促红细胞生成素的应用的制作方法

专利名称：促红细胞生成素的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及促红细胞生成素的新用途，尤其是治疗糖尿病中的铁分布紊乱。
已知铁代谢在多种疾病中是不正常的。在贫血中，由于体内全面缺铁而不能形成足够的血液。与铁有关的另一种代谢状况是血色病，其中体内总体铁浓度高于正常，导致多种状况，诸如器官破坏。
铁分布紊乱与上文所述的贫血症和血色病不同，因为体内总体铁浓度是正常的。一方面，铁在多个器官中积累，而且能够导致这些器官的损伤甚至破坏。另一方面，以正常数量存在的铁在形成血液中的用途受到削弱，导致与贫血相关效应相当的次生效应。
至今仍不知道糖尿病患者很有可能被铁分布紊乱影响。铁分布紊乱能够通过常用于诊断铁状况的多种参数来诊断。根据铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体的测量，有可能评估糖尿病患者体内的总体铁浓度是否正常。如果是这种情况，那么网织红细胞中的降低浓度血红蛋白是铁分布紊乱的指标。另一项指标是患有糖尿病且展示正常总体铁浓度的患者体内持续/延续升高的C反应性蛋白质(CRP)浓度。用于诊断铁分布紊乱的一种方法描述于P.Lehmann、M.Volkmann、J.Lotz、A.Baldauf、R.Roeddiger，海报展示，AACC/CSCC年会，2001年7月29日-8月2日，伊利诺斯州，芝加哥。
至今尚未提出针对遭受铁分布紊乱的糖尿病患者的治疗方法。因此，本发明要解决的问题是为糖尿病中的铁分布紊乱提供治疗方法，从而减小或遏制上述不利情况。出人意料的已发现了促红细胞生成素对于糖尿病中的铁分布紊乱具有有益效果。因此，依照本发明，通过提供促红细胞生成素在治疗糖尿病中的铁分布紊乱中的用途而解决了问题。
除非另外说明，陈述下列定义以说明和限定用于描述本发明的各种术语的含义和范围。
术语“低级烷基”在用于本文时指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基。低级烷基的范例包括甲基、乙基、和异丙基，优选甲基。
术语“低级烷氧基”在用于本文时指R’-O-基团，其中R’是上文所述低级烷基。
术语“糖尿病中的铁分布紊乱”指糖尿病患者中发生的铁分布紊乱。铁分布紊乱可以如上文所述表征。具体而言，铁分布紊乱由下列参数表征可溶性转铁蛋白受体浓度[mg/L]除以log(铁蛋白浓度[μg/L])小于3.5，同时C反应性蛋白质浓度超过5mg/L。
术语“促红细胞生成素”或“促红细胞生成素蛋白质”指具有引起骨髓细胞生成网织红细胞和红细胞增加的体内生物学活性且选自下组的蛋白质人促红细胞生成素及其下文定义的类似物。
术语“PEG化促红细胞生成素(Peg-EPO或PEG-EPO)”指如下所述共价连接1-3个聚乙烯衍生物的促红细胞生成素蛋白质。
附图描述

图1人EPO的一级结构(165个氨基酸)(SEQ ID NO1)。
图2人EPO的一级结构(166个氨基酸)(SEQ ID NO2)。
更详细的说，本发明涉及促红细胞生成素在制造用于治疗糖尿病中的铁分布紊乱的药物中的用途。在一个优选的实施方案中，本发明涉及上文定义的用途，其中糖尿病是非胰岛素依赖性糖尿病。
本发明对于包含促红细胞生成素作为药物活性成分的药物组合物的制备尤其有用。术语“促红细胞生成素”或“促红细胞生成素蛋白质”或“EPO”如下具体而言，这些术语指糖蛋白，如人促红细胞生成素，如具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所列氨基酸序列或与其基本同源的氨基酸序列，它的生物学特性涉及在骨髓中刺激红细胞的生成和刺激定向类红细胞祖先的分裂和分化。在用于本文时，这些术语包括经过故意修饰的这些蛋白质，例如通过定点诱变或偶然突变。这些术语还包括具有1-6个额外糖基化位点的类似物、在糖蛋白的羧基末端具有至少一个额外氨基酸的类似物(其中额外氨基酸包括至少一个糖基化位点)、和具有包括至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的类似物。这些术语包括天然和重组生成的这两类人促红细胞生成素。在本发明的一个优选实施方案中，促红细胞生成素蛋白质是人促红细胞生成素。
如下文详细所述，EPO的制备和纯化在本领域是众所周知的。促红细胞生成素指由任何常规来源诸如组织、蛋白质合成、天然或重组细胞的细胞培养获得的天然或重组蛋白质，优选人的，如epoetinα或epoetinβ。涵盖具有促红细胞生成素活性的任何蛋白质，诸如突变型蛋白质或其它经修饰蛋白质。在本发明的一个优选实施方案中，促红细胞生成素蛋白质是epoetinα或epoetinβ。可以通过重组DNA技术或通过内源基因激活经由CHO、BHK、或HeLa细胞系的表达来制备重组EPO。包括通过内源基因激活在内的蛋白质表达在本领域是众所周知的，而且公开于例如美国专利号5,733,761、5,641,670、和5,733,746，以及国际专利公开号WO 93/09222、WO 94/12650、WO95/31560、WO 90/11354、WO 91/06667、和WO 91/09955(将它们的内容收入本文作为参考)。优选上文定义的用途，其中促红细胞生成素蛋白质是通过内源基因激活而表达的。用于制备促红细胞生成素糖蛋白产物的优选EPO种类是人EPO种类。更优选的是，EPO种类是具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所列氨基酸序列的人EPO，更优选氨基酸序列SEQ ID NO1。因此，本发明的一个优选实施方案涉及上文所述用途，其中促红细胞生成素蛋白质具有SEQ ID NO1或SEQID NO2的氨基酸序列。
此外，促红细胞生成素可以是具有1-6个额外糖基化位点的糖蛋白类似物。因此，本发明还涉及上文所述用途，其中促红细胞生成素蛋白质具有通过添加1-6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素序列。具有一个或多个寡糖基团的蛋白质的糖基化沿着多肽主链发生于特定位置，而且大大影响蛋白质的物理特性，诸如蛋白质稳定性、分泌、亚细胞定位、和生物学活性。糖基化通常有两类。O连接寡糖附着于丝氨酸或苏氨酸残基，而N连接寡糖附着于天冬酰胺残基。在N连接和O连接寡糖中都发现的一类寡糖是N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，它是含有9个或更多碳原子的氨基糖家族。唾液酸常常是N连接和O连接寡糖的末端残基，而且由于它携带一个负电荷而赋予糖蛋白以酸性特性。具有165个氨基酸的人促红细胞生成素含有3个N连接寡糖链和1个O连接寡糖链，它们占到糖蛋白总分子量的大约40％。N连接糖基化发生于第24、38、和83位天冬酰胺残基，而O连接糖基化发生于第126位丝氨酸残基。寡糖链由末端唾液酸残基得到修饰。糖基化促红细胞生成素中所有唾液酸残基的酶促清除导致体内活性而非体外活性的损失，因为促红细胞生成素的唾液酸化防止其结合肝结合蛋白及随后的清除。
术语“促红细胞生成素”包括人促红细胞生成素氨基酸序列中具有一处或多处改变而导致唾液酸附着位点数目增加的人促红细胞生成素类似物。可以通过定点诱变来生成这些糖蛋白类似物，它们具有氨基酸残基的添加、删除、或替代从而增加或改变能够糖基化的位点。唾液酸水平高于人促红细胞生成素的糖蛋白类似物是通过添加不干扰生物学活性所必需的二级或三级构象的糖基化位点而生成的。本发明的糖蛋白还包括在糖基化位点具有升高的碳水化合物附着水平的类似物，这常常涉及密切接近N连接或O连接位点的一个或多个氨基酸的替代。本发明的糖蛋白还包括由促红细胞生成素的羧基末端具有一个或多个氨基酸延伸并提供至少一个额外碳水化合物位点的类似物。本组合物的促红细胞生成素蛋白质还包括具有包含至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的类似物。这种糖基化位点重排涉及人促红细胞生成素中一个或多个糖基化位点的删除和一个或多个非天然存在糖基化位点的添加。增加促红细胞生成素上碳水化合物链的数目因而每个促红细胞生成素分子的唾液酸数目可以赋予有利特性，诸如溶解性增加、蛋白水解抗性增强、免疫原性降低、血清半衰期延长、和生物学活性增加。具有额外糖基化位点的促红细胞生成素类似物更加详细的公开于1995年3月1日公开的授予Elliot的欧洲专利申请640 619。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含促红细胞生成素蛋白质，它具有包含至少一个额外糖基化位点的氨基酸序列，诸如但不限于包含通过选自下组的修饰而修饰的人促红细胞生成素序列的促红细胞生成素Asn30Thr32；Asn51Thr53；Asn57Thr59；Asn69；Asn69Thr71；Ser68Asn69Thr71；Val87Asn88Thr90；Ser87Asn88Thr90；Ser87Asn88Gly89Thr90Ser87Asn88Thr90Thr92；Ser87Asn88Thr90Ala162；Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90；Asn30Thr32Val87Asn88Thr90；Asn89Ile90Thr91；Ser87Asn89Ile90Thr91；Asn136Thr138；Asn138Thr140；Thr125；和Pro124Thr125。
本文中用于变更氨基酸序列的符号指相应未变更蛋白质(如SEQID NO1或SEQ ID NO2的hEPO)中上标数值指示的位置变更成紧挨着各个上标数值前面的氨基酸。
促红细胞生成素蛋白质还可以是在糖蛋白的羧基末端具有至少一个额外氨基酸的类似物，其中额外氨基酸包括至少一个糖基化位点。额外氨基酸可以包括由人绒毛膜促性腺激素羧基末端衍生的肽片段。优选的是，糖蛋白是选自下组的类似物(a)羧基末端具有延伸氨基酸序列Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro SerPro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln的人促红细胞生成素；(b)还包括Ser87Asn88Thr90EPO在内的(a)中的类似物；和(c)还包括Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO在内的(a)中的类似物。
促红细胞生成素蛋白质还可以是具有包含至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的类似物。重排可以包括人促红细胞生成素中任何N连接碳水化合物位点的删除和人促红细胞生成素氨基酸序列第88位处N连接碳水化合物位点的添加。优选的是，糖蛋白是选自下组的类似物Gln24Ser87Asn88Thr90EPO；Gln38Ser87Asn88Thr90EPO；和Gln83Ser87Asn88Thr90EPO。另一种类似物是darbepoetinα。上文所述用途中的一种优选促红细胞生成素蛋白质是darbepoetinα。
更具体的说，上文所述本发明药物组合物的促红细胞生成素蛋白质还可以包括它的PEG化衍生物。促红细胞生成素的PEG化衍生物及其制备在本领域是知道的，而且描述于例如WO 01/02017、EP-A-1,064,951、EP-A-539,167、EP-A-605,963、WO 93/25212、WO94/20069、WO 95/11924、US专利号5,56、EP-A-584,876、WO 92/16555、WO 94/28024、WO 97/04796、美国专利号5,359,030和5,681,811、美国专利号4,179,337、日本专利、WO 98/32466、美国专利号5,324,650。优选的是，在上文所述用途中，促红细胞生成素蛋白质是PEG化的。PEG化促红细胞生成素种类的一个优选实施方案涉及下文所述衍生物。
因此，本发明还涉及上文所述用途，其中促红细胞生成素蛋白质是缀合物，所述缀合物包含的上文所述促红细胞生成素蛋白质具有至少一个游离氨基且具有引起骨髓细胞生成网织红细胞和红细胞增加的体内生物学活性，而且选自人促红细胞生成素及其类似物，即具有通过添加1-6个糖基化位点或至少一个糖基化位点的重排而修饰的人促红细胞生成素序列；所述促红细胞生成素共价连接n个通式为-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚乙二醇基团，每个聚乙二醇基团的-CO(即羰基)与所述氨基之一形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或3；m是大约450-大约900；n是1-3；且n和m的选择使得缀合物减去促红细胞生成素蛋白质的分子量是20kDa-100kDa。本发明还提供了包含本文所述缀合物的药物组合物，其中n是1的缀合物的百分率是组合物中所有缀合物的至少90％，优选至少92％，更优选96％。
更具体的说，上述缀合物可以表述成通式(I)P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n(I)其中P是具有引起骨髓细胞生成网织红细胞和红细胞增加的体内生物学活性的本文所述促红细胞生成素蛋白质残基(即不含通式I中所示与羰基形成酰胺键的一个或多个氨基)；而且其中R是低级烷基；x是2或3；m是大约450-大约900；n是1-3；且n和m的选择使得缀合物减去促红细胞生成素糖蛋白的分子量是20kDa-100kDa。依照本发明，R是任何低级烷基。优选R是甲基的缀合物。
符号“m”代表聚环氧乙烷基团中环氧乙烷残基(OCH2CH2)的数目。单个PEG(聚乙二醇)亚基的环氧乙烷分子量是大约44道尔顿。由此，缀合物的分子量(减去EPO的分子量)取决于“m”的数值。在本发明的缀合物中，“m”是大约450-大约900(对应于分子量大约20kDa-大约40kDa)，优选大约650-大约750(对应于分子量大约30kDa)。数值m的选择使得由此产生的本发明缀合物的生理学活性与未修饰EPO相当，这种活性可以表述成与未修饰EPO的相应活性相同、更高、或其部分。“大约”某一数值的分子量指它位于通过常规分析技术测定的该数值的合理范围内。数值“m”的选择使得与促红细胞生成素糖蛋白共价连接的每个聚乙二醇基团的分子量是大约20kDa-大约40kDa，优选大约30kDa。
在本发明的缀合物中，数值“n”指通过酰胺键与促红细胞生成素蛋白质的游离氨基(包括赖氨酸的ε-氨基和/或氨基末端的氨基)共价结合的聚乙二醇基团的数目。本发明的缀合物可以是每个EPO分子具有一个、两个、或三个PEG基团。“n”是1-3的整数，优选“n”是1或2，更优选“n”是1。上文所述缀合物的一种优选缀合物包括x是2、m是650-750、n是1、且R是甲基的化合物。
可以由已知聚合材料通过通式II的化合物与促红细胞生成素糖蛋白的缩合来制备通式(I)的化合物 其中R和m如上文所述。x是3的通式(II)化合物是α-低级烷氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SBA)。x是2的通式(II)化合物是α-低级烷氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SPA)。可以采用使活化酯与胺反应而形成酰胺的任何常规方法。在上文所述反应中，例示性琥珀酰亚胺酯是引起酰胺形成的离去基团。琥珀酰亚胺酯诸如通式II化合物用于与蛋白质生成缀合物的用途公开于1997年9月30日授权的美国专利号5,672,662(Harris等人)。
人EPO含有九个游离氨基，氨基末端的氨基和8个赖氨酸残基的ε-氨基。在PEG化试剂与通式II的SBA化合物联合后，发现在pH7.5、蛋白质∶PEG比率1∶3、和反应温度20-25℃的条件下，生成了单-、双-、和痕量三-PEG化种类的混合物。当PEG化试剂是通式II的SPA化合物时，在相似条件下(只是蛋白质∶PEG比率是1∶2)，主要生成单-PEG化种类。可以以混合物，或者是通过阳离子交换层析分离的不同PEG化种类的形式施用PEG化EPO。通过操控反应条件(如试剂比率、pH、温度、蛋白质浓度、反应时间、等)，可以改变不同PEG化种类的相对量。
本发明的另一个优选实施方案涉及上文定义的用途，其中促红细胞生成素蛋白质是缀合物，所述缀合物包含的上文定义的促红细胞生成素蛋白质具有至少一个游离氨基且具有引起骨髓细胞生成网织红细胞和红细胞增加的体内生物学活性，而且选自人促红细胞生成素蛋白质及其类似物，即具有通过添加1-6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素蛋白质一级结构；所述促红细胞生成素蛋白质共价连接1-3个低级烷氧基聚乙二醇基团，每个聚乙二醇基团通过通式为-C(O)-X-S-Y-的接头共价连接促红细胞生成素蛋白质，接头的C(O)与所述氨基之一形成酰胺键，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1-10，Y是 或 每个聚乙二醇模块的平均分子量是大约20kDa-大约40kDa，且缀合物的分子量是大约51kDa-大约175kDa。
这一促红细胞生成素种类也表述成通式(III)P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n(III)其中R可以是任何低级烷基。优选的低级烷基是甲基。X可以是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1-约10。优选的是，k是1-大约4，更优选的是，k是1或2。最优选的是，X是-(CH2)。
在通式I中，Y是 或
优选 或 更优选 在通式(III)中，数值m的选择使得由此产生的通式(III)的缀合物具有与未修饰EPO相当的生理学活性，这种活性可以表述成与未修饰EPO的相应活性相同、更高、或其部分。m代表PEG单元中环氧乙烷残基的数目。单个PEG亚基-(OCH2CH2)-的分子量是大约44道尔顿。由此，缀合物的分子量(减去EPO的分子量)取决于数值m。“大约”某一数值的分子量指它位于通过常规分析技术测定的该数值的合理范围内。m是大约450-大约900的整数(对应于分子量20kDa-40kDa)，优选的是，m是大约550-大约800(大约24kDa-35kDa)，最优选的是，m是大约650-大约700(大约29kDa-大约31kDa)。
在通式(III)中，数值n是通过酰胺键与PEG单元共价结合的促红细胞生成素蛋白质中赖氨酸ε-氨基的数目。本发明的缀合物可以是每个EPO分子具有一个、两个、或三个PEG单元。n是1-3的整数，优选n是1或2，更优选n是1。
通式(III)的优选促红细胞生成素蛋白质表述成通式
和 在本发明的最优选实施方案中，促红细胞生成素缀合物表述成通式 其中n是1-3的整数；m是大约450-900的整数；R是低级烷基；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，且P是促红细胞生成素蛋白质不含与X形成酰胺键的一个或多个氨基的残基。
其它优选促红细胞生成素糖蛋白产物表述成通式 和 更优选的促红细胞生成素糖蛋白产物表述成通式
可以如下制备这些促红细胞生成素蛋白质(a)使由通式P-[NH2]n代表的促红细胞生成素蛋白质赖氨酸ε-氨基与由通式Z-CO-X-S-Q代表的双功能试剂共价反应而形成具有酰胺键的中间物，通式为P-[NH-CO-X-S-Q]n其中P是不含形成酰胺键的氨基的促红细胞生成素蛋白质；n是1-3的整数；Z是反应基，如羧基-NHS酯；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1-大约10；且Q是保护基，像烷酰基，如乙酰基。
(b)使步骤(a)中具有酰胺键的中间物与由通式W-[OCH2CH2]m-OR代表的活化聚乙二醇衍生物共价反应而形成促红细胞生成素糖蛋白产物，表述成通式 其中W是Y的巯基反应性形式；m是大约450-大约900的整数；R是低级烷基；且Y如上文定义。
在这个实施方案中，双功能试剂优选N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代丙酸酯或N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯，Z优选N-羟基-琥珀酰亚胺，且活化聚乙二醇衍生物W-[OCH2CH2]m-OR优选选自下组碘代-乙酰基-甲氧基-PEG、甲氧基-PEG-乙烯基砜、和甲氧基-PEG-马来酰亚胺。
更加详细的说，可以通过将硫醇基共价连接到EPO上(“活化”)并将由此产生的活化EPO与聚乙二醇(PEG)衍生物偶联来制备通式(III)的促红细胞生成素蛋白质。用于制备依照本发明的PEG化EPO的第一步包括通过EPO的NH2基团共价连接硫醇基。这一EPO活化使用携带受保护硫醇基和额外反应基的双功能试剂来进行，分别诸如活性酯(如琥珀酰亚胺酯)、酸酐、磺酸酯、羧酸和磺酸的卤化物。硫醇基受到本领域已知基团的保护，如乙酰基。这些双功能试剂能够通过形成酰胺键而与赖氨酸的ζ-氨基反应。第一步反应表示如下 EPO、n、和X如上文定义，而且Z是本领域已知的反应基，如N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)取代基，通式如下 在一个优选实施方案中，ε-氨基赖氨酸的活化是使用具有琥珀酰亚胺部分的双功能试剂进行的。双功能试剂可以携带不同的间隔物种类，如-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-部分，其中k是1-大约10，优选1-大约4，更优选l和2，最优选1。这些试剂的实例是N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP)和N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA) 乙酰硫代烷基-羧基-NHS-酯，像
或 2-(乙酰基硫代)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯k如上文定义。
双功能试剂的制备在本领域是知道的。2-(乙酰基硫代)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯的前体描述于DE-3924705，而乙酰硫代化合物的衍生化描述于March，J.，Advanced Organic Chemistry，McGraw-Hill，1977年，第375-376页。SATA可以通过商业途径获得(MolecularProbes，尤金，俄勒冈州，美国和Pierce，洛克福特，伊利诺斯州)。
可以通过调节反应参数来选择添加到EPO分子上的硫醇基数目，即蛋白质(EPO)浓度和蛋白质/双功能试剂比率。优选的是，通过每个EPO分子共价连接1-5个硫醇基更优选每个EPO分子1.5-3个硫醇基来活化EPO。这些范围指硫醇基相对于EPO蛋白质群的统计学分布。
反应在例如pH6.5-8.0的水性缓冲溶液中进行，如10mM磷酸钾、50mM NaCl pH7.3。可以在DMSO中添加双功能试剂。反应完成后，优选30分钟后，通过添加赖氨酸来终止反应。可以通过本领域知道的方法来分离过量的双功能试剂，如通过透析或柱过滤。可以通过例如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.，J.Appl.Biochem.Biotechnol.，11941-49，1967中描述的光度法来测定添加到EPO上的硫醇基平均数。
上述反应之后跟随活化聚乙二醇(PEG)衍生物的共价偶联。合适的PEG衍生物是平均分子量大约20kDa-大约40kDa的活化PEG分子，更优选大约24kDa-大约35kDa，最优选大约30kDa。
活化PEG衍生物在本领域是知道的，而且例如Morpurgo，M.等人，J.Bioconj.Chem.，7363，1996描述了PEG-乙烯基砜。直链和支链PEG种类适于制备通式I的化合物。反应性PEG试剂的范例是碘代-乙酰基-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙酰基砜 或 这些碘代活化物质的用途在本领域是知道的，而且描述于例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic出版社，圣迭戈，1996，第147-148页。
最优选的是，PEG种类是通过马来酰亚胺活化的，使用低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺，诸如甲氧基-PEG-马来酰亚胺(MW 30000；Shearwater Polymers公司)。低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺的结构如下 或 R和m如上文定义，优选 低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺的偶联反应在水性缓冲溶液中在原位切割硫醇保护基后进行，水性缓冲溶液如10mM磷酸钾、50mM NaCl、2mM EDTA pH6.2。例如，保护基的切除可以用羟胺在DMSO中于25℃、pH6.2进行大约90分钟。对于PEG修饰，活化EPO/低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺的摩尔比应当是大约1∶3-大约1∶6，优选1∶4。可以通过添加半胱氨酸和剩余硫醇(-SH)基与N-甲基马来酰亚胺或能够形成二硫键的其它合适化合物的反应来终止反应。由于任何剩余活泼硫醇基与保护基诸如N-甲基马来酰亚胺或其它合适保护基的反应，本发明缀合物中的EPO糖蛋白可能含有这些保护基。一般而言，根据糖蛋白上未与PEG-马来酰亚胺缀合的活化硫醇基的数目，本文描述的流程将生成具有受到不同数目保护基保护的不同数目硫醇的分子的混合物。
尽管N-甲基马来酰亚胺在用于阻断PEG化蛋白质上的剩余硫醇基时形成相同类型的共价键，二硫化物化合物将引导分子间硫化物/二硫化物交换反应趋向阻断剂的二硫桥偶联。用于这类阻断反应的优选阻断剂是氧化型谷胱甘肽(GSSG)、半胱氨酸、和胱胺。尽管在使用半胱氨酸时未向PEG化蛋白质中导入额外净电荷，阻断剂GSSG或胱胺的使用导致额外的负或正电荷。
通式(III)的化合物的进一步纯化，包括单-、双-、和三-PEG化EPO种类的分离，可以通过本领域已知方法进行，如柱层析。
PEG化促红细胞生成素衍生物优选含有至少90％的单-PEG缀合物。通常希望促红细胞生成素糖蛋白的单-PEG缀合物，因为它们趋于具有比双-PEG缀合物更高的活性。通过合并洗脱峰周围更宽广的级分以降低组合物中单-PEG的百分率或者合并更狭窄的级分以提高单-PEG的百分率，可以控制单-PEG缀合物的百分率以及单-PEG与双-PEG种类的比率。大约90％单-PEG缀合物是产量与活性之间的较好平衡。有时可能希望例如其中至少92％百分率或至少96％的缀合物是单-PEG种类(n＝1)的组合物。在本发明的一个实施方案中，n是1的缀合物的百分率是90％-96％。
包含PEG化促红细胞生成素的药物组合物在本领域是已知的，而且描述于如国际专利申请WO 01/87329。如上文所定义的，组合物可以含有10-10000μg/ml促红细胞生成素蛋白质。优选的是，组合物含有10-1000μg/ml，如10、50、100、400、800、或2500μg/ml。另外，组合物可以含有10-10000μg/ml促红细胞生成素蛋白质、10-200mmol/L硫酸盐、10-50mmol/L磷酸盐pH6.0-6.5。这种组合物还可以含有可高达20mM甲硫氨酸、1-5％多元醇(w/v)、可高达0.1％pluronic F68(w/v)、和任选的可高达1mM CaCl2。这种组合物的一个实例含有10μg-10000μg/ml促红细胞生成素蛋白质、40mmol/L硫酸盐、10mmol/L磷酸盐、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)pH6.2。或者，组合物可以含有10μg-10000μg/ml促红细胞生成素蛋白质、10-100mmol/L NaCl、10-50mmol/L磷酸盐pH6.0-7.0，任选1-5％(w/v)多元醇。另外，这种组合物可以含有可高达20mM甲硫氨酸、可高达0.1％pluronic F68(w/v)、和任选的7.5μmol/L CaCl2。具体而言，这种组合物可以含有10μg-10000μg/ml促红细胞生成素蛋白质、100mmol/L NaCl、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)、和10mmol/L磷酸盐pH7.0。
本发明还涉及含有10μg-10000μg/ml促红细胞生成素蛋白质、10-50mmol/L精氨酸pH6-6.5、10-100mmol/L硫酸钠的上述组合物。另外，这种组合物可以含有可高达20mM甲硫氨酸、可高达0.1％pluronic F68(w/v)、任选的可高达1mmol/L CaCl2、和任选的1-5％(w/v)多元醇。具体而言，这种组合物可以含有10μg-10000μg/ml促红细胞生成素蛋白质、40mmol/L精氨酸pH6.2、30mmol/L硫酸钠、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronicF68(w/v)、和任选的1mmol/L CaCl2。
本发明的一个优选实施方案涉及含有10-10000μg/ml促红细胞生成素、优选25-2500μg/ml促红细胞生成素和下列成分的组合物a)10mM磷酸钠/钾，100mM NaCl pH7.0或b)10mM磷酸钠，120mM硫酸钠pH6.2或c)10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露醇(w/v)pH6.2或d)10mM磷酸钠，40mM硫酸钠、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)pH6.2或
e)40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露醇(w/v)pH6.2或f)40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)pH6.2。
在最优选的实施方案中，组合物含有50，100，400，800或2500μg/ml量的促红细胞生成素蛋白质。最优选的组合物含有10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)pH 6.2或40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)pH6.2。可以由WO 01/87329了解这些组合物的其它细节。
本发明还涉及用于治疗糖尿病中的铁分布紊乱的方法，包括施用有效量的上文定义的促红细胞生成素蛋白质。此外，本发明涉及用于治疗糖尿病中的铁分布紊乱的药物，特征是它包含有效量的促红细胞生成素蛋白质。在上述情况中，糖尿病的优选形式是非胰岛素依赖性糖尿病。
在糖尿病中的铁分布紊乱的治疗中，可以例如以150U/kg体重的剂量每周两次施用EPO。剂量可以根据个别患者的需要而变化，而且还可以在如100-200U/kg的范围内。根据所用EPO衍生物的半衰期，可以例如每周1-3次施用剂量。根据个别患者的需要，医师还可以选择不同的剂量。
可以通过本领域已知的各种测定法来测定依照本发明的EPO或EPO缀合物的比活。纯化的本发明EPO蛋白质的生物学活性是通过注射将EPO蛋白质施用于人类患者后导致与未注射或对照组患者相比骨髓细胞生成网织红细胞和红细胞增加。可以通过依照Annable等人，Bull.Wld.Hlth.Org，4799-112，1972和Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio，1997(2)的方法来测试依照本发明获得并纯化的EPO蛋白质或其片段的生物学活性。本领域描述了用于测定EPO蛋白质活性的另一种生物学测定法即normocythaemic(正常红细胞贫血症)小鼠测定法(如Pharm.Europa Spec.IssueErythropoietin BRP Bio，1997(2)和Ph.Eur.BRP.的促红细胞生成素专论)。
通过参照下面的实施例将更好的理解本发明，它们是举例说明而非限制本文所述发明。
实施例通过测定下列参数对患有糖尿病的中年妇女检查铁分布紊乱CRP(C反应性蛋白质)、铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体—如P.Lehmann、M.Volkmann、J.Lotz、A.Baldauf、R.Roeddiger，AACC/CSCC海报展示，年会，2001年7月29日-8月2日，伊利诺斯州，芝加哥所述。结果显示了铁分布紊乱。患者接受150U/kg RecormonTM(商品化促红细胞生成素蛋白质)的皮下处理，每周两次，最多12周。此后，如上所述测定的参数显示缺铁紊乱得到改善。
序列表(1)常规信息(i)申请人(A)名称霍夫曼-拉罗奇有限公司(B)街道124 Grenzacherstrasse(C)城市巴塞尔(E)国家瑞士(F)邮政编码(ZIP)CH-4070(G)电话(61)688 11 11(H)传真(61)688 13 95(I)电报962 292 hlr ch(ii)发明名称新药物组合物(iii)序列数2(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统WORD(D)软件PatentIn Release 2.0<170>PatentIn Ver.2.0<210>1
<211>165<212>PRT<213>人<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>166<212>PRT<213>人<400> 2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165
序列表(1)常规信息(i)申请人(A)名称霍天曼-拉罗奇有限公司(B)街道124 Grenzacherstrasse(C)城市巴塞尔(E)国家瑞士(F)邮政编码(ZIP)CH-4070(G)电话(61)688 11 11(H)传真(61)688 13 95(I)电报962 292 hlr ch(ii)发明名称新药物组合物(iii)序列数2(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统WORD(D)软件PatentIn Release 2.0<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>165<212>PRT<213>人<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>166<212>PRT<213>人
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1.促红细胞生成素蛋白质在制造用于治疗糖尿病中的铁分布紊乱的药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中糖尿病是非胰岛素依赖性糖尿病。
3.依照权利要求1-2任一项的应用，其中促红细胞生成素蛋白质是人促红细胞生成素。
4.依照权利要求3的应用，其中促红细胞生成素蛋白质是epoetinα或epoetinβ。
5.依照权利要求1-4任一项的应用，其中促红细胞生成素蛋白质是通过内源基因激活而表达的。
6.依照权利要求1-2任一项的应用，其中促红细胞生成素蛋白质具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
7.依照权利要求1-2任一项的应用，其中促红细胞生成素蛋白质具有通过添加1-6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素序列。
8.依照权利要求1-2任一项的应用，其中促红细胞生成素蛋白质是darbepoetinα。
9.依照权利要求1-2任一项的应用，其中权利要求3-8任一项中定义的促红细胞生成素蛋白质是PEG化的。
10.依照权利要求9的应用，其中促红细胞生成素蛋白质是缀合物，所述缀合物包含的促红细胞生成素蛋白质具有至少一个游离氨基且具有引起骨髓细胞生成网织红细胞和红细胞增加的体内生物学活性，而且选自由人促红细胞生成素及其类似物组成的组，其具有通过添加1-6个糖基化位点或至少一个糖基化位点的重排而修饰的人促红细胞生成素序列；所述促红细胞生成素蛋白质共价连接n个通式为-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚乙二醇基团，每个聚乙二醇基团的-CO与所述氨基之一形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或3；m是大约450-大约900；n是1-3；且n和m的选择使得缀合物减去促红细胞生成素蛋白质的分子量是20kDa-100kDa。
11.依照权利要求10的应用，其中x是2，m是650-750，n是1，且R是甲基。
12.依照权利要求9的应用，其中促红细胞生成素蛋白质是缀合物，所述缀合物包含的促红细胞生成素蛋白质具有至少一个游离氨基且具有引起骨髓细胞生成网织红细胞和红细胞增加的体内生物学活性，而且选自由人促红细胞生成素蛋白质及其类似物组成的组，其具有通过添加1-6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素蛋白质一级结构；所述促红细胞生成素蛋白质共价连接1-3个低级烷氧基聚乙二醇基团，每个聚乙二醇基团通过通式为-C(O)-X-S-Y-的接头共价连接促红细胞生成素蛋白质，接头的C(O)与所述氨基之一形成酰胺键，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1-10，Y是 或 每个聚乙二醇部分的平均分子量是大约20kDa-大约40kDa，且缀合物的分子量是大约51kDa-大约175kDa。
13.依照权利要求12的应用，促红细胞生成素缀合物的通式是 其中n是1-3的整数；m是450-900的整数；R是低级烷基；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1-10，且P是促红细胞生成素蛋白质不含与X形成酰胺键的n个氨基的残基。
14.一种用于治疗糖尿病中的铁分布紊乱的方法，包含施用有效量的促红细胞生成素蛋白质。
15.一种用于治疗糖尿病中的铁分布紊乱的药物，特征为它包含有效量的促红细胞生成素蛋白质。
16.如上文定义的发明。
全文摘要
本发明涉及促红细胞生成素用于治疗糖尿病中的铁分布紊乱的用途。
文档编号A61P39/00GK1678341SQ03820545
公开日2005年10月5日 申请日期2003年8月20日 优先权日2002年8月29日
发明者保罗·莱曼, 拉尔夫·罗勒迪格, 露特·瓦尔特－马茨苏 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司