基于节杆菌细胞的抗鲑鱼立克次氏体败血病疫苗的制作方法

专利名称：基于节杆菌细胞的抗鲑鱼立克次氏体败血病疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用节杆菌属活菌株制备用于治疗或预防鲑鱼立克次氏体败血症(SRS)的药物，以及基于这些细菌的疫苗。
背景技术：
鲑鱼立克次氏体(Piscirickettsia salmonis)是一种革兰氏阴性专性细胞内细菌，其导致鲑鱼(salmonid fish)的系统性败血症(鲑鱼立克次氏体综合症(salmonid rickettsial syndrome)，SRS，或鱼类立克次氏体病(piscirickettsiosis))。目前越来越频繁地在来自世界各地的淡水到海水的其它多种鱼类中意识到鱼类立克次氏体样细菌。
鱼类立克次氏体病及鱼类立克次氏体病样疾病已经影响到水产业的生产力、收益、与商业养殖相容的物种、和鱼从一个地方向另一个地方的运输。仅智利水产业每年就因鲑鱼立克次氏体病损失$1.5亿。在智利，这种综合症已经致使人们从具有商业上更期望的银大马哈鱼(coho salmon)转向商业上较不期望的但具有更高鱼立克次氏体病抗性的鲑(Atlantic salmon)作为主要养殖种类。
在SRS的治疗上已经测试了抗微生物剂，但未获得一致的成功。其它提出的措施包括通过降低放养密度和毫不迟延地从鱼塘中移走死鱼来减轻鱼的压力。对付SRS流行病最实际的解决方法将是首先找到预防这种病的有效疫苗。源于鲑鱼立克次氏体的灭活菌苗制品已经被证实具有一定的保护作用，并且对于多价油制品中共同给药而言，该制品可能是仅有的适宜选择，但商业规模生产这种制品相对昂贵。基于来自鲑鱼立克次氏体的重组抗原的疫苗仍未进入市场。
因此，迫切需要获得能够显著降低由鱼类立克次氏体病导致的鱼死亡率的疫苗。我们发现一种现有的商业疫苗产品可显著有效预防这种疾病，本发明就是基于这种惊人的发现。这种疫苗的商品名为RenogenTM，其包含活的无毒节杆菌属细菌菌株。当前，该疫苗用于预防大马哈鱼(salmon)及其它养殖鱼类的细菌性肾病(BKD)。这种菌株的特征在WO 98/33884中公开，在此将此文献并入作为参考。
发明概述本发明的第一方面，提供节杆菌活细胞在制备用于鱼中治疗或预防鱼类立克次氏体病的药物中的用途。此药物的优选目标是暴露于SRS感染危险的鲑鱼。优选节杆菌细胞来自保藏号为ATCC 59921的菌株或等价菌株。
在本发明的第二方面，提供包含节杆菌活细胞和死(killed)细菌免疫刺激剂及药用可接受载体的疫苗组合物。本发明的另外一个方面，提供包含死节杆菌细胞物质的疫苗组合物，以及节杆菌死细胞物质作为免疫刺激剂的用途。这种节杆菌死细胞物质优选来源于保藏号为ATCC 59921的菌株或等价菌株。
本发明的另一个方面提供疫苗组合物，其含有节杆菌活细胞和灭活的鲑鱼立克次氏体抗原，由此，疫苗可以任选地以试剂盒的形式提供，在该试剂盒中包括冻干的节杆菌活细胞培养物和含有灭活的鲑鱼立克次氏体抗原的无菌稀释剂。
本发明的再一个方面提供在鱼中预防或治疗鱼类立克次氏体病的方法，包括给需要此类治疗的鱼施用包含节杆菌活细胞的疫苗。
发明详述RenogenTM疫苗已有一段时间被用于对抗鲑鱼的细菌性肾病(BKD)。该疫苗是独特的，因为其是第一个被许可在水产业中使用的活培养物。该疫苗包含保藏号为ATCC 55921的节杆菌属新种(Arthrobacter sp.nov.)的活培养物(该菌株在1996年12月20日保藏于美国典型培养物保藏中心(10801 Boulevard大学，马纳萨斯，VA 20110-2209))。节杆菌属细菌不会使鱼致病，并且也不是BKD的病原体(该病原体为Renibacteriumsalmoninarum)。
于田间的一个地点观察到，在有感染BKD危险的鲑鱼群体中使用RenogenTM，导致与未经处理的鱼相比死亡率戏剧性的下降。在RenogenTM处理组中，平均体重增加比未处理组高18％。由于SRS在此地也是常见的，这致使本发明人推测RenogenTM可能赋予了对抗BKD以及SRS的潜在防护作用。
为了验证该设想，用RenogenTM对池塘养殖的鱼进行免疫，随后用鲑鱼立克次氏体攻击这些鱼，见实施例2所述。在阴性对照组(用生理盐水进行注射)中，几乎所有的鱼均死于SRS。接受疫苗RenogenTM的试验组，在471dd(度天)后表现出极低的死亡率，折合88-100的相对百分存活(relative percent survival，RPS)。甚至在1441dd(相当于在海水中1年)后，试验组的RPS仍在69到85％之间，而在灭活的鲑鱼立克次氏体“金标准”组中仅为48.6％。
有关RenogenTM接种的潜力的进一步证据，由使用兔抗节杆菌多克隆抗体作为探针探测时鲑鱼立克次氏体抗原的交叉反应性证实(实施例1)。
我们已经证实，RenogenTM比任何其它已知疫苗能够更有效地防止SRS。已知节杆菌属活细菌能够进入细胞并在有限时间内进行复制。本发明人认为这使得与鲑鱼立克次氏体的T-细胞表位有足够同源性的糖和蛋白质抗原可以被加工，从而针对强致病性鲑鱼立克次氏体的直接攻击提供了高水平的保护作用。
因此，本发明提供节杆菌属细菌细胞在制备治疗或预防鱼中的鱼类立克次氏体病的药物中的用途，其中所述鱼特别是鲑鱼，包括大马哈鱼和鳟鱼类，特定是银大马哈鱼(Oncorhyncus kisutch)，大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)，马苏大马哈鱼(Oncorhyncus masou)，细鳞大马哈鱼(Oncorhynchus gorbuscha)，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)，及鲑(Salmo salar)。但对于任何易感染鱼类立克次氏体病或类似疾病的其它鱼类可能也是有益的，例如罗非鱼(Tilapia sp.)，Black seabass(Dicentrarchus sp.)，White seabass(Atractoscion nobilis)，石斑鱼(grouperfish)、丽鱼科(cichlids)鱼类等。
RenogenTM基于一种特定的节杆菌属保藏菌株(ATCC 59921)。在实施本发明时，可使用该菌株或等价的节杆菌属菌株。等价的节杆菌属菌株具有节杆菌ATCC 59921的鉴别特征(identifying characteristics)。它们展示出相似的对抗SRS的保护能力。与ATCC 59921菌株有相同的16S rDNA序列或是16S rDNA序列与ATCC 59921菌株的序列分歧小于3％的的节杆菌属物种被认为是等价的。此16S rDNA序列已在Genbank上登记，登记号为AF099202。另外一种确定等价菌株的方法是根据Griffiths，SG等(1998)鱼及贝免疫学(Fish & Shellfish Immunology)8607-619所述，通过RAPD方法，采用引物F12-373(5′-ACGGTACCAG-3′)进行分析。当在节杆菌ATCC 59921及等价菌株上实施该分析试验时，产生约373bp的区别性片段。在此出版物中描述了另一种RAPD方法，其采用引物Rsxll-67f(5′-CTGTGCTTGCACGGGGGATTA-3′)和Rsxll-284r(5′-GTGGCCGGTCAC CCTCTCAG-3′)，当用于节杆菌ATCC 59921或等价菌株时产生260bp的片段。
在各种各样的生境，包括海洋环境中，节杆菌属物种数目众多并且丰富。许多节杆菌属菌株可从商业保藏机构获得。对于本领域技术人员而言，基于所述鉴别特征和/或此处鉴定的SRS免疫原性，对已知菌株或新分离的菌株进行筛选并不会构成过度繁重的工作。SRS免疫原性性质的鉴定可以通过前段中的筛选试验进行，和/或通过实施例1和2所述的实验方法进行。
优选的疫苗给药途径是通过腹膜腔注射，但也可采用其它的给药途径，包括口服喂饲、皮内注射或肌内注射，或是在海水或淡水中浸浴。在给鱼注射疫苗前，通常将鱼麻醉。对于通过腹膜腔注射施用本发明疫苗，推荐鱼体重等于或大于10克。对于浸浴给药或口服给药，优选体重至少为2克。
疫苗的有效剂量可随对象的大小和物种及给药模式而变。兽医或水产专家可通过反复试验确定最适剂量。适宜剂量范围可以在大约102到109cfu每单位剂量，优选约104到107cfu每单位剂量，更优约105到106cfu每单位剂量，最优约105cfu每单位剂量。然而，更高或更低的剂量可能也是有效的。优选向待治疗的鱼给予单一剂量单位。较小的鱼可以得益于约104到107cfu/ml剂量的浸渍(药浴)给药，接触时间为例如约60秒。对于药浴给药方式来说，也可将疫苗稀释在1到10体积的水中，之后加入鱼池或鱼箱内。
优选的注射剂量体积为大约0.05-0.5ml，优选0.075-0.25ml，更优选0.1-0.2ml，可选地大约0.1ml。
由于免疫形成依赖于水温，因此，用本发明节杆菌疫苗对鱼进行接种后，优选在至少400度天(度天＝天数×水平均温度℃)前，不让鱼暴露于SRS感染。
在本发明的一个实施方式中，将节杆菌活细胞与可药用载体或赋形药在药物组合物中组合。合适的载体/赋形药包括常规的赋形剂，并且可以是例如溶剂如水、油或盐水、葡萄糖、甘油、润湿剂或乳化剂、疏松剂、包衣、粘合剂、填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、pH缓冲剂、或常规佐剂例如胞壁酰二肽，阿夫立定，氢氧化铝，油类(如矿物油)，皂苷，嵌段共聚物及本领域已知的其它物质。优选的药物组合物含有盐水稀释剂。
典型地，将疫苗制成液体溶液或悬浮液用于注射或用于在水中递送。也可以制成适于在给药前溶解或悬浮于液体赋形药中或与固体食物混合的固体形式(如粉末)。
优选疫苗是冻干的培养物。该种形式的疫苗适于用无菌稀释剂复原(reconstitution)。例如冻干细胞可以在0.9％盐水(任选地作为包装的疫苗产品的一部分提供)中复原。本发明的疫苗药物组合物可以以立即释放或长期释放的形式给药。
在一个实施方式中，本发明节杆菌疫苗包含免疫刺激剂。该免疫刺激剂可以是任何已知的免疫刺激剂，但是优选为死细菌制品。优选地，免疫刺激剂是节杆菌死细胞物质，其任何地是热灭活的并可以任选地来自节杆菌ATCC 59921的培养物。死细菌制品的适宜例子包括″Peptimune″(加热灭活的节杆菌ATCC 59921培养物)和″Ultracorn″(超声破碎的Corynebacterium cutis裂解物)。死细菌免疫刺激剂的最佳剂量(按每个疫苗单位剂量计)为1到100μg的细胞物质，优选5到50μg，更优10到20μg，任选地12μg左右。死细菌免疫刺激剂任选地溶解或悬浮在无菌稀释剂(如盐水)中，用于与冻干的节杆菌活细胞混合。
一方面，本发明提供疫苗组合物，其包含节杆菌活细胞，还包含至少一种其它的免疫原(在此，“免疫原”被定义为一种能够引起鱼的特异免疫应答的分子，如抗原)。免疫原任选地选自由鲑鱼立克次氏体(P.salmonis)制备的灭活抗原；重组鲑鱼立克次氏体抗原；及携带可表达的鲑鱼立克次氏体抗原的核酸载体。在一些情况下，可能期望将本发明的RenogenTM疫苗与常规的SRS疫苗(鲑鱼立克次氏体菌苗或重组抗原疫苗或核酸疫苗)组合在包含此两种成分的试剂盒中，用于单独、相继或同时给药治疗或预防SRS。
在一个优选实施方式中，本发明涉及包含节杆菌活细胞和灭活的鲑鱼立克次氏体抗原，以及任选地节杆菌死细胞物质(作为免疫刺激剂)的疫苗。鲑鱼立克次氏体抗原可以通过使用任何已知的灭活剂灭活来制备，但优选通过福尔马林灭活的方式制备。鲑鱼立克次氏体抗原可以从任何细菌分离物制备。任选地，使用保藏号ATCC VR-1361的菌株LF-89或来源其的菌株，制备灭活抗原。
用于灭活鲑鱼立克次氏体抗原的一种适宜方法是从鲑鱼立克次氏体感染的CHSE-14细胞培养物收获上清液，加入福尔马林(37％甲醛溶液)至终浓度0.125％(v/v)。将培养物液体/福尔马林混合物搅拌至均质，然后保持在4±2℃，持续搅动最少72小时。灭活的收获物可以通过无菌超滤浓缩。按照酶免疫试验(EIA)比例(表示为抗原的OD405/OD490/标准OD405/OD490)的定义，适宜的鲑鱼立克次氏体抗原制品的终浓度为1.5±0.2单位。
节杆菌和鲑鱼立克次氏体成分在单一疫苗中的组合导致与单独的节杆菌活细胞疫苗相比显著提高的抗SRS保护作用。在类似于实施例2中所述的SRS攻击试验中，证实与单价活节杆菌疫苗相比，二价疫苗经过一个长时期(1400度天后)增加20个以上RPS(相对百分存活)点。
优选地，疫苗以试剂盒的形式生产和出售，试剂盒中包含冻干的活节杆菌细胞培养物以及其中溶解或悬浮有灭活的鲑鱼立克次氏体抗原(及任选地死细菌免疫刺激剂)的无菌稀释剂如盐水。例如，按上述制备的鲑鱼立克次氏体抗原可以以大约10-大约150ml/升、优选大约20-大约100ml/升、最优选75ml/升的浓度，与稀释剂混和。
本发明范围内也包括制备包含活节杆菌细胞和来自非鲑鱼立克次氏体的病原体的抗原的多价疫苗。
包含节杆菌活细胞的所有本发明疫苗不仅提供对抗SRS的保护作用，也导致对鱼的抗BKD感染的保护作用。
实施例实施例1鲑鱼立克次氏体抗原和抗节杆菌多克隆抗体的交叉反应性将从CHSE-214细胞培养物中收集的约25μg鲑鱼立克次氏体细菌细胞进行三次洗涤后，与100μl Laemmli缓冲液混合，于95℃加热3分钟。在9％丙烯酰胺胶中加入10μl样品，150伏电泳1小时分离蛋白。用半干印迹转移器(semi-dry transblotter，BIORAD)将蛋白转移到100％硝酸纤维素膜上。于20伏转移蛋白，50分钟。
将印迹与20μl兔抗节杆菌多克隆抗体在15ml 1％酪蛋白Tris-硼酸盐水(cTBS)中孵育45分钟。之后使印迹暴露于5μl山羊抗兔免疫球蛋白碱性磷酸酶(GAR-AP)并显色。印迹上显示出几种蛋白，表明抗节杆菌蛋白抗体与某些鲑鱼立克次氏体蛋白具有强烈的亲和性。在二维Wester印迹中也验证了此结果。
本实验证明，某些鲑鱼立克次氏体和节杆菌蛋白具交叉反应性，说明这些节杆菌蛋白能够引发免疫系统产生有潜在识别和抵抗鲑鱼立克次氏体强致病性细菌能力的抗体。
实施例2节杆菌疫苗抗SRS的保护作用根据标准操作方法，将银大马哈鱼(每个处理组n＝110条，平均体重为10克)于12℃在常规饲养条件下维持在池水中。在一周的环境适应后，分别给第1、2、和3组腹膜内接种0.1ml 105、106和107cfu/剂在盐水稀释剂中复原的冻干节杆菌属新种细胞(RenogenTM)。第4和5组采用与第1组相同的方式处理，但每剂分别加入12.2μg和50μg于盐水稀释剂中的″Peptimune″。Peptimune是在液体培养基(MTSB肉汤)中生长到细胞密度大于1XE9的节杆菌的热灭活制品，通过蛋白分析试验标准化以便每剂给药12μg和50μg。第6和7组为阳性对照，用鲑鱼立克次氏体菌苗进行接种。此菌苗从鲑鱼立克次氏体菌株LF-89感染的CHSE-14细胞培养物上清，通过在4℃用0.125％福尔马林处理至少72小时而制备。使用U/F浓缩，将浓缩的上清用于每0.1ml剂量掺入8μg(蛋白)。此菌苗疫苗与Ultracorn(Virbac，法国)一起按每条鱼20μg(组6)和100μg(组7)递送。Ultracorn是一种基于超声的Corynebacterium cutis裂解物的免疫刺激剂。这些抗原在注射前用等体积矿物油佐剂乳化。阴性对照组(组8)用盐水注射。
表1处理组汇总(对于20ml的剂量体积(每条鱼0.1ml))
攻击方法在接种后471和1441dd(度天)时，每个处理2个重复组，各25条鱼，通过腹膜内注射用致病性鲑鱼立克次氏体进行攻击。致病性鲑鱼立克次氏体在CHSE-14细胞上至少培养2-3周。培养上清至少达到50％CPE时用于腹膜内注射。致病性立克次氏体以10-2稀释度或更高稀释度按每条鱼0.1ml进行注射(n＝25)。受攻击的鱼维持在12℃。
在攻击1结束前，从第1组、7组和8组(在该组中仅有8条鱼存活)的存活群体中取10条鱼处死，并取0.5g的脾肾组织样品，匀浆，稀释在10ml组织培养基中。在含有汇合的CHSE-214细胞的96孔板上检测TCID50。
结果与讨论表128天安全检验期的死亡率，在整个安全期和攻击前期维持在9-12℃。
在此安全研究中，观测到，接近28天安全期结束时，组3的鱼有一些损失(6.3％)。实验室研究人员对该群体的所有鱼进行了3天福尔马林处理用于治疗细菌性鳃病。在最初的3天pv记录到组5中的死亡率(3.6％)，表明以稀释剂的40％包括Peptimune是稍有毒性的。在安全期未从这些损失，针对活疫苗菌株或任何偶发的细菌培养物，进行阳性板培养。
表2在用节杆菌属新种细胞(1-5组)、灭活SRS疫苗或盐水接种后471dd，用强致病性鲑鱼立克次氏体通过腹膜内注射(TCID503×102.9/鱼)攻击，银大马哈鱼(平均体重为10克)在12℃的累积死亡率和相对百分存活率。
在接种后471dd时，组1中鱼的相对百分存活率(RPS)为97.6，即32天对抗鲑鱼立克次氏体直接感染的高水平保护作用，而此时盐水对照组的死亡率为84％。这有利地与用标准灭活疫苗接种(组6和组7)获得的保护形成对比，它们的RPS值分别为50％和69％。
TCID50分析组1、组7和组8中的存活鱼。
来自此471dd攻击(感染后32天)的存活鱼(n＝7-10)的组织样中SRS的感染水平
取自RenogenTM组的鱼样品的TCID50值低于灭活疫苗组，并且这两组都低于盐水对照组。这无明显临床相关性，因为当进行平均时，高效价组的贡献抵消较低的感染剂量。但是RenogenTM组确实有最低的百分阳性(＜20％)，因为低于102的样本被认为未临床感染SRS。这与取自盐水对照组的相同样品形成了比较(盐水对照组中50％的鱼为SRS阳性)，并有利地与灭活疫苗组(44％的鱼SRS阳性)形成了比较。
表3用节杆菌属新种细胞(1-5组)、灭活SRS疫苗或盐水接种后1441dd，以致病性鲑鱼立克次氏体通过腹膜内注射(TCID 3×102.9/鱼)进行攻击，银大马哈鱼(平均体重为10克)在12℃的累积死亡率和相对百分存活率。
注旨在用于进行长期效力研究的第6组备用鱼由于该鱼池(17)意外的水流切断而损失。
经过1140dd时间后，对较早试验期(471dd)观察到的保护作用进行了持续应答的评价。这第二次攻击的结果(此时，盐水对照组中观察到72％的死亡率)，说明在RenogenTM处理的鱼中仍然有高水平的保护(RPS值为69.4％)，同时在某种程度上说明高剂量可促进长期保护(106和107cfu/剂量分别产生85.8和81.7的RPS)。在稀释剂中加入12μg和15μg的免疫刺激剂Peptimune提高了产物的给药效力(分别为76.1和79.7％)。标准参考疫苗(第6组)的意外损失使得仅与组7进行了比较，而组7的RPS为48.6％。
结论在接种后471dd和1441dd，对于鲑鱼立克次氏体的直接攻击，RenogenTM均提供了显著的防护作用。这种疫苗比标准油疫苗提供了更优的保护作用。我们能够证明在RenogenTM组中更少的存活鱼被鲑鱼立克次氏体临床感染。本研究说明节杆菌属新种活疫苗提供了高度的抗鲑鱼立克次氏体感染的保护作用，并且这种保护效果被证实是长期的。在疫苗中包括死节杆菌制品具有免疫刺激效应，从而导致提高的存活率。
权利要求
1.活节杆菌细胞在制备用于鱼中治疗或预防鱼类立克次氏体病的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中鱼是鲑鱼。
3.根据权利要求1或2的用途，其中鱼类立克次氏体病是鲑鱼立克次氏体败血病(SRS)。
4.根据前述权利要求任一项的用途，其中节杆菌细胞来自保藏号为ATCC 55921的菌株，或等价菌株。
5.根据前述权利要求任一项的用途，其中鱼是银大马哈鱼(Oncorhyncus kisutch)。
6.根据前述权利要求任一项的用途，其中药物还含有鲑鱼立克次氏体(Piscirickettsia salmonis)抗原。
7.疫苗组合物，其包含活节杆菌细胞和免疫刺激剂以及药用可接受载体。
8.根据权利要求7的疫苗组合物，其中所述免疫刺激剂包括死细菌细胞物质。
9.根据权利要求8的疫苗组合物，其中所述细胞物质来源于死节杆菌细胞。
10.含有死节杆菌细胞物质的疫苗组合物。
11.根据权利要求10的疫苗组合物，其中节杆菌细胞物质是热灭活的。
12.根据权利要求7-11之任一项的疫苗组合物，其中节杆菌细胞和/或死节杆菌细胞物质来源于保藏号为ATCC 55921的菌株。
13.根据权利要求7-12之任一项的疫苗组合物，其是冻干的或是盐水悬浮液的形式。
14.疫苗组合物，其含有活节杆菌细胞并还含有至少一种其它的免疫原。
15.根据权利要求14的疫苗组合物，其中所述免疫原选自由鲑鱼立克次氏体制备的灭活抗原；重组鲑鱼立克次氏体抗原；和携带可表达的鲑鱼立克次氏体抗原的核酸载体。
16.根据权利要求15的疫苗组合物，其包含活节杆菌细胞和通过福尔马林灭活的鲑鱼立克次氏体抗原。
17.试剂盒，其包含用于分开地、相继地或同时地向鱼施用的第一疫苗和第二疫苗，其中，第一疫苗包含活节杆菌细胞，第二疫苗包含选自如下的免疫原由鲑鱼立克次氏体制备的灭活抗原；重组鲑鱼立克次氏体抗原；和携带可表达的鲑鱼立克次氏体抗原的核酸载体。
18.根据权利要求17的试剂盒，其包含冻干的活节杆菌细胞；和含有灭活的鲑鱼立克次氏体抗原的无菌稀释剂。
19.根据权利要求16的疫苗组合物或根据权利要求18的试剂盒作为药物的用途，用于向鱼提供抗SRS和BKD感染的保护作用。
20.治疗或预防鱼类立克次氏体病的方法，包括向鱼施用根据权利要求7-16之任一项的疫苗组合物。
21.死节杆菌细胞物质作为用于鱼的免疫刺激剂的用途。
全文摘要
基于节杆菌活细胞的疫苗可以用于预防鱼的鱼类立克次氏体病。
文档编号A61K9/10GK1668328SQ03816688
公开日2005年9月14日 申请日期2003年7月14日 优先权日2002年7月15日
发明者K·萨洛纽斯, S·G·格里菲斯 申请人:诺瓦提斯公司