型血气分析仪测定血氧含量。计算心肌血流量、冠脉阻力、心肌耗氧量、心肌耗氧指数、心肌氧利用率。
试验结果表明，输注山楂总酚酸部位2mg/kg对血流动力学各项指标无明显影响；4、8mg/kg可明显增加心肌血流量，降低冠脉阻力，显著降低心肌耗氧量及心肌耗氧指数，降低心肌氧利用率。
4.对鹌鹑高脂血症和动脉粥样硬化的作用取健康雄性鹌鹑60只，随机分成6组，每组10只。正常饲料组；高脂模型组喂高脂饲料(内含79％基础饲料，1％胆固醇，20％猪油)；山楂总酚酸部位小、中、大剂量组40、80和160mg/kg.d；洛伐他汀阳性对照组4mg/kg.d。除正常对照组给正常饲料和高脂模型组给高脂饲料外，各组在给高脂饲料的同时分别给不同的药物。各组动物分笼饲养，定量给食，每日给药1次，连续给药60d后颈静脉取血，分别测定血清TC、TG和HDL-C，LDLC-C按公式LDL-C＝TC-(1/2.2TG+HDLC-C)计算，然后处死动物，取出主动脉和肝脏，观察动脉壁病损情况及肝脏脂肪变性程度。
实验结果表明1)对血脂的影响 鹌鹑灌服山楂总酚酸部位60d后，中剂量组(80mg/kg.d)可明显降低血清TC、TG和LDL-C的含量(p＜0.05)，降低百分率分别为36.21％、29.18％和35.27％。大剂量组(160mg/kg.d)可显著降低血清TC、TG和LDL-C的含量(p＜0.01)，降低百分率分别为47.29％、43.38％和45.87％，同时可使TC/HDL-C比值明显降低(p＜0.05)，降低百分率为36.92％。2)对动脉粥样斑块形成的影响鹌鹑灌服山楂总酚酸部位后，斑块面积百分率和平均灰度在3种不同剂量组可分别下降7.3％～29.8％和8.4％～21.9％，大剂量组降低斑块面积百分率和平均灰度的作用非常显著(p＜0.01)。显微镜下观察也可见山楂总酚酸部位组的主动脉内膜厚度较高脂模型组为薄，出现的泡沫细胞数也较少。3)对肝脏的影响鹌鹑灌服山楂总酚酸部位80mg/kg和160mg/kg 60d后，肝脏重量系数有明显降低(p＜0.01)。肝组织切片镜检也可见用药组的肝脂肪变性程度较高脂模型组明显减轻。上述实验结果表明山楂总酚酸部位具有明显的降血脂和预防动脉粥样硬化的作用。
本发明与现有技术比较具有以下优点或积极效果1.相对于其它的一些心脑血管药物，山楂叶或果实具有原料来源充足、价格便宜，成本低。
2.现有技术一般认为山楂的活性部位为其中的总黄酮类成分。我们的研究结果表明，山楂总酚酸部位的活性要强于山楂总黄酮部位。
3.现有的关于山楂提取物及制剂均是针对其中的山楂总黄酮类成分。本发明提供了山楂总酚酸部位的制备工艺、质量标准及在医药上的应用。
4.现有的山楂的提取物及制剂的质量标准是测定总黄酮的含量来制定，测定方法也多以紫外法测定，因紫外法干扰大，测定方法不准确。而本发明应用HPLC法测定，其中可认识的有效成分的含量达到50％以上。
5.因为成分的差异，现有的关于山楂制剂水溶性差，一般只能制成口服制剂，如片剂、胶囊、滴丸。而本发明得到的山楂总酚酸部位可以制成包括注射剂型在内的多种制剂。
图1为本发明的山楂总酚酸部位的提取工艺流程图。
具体实施例方式实施例一有效部位的制备取干燥的山楂叶100kg，粉碎成粗粉，用10倍量60％乙醇分三次回流提取，合并提取液，减压浓缩至50L，放置沉淀，离心，上清液经AB-8大孔吸附树脂层析，水洗脱部分调节pH值至1后，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后以水溶解，再经AB-8大孔吸附树脂层析，以水洗脱至pH值为3～5，继续以60％的稀丙酮洗脱，洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得到浅黄色粉末0.52kg，即为山楂总酚酸部位(按生药量计得率为0.52％)。经含量测定，纯度为84.79％。
实施例二有效部位的制备取干燥的山楂果实100kg，粉碎，用20倍量80％甲醇分渗漉提取，合并渗漉液，减压浓缩至50L，放置沉淀，离心，上清液经D101大孔吸附树脂层析，水洗脱部分调节pH值至2后，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后以水溶解，再经AB-8大孔吸附树脂层析，以水洗脱至pH值为3～5，继续以20％的稀乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得到浅黄色粉末0.42kg，即为山楂总酚酸部位(按生药量计得率为0.42％)。经含量测定，纯度为67.25％。
实施例三片剂的制备取本发明部位100g、淀粉80g、糊精5g混合均匀，加入10％淀粉浆制软材，用14目尼龙筛网制粒，60～70℃通风干燥，16目筛整粒，加硬脂酸镁1.5g、羧甲基淀粉纳5g混匀，压制成1000片，包衣即得。每片含本发明部位100mg。成人每日2～5次，每次1～10片。
实施例四口服液的制备取本发明部位20g，与蜂蜜30g、蔗糖50g、苯甲酸钠2g及蒸馏水300ml混合，加热至85～90℃，搅拌使溶解，保温30min，滤过，滤液加水稀释至1000ml，搅匀，灌封(每支10ml)，灭菌即得。成人每日2～5次，每次1～5支。
实施例五注射液的制备取本发明部位50g，加注射用水适量使溶解，加配制量的0.02％活性炭搅拌5～10min，滤过，滤液稀释至10L左右，加氯化钠调节渗透压至等渗，调节pH5.5～7.5，超滤，灌封成1000支(10ml/支)，100℃30min灭菌即得。成人静脉或肌肉注射给药，每日1～2次，每次1～5支。
实施例六粉针剂的制备取本发明部位50g，加注射用水适量使溶解，加配制量的0.02％活性炭搅拌5～10min，滤过，滤液稀释至1L，调节pH5.5～7.5，超滤，喷雾干燥，干粉无菌分装即得。每支50mg，临用前加注射用水适量使溶解，用氯化钠输液100～500ml稀释后缓慢静脉滴注。成人每日1～2次，每次1～5支。
权利要求
1.一种山楂叶或果实中提取有效部位的制备工艺，其特征是山楂叶或果实经提取得到其中的总酚酸部位。
2.根据权利要求1所述的总酚酸部位，其特征在于其提取工艺可由以下提取方法得到山楂叶或果实经粉碎后，以含水醇提取，提取液减压浓缩，放置沉淀，上清液经大孔吸附树脂层析，水洗脱部分调节pH值至1-2后，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后以水溶解，再经大孔吸附树脂层析，含水醇或含水丙酮洗脱，洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得到浅黄色粉末，即为山楂总酚酸部位。
3.根据权利要求1、2所述的山楂总酚酸部位，其特征在于该有效部位含有咖啡酸、咖啡酰奎宁酸类化合物、咖啡酰苏阿糖酸类化合物。
4.根据权利要求2所述的山楂总酚酸部位的提取方法，其特征在于所说的醇为甲醇、乙醇及其它C1～C5的低级脂肪醇。
5.根据权利要求2所述的山楂总酚酸部位的提取方法，其特征在于对药材进行提取时所用的含水醇的浓度为50％～90％。
6.根据权利要求2所述的山楂总酚酸部位的提取方法，其特征在于洗脱大孔吸附树脂时所用的含水醇或含水丙酮的浓度为20％～60％。
7.根据权利要求1、2所述的山楂总酚酸部位，其特征在于总酚酸含量在50％以上。
8.按权利要求1、2所述的山楂总酚酸部位，其特征在于可将该部位单独或与其它药用许可的辅料配合后按现有方法制成片剂、胶囊、滴丸、颗粒剂、口服液、注射剂等各种口服和注射剂型。
9.按权利要求8所述的山楂总酚酸制剂在预防和治疗各种缺血性心脑血管疾病、老年痴呆、高血脂症方面的应用。
全文摘要
本发明提供了一种从山楂叶或果实中提取山楂总酚酸部位的技术。该部位可单独或与其他药用许可的辅料配合后制成口服和注射剂型，适用于各种缺血性心脑血管疾病、老年痴呆、高血脂症的预防与治疗。
文档编号A61K9/20GK1589845SQ0315054
公开日2005年3月9日 申请日期2003年8月26日 优先权日2003年8月26日
发明者张蓉 申请人:上海永恒生物科技有限公司