专利名称：熊果酸在制备肿瘤细胞凋亡诱导剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物化学技术领域。具体涉及熊果酸在制备肿瘤细胞凋亡诱导剂中的应用。
背景技术：
人类对付癌症，已筛选出众多毒杀癌细胞的药物，并已在肿瘤的化疗中发挥了重要作用，但这些药物对细胞缺乏选择性，即它亦伤及机体正常细胞，毒副反应大。如何诱发癌细胞发生凋亡，即如何使癌细胞发生自主性死亡，是当今抗癌药筛选的新方向，大有开发前景。
凋亡(apoptosis)亦称程序性细胞死亡(programmed cell dealth，PCD)是一种特殊的细胞死亡形式。它不同于坏死(necrosis)，是一种由基因调控的细胞自主性死亡过程。
凋亡细胞不同于坏死细胞，多发生于单个细胞，发生时细胞形态发生体积变小，胞膜及核膜不断绉褶、鼓泡等明显形态学改变，可直接在显微镜下观察到。
凋亡细胞的生化特征是膜上的磷脂酰丝氨酸(phosphatidy serine，PS)从内层翻转至外层，另外，细胞中的半胱天冬酶(caspase)和核酸内切酶(endonuclease DNase)被激活。Caspase全名为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Cysteine aspartate specific proteinase)，是参与细胞凋亡的关键酶，故又名凋亡酶。核酸内切酶的活化，常使染色体在核小体连接部位发生裂解，产生180-200bp的DNA凋亡片断。
细胞凋亡受bcl-2基因调控。bcl-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2)又称凋亡抑制基因，它编码一簇25-26KD的蛋白(Bcl-2蛋白)可阻止多种凋亡因子引起的细胞凋亡，因此当Bcl-2蛋白表达受抑时，常导致细胞发生程序性死亡。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究开发熊果酸对癌细胞凋亡的诱导作用。
本发明通过流式细胞术(flow cytometry，FCM)对添加熊果酸的癌细胞培养物作细胞学、生物化学及分子免疫学分析，发现熊果酸能使癌细胞形态呈现典型的凋亡特征，磷脂酰丝氨酸翻转于外，半胱天冬酶和核酸内切酶被激活，而bcl-2基因的表达则受阻，熊果酸能诱导癌细胞发生凋亡，是癌细胞凋亡的诱导剂。
本发明提供了熊果酸在在制备肿瘤细胞凋亡诱导剂中的应用。
实施例一熊果酸使HL-60细胞形态出现典型的凋亡特征。
HL-60——人急性早幼粒白血病细胞是当前研究细胞凋亡最经典的模式细胞株，该株ATCC(美国模式细胞株保藏中心)编号为CCL-240，原冷藏于-196℃液氮罐中。实验前取出冻融并培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中(完全培养基，CRPMI)，于37℃，5％ CO2培养箱中培养至对数生长期。然后每2-3天更换2/3培养基，使细胞密度不大于8×105/ml。台盼蓝检查成活率不小于95％。
试验开始时用新鲜CRPMI将细胞稀释成1×105/ml，于CO2培养箱中培养24小时，然后加入熊果酸DMSO溶液，使终浓度为10μM。对照组加入等量的DMSO。细胞继续培养24小时，然后直接取细胞悬液做成装片，置于Lecia550+倒置显微镜上作凋亡形态学观察，并用Quantinet图像处理分析系统记录图像。结果当HL-60细胞在含有10μM熊果酸的培养基中孵育4小时后，细胞呈现皱缩、变小，核膜鼓泡等凋亡的典型特征(图1)图1 熊果酸诱导HL-60细胞凋亡的形态学改变HL-60的对照组细胞(左上)和熊果酸组细胞(左下)右侧两照片是放大的熊果酸组培养细胞，示细胞皱缩(上)和核膜鼓泡(下)*HL-60细胞与10μM熊果酸孵育24小时后，取一滴细胞悬液制成装片置于Lecia550+倒置显微镜上观察(20x物镜)，并用Quantinet图像处理分析系统记录图像。未加熊果酸处理的细胞作为对照实施例二熊果酸使HL-60细胞膜上的磷脂酰丝氨酸由内翻转至外。
已知磷脂酰丝氨酸(PS)位于正常细胞膜膜内，凋亡时翻转于外，该成分又极易与一种命名为Annexin V的磷脂结合蛋白作特异性结合，我们利用这一特性用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的Annexin V用作检测PS的探针。
早期凋亡细胞和死细胞均有PS翻转于膜外，鉴别两者可用复染法。由于早期凋亡细胞、细胞膜结构尚未破坏，具拒染性，不被染料(如碘化丙啶，PI)着染；死细胞(含晚期凋亡细胞)由于膜结构已破坏，细胞失去拒染性，易被着染，因此人们利用Annexin V的荧光标记法和PI复染法，可方便地鉴别出细胞凋亡与否及凋亡早晚。即活细胞由于PS位膜内不会被Annexin V-FITC探针标记，亦不被PI染料着染(Annexin V-/PI-)；凋亡早期细胞能被Annexin V-FITC探针标记，但不被PI着染(Annexin V+/PI-)；凋亡晚期细胞或继发性死细胞，能被Annexin V-FITC标记，亦被PI着染(Annexin V+/PI+)。
具体做法是取与10μM熊果酸共同孵育24小时后的HL-60细胞2×105，离心(500g，5分钟)收集细胞，用PBS洗涤一次，加入100μl含1μg Annexin V-FITC和5μg/ml PI的含钙洗涤液(均为TACSTMAnnexin V-FITC试剂盒组分，Trevigen Inc.，USA)于暗处染色15分钟，然后加入400μl含钙洗涤液并立即用流式细胞仪分析。
结果HL-60细胞接触熊果酸24小时后，活细胞从92.6％下降到67.2％，早期凋亡细胞从3.5％增加到12.3％，晚期凋亡细胞和坏死细胞从4.2％上升到19.4％。(图2)图2用Annexin V检测熊果酸诱导的HL-60凋亡细胞百分比(左对照组细胞，右熊果酸组细胞)HL-60与10μM UA共同孵育24小时后，用Annexin V-FITC和PI进行双染然后用细胞流式仪分析。图中蓝色的代表正常细胞(AnnexinV-/PI-)，红色的为早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)，绿色的为凋亡晚期细胞或坏死细胞(Annexin V+/PI+)。
实施例三熊果酸能激活HL-60细胞内的凋亡酶(caspase)。
已知细胞的凋亡与半胱天冬酶(caspase)的活性密切相关，故caspase又称凋亡酶。荧光标记的凋亡酶抑制剂(Fluorochrome-labeledinhibitor of caspases，FLICA)能专一地与活化了的凋亡酶相结合，从而使该细胞带上荧光标记，用FLICA分别对HL-60细胞及经熊果酸接触24hr后的HL-60细胞作凋亡酶的活性检测，发现熊果酸有诱发凋亡酶活化的作用。具体实验是从熊果酸组和对照组中分别取2×105个细胞，500g离心5min，重新悬浮在300μl培养液中，然后加入10μl FLICA稀释液*，于CO2培养箱中孵育标记1小时。标记完后细胞用1％BSA-PBS洗涤两次(每次孵育5分钟)，然后细胞重新悬浮在1％BSA-PBS中，用Cytospin仪将细胞离心固定在载玻片上，用70％乙醇-20℃固定2小时，然后用1mg/ml PI染色2分钟并制成装片，在Zeiss Aexioplan倒置荧光显微镜上观察(20x物镜)，激发波长为488nm，红色的PI荧光和黄绿色的FLICA荧光用Kodak Max400负片摄影纪录。
*将FLICA试剂先溶于DMSO中制成贮备液，保存在-20℃暗处，临用前用PBS稀释5倍。
结果见图3。左为对照组HL-60细胞，右为加熊果酸(10μM)孵育24hr后的HL-60细胞，在此组细胞中黄绿色荧光标记细胞(蓝色箭头)大量出现，提示熊果酸能增加HL-60的凋亡酶活化细胞。
图3 熊果酸能使HL-60的凋亡酶活化细胞增加(左对照组细胞，右熊果酸组细胞)实施例四熊果酸使HL-60细胞DNA凋亡峰明显增加细胞凋亡时DNA的一个重要变化是染色体DNA在核小体连接处被细胞内的核糖内切酶酶解，产生180-200bp的DNA片断。用流式细胞仪测定细胞周期DNA含量，在与细胞百分含量的直方图中，此DNA片断呈现一小峰，位于G1期峰左侧，由于此峰明显出现在凋亡细胞中，故又名凋亡峰。
HL-60细胞经与熊果酸共同孵育24小时后，用70％乙醇-20℃固定，VPI试剂染色，用流式细胞仪检测DNA含量，得直方图，结果熊果酸组的凋亡峰DNA明显高于对照组。
图4熊果酸处理过的HL-60细胞出现明显的凋亡峰(左对照组细胞，右熊果酸组细胞)制法将HL-60细胞在含10μM熊果酸的培养基中孵育24hr后，离心(500g，5分钟)收集细胞，用70％乙醇固定过夜，用PBS缓冲液洗去乙醇，悬浮于VPI试剂中(VindelovL，1977)，室温孵育30分钟，用流式细胞仪分析，得直方图。结果对照组HL-60细胞的凋亡峰仅3.9％，熊果酸组为17.5％。
实施例五熊果酸使HL-60内的凋亡抑制基因(bcl-2)表达受抑。
将HL-60细胞及与10μM熊果酸共同孵育24小时后的HL-60细胞分别离心，取沉淀，各用PBS洗涤一次，然后用70％-20℃乙醇固定过夜。每2×106细胞用PBS洗涤一次，另用2％BSA-PBS洗涤一次，然后各加入100μl鼠抗人Bcl-2抗体(BD PharMingen，USA；1∶100稀释在2％BSA-PBS中)或鼠IgG1(Sigma，USA；1∶40 diluted in2％BSA-PBS)作阴性对照。细胞与抗体于室温中孵育1小时，并加振摇使细胞重新悬浮，与抗体充分混合。孵育结束后，各用2％BSA-PBS洗涤一次，然后加入100μl用FITC标记的兔抗鼠荧光第二抗体，并于暗处孵育1小时，孵育结束后用2％BSA-PBS洗涤一次，PBS洗涤一次，然后悬浮在1ml PBS中用流式细胞仪分析。以阴性对照的本底自发荧光强度，作区分bcl-2表达与否的阈值。
结果HL-60细胞经与熊果酸共育24hr后，其Bcl-2蛋白的荧光强度和Bcl-2阳性表达细胞，与对照组细胞相比，均有明显下降(P＜0.01)，提示熊果酸能抑制凋亡抑制基因的表达(表1、图5)。
表1 两组HL-60细胞的Bcl-2蛋白荧光强度比较
P＜0.01图5 熊果酸使Bcl-2蛋白阳性表达细胞百分比下降HL-60细胞与10μM UA孵育24小时后，用70％-20℃乙醇固定，然后用鼠抗人Bcl-2抗体(阳性对照)或鼠IgG1(阴性对照)标记，并用兔抗鼠-FITC标记荧光，用流式细胞仪分析。用阴性对照中少于5％细胞的范围作为Bcl-2表达阳性范围(图中箭头范围)。数字为Bcl-2阳性表达细胞占细胞总体的百分比。由图可见HL-60与10μMUA孵育24小时后，Bcl-2为阳性表达的细胞百分比显著下降，p＜0.01。
上述结果显示熊果酸能诱导HL-60肿瘤细胞出现皱缩和胞膜鼓泡等凋亡的典型形态特征，能激活HL-60细胞的凋亡酶，使HL-60细胞DNA凋亡峰明显增加及HL-60细胞内的凋亡抑制基因(bcl-2)表达受抑。
图1 熊果酸诱导HL-60细胞凋亡的形态学改变HL-60的对照组细胞(左上)和熊果酸组细胞(左下)右侧两照片是放大的熊果酸组培养细胞，示细胞皱缩(上)和核膜鼓泡(下)*HL-60细胞与10μM熊果酸孵育24小时后，取一滴细胞悬液制成装片置于Lecia550+倒置显微镜上观察(20x物镜)，并用Quantinet图像处理分析系统记录图像。未加熊果酸处理的细胞作为对照图2 用Annexin V检测熊果酸诱导的HL-60凋亡细胞百分比(左对照组细胞，右熊果酸组细胞)HL-60与10μM UA共同孵育24小时后，用Annexin V-FITC和PI进行双染然后用细胞流式仪分析。图中蓝色的代表正常细胞(AnnexinV-/PI-)，红色的为早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)，绿色的为凋亡晚期细胞或坏死细胞(Annexin V+/PI+)。
图3 熊果酸能使HL-60的凋亡酶活化细胞增加(左对照组细胞，右熊果酸组细胞)图4 熊果酸处理过的HL-60细胞出现明显的凋亡峰(左对照组细胞，右熊果酸组细胞)图5 熊果酸使Bcl-2蛋白阳性表达细胞百分比下降
权利要求
1.一种熊果酸在制备肿瘤细胞凋亡诱导剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种熊果酸在制备肿瘤细胞凋亡诱导剂中的应用，其特征在于该诱导剂能使肿瘤细胞形态呈现典型的凋亡特征，激活凋亡酶，并使凋亡抑制基因表达受抑。
全文摘要
本发明属于药物化学技术领域。本发明公开了一种熊果酸在制备肿瘤细胞凋亡诱导剂中的应用。本发明揭示了熊果酸能使肿瘤细胞形态呈现典型的凋亡特征，能激活凋亡酶，并使凋亡抑制基因(Bcl－2)的表达受抑。
文档编号A61K31/56GK1589800SQ0315071
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月1日 优先权日2003年9月1日
发明者杨晓彤 申请人:太平保健药业(蛇口)有限公司