专利名称：层-层自组装固定生物活性因子于组织工程材料上的方法
技术领域：
本发明涉及组织工程用材料的生物活化改性，尤其是采用层-层自组装技术固定生物活性因子于组织工程材料上的方法。
背景技术：
组织工程是一个涉及到医学、化学、生物学、材料学等多学科、多领域的交叉研究课题。在组织工程的研究中，将生物活性因子有效地固定到组织工程材料表面，构建生物活化支架材料是其中的重要环节，直接影响到目的细胞的增殖和功能表达。生物活性因子是一类通过特异的、高亲和性的细胞膜上的受体结合，最终刺激细胞增殖和其它生物学效应的多肽类物质。它们对靶细胞的作用表现为多功能性。它们存在于血小板和各种成体或胚胎组织以及大多数培养细胞中。生物活性因子是多细胞生物中细胞间交流的基础，是强有力的细胞行为的调节剂。它具有调节细胞的增殖、迁移、分化及蛋白表达等功能，并且在组织再生中具有治疗作用。生物活性因子也可开发成生物材料和生物材料系统的组成部分。生物活性因子不仅对促进移植细胞的增殖与分化有直接的作用，而且可维持它们的生物功能。
生物活性因子与组织工程支架的复合是实现组织工程支架生物活性化的重要手段，复合有生物活性因子的支架可加速组织的再生。传统的复合技术主要有物理吸附法和化学固定法。简单的物理吸附不能达到稳定固定生物活性因子的目的，而化学方法固定则有可能使生物活性因子丧失其生物活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便易行的层-层自组装将生物活性因子固定到组织工程材料上的方法。
本发明方法是利用生物活性因子在一定pH条件下带电荷的特性，通过层-层自组装技术将其与具有相反电荷的聚电解质交替组装到组织工程材料表面，获得具有促进目的细胞增殖与功能表达的生物活性化的组织工程材料。该方法具体包括以下步骤1)将按常规经过阴离子化或阳离子化的组织工程用材料置于含有0.01-100mg/ml的聚电解质的0.01-10M的盐溶液中浸泡0.1-100分钟，然后移至0.01-10M的盐溶液中重复漂洗数次，每次漂洗0.1-100分钟；
2)将上述组装有聚电解质的材料置于含0.01-100μg/ml的生物活性因子的0.01-10M且pH值为5-12的磷酸盐缓冲溶液中浸泡0.1-100分钟，然后移至0.01-10M的pH值为5-12的磷酸盐缓冲溶液中重复漂洗数次，每次漂洗0.1-100分钟；3)依次重复步骤1)和2)或依次重复步骤2)和1)，获得组装了不同层数生物活性因子的组织工程用材料。
根据材料和生物活性因子的电荷特性，上述步骤1)和2)的顺序可互换，即先组装聚电解质，后组装生物活性因子，或先组装生物活性因子，后组装聚电解质。
上述的经过阴离子化或阳离子化的组织工程用材料可以是玻璃、石英玻璃、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨酯或聚已内酯的平面膜、多孔支架、线、棒或者管等。材料的阴离子化或阳离子化可以按常规通用方法进行，如含有氨基的材料经酸处理后带正电，而含有羧基的材料经碱处理后带负电；也可利用材料在特定pH条件下的带电特性进行组装。
本发明中，所说的聚电解质指的是与所固定的生物活性因子具有相反电荷的聚合物，如包括有硫酸软骨素、壳聚糖、明胶或海藻酸钠等。生物活性因子指的是细胞粘附因子、细胞生长因子或细胞分化因子，如包括有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮细胞生长因子(VGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF)等。对所说的盐溶液所用盐没有特别要求，可以是氯化钠，氯化钾等。
本发明的优点该方法充分利用了生物活性因子在一定pH条件下的电荷特性，通过与带相反电荷的聚电解质的交替组装，达到将生物活性因子固定到材料表面的目的。层-层自组装技术固定生物活性因子在解决组装层稳定化问题的同时又不破坏生物活性因子的功能，而且该方法能有效保持支架材料特定的微结构，特别适合具有复杂三维结构的组织工程支架的生物活化改性。该方法工艺简单可行，重复性好，适合于各种带电荷的生物活性因子，具有应用的广泛性。通过本发明可以制备出具有可促进目的细胞增殖与功能性表达的生物活性化的组织工程支架，可以广泛地应用于皮肤、软骨、骨、血管、神经、肌腱、心脏瓣膜等多种组织工程支架改性。
图1为罗丹明标记的bFGF紫外-可见吸收值随组装层数变化曲线；图2为交替组装bFGF和硫酸软骨素(CS)后石英表面接触角的变化曲线；图3为层-层自组装bFGF/CS多层膜在石英表面的稳定性；图4成纤维细胞在组装bFGF/CS前后的胶原平面膜的增殖曲线；图5a为未组装bFGF/CS的胶原支架的表面SEM图；图5b为组装了2双层bFGF/CS后胶原支架的表面SEM图；图5c为组装了6双层bFGF/CS后胶原支架的表面SEM图；图5d为组装了10双层bFGF/CS后胶原支架的表面SEM图；图6组装bFGF/CS前后胶原支架中成纤维细胞的MTT活性；图7a为组装了5双层bFGF/CS胶原支架体外培养3天后的组织切片图；图7b为组装了5双层bFGF/CS胶原支架体外培养7天后的组织切片图；图7c为组装了5双层bFGF/CS胶原支架体外培养21天后的组织切片图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作详细说明。
实施例1紫外-可见光谱表征石英表面层-层自组装碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)/硫酸软骨素(CS)的过程将接枝了KH-550的石英玻璃浸泡于3％的乙酸溶液中15分钟，使石英玻璃表面的氨基质子化(即阳离子化)，然后将其放入含有1mg/ml硫酸软骨素的0.1M NaCl溶液中浸泡15分钟。组装了一层硫酸软骨素的石英玻璃放入0.1M的NaCl溶液中漂洗3次，每次漂洗2分钟。经过漂洗后的石英玻璃放入10μg/ml的罗丹明标记的bFGF(Rd-bFGF)的PBS溶液(pH值7.4)中浸泡15分钟，然后用PBS(pH值7.4)溶液漂洗3次，每次漂洗2分钟。重复以上步骤就可以得到组装了多层bFGF/CS的石英玻璃表面。每组装了一个双层之后用紫外-可见分光光度计来检测Rd-bFGF在560nm处吸收(图1)。由图1可见，随着Rd-bFGF组装层的增加，其于560nm的吸收呈线性增加，从而证明bFGF与CS在石英玻璃表面层-层自组装的发生。
实施例2接触角测定仪表征石英表面层-层自组装碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)/硫酸软骨素(CS)的过程将接枝了KH-550的石英玻璃浸泡于3％的乙酸溶液中15分钟，使石英玻璃表面的氨基质子化(即阳离子化)，然后将其放入含有1mg/ml硫酸软骨素的0.1M NaCl溶液中浸泡15分钟。组装了一层硫酸软骨素的石英玻璃放入0.1M的NaCl溶液中漂洗3次，每次漂洗2分钟。经过漂洗后的石英玻璃放入10μg/mlbFGF的PBS溶液(pH值7.4)中浸泡15分钟，然后用PBS溶液(pH值7.4)漂洗3次，每次漂洗2分钟。重复以上步骤就可以得到组装了多层bFGF/CS的石英玻璃表面。每组装一层用表面张力仪测定其接触角的变化从而跟踪自组装的发生(图2)。由图2可见，随着组装过程中bFGF和CS的交替变化，石英表面的接触角也同时发生交替变化，同样证明这两种物质在石英表面层-层自组装行为的发生。
实施例3紫外-可见光谱评价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)/硫酸软骨素(CS)多层膜在石英表面的稳定性将接枝了KH-550的石英玻璃浸泡于3％的乙酸溶液中15分钟，使石英玻璃表面的氨基质子化(即阳离子化)，然后将其放入含有1mg/ml硫酸软骨素的0.1M NaCl溶液中15分钟。组装了-层硫酸软骨素的石英玻璃放入0.1M的NaCl溶液中漂洗3次，每次漂洗2分钟。经过漂洗后的石英玻璃放入10μg/ml的罗丹明标记的bFGF(Rd-bFGF)的PBS溶液(pH值7.4)中浸泡15分钟，然后用PBS(pH值7.4)溶液漂洗3次，每次漂洗2分钟。重复以上步骤得到组装10层的Rd-bFGF/CS的石英玻璃表面。将其浸泡于PBS缓冲液中，测定浸泡不同时问后的石英玻璃表面Rd-bFGF的紫外-可见吸收，从而考察组装后的Rd-bFGF/CS多层的稳定性(图3)。结果显示，通过层-层自组装技术构建的Rd-bFGF/CS多层具有较好的稳定性，在24小时的PBS环境中浸泡后bFGF仍有较大程度的保留。
实施例4胶原平面膜表面层-层自组装成纤维细胞生长因子(bFGF)/硫酸软骨素(CS)后细胞相容性评价将经干热交联的胶原平面膜浸泡于3％的乙酸溶液中15分钟，使胶原表面的氨基质子化(即阳离子化)。然后将平面膜放入含有1mg/ml硫酸软骨素的0.1MNaCl溶液中15分钟，组装-层硫酸软骨素的胶原平面膜于0.1M的NaCl溶液中漂洗3次，每次漂洗2分钟。经过漂洗后的胶原平面膜放入10μg/ml的bFGF的PBS溶液(pH值7.4)中浸泡15分钟，然后用PBS(pH值7.4)溶液漂洗3次，每次漂洗2分钟。重复以上步骤就可以得到组装了10层bFGF/CS的胶原平面膜。将制备的平面膜用环氧乙烷熏蒸的方法对其消毒、灭菌。然后于96孔培养板中，以每孔1万的密度种植人体成纤维细胞进行细胞培养。分别于种植后2天、4天、6天、8天检测细胞数量，每组平行3个样品(图4)。图中可见，在整个培养过程中，细胞在组装了bFGF的胶原平面膜上得到更快的增殖，而且到培养后期，在组装了bFGF的胶原平面膜上的细胞数量高于在96孔培养板表面培养的细胞。
实施例5层-层自组装成纤维细胞生长因子(bFGF)/硫酸软骨素(CS)的胶原支架的微结构变化用0.5％的胶原溶液于-20℃条件下冷冻1小时后，冷冻干燥制备得到未交联胶原多孔支架。经干热交联后于20mM 1-乙基-3-(二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDAC)/10mM N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的50mM 2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)的溶液中，室温交联24小时。交联之后用三蒸水洗6次，每次10分钟。经过冷冻干燥即可得到交联后的多孔支架将胶原多孔支架浸泡于3％的乙酸溶液中15分钟，使胶原表面的氨基质子化(即阳离子化)，然后将多孔支架放入含有1mg/ml硫酸软骨素的0.1M NaCl溶液中15分钟，组装一层硫酸软骨素的胶原多孔支架于0.1M的NaCl溶液中漂洗3次，每次漂洗2分钟。经过漂洗后的胶原支架放入10μg/ml的bFGF的PBS溶液(pH值7.4)中浸泡15分钟，然后用PBS(pH值7.4)溶液漂洗3次，每次漂洗2分钟。重复以上步骤就可以得到组装了2双层、6双层、10双层bFGF/CS的胶原支架。应用扫描电子显微镜(SEM)观测其表面的形貌在组装前后的形貌的变化(图5a、图5b、图5c、图5d)。从图可见，经过层-层自组装后，胶原多孔支架的孔径和微观结构没有明显的变化，证明该方法在使支架生物活性化的同时能有效地保持支架特定的微结构。
实施例6层-层自组装成纤维细胞生长因子(bFGF)/硫酸软骨素(CS)的胶原支架的细胞相容性评价按应用实例5制备交联的胶原多孔支架。将胶原多孔支架浸泡于3％的乙酸溶液中15分钟，使胶原表面的氨基质子化(即阳离子化)，然后将多孔支架放入含有1mg/ml硫酸软骨素的0.1M NaCl溶液中15分钟，组装一层硫酸软骨素的胶原多孔支架于0.1M的NaCl溶液中漂洗3次，每次漂洗2分钟。经过漂洗后的胶原支架放入10μg/ml的bFGF的PBS溶液(pH值7.4)中浸泡15分钟，然后用PBS(pH值7.4)溶液漂洗3次，每次漂洗2分钟。重复以上步骤就可以得到组装了5双层bFGF/CS的胶原支架。将50μl 500万/ml的成纤维细胞悬液注射到胶原多孔支架中，经体外培养3，7，14，21天后测定细胞的MTT活性(图6)。分别取培养3，7，21天的支架样品行组织学观察(图7a、图7b、图7c)。细胞培养的结果显示，组装了bFGF的胶原多孔支架的细胞MTT活性始终高于培养相同天数的纯胶原多孔支架。细胞在种植细胞初期主要分布在支架的边缘(图7a)，经过21天的培养后，在支架内部也可观察到大量分布均匀的成纤维细胞(图7c)。
权利要求
1.层-层自组装固定生物活性因子于组织工程材料上的方法，其特征在于包括以下步骤1)将经过阴离子化或阳离子化的组织工程用材料置于含有0.01-100mg/ml的聚电解质的0.01-10M的盐溶液中浸泡0.1-100分钟，然后移至0.01-10M的盐溶液中重复漂洗数次，每次漂洗0.1-100分钟；2)将上述组装有聚电解质的材料置于含0.01-100μg/ml的生物活性因子的0.01-10M且pH值为5-12的磷酸盐缓冲溶液中浸泡0.1-100分钟，然后移至0.01-10M的pH值为5-12的磷酸盐缓冲溶液中重复漂洗数次，每次漂洗0.1-100分钟；3)依次重复步骤1)和2)或依次重复步骤2)和1)，获得组装了不同层数生物活性因子的组织工程用材料。
2.根据权利要求书1所述的层-层自组装固定生物活性因子于组织工程材料上的方法，其特征在于所说的经过阴离子化或阳离子化的组织工程用材料是玻璃、石英玻璃、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨酯或聚已内酯的平面膜、多孔支架、线、棒或者管。
3.根据权利要求书1所述的层-层自组装固定生物活性因子于组织工程材料上的方法，其特征在于所说的聚电解质指的是与所固定的生物活性因子具有相反电荷的聚合物，包括有硫酸软骨素、壳聚糖、明胶或海藻酸钠。
4.根据权利要求书1所述的层-层自组装固定生物活性因子于组织工程材料上的方法，其特征在于所说的生物活性因子是细胞粘附因子、细胞生长因子或细胞分化因子，包括有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮细胞生长因子(VGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF)。
全文摘要
本发明公开了一种采用层－层自组装固定生物活性因子于组织工程材料上的方法。该方法利用天然生物活性因子在一定pH环境下的带电特性，通过与其它的带相反电荷的聚电解质层－层自组装，将生物活性因子组装到离子化的材料表面，获得具有生物活性的组织工程材料。本发明方法不破坏生物活性因子的生物活性，而且不影响组织工程材料的特定微结构，适合于结构复杂的组织工程支架的改性。本发明工艺简单可行，重复性好，所构建的生物活性支架可以广泛地应用于皮肤、软骨、骨、血管、神经、肌腱、心脏瓣膜等多种组织工程领域。
文档编号A61L27/54GK1515324SQ03150628
公开日2004年7月28日 申请日期2003年8月25日 优先权日2003年8月25日
发明者高长有, 马列, 周杰, 毛峥伟, 沈家骢 申请人:浙江大学