调节免疫反应的核酸成分的制作方法

专利名称：调节免疫反应的核酸成分的制作方法
技术领域：
本发明与刺激免疫反应的核酸、其组合物及使用方法相关。
背景技术：
细菌DNA具有激活B细胞和自然杀伤细胞的免疫刺激功能，但脊椎动物的DNA没有该功能(见Tokunaga.T等人1988年发表在《Jpn J.Cancer Res》79卷682-686页；Tokunaga.T等人1984年发表在《JNCI》72卷955-962页；Messina，J.P.等人1991年发表在《J.Immunol.》147卷1759-1764页和1998年由C.A.Stein和A.M.Krieg编辑、纽约John Wiley和Sons公司出版的《寡聚核酸应用技术》431-448页有关综述)。现在已知细菌DNA的免疫刺激功能是由存在于特定碱基部位的未甲基化的CpG二核酸(CpG基序)引起的，这一结构在细菌DNA中很普遍，但在脊椎动物DNA中该基序被甲基化或数量减少(见Krieg等人1995年发表于《Nature》374卷546-549页；Krieg 1999年发表于《Biochim.Biophys.Acta》93321卷1-10页的文章)。
可以通过人工合成包含CpG基序的寡聚脱氧核酸(ODN)模拟细菌DNA的免疫刺激功能。这类CpG ODN对人和鼠的淋巴细胞具有高度刺激效应，包括诱导B细胞增值；分泌细胞因子和免疫球蛋白；活化自然杀伤细胞(NK)的细胞溶解活性和分泌IFN-r；激活树突状细胞(DCs)和其它抗原呈递细胞表达共刺激分子，分泌细胞因子特别是Th-1类细胞因子，该因子在促进Th-1类T细胞反应中发挥重要作用。
天然磷酸二酯骨架的CpG ODN的免疫刺激效应具有高度的CpG特异性，当CpG基序被甲基化、改变为GpC或用其它方法消除或改变后将失去免疫刺激功能(见Krieg等人1995年发表于《自然》374卷的文章，546-549页；Hartmann等人1999年发表于《Proc.Natl.Acad.Sci USA》96卷的文章，9305-9310页)。磷酸二酯CpG ODN可以与脂类、铝或其它能吸附或促进细胞吸收的媒介混合增强免疫刺激功能(见Yamamoto等人1994年发表于《Microbiol.Immunol.》38卷的文章，831-836；Gramzinski等人1998年发表于《Mol.Med》4卷的文章，109-118页)。
早期研究认为存在于嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶结构中的CpG基序具有免疫刺激功能(见Krieg等人1995年发表于《自然》374卷的文章，546-549页；Pisetsky等人1996年发表在《免疫学》156卷的文章，421-423；Hacker等人1998年发表在《EMBO J.》17卷的文章，6230-6240；Lipford等人1998年发表在《Trends in Microbiol.》6卷的文章，496-500页)。但是现在发现小鼠淋巴细胞同样能与不按上述结构组成的磷酸二酯CpG基序发生反应(见Yi等人1998年发表于《免疫学》160卷的文章，5898-5906页)，人B细胞和树突细胞反应相似(Hartmann等人1999年发表于《Proc.Natl.Acad.Sci USA》96卷的文章，9305-9310页；Liang1996年发表于《J.Clin.Invest.》98卷的文章，1119-1129页)。
过去曾有多位学者研究过ODN的核酸含量是否对ODN序列有影响。有趣的是在包含GG、CCC、CC、CAC和CG序列中发现反义ODN含量增加，如果按照碱基随机出现原理与预期相比，出现TT或TCC核酸序列的频率减少(Smetsers等人1996年发表于《Antisense Nucleic Acid Drug Develop.》6卷的文章，63-67页)。其可能原因是过多存在的序列中可能包含反义寡聚核酸优先作用的靶位点，反之亦然。在反义试验中避免使用富含胸腺嘧啶的ODN的一个原因是ODN被细胞中的核酸酶降解后释放出游离的胸腺嘧啶，与3H标记的胸腺嘧啶进行竞争，而后者在细胞增值试验中经常使用(Matson等人1992年发表在《反义核酸研究进展》2卷中发表的文章，325-330页)。
发明概述本发明的部分依据是发现了一个新的核酸家族，该家族核酸与以前已知的核酸相比能诱导产生高水平的免疫刺激效应。该发现之所以令人惊奇，部分原因是在本发明以前已经筛选超过100个核酸序列。
一方面本发明提供了由序列编号为NO1(ODN 10102)，NO19(ODN 10103)，NO45(ODN 10104)，NO118(ODN 10105)或NO141(ODN 10106)的核酸序列组成的免疫调节核酸分子。
另一方面本发明还提供了在免疫对象中使用刺激免疫反应的方法，对免疫对象接种由序列编号为NO1(ODN 10102)，NO19(ODN 10103)，NO45(ODN 10104)，NO118(ODN 10105)或NO141(ODN 10106)核酸序列组成的免疫调节核酸分子，接种量以能刺激产生有效的免疫反应为准。
本发明的多项实施方案都应用了这里提供的各个方面，其中一些见下所述。
在一个实施方案中，免疫调节核酸分子由核酸序列编号为NO1(ODN 10102)，NO19(ODN 10103)，NO45(ODN 10104)，NO118(ODN 10105)或NO141(ODN 10106)的核酸序列组成。
在另一个实施方案中，组合物还包括抗原。相应的，免疫对象也需要接种抗原。抗原可以是微生物抗原，自身抗原，癌抗原或过敏原，但不局限于以上几种。在一个实施方案中，微生物抗原包括细菌抗原，病毒抗原，真菌抗原和寄生虫抗原。在另一个实施方案中，将核酸载体与免疫调节核酸进行分离。抗原还可以是肽抗原。
在另一个实施方案中，组合物还包括佐剂，或者免疫对象还需要接种佐剂。佐剂可以是粘膜佐剂，但不局限于此。
在另一个实施方案中，组合物还包括细胞因子，或者免疫对象需要进一步接种细胞因子。
在另一个实施方案中，组合物包括治疗性制剂如抗微生物制剂，抗癌制剂和过敏/哮喘药物，或者免疫对象需要进一步接种如上所述的治疗性制剂。在相关实施方案中，抗微生物制剂包括抗细菌制剂，抗病毒制剂，抗真菌制剂和抗寄生虫制剂。在另一个相关实施方案中，抗癌制剂包括化疗制剂，癌症疫苗和免疫治疗制剂。在另一个相关实施方案中，过敏原/哮喘药物包括PDE-4抑制剂，支气管扩张剂/β-2拮抗剂，K+通道开放剂，VLA-4对抗剂，neurokin对抗剂，TXA2合成抑制剂，xanthanine，花生四烯酸对抗剂，5 lipoxygenase抑制剂，thromboxin A2受体对抗剂，thromboxane A2对抗剂，5-lipox激活蛋白抑制剂和蛋白酶抑制剂，
在一些实施方案中免疫调节核酸具有至少一个经过修饰的核酸骨架。在一个实施方案中，骨架经硫代磷酸修饰。在另一个实施方案中，核酸骨架为嵌合型。在一个实施方案中，核酸骨架完全经过修饰。
在一个实施方案中，组合物还包括药物界认可的载体。
在一个实施方案中，免疫调节核酸是未甲基化的CpG二核酸。在另一个实施方案中，免疫调节核酸包括至少4个CpG基序。在另一个实施方案中，免疫调节核酸富含T。在相关实施方案中，免疫调节核酸包括多聚T序列。在另一个实施方案中，免疫调节核酸包括多聚G序列。
在某些实施方案中，免疫调节核酸有多种构成形式。在一个实施方案中，免疫调节核酸采用口服形式给药。免疫调节核酸还可以作为营养添加剂。在相关实施方案中，营养添加剂可以为胶囊，药丸或舌下药片。在另一个实施方案中，免疫调节核酸采用局部给药方式。免疫调节核酸还可以采用注射方式给药或与缓释载体结合给药。缓释载体可以是微粒但不局限于此。在另一个实施方案中，免疫调节核酸采用粘膜表面给药的方式，可以是口腔，鼻腔，直肠，阴道或眼睛粘膜，但不限于此。
在一个实施方案中，免疫调节核酸刺激发生粘膜免疫反应。在另一个实施方案中，免疫调节核酸刺激发生全身免疫反应。在重要的实施方案中，免疫调节核酸同时刺激发生粘膜和全身免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是抗原特异性反应。在相关实施方案中提供足够量的免疫调节核酸以引发粘膜免疫反应。在其它实施方案中，提供足够量的免疫调节核酸以引发全身免疫反应。仍然是在其它实施方案中，提供足够量的免疫调节核酸以引发固有免疫反应。
在不同的实施方案中，免疫调节核酸用来治疗或治疗多种疾病。因此在一个实施方案中，提供足够量的免疫调节核酸治疗或预防感染性疾病。在另一个实施方案中，提供足够量的免疫调节核酸治疗或预防过敏。仍然是在另一个实施方案中，提供足够量的免疫调节核酸治疗或预防哮喘。在另一个实施方案中，提供足够量的免疫调节核酸治疗或预防癌症。
在相关实施方案中，感染性疾病为单纯疱疹病毒感染。在另一个实施方案中，免疫调节核酸用来免疫感染者或高危人群。感染可能包括细菌感染，病毒感染，真菌感染和寄生虫感染。在一个实施方案中，病毒感染包括人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)，人T淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)，人T淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)，单纯疱疹病毒I型(HSV-1)，单纯疱疹病毒II型(HSV-2)，人乳头瘤病毒(多种型别)，甲肝病毒，乙肝病毒，丙肝和丁肝病毒，EB病毒(EBV)，巨细胞病毒和传染性软疣病毒。在一个重要的实施方案中，病毒性感染为单纯疱疹病毒感染。
在其它实施方案中，感染微生物的种类包括疱疹病毒属，逆转录病毒属，orthomyroviridae，弓形体，haemophilus，campylobacter，梭状芽孢杆菌，大肠杆菌和葡萄球菌。在相关实施方案中，免疫对象接种来自上述种属的抗原，或在组份中包含该抗原。
在某些实施方案中，感染类型为SARS感染或猴天花感染。
在其它实施方案中，免疫调节核酸的免疫对象为患过敏的人或其高危人群，或是患哮喘的人或其高危人群，或是癌症患者或高危人群。
在与治疗相关的实施方案中，本方法还包括从免疫对象体内分离免疫细胞，将分离得到的免疫细胞与足够量的免疫调节核酸孵育激活免疫细胞，然后将激活的免疫细胞回输给免疫对象。在一个实施方案中，分离的免疫细胞为淋巴细胞。在另一个实施方案中，分离的免疫细胞为树突状细胞。在另一个实施方案中，本方法还包括将免疫细胞与抗原接触。
在重要的实施方案中，免疫对象为人。在其它实施方案中，免疫对象包括狗，猫，马，牛，猪，绵羊，山羊，鸡，猴和鱼。
因此，这里提供的方法可用于免疫患有感染疾病的免疫对象或高危对象，因此本方法是治疗或预防感染性疾病的一种方法。这些方法还可用于患哮喘的免疫对象或高危对象，因此本方法是治疗或预防哮喘的一种方法。这些方法还可用于有过敏史的免疫对象或高危对象，因此本方法是治疗或预防过敏的一种方法。这些方法还可用于患癌症的免疫对象或高危对象，因此本方法是治疗或预防癌症的一种方法。在一个实施方案中，癌症种类包括胆管癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；结缔组织癌；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；胃癌；何杰金淋巴癌；上皮内瘤；喉癌；淋巴瘤；肝癌；肺癌(比如小细胞和非小细胞)；黑色素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；恶性毒瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌和肾癌。
在另一个实施方案中提供的治疗性或预防性方法还包括使用针对细胞表面抗原的抗体进行免疫，诱导产生抗原依赖的细胞毒作用(ADCC)。
另一方面本发明提供了在免疫对象中预防疾病的方法，包括使用免疫调节核酸接种免疫对象以预防疾病发生，其中免疫核酸的序列编号为NO1(ODN 10102)，NO19(ODN 10103)，NO45(ODN 10104)，NO118(ODN 10105)或NO141(ODN10106)。
仍然是另一方面，本发明提供了诱导产生天然免疫反应的方法，包括使用足够量的免疫调节核酸接种免疫对象，激活产生天然免疫反应，其中免疫核酸的序列编号为NO1(ODN10102)，NO19(ODN 10103)，NO45(ODN 10104)，NO118(ODN 10105)或NO141(ODN 10106)。
仍然是另一方面，本发明提供了鉴别免疫调节核酸的方法，包括免疫细胞群与序列编号为NO1(ODN 10102)，NO19(ODN10103)，NO45(ODN 10104)，NO118(ODN 10105)或NO141(ODN 10106)的免疫调节核酸接触后，分别测量免疫细胞活化的对照水平和试验水平，将活化的对照水平与检测水平进行比较，其中当检测水平等于或高于对照水平时指示其为免疫调节核酸。
将对本发明实施方案中的这些方面进行更加详细的描述。
图示简介

图1ODNs 7909和10102刺激产生的TLR9结合试验。表达TLR9的细胞系与实施方案1中所述浓度的ODNs孵育。图示为高于对照质控的刺激指数均值。IL-1作为报告基因的阳性质控。
图2PBMC与CpG ODNs孵育后B细胞上调表达活化标记分子CD86。人PBMC与ONDs7909和10102按所示浓度孵育48小时。图示为三名不同捐献者CD19阳性的B细胞(通过流式细胞仪检测)表达CD86的平均百分数。
图3CpG ODNs 7909和10102诱导的B细胞增值试验。PBMC与CFSE染色剂预孵育后，在存在或不存在所示浓度ODN的情况下培养5天。收获细胞，根据CD19阳性的B细胞增生后CFSE染色降低的原理，通过流式细胞仪对三名不同捐献者的CD19阳性B细胞的增生情况进行检测(见实施方案1)。
图4CpG ODNs 7909和10102诱导分泌IFN-α。来自三名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs孵育48小时。收获上清，使用ELISA检测IFN-α(见实施方案1)。图示为三名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌IFN-α的平均量、最低量和最高量。
图5CpG ODNs 7909和10102诱导分泌IP-10。来自三名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs孵育48小时。收获上清，使用ELISA检测IP-10(见实施方案1)。图示为三名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌IP-10的平均量、最低量和最高量。
图6CpG ODNs 7909和10102诱导分泌IL-10。来自三名不同捐献者的人PBMC与ODNs 7909和10102D所示浓度或质控ODN孵育。收获上清，使用ELISA检测IL-10(见实施方案1)。图示为三名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌IL-10的平均量、最低量和最高量。
图7CpG ODNs 7909和10102诱导分泌TNF-α。来自三名不同捐献者的人PBMC与ODNs 7909和10102D所示浓度或质控ODN孵育24小时。收获上清，使用ELISA检测TNF-α(见实施方案1)。图示为三名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌TNF-α的平均量、最低量和最高量。
图8未致敏BALB/c小鼠脾细胞(5×106个/ml或2.5×106个/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 10102孵育。孵育96小时后用3H标记的胸腺嘧啶(20uCi/ml)作用16小时，收获细胞检测放射性。每个条形代表刺激指数(孵育细胞每分钟的数目(CPM)/培养基孵育的细胞的CPM)。
图9未致敏BALB/c小鼠脾细胞(5×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909，10102或质控ODN2137孵育。6小时时收获含TNF-α的上清(D组)，24小时收获IL-12(B组)或48小时收获IL-6(C组)，IL-10(A组)。
图10未致敏BALB/c小鼠脾细胞(30×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909和10102孵育。使用51Cr放射试验检测NK细胞的活性。
图11单独使用1ug HBsAg免疫或与CpG ODN(10ug)10102，7909或质控ODN(10ug)2137联合免疫成年(6-8周龄)BALB/c小鼠。免疫4周后取血，检测血浆中抗HBsAg(抗-HBs)的总IgG水平。每个条形代表全组(n＝10)ELISA终点稀释效价的几何均值(±SEM)。效价是指免疫组血浆吸光值比未免疫组血浆高2倍时加0.05为阈值的最高稀释度。
图12单独使用1ug HBsAg免疫或与10ug CpG ODN 7909，10102，或10ug质控ODN 2137联合免疫成年(6-8周龄)BALB/c小鼠。免疫4周后取血，检测血浆中抗HBsAg(抗-HBs)的IgG1和IgG2a的抗体水平。每个条形代表全组(n＝10)ELISA终点稀释效价的几何均值(±SEM)。效价是指阈值为0.05时免疫组血浆吸光值比未免疫组血浆高2倍时的最高稀释度。
图13ODNs 7909和10103刺激的TLR9结合试验。表达TLR9的细胞系与实施方案2中所述浓度的ODNs孵育。图示为4个独立试验中高于对照质控的刺激指数均值。IL-1作为报告基因的阳性质控。
图14PBMC与CpG ODNs孵育后B细胞上调表达活化标记分子CD86。人PBMC与ONDs7909和10103及质控ODN按所示浓度孵育48小时。图示为三名不同捐献者CD19阳性的B细胞(通过流式细胞仪检测)表达CD86的平均百分数。
图15CpG ODNs 7909和10103诱导的B细胞增值试验。PBMC与CFSE染色剂预孵育后，在存在或不存在所示浓度ODN的情况下培养5天。收获细胞，根据CD19阳性的B细胞增生后CFSE染色降低的原理，通过流式细胞仪对CD19阳性B细胞的增生情况进行检测(见实施方案2)。
图16ODNs 7909和10103诱导分泌IFN-α。来自六名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs孵育48小时。收获上清，使用ELISA检测IFN-α(见实施方案2)。图示为六名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌IFN-α的量。
图17CpG ODNs 7909和10103诱导分泌IP-10。来自三名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs孵育48小时。收获上清，使用ELISA检测IP-10(见实施方案2)。图示为三名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌IP-10的平均量。
图18显示与不同浓度7909，10103和质控ODN孵育后诱导分泌IL-10的情况。图为来自三名不同捐献者的PBMC按要求孵育48小时的方法。
图19分泌TNF-α来自三名不同血液捐献者的PBMC与所示浓度的ODNs 7909和10103或质控ODN孵育48小时。收获上清，使用ELISA检测TNF-α。图示为三名捐献者的平均量。
图20未致敏BALB/c小鼠脾细胞(5×106/ml或2.5×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909(白色条带)、10103(黑色条带)孵育。孵育96小时后用3H标记的胸腺嘧啶(20uCi/ml)作用16小时，收获细胞检测放射性。每个条形代表刺激指数(每分钟孵育细胞的数目(CPM)/培养基孵育的细胞的CPM)。
图21未致敏BALB/c小鼠脾细胞(5×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909，10103或质控ODN2137孵育。6小时时收获含TNF-α的上清，(D组)，24小时收获IL-12(B组)或48小时收获IL-6(C组)，IL-10(A组)。
图22未致敏BALB/c小鼠脾细胞(30×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909和10103孵育。使用51Cr放射试验检测NK细胞的活性。
图23单独使用1ug HBsAg免疫或与CpG ODN(10ug)10103，7909或质控ODN(10ug)2137联合免疫成年(6-8周龄)BALB/c小鼠。免疫4周后取血，检测血浆中抗HBsAg(抗-HBs)的总IgG水平。每个条形代表全组(n＝5)ELISA终点稀释效价的几何均值(±SEM)。效价是指免疫组血浆吸光值比未免疫组血浆高2倍时加0.05为阈值的最高稀释度。
图24单独使用1mg HBsAg免疫或与10mg CpG ODN7909，10103，或10ug质控ODN 2137联合免疫成年(6-8周龄)BALB/c小鼠。免疫4周后取血，检测血浆中抗HBsAg(抗-HBs)的IgG1和IgG2a的抗体水平。每个条形代表全组(n＝5)ELISA终点稀释效价的几何均值(±SEM)。效价是指免疫组血浆吸光值比未免疫组血浆高2倍时加0.05为阈值的最高稀释度。
图251mg HBsAg与CpG ODN 7909(10ug)或10103联合使用免疫成年(6-8周龄)BALB/c小鼠。免疫4周后取脾制备脾细胞，使用51Cr放射试验检测CTL活性。用不同效靶比时试验动物组(n＝5)的特异裂解(±SEM)平均百分数表示CTL活性。
图26是用HSV-2攻击小鼠并接种免疫调节核酸10104，出现平均病理等级作为感染后作用时间的图表。
图27是用HSV-2攻击小鼠并接种免疫调节核酸10104后，小鼠的存活百分数作为感染后作用时间的图表。
图28是在人PBMC与核酸10104或对照共同培养48小时后诱导产生人IFN-α的条形图。通过ELISA检测IFN-α水平，结果是三名血液捐献者IFN-α检测水平均值+/-SEM。
图29是在人PBMC与核酸10104或对照共同培养48小时后诱导产生人IL-10的条形图。通过ELISA检测IL-10水平，结果是三名血液捐献者IL-10检测水平均值+/-SEM。
图30是与核酸10104或对照孵育16小时后人TLR-介导的NFkB刺激作用的条形图。通过报告基因上调分析来检测刺激作用。
图31ODNs 7909和10105刺激的TLR9结合试验。表达TLR9的细胞系与实施方案4中所述浓度的ODNs孵育。图示为4个独立试验中高于对照质控的刺激指数均值。IL-1作为报告基因的阳性质控。
图32PBMC与CpG ODNs孵育后B细胞上调表达活化标记分子CD86。人PBMC与ONDs7909和10105及质控ODN按所示浓度孵育48小时。图示为三名不同捐献者CD19阳性的B细胞(通过流式细胞仪检测)表达CD86的平均百分数。
图33CpG ODNs 7909和10105诱导的B细胞增值试验。PBMC与CFSE染色剂预孵育后，在存在或不存在所示浓度ODN的情况下培养5天。收获细胞，根据CD19阳性的B细胞增生后CFSE染色降低的原理，通过流式细胞仪对CD19阳性B细胞的增生情况进行检测(见实施方案4)。
图34ODNs 7909和10105诱导分泌IFN-α。来自三名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs孵育48小时。收获上清，使用ELISA检测IFN-α(见实施方案4)。图示为三名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌IFN-α的量。
图35CpG ODNs 7909和10105诱导分泌IP-10。来自三名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs孵育48小时。收获上清，使用ELISA检测IP-10(见实施方案4)。图示为三名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌IP-10的平均量。
图36IFN-α分泌的时间动力学。来自两名血液捐献者的PMBC与所示浓度的ODNs 7909和10105或对照孵育8小时或24小时。收集上清，ELISA检测IFN-α的量。图示为两名捐献者的PMBC在不同时间分泌的IFN-α量。
图37IFN-α分泌的时间动力学。来自两名血液捐献者的PMBC与所示浓度的ODNs 7909和10105或对照孵育36小时或48小时。收集上清，ELISA检测IFN-α的量。图示为两名捐献者的PMBC在不同时间分泌的IFN-α量。
图38IL-10分泌的时间动力学。来自三名血液捐献者的PMBC与所示浓度的ODNs 7909和10105或对照孵育8小时，24小时或48小时。收集上清，ELISA检测IL-10的量。图示为三名捐献者的PMBC在不同时间分泌的IFN-α量。
图39IL-10分泌的时间动力学。与图8所示试验相同。计算三名捐献者之间在每个浓度和时间点时IL-10的平均量。
图40未致敏BALB/c小鼠脾细胞(5×106/ml或2.5×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909、10105孵育。孵育96小时后用3H标记的胸腺嘧啶(20uCi/ml)作用16小时，收获细胞检测放射性。每个条形代表刺激指数(每分钟孵育细胞的数目(CPM)/培养基孵育的细胞的CPM)。
图41未致敏BALB/c小鼠脾细胞(5×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909，10105或质控ODN2137孵育。6小时时收获含TNF-α的上清(D组)，24小时收获IL-12(B组)或48小时收获IL-6(C组)，IL-10(A组)。
图42未致敏BALB/c小鼠脾细胞(30×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909和10105孵育。使用51Cr放射试验检测NK细胞的活性。
图43单独使用1ug HBsAg免疫或与CpG ODN(10ug)10105，7909或质控ODN(10ug)2137联合免疫成年(6-8周龄)BALB/c小鼠。免疫4周后取血，检测血浆中抗HBsAg(抗-HBs)的总IgG水平。每个条形代表全组(n＝10)ELISA终点稀释效价的几何均值(±SEM)。效价是指免疫组血浆吸光值比未免疫组血浆高2倍时加0.05为阈值的最高稀释度。
图44单独使用1ug HBsAg免疫或与10ug CpG ODN7909，10105TU，或10ug质控ODN 2137联合免疫成年(6-8周龄)BALB/c小鼠。免疫4周后取血，检测血浆中抗HBsAg(抗-HBs)的IgG1和IgG2a的抗体水平。每个条形代表全组(n＝10)ELISA终点稀释效价的几何均值(±SEM)。效价是指免疫组血浆吸光值比未免疫组血浆高2倍时加0.05为阈值的最高稀释度。
图45CpG ODNs诱导B细胞增值。浓度为0.5×106/ml的来自普通健康人(n＝10)或HCV慢性感染者(n＝10)的PBMCs与培养基(阴性对照)或浓度增高到6ug/mL的CpG ODN 7909，10106或4010孵育。孵育5天后用3H标记的胸腺嘧啶(20uCi/ml)作用16到18小时，收获细胞检测放射性。每个条形代表刺激指数(每分钟孵育细胞的数目(CPM)/培养基孵育的细胞的CPM)。
图46CpG ODNs诱导分泌IFN-α。来自普通健康人和HCV慢性感染者的PBMCs与浓度从1到6ug/mL的质控CpG ODN4010，7909或10106孵育。收集上清ELISA检测IFN-α(见实施方案5)。该方法的检出限为31.2pg/mL，图中没有表示低于该检出限的IFN-α结果。用直线方法表示可以检出IFN-α的受试对象。
图47CpG ODNs诱导分泌IP-10。来自10名普通健康人和10名HCV慢性感染者的PBMCs与浓度从1到6ug/mL的质控CpG ODN 4010，7909或10106孵育。收集上清ELISA检测IP-10(见实施方案5)。该方法的检出限为15.6pg/mL。
图48CpG ODNs诱导分泌IL-10。来自10名普通健康人和10名HCV慢性感染者的PBMCs与浓度从1到6ug/mL的质控CpG ODN 4010，7909或10106孵育。收集上清ELISA检测IL-10(见实施方案5)。该方法的检出限为23.4pg/mL。如果试验组中有低于IL-10检出限的受试对象，图中用所有受试对象的比例表示可检出IL-10的受试对象的数目。对可检出IL-10的受试对象计算平均数和标准偏差。
图49ODNs 7909和10106刺激的TLR9结合试验。表达TLR9的细胞系与实施方案5中所述浓度的ODNs孵育。图示为高于对照质控的刺激指数均值。IL-1作为报告基因的阳性质控。
图50PBMC与CpG ODNs孵育后B细胞上调表达活化标记分子CD86。人PBMC与ONDs7909和10106及质控ODN按所示浓度孵育48小时。图示为三名不同捐献者CD19阳性的B细胞(通过流式细胞仪检测)表达CD86的平均百分数。
图51CpG ODNs 7909和10106诱导的B细胞增值试验。PBMC与CFSE染色剂预孵育后，在存在或不存在所示浓度ODN的情况下培养5天。收获细胞，根据CD19阳性的B细胞增生后CFSE染色降低的原理，通过流式细胞仪对CD19阳性B细胞的增生情况进行检测(见实施方案5)。
图52ODNs 7909和10106诱导分泌IFN-α。来自三名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs孵育48小时。收获上清，使用ELISA检测IFN-α(见实施方案5)。图示为三名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌IFN-α的平均量、最低量和最高量。
图53CpG ODNs 7909和10106诱导分泌IP-10。来自三名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs孵育48小时。收获上清，使用ELISA检测IP-10(见材料与方法)。图示为三名不同捐献者的PBMC在每个浓度分泌IP-10的平均量、最低量和最高量。
图54IL-10分泌。来自三名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs 7909，10106或对照孵育。收获上清，使用ELISA检测IL-10。图示为三名不同捐献者的PBMC所分泌IL-10的平均量、最低量和最高量。
图55TNF-α分泌。来自三名不同捐献者的人PBMC与所示浓度的ODNs 7909，10106或质控孵育16小时。收获上清，使用ELISA检测TNF-α。图示为三名不同捐献者的PBMC所分泌TNF-α的平均量、最低量和最高量。
图56未致敏BALB/c小鼠脾细胞(5×106/ml或2.5×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909、10106孵育。孵育96小时后用3H标记的胸腺嘧啶(20uCi/ml)作用16小时，收获细胞检测放射性。每个条形代表刺激指数(每分钟孵育细胞的数目(CPM)/培养基孵育的细胞的CPM)。
图57未致敏BALB/c小鼠脾细胞(5×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909，10106或质控ODN2137孵育。6小时时收获含TNF-α的上清(D组)，24小时收获IL-12(B组)或48小时收获IL-6(C组)，IL-10(A组)。
图58未致敏BALB/c小鼠脾细胞(30×106/ml)与培养基(阴性对照)或不同量的CpG ODN 7909和10106孵育。使用51Cr放射试验检测NK细胞的活性。
图59单独使用1ug HBsAg免疫或与CpG ODN(10ug)10106，7909或质控ODN(10ug)2137联合免疫成年(6-8周龄)BALB/c小鼠。免疫4周后取血，检测血浆中抗HBsAg(抗-HBs)的总IgG水平。每个条形代表全组(n＝10)ELISA终点稀释效价的几何均值(±SEM)。效价是指免疫组血浆吸光值比未免疫组血浆高2倍时加0.05为阈值的最高稀释度。
图60单独使用1ug HBsAg免疫或与10ug CpG ODN7909，10106，或10ug质控ODN 2137联合免疫成年(6-8周龄)BALB/c小鼠。免疫4周后取血，检测血浆中抗HBsAg(抗-HBs)的IgG1和IgG2a的抗体水平。每个条形代表全组(n＝10)ELISA终点稀释效价的几何均值(±SEM)。效价是指免疫组血浆吸光值比未免疫组血浆高2倍时加0.05为阈值的最高稀释度。
图61A显示在小鼠阴道内HSV-2攻击后，使用BEMA圆盘导入CpG对小鼠局部病理的影响。
图61B显示在小鼠阴道内HSV-2攻击后，导入溶于生理盐水中的CpG对局部病理的影响。
图62A显示在小鼠阴道内HSV-2攻击后，使用BEMA圆盘导入CpG对小鼠存活的影响。
图62B显示在小鼠阴道内HSV-2攻击后，导入溶于生理盐水的CpG对小鼠存活的影响。
图63显示注射CpG 10104对小鼠血浆中IP-10水平的影响。
图64显示注射CpG 10104对小鼠血浆中IFN-g水平的影响。
图65显示阴道内导入CpG 10104对小鼠血浆中IP-10水平的影响。
图66显示在小鼠阴道内HSV-2攻击后，局部导入CpG对小鼠局部病理的影响。
图67显示在小鼠阴道内HSV-2攻击后，局部导入CpG对小鼠存活的影响。
图68显示阴道内导入CpG 10104对小鼠阴道洗液中IP-10水平的影响。
图69A显示在小鼠阴道内HSV-2攻击后，局部导入CpG对小鼠局部病理的影响。
图69B显示在小鼠阴道内HSV-2攻击后，局部导入CpG对小鼠存活的影响。
图70A显示不存在铝佐剂时，CpG10104增强BALB/c小鼠对HBsAg体液反应的能力与CPG7909一样有效。
图70B显示存在铝佐剂时，CpG 10104增强BALB/c小鼠对HBsAg体液反应的能力与CPG 7909一样有效。
图71A显示不存在铝佐剂时，CpG 10104促进BALB/c小鼠对HBsAg产生Th1为主的免疫反应(即IgG2a效价高于IgG1的效价)的能力与CpG 7909同样有效。
图71B显示存在铝佐剂时，CpG 10104促进BALB/c小鼠对HBsAg产生Th1为主的免疫反应(即IgG2a效价高于IgG1的效价)的能力与CPG 7909同样有效。
本发明详述以前已知CpG包含能刺激免疫反应的核酸，因此可以用来治疗癌症、感染性疾病、过敏、哮喘及其它疾病，还有助于避免癌症化疗后的机会感染。CpG刺激后产生强烈但平衡的细胞免疫反应和体液免疫反应反映了机体自身的天然防御系统对侵入病原和癌细胞的抵御。CpG序列，在人DNA中很少见，在感染性微生物如细菌中却很普遍。显然进化后人类的免疫系统将识别CpG序列作为感染的早期警告，立即产生针对侵入病原的有效的免疫反应，同时还不引起在其它免疫刺激剂中经常出现的副反应。因此根据先天免疫防御机制，包含核酸的CpG能够利用独特的自然途径进行免疫治疗。
CpG核酸的免疫调节作用由申请专利的发明者发明，在其它共同待审的专利申请中有广泛描述，如美国专利申请号02/07/95提交的，08/386,063(相关PCT US 95/01570)；10/30/96提交的08/738,652；10/30/97提交的08/960,774(相关PCT/US97/19791，WO98/18810)；11/13/98提交的09/191,170；02/25/98提交的09/030,701(相关PCT/US98/03678)；05/20/98提交的09/082,649(相关PCT/US98/10408)；06/03/99提交的09/325,193(相关PCT/US98/04703)；04/02/99提交的09/286,098(相关PCT/US99/7335)；05/06/99提交的09/306,281(相关PCT/US99/09863)。这些专利和专利申请的全部内容在此通过引证并入本篇。
本发明部分依据是对几个核酸家族的意外发现，这些核酸家族比以前报导的CpG核酸具有更强的免疫调节作用。每个家族由一个特定的免疫调节核酸代表。这些核酸家族和它们的代表将在下面详细描述。
ODN 10102家族该核酸家族包括具有以下组成方式的核酸序列5’X1X2X3X4X5X6X7TT CGT CGT TTC GTC GTT3’(序列编号3)，其中X1，X2，X3，X4，X5，X6和X7各自代表残基，可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶。在一些实施方案中，可能没有两侧的残基。如核酸序列为5’TT CGT CGT TTC GTCGTT3’(序列编号4)。
在另一个实施方案中，核酸序列可能缺少X1；X1和X2；X1，X1，X6和X3；X1，X2，X3和X4；或X1，X2，X3，X4和X5，或缺少X1到X6或缺少X1到X7。
在一个实施方案中，X1是胸腺嘧啶，X2是胞嘧啶，X3是鸟嘌呤，X4是胸腺嘧啶，X5是胞嘧啶，X6是鸟嘌呤，X1是胸腺嘧啶。本领域的专业人员能够确定属于该家族的核酸序列。
该家族的核酸长度至少为17个核苷酸。在一些实施方案中，核酸长度至少为19个核苷酸，20个核苷酸，21个核苷酸，22个核苷酸，23个核苷酸及24个核苷酸。在优选实施方案中的核酸长度为24个核苷酸。仍然是在实施方案中，核酸长度超过24个核苷酸，如至少包括50个核苷酸，至少包括75个核苷酸，至少包括100个核苷酸，至少包括200个核苷酸，至少包括500个核苷酸，至少包括1000个核苷酸或更长。核酸长度在17-100个核苷酸之间时比较适宜，在24-100个核苷酸之间时最适宜。
该家族中的所有核酸至少包括三个CpG基序。这些核酸可能包括四个或五个或更多CpG基序。CpG基序可以是互相连接，或者被一定或随意的距离分隔。
该家族的核酸还含有过量的胸腺嘧啶，这些核酸中胸腺嘧啶的含量可能超过60％，低于60％或低于55％。
本发明的部分依据是对另外一个核酸家族的发现，该核酸家族比以前报导的CpG核酸具有更强的免疫调节作用。该核酸家族包括具有以下组成方式的核酸序列5’TCG TCG TTT CGTCGT TTC X1X2X3X4X5X63’(序列编号5)，其中X1，X2，X3，X4，X5和X6各自代表残基，可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶。在一些实施方案中，可能没有两侧的残基。如核酸序列为5’TCG TCG TTT CGT CGT TTC3’(序列编号6)。
在另一个实施方案中，核酸序列可能缺少X1；X6和X5；或X6，X5和X4；X6到X3；X6到X2或X6到X1。
在一个实施方案中X1是胞嘧啶。在另一个实施方案中X2是鸟嘌呤。在另一个实施方案中X3是胸腺嘧啶。在另一个实施方案中X4是胸腺嘧啶。本领域的专业人员能够确定属于该家族的核酸序列。
该家族的核酸长度至少为18个核苷酸。在一些实施方案中，核酸长度至少为20个核苷酸，22个核苷酸，23个核苷酸，24个核苷酸。在优选实施方案中的核酸长度为24个核苷酸。仍然是在实施方案中，核酸长度超过24个核苷酸，如至少为50个核苷酸，至少为75个核苷酸，至少为100个核苷酸，至少为200个核苷酸，至少为500个核苷酸，至少为1000个核苷酸或更长。核酸长度在18-100个核苷酸之间时比较适宜，在24-100个核苷酸之间时最适宜。
所述第二个家族中所有核酸至少包括四个CpG基序。根据实施方案的不同，这些核酸可能包括五个或更多CpG基序。CpG基序可以是互相连接，或者被一定或随意的距离分隔。
该家族的核酸还含有过量的胸腺嘧啶，这些核酸中胸腺嘧啶的含量可能超过60％，低于60％或低于55％。
另一方面，本发明提供了序列为TCG TCG TTT CGT CGTTTC GTC GTT(序列编号1)(ODN 10102)的核酸。正如在实例中详细描述的一样，该核酸是对大量核酸的检测结果，该核酸具有与以前描述的免疫调节核酸相似或更强的免疫调节作用。更加特殊之处是可以将该核酸比做具有TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT(序列编号2)序列的核酸，后者具有免疫调节功能。含有序列编号1的核酸是对大约165种核酸序列检测后得到的结果，该核酸比序列编号2的核酸具有更强的免疫调节作用。二者在活性方面的显著差别令人惊奇，因为序列编号1的核酸和序列编号2的核酸之间仅存在非常小的差异(如2个核苷酸的差别)。序列上如此小的差异导致产生统计学上有显著意义的增强免疫调节作用出乎人们预料。
本发明的另一方面，提供了具有下述序列的核酸5’TCGTCG TTT CGT CGT TTC GTC GT3’(序列编号7)；5’TCG TCGTTT CGT CGT TTC GTC G3’(序列编号8)；5’TCG TCG TTTCGT CGT TTC GTC3’(序列编号9)；5’TCG TCG TTT CGTCGT TTC GT3’(序列编号10)；5’TCG TCG TTT CGT CGT TTCG3’(序列编号11)；5’CG TCG TTT CGT CGT TTC GTCGTT3’(序列编号12)；5’G TCG TTT CGT CGT TTC GTCGTT3’(序列编号13)；5’TCG TTT CGT CGT TTC GTCGTT3’(序列编号14)；5’CG TTT CGT CGT TTC GTC GTT3’(序列编号15)；5’G TTT CGT CGT TTC GTC GTT3’(序列编号16)；5’TTT CGT CGT TTC GTC GTT3’(序列编号17)；5’TT CGTCGT TTC GTC GTT3’(序列编号18)。
本发明的核酸还包括其它免疫调节基序如poly T基序，poly G基序，poly TG基序，poly A基序，poly C基序及类似结构，如存在于序列编号4和序列编号6核酸的核心序列中。
这些具有免疫调节作用的基序在下面或美国非临时专利申请系列号09/669,187，2000年9月25日提交，出版PCT专利申请PCT/US00/26383，公开号为WO01/22972有详细描述。
ODN10103家族该核酸家族包括具有以下组成方式的核酸序列5’X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12GGT CGT TTT3’(序列编号20)，其中X1，X2，X3，X4，X5，X6、X7、X8、X9、X10、X11和X12各自代表残基，可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶。在一些实施方案中，可能没有两侧的残基。如核酸序列为5’GGTCGT TTT 3’(序列编号21)。
在其它实施方案中，核酸序列可能缺少X1；X1和X2；X1，X2和X3；X1，X2，X3和X4；X3和X4；或X1，X2，X3，X4和X5，X1到X6，X1到X7，X1到X8，X1到X9，X1到X10，X1到X11和X1到X12。
在多个实施方案中X1是胸腺嘧啶，X2是胞嘧啶，X3是鸟嘌呤，X4是胸腺嘧啶，X5是胞嘧啶，X6是鸟嘌呤，X7胸腺嘧啶，X8是胸腺嘧啶，X9是胸腺嘧啶，X10是胸腺嘧啶，X11是胸腺嘧啶，X12是胞嘧啶。本领域的专业人员能够确定属于该家族的核酸序列。
该家族的核酸长度至少为9个核苷酸。在一些实施方案中，核酸长度至少为10个核苷酸，12个核苷酸，15个核苷酸，18个核苷酸，20个核苷酸和21个核苷酸。在优选实施方案中的核酸长度为21个核苷酸。仍然是在实施方案中，核酸长度超过21个核苷酸，如至少为50个核苷酸，至少为75个核苷酸，至少为100个核苷酸，至少为200个核苷酸，至少为500个核苷酸，至少为1000个核苷酸或更长。核酸长度在9-100个核苷酸之间时比较适宜，在21-100个核苷酸之间时最适宜。
该家族中所有核酸至少包括一个CpG基序。这些核酸可能包括两个，三个，四个或更多CpG基序。CpG基序可以是互相连接，或者被一定或随意的距离分隔。
该家族的核酸还含有过量的胸腺嘧啶，这些核酸中胸腺嘧啶的含量至少为60％，至少为55％或至少为50％。
本发明的部分依据是对另外一个核酸家族的发现，该核酸家族与以前报导的CpG核酸具有同样的免疫调节作用。该核酸家族包括具有以下组成方式的核酸序列5’TCG TCG TT T TTCX1X2X3X4X5X6X7X8X93’(序列编号22)，其中X1到X9各自代表残基，可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶。在一些实施方案中，可能没有两侧的残基。如核酸序列为5’TCGTCG TT T TTC 3’(序列编号23)。
在其它实施方案中，核酸序列可能缺少X9；X9和X8；X9，X8和X7；X9到X6；X9到X5；X9到X4；X9到X3；X9到X2和X9到X1。
在多个实施方案中X1是鸟嘌呤，X2是鸟嘌呤，X3是胸腺嘧啶，X4是胞嘧啶，X5是鸟嘌呤，X6是胸腺嘧啶，X7胸腺嘧啶，X8是胸腺嘧啶，X9是胸腺嘧啶。本领域的专业人员能够确定属于该家族的核酸序列。
该家族的核酸长度至少为12个核苷酸。在一些实施方案中，核酸长度至少为15个核苷酸，18个核苷酸，21个核苷酸。在优选实施方案中的核酸长度为21个核苷酸。仍然是在实施方案中，核酸长度超过21个核苷酸，如至少为50个核苷酸，至少为75个核苷酸，至少为100个核苷酸，至少为200个核苷酸，至少为500个核苷酸，至少为1000个核苷酸或更长。核酸长度在12-100个核苷酸之间时比较适宜，在21-100个核苷酸之间时最适宜。
第二个核酸家族中所有核酸至少包括两个CpG基序。这些核酸可能包括三个，四个或更多CpG基序。CpG基序可以是互相连接，或者被一定或随意的距离分隔。
该家族的核酸还含有过量的胸腺嘧啶，这些核酸中胸腺嘧啶的含量至少为60％，至少为55％或至少为50％。
另一方面，本发明提供了序列为TCG TCG TTT TTC GGTGGT TTT(序列编号19)(ODN 10103)的核酸。正如在实例中详细描述的一样，该核酸是对大量核酸的检测结果，该核酸具有与以前描述的免疫调节核酸相似或更强的免疫调节作用。更加特殊之处是可以将该核酸看做具有TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT(序列编号2)序列的核酸，后者具有免疫调节功能。含有序列编号19的核酸是对大约165种核酸序列检测后得到的结果，该核酸比序列编号2的核酸具有相似或更强的免疫调节作用。二者在活性方面的显著差别令人惊奇，因为序列编号19的核酸和序列编号2的核酸之间仅存在非常小的差异(如序列编号19的核酸序列内含有三个额外的核苷酸(如TCG)，与序列编号为2的核酸相比3’端缺少六个核苷酸)。序列上如此小的差异增强免疫调节的作用出乎人们预料。
本发明的另一方面，提供了具有下述序列的核酸5’TCGTCG TTT TTC GGT CGT TT3’(序列编号24)；5’TCG TCG TTTTTC GGT CGT T3’(序列编号25)；5’TCG TCG TTT TTC GGTCGT 3’(序列编号26)；5’TCG TCG TTT TTC GGT CG3’(序列编号27)；5’TCG TCG TTT TTC GGT C3’(序列编号28)；5’TCGTCG TTT TTC GGT3’(序列编号29)；5’TCG TCG TTT TTC GC3’(序列编号30)；5’TCG TCG TTT TTC G3’(序列编号44)；5’TCG TCG TTT TTC3’(序列编号31)；5’TCG TCG TTT TTCGGT GGT TTT3’(序列编号32)；5’CG TCG TTT TTC GGT GGTTTT 3’(序列编号33)；5’G TCG TTT TTC GGT CGT TTT3’(序列编号34)；5’TCG TTT TTC GGT CGT TTT3’(序列编号35)；5’CG TTT TTC GGT CGT TTT3’(序列编号36)；5’G TTT TTCGGT CGT TTT 3’(序列编号37)；5’TTT TTC GGT CGTTTT3’(序列编号38)；5’TT TTC GGT CGT TTT3’(序列编号39)；5’T TTC GGT CGT TTT3’(序列编号40)；5’TTC GGT CGTTTT3’(序列编号41)；5’TC GGT CGT TTT 3’(序列编号42)；5’C GGT CGT TTT3’(序列编号43)；5’GGT CGT TTT3’(序列编号21)。
这些免疫调节核酸能激发固有免疫反应，与抗原如乙肝病毒表面抗原共同免疫时促进抗原特异性的体液和细胞免疫反应。这里的实例显示这些核酸在体外试验中能调节人免疫细胞，在小鼠的体内和体外试验中调节小鼠细胞的能力。将这些序列与已知为有效佐剂的核酸序列相比，序列编号为19的核酸至少具有疫苗佐剂10-15％的序列。
本发明的核酸还包括其它免疫调节基序如poly T基序，poly G基序，poly TG基序，poly A基序，poly C基序及类似结构，如存在于序列编号21和序列编号23核酸的核心序列中。这些具有免疫调节作用的基序在下面或美国非临时专利申请系列号09/669,187，2000年9月25日提交，出版PCT专利申请PCT/US00/26383，公开号为WO01/22972中有非常详细的描述。
ODN10104家族该核酸家族包括具有以下组成方式的核酸序列5’X1X2X3X4X5X6TTT CGT CGT TTT GTC GTT3’(序列编号46)，其中X1，X2，X3，X4，X5G和X6各自代表残基，可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶。在一些实施方案中，可能没有两侧的残基。如核酸序列为5’TTT CGT CGT TTT GTC GTT3’(序列编号47)。
在其它实施方案中，核酸序列可能缺少X1；X1和X2；X1，X2和X3；X1，X2，X3和X4或X1，X2，X3，X4和X5。相应地，本发明利用下列核酸序列5’X1X2X3X4X5X6TTT CGT CGTTTT GTC GTT3’(序列编号48)，5’X3X4X5X6TTT CGT CGTTTT GTC GTT3’(序列编号49)，5’X4X5X6TTT CGT CGTTTT GTC GTT3’(序列编号50)，5’X5X6TTT CGT CGT TTTGTC GTT3’(序列编号51)；5’X6TTT CGT CGT TTT GTCGTT3’(序列编号52)。
在一个实施方案中X1是胸腺嘧啶。在另一个实施方案中X2是胞嘧啶。在另一个实施方案中X3是鸟嘌呤。在另一个实施方案中X4是胸腺嘧啶。而在另一个实施方案中X5是鸟胞嘧啶。仍然是在另一个实施方案中X6是鸟嘌呤。本发明进一步利用两侧残基可以有不同的组合(空格为N残基，可以是任意的天然或非天然核苷酸，如这里所引用的或专业人士已知的)表1
表1列出的仅仅是该部分描述的第一个核酸家族中可能出现的核苷酸，本领域的专业人员能够确定属于该家族的核酸序列。
该家族的核酸长度至少为18个核苷酸。在一些实施方案中，核酸长度至少为19个核苷酸，20个核苷酸，21个核苷酸，22个核苷酸，23个核苷酸和24个核苷酸。在优选实施方案中的核酸长度为24个核苷酸。仍然是在实施方案中，核酸长度超过24个核苷酸。实例中的核酸长度至少为50个核苷酸，至少为75个核苷酸，至少为100个核苷酸，至少为200个核苷酸，至少为500个核苷酸，至少为1000个核苷酸或更长。核酸长度在18-100个核苷酸之间时比较适宜，在24-100个核苷酸之间时最适宜。
该家族中所有核酸至少包括三个CpG基序。这些核酸可能包括四个，五个或更多CpG基序。CpG基序可以是互相连接，或者被一定或随意的距离分隔。
该家族的核酸还含有过量的胸腺嘧啶，这些核酸中胸腺嘧啶的含量可能高于60％，低于60％或低于55％。
本发明的部分依据是对另外一个核酸家族的发现，该核酸家族比以前报导的CpG核酸具有更强的免疫调节作用。该核酸家族包括具有以下组成方式的核酸序列5’TCG TCG TTT CGTCGT TTT GT X1X2X3X43’(序列编号95)，其中X1X2X3X4各自代表残基，可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶。在一些实施方案中，可能没有两侧的残基。如核酸序列为5’TCGTCG TT T CGT CGT TTT GT 3’(序列编号96)。
在其它实施方案中，核酸序列可能缺少X4；X4和X3；X4和X3；或X4，X3和X2。相应地，本发明利用具有下面核苷酸序列的核酸5’TCG TCG TTT CGT CGT TTT GT X1X2X33’(序列编号97)；5’TCG TCG TTT CGT CGT TTT GT X1X23’(序列编号98)；和5’TCG TCG TTT CGT CGT TTT GT X13’(序列编号99)。
在一个实施方案中X1是胞嘧啶。在另一个实施方案中，X2是鸟嘌呤。在另一个实施方案中，X3是胸腺嘧啶。在另一个实施方案中，X4是胸腺嘧啶。本发明进一步利用两侧残基可以有不同的组合(空格为N残基，可以是任意的天然或非天然核苷酸，如这里所引用的或专业人士已知的)表2
表2列出的仅仅是该部分描述的第二个核酸家族中可能出现的核苷酸，本领域的专业人员能够确定属于该家族的核酸序列。
该家族的核酸长度至少为20个核苷酸。在一些实施方案中，核酸长度至少为21个核苷酸，22个核苷酸，23个核苷酸和24个核苷酸。在优选实施方案中的核酸长度为24个核苷酸。仍然是在实施方案中，核酸长度超过24个核苷酸。实例中的核酸长度至少为50个核苷酸，至少为75个核苷酸，至少为100个核苷酸，至少为200个核苷酸，至少为500个核苷酸，至少为1000个核苷酸或更长。核酸长度在20-100个核苷酸之间时比较适宜，在24-100个核苷酸之间时最适宜。
该家族中所有核酸至少包括四个CpG基序。根据实施方案不同，这些核酸可能包括五个或更多CpG基序。CpG基序可以是互相连接，或者被一定或随意的距离分隔。
该家族的核酸还含有过量的胸腺嘧啶，这些核酸中胸腺嘧啶的含量可能高于60％，低于60％或低于55％。
另一方面，本发明提供了序列为TCG TCG TTT CGT CGTTTT GTC GTT(序列编号45)(ODN 10104)的核酸。正如在实例中详细描述的一样，该核酸是对大量核酸的检测结果，该核酸具有与以前描述的免疫调节核酸相似或更强的免疫调节作用。更加特殊之处是可以将该核酸看做具有TCG TCG TTT TGTCGT TTT GTC GTT(序列编号2)序列的核酸，后者具有免疫调节功能。含有序列编号45的核酸是对大约165种核酸序列检测后得到的结果，该核酸比序列编号2的核酸具有更强的免疫调节作用。二者在活性方面的显著差别令人惊奇，因为序列编号45的核酸和序列编号2的核酸之间仅存在非常小的差异(如胸腺嘧啶(序列编号2)被胞嘧啶(序列编号45)替代)。序列上如此小的差异产生在统计学上有显著意义的增强免疫调节作用出乎人们预料。
本发明的另一方面，提供了具有下述序列的核酸5’CGTCG TTT CGT CGT TTT GTC GTT3’(序列编号110)；5’G TCGTTT CGT CGT TTT GTC GTT3’(序列编号111)；5’TCG TTTCGT CGT TTT GTC GTT 3’(序列编号112)；5’CG TTT CGTCGT TTT GTC GTT3’(序列编号113)；5’G TTT CGT TTT GTCGTT3’(序列编号114)；5’TTT CGT CGT TTT GTC GTT3’(序列编号47)；5’TCG TCG TTT CGT CGT TTT GTC GT3’(序列编号115)；5’TCG TCG TTT CGT CGT TTT GTC G3’(序列编号116)；5’TCG TCG TTT CGT CGT TTT GTC3’(序列编号117)；5’TCG TCG TTT CGT CGT TTT GT3’(序列编号96)。
本发明的核酸还包括其它免疫调节基序如poly T基序，poly G基序，poly TG基序，poly A基序，poly C基序及类似结构，如存在于序列编号47和序列编号96核酸的核心序列中。这些具有免疫调节作用的基序在下面或美国非临时专利申请系列号09/669,187，2000年9月25日提交，出版PCT专利申请PCT/US00/26383，出版号为WO01/22972中有非常详细的描述。
ODN10105家族该核酸家族包括具有以下组成方式的核酸序列5’X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15TTT TTT CGA3’(序列编号119)，其中X1，X2，X3，X4，X5，X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14和X15各自代表残基，可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶。在一些实施方案中，可能没有两侧的残基。如核酸序列为5’TTT TTT CGA 3’(序列编号120)。
在其它实施方案中，核酸序列可能缺少X1；X1和X2；X1，X2和X3；X1，X2，X3和X4；X3和X4；或X1，X2，X3，X4和X5，X1到X6，X1到X7，X1到X8，X1到X9，X1到X10，X1到X11，X1到X12，X1到X13，X1到X14和X1到X15。
在多个实施方案中X1是胸腺嘧啶，X2是胞嘧啶，X3是鸟嘌呤，X4是胸腺嘧啶，X5是胞嘧啶，X6是鸟嘌呤，X7胸腺嘧啶，X8是胸腺嘧啶，X9是胸腺嘧啶，X10是胸腺嘧啶，X11是胸腺嘧啶，X12是胞嘧啶，X13是胞嘧啶，X14鸟嘌呤，X15是胸腺嘧啶。本领域的专业人员能够确定属于该家族的核酸序列。
该家族的核酸长度至少为9个核苷酸。在一些实施方案中，核酸长度至少为10个核苷酸，12个核苷酸，15个核苷酸，18个核苷酸，20个核苷酸22个核苷酸和24个核苷酸。在优选实施方案中的核酸长度为24个核苷酸。仍然是在实施方案中，核酸长度超过24个核苷酸。实例中核酸长度至少为50个核苷酸，至少为75个核苷酸，至少为100个核苷酸，至少为200个核苷酸，至少为500个核苷酸，至少为1000个核苷酸或更长。核酸长度在9-100个核苷酸之间时比较适宜，在24-100个核苷酸之间时最适宜。
该家族中所有核酸至少包括一个CpG基序。这些核酸可能包括两个，三个，四个或更多CpG基序。CpG基序可以是互相连接，或者被一定或随意的距离分隔。
该家族的核酸还含有过量的胸腺嘧啶，这些核酸中胸腺嘧啶的含量至少为60％，至少为55％或至少为50％。
本发明的部分依据是对另外一个核酸家族的发现，该核酸家族与以前报导的CpG核酸一样具有免疫调节作用。该核酸家族包括具有以下组成方式的核酸序列5’TCG TCG TTT TGTCGT TTT TX1X2X3X4X53’(序列编号121)，其中X1到X9各自代表残基，可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶。在一些实施方案中，可能没有两侧的残基。如核酸序列为5’TCGTCG TT T TGT CGT TTT T3’(序列编号122)。
在其它实施方案中，核酸序列可能缺少X5；X5和X4；X5，X4和X3；X5到X2和X5到X1。
在多个实施方案中X1是胸腺嘧啶，X2是胸腺嘧啶，X3是胞嘧啶，X4是鸟嘌呤，X5是腺嘌呤。本领域的专业人员能够确定属于该家族的核酸序列。
该家族的核酸长度至少为19个核苷酸。在一些实施方案中，核酸长度至少为20个核苷酸，22个核苷酸，24个核苷酸。在优选实施方案中的核酸长度为24个核苷酸。仍然是在实施方案中，核酸长度超过24个核苷酸。实例中核酸长度至少为50个核苷酸，至少为75个核苷酸，至少为100个核苷酸，至少为200个核苷酸，至少为500个核苷酸，至少为1000个核苷酸或更长。核酸长度在19-100个核苷酸之间时比较适宜，在24-100个核苷酸之间时最适宜。
该家族中所有核酸至少包括三个CpG基序。在不同实施方案中这些核酸可能包括四个或更多CpG基序。CpG基序可以是互相连接，或者被一定或随意的距离分隔。
该家族的核酸还含有过量的胸腺嘧啶，这些核酸中胸腺嘧啶的含量至少为60％，至少为55％或至少为50％。
另一方面，本发明提供了序列为TCG TCG TTT TGT CGTTTT TTT CGA(序列编号118)(ODN 10105)的核酸。正如在实例中详细描述的一样，该核酸是对大量核酸的检测结果，该核酸具有与以前描述的免疫调节核酸相似或更强的免疫调节作用。更加特殊之处是可以将该核酸看做具有TCG TCG TTTTGT CGT TTT GTC GTT(序列编号2)序列的核酸，后者具有免疫调节功能。含有序列编号118的核酸是对大约165种核酸序列检测后得到的结果，该核酸与序列编号2的核酸具有相似或更强的免疫调节作用。二者在活性方面的显著差别令人惊奇，因为序列编号118的核酸和序列编号2的核酸之间有79％完全相同(如序列编号118和序列编号2在3’端有5个核苷酸差异)。序列改变导致免疫调节作用增强出乎人们预料。
本发明的另一方面，提供了具有下述序列的核酸5’TCGTCG TTT TGT CGT TTT TTT CG3’(序列编号123)；5’TCGTCG TTT TGT CGT TTT TTT C3’(序列编号124)；5’TCG TCGTTT TGT CGT TTT TTT3’(序列编号125)；5’TCG TCG TTTTGT CGT TTT TT3’(序列编号126)；5’CG TCG TTT TGT CGTTTT TTT CGA3’(序列编号127)；5’G TCG TTT TGT CGT TTTTTT CGA3’(序列编号128)；5’TCG TTT TGT CGT TTT TTTCGA3’(序列编号129)；5’CG TTT TGT CGT TTT TTTCGA3’(序列编号130)；5’G TTT TGT CGT TTT TTT CGA3’(序列编号131)；5’TTT TGT CGT TTT TTT CGA3’(序列编号132)；5’TT TGT CGT TTT TTT CGA3’(序列编号133)；5’T TGTCGT TTT TTT CGA3’(序列编号134)；5’TGT CGT TTT TTTCGA3’(序列编号135)；5’GT CGT TTT TTT CGA3’(序列编号136)；5’T CGT TTT TTT CGA3’(序列编号137)；5’CGT TTTTTT CGA3’(序列编号138)；5’GT TTT TTT CGA3’(序列编号139)和5’T TTT TTT CGA3’(序列编号140)。
这些免疫调节核酸能激发固有免疫反应，与抗原如乙肝病毒表面抗原共同免疫时促进抗原特异性的体液和细胞免疫反应。这里的实例显示这些核酸在体外试验中能调节人免疫细胞，在小鼠的体内和体外试验中调节小鼠细胞的能力。序列编号为118的核酸与已知为有效佐剂的核酸序列相比，作用相同或更为有效。
本发明的核酸还包括其它免疫调节基序如poly T基序，poly G基序，poly TG基序，poly A基序，poly C基序及类似结构，如存在于序列编号120和序列编号122核酸的核心序列中。这些具有免疫调节作用的基序在下面或美国非临时专利申请系列号09/669,187，2000年9月25日提交，出版PCT专利申请PCT/US00/26383，出版号为WO01/22972有非常详细的描述。
ODN10106家族该核酸家族包括具有以下组成方式的核酸序列5’TCGTCG TTT TTC GTG CGT TTT T3’(序列编号141)(ODN10106)。该序列两侧可能包含残基，可以是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶。
该家族的核酸长度至少为22个核苷酸。在优选实施方案中的核酸长度为22个核苷酸。仍然是在实施方案中，核酸长度超过22个核苷酸。实例中核酸长度至少为50个核苷酸，至少为75个核苷酸，至少为100个核苷酸，至少为200个核苷酸，至少为500个核苷酸，至少为1000个核苷酸或更长。核酸长度在12-100个核苷酸之间时比较适宜。
该家族中所有核酸至少包括四个CpG基序。这些核酸可能包括五个或更多CpG基序。CpG基序可以是互相连接，或者被一定或随意的距离分隔。
该家族的核酸还含有过量的胸腺嘧啶，这些核酸中胸腺嘧啶的含量可能超过60％，低于60％或低于55％。
另一方面，本发明提供了序列为TCG TCG TTT TTC GTGCGT TTT T(序列编号141)的核酸。正如在实例中详细描述的一样，该核酸是对大量核酸的检测结果，该核酸具有与以前描述的免疫调节核酸相似或更强的免疫调节作用。更加特殊之处是可以将该核酸看做具有TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTCGTT(序列编号2)序列的核酸，后者具有免疫调节功能。含有序列编号141的核酸是对大约165种核酸序列检测后得到的结果，该核酸与序列编号2的核酸具有相似或更强的免疫调节作用。二者在活性方面的显著差别令人惊奇，因为序列编号141的核酸和序列编号2的核酸之间仅存在微小差异。序列上如此小的差异产生在统计学上有显著意义的增强免疫调节作用出乎人们预料。
本发明的核酸还包括其它免疫调节基序如poly T基序，poly G基序，poly TG基序，poly A基序，poly C基序及类似结构，如存在于序列编号141核酸的核心序列中。这些具有免疫调节作用的基序在下面或美国非临时专利申请系列号09/669,187，2000年9月25日提交，公开的PCT专利申请PCT/US00/26383，公开号为WO01/22972中有描述。
应当理解的是这里提及的任何实施方案同样适用于这里所述的核酸。因此如果一个实施方案提到，比如序列编号1，应当理解为它同样适用于序列编号19，序列编号45，序列编号118和序列编号141。
这里所述核酸的CpG基序首选是未甲基化的。未甲基化CpG基序是指胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列未被甲基化(如5’端未甲基化的胞嘧啶后为3’端鸟嘌呤，由磷酸键连接)。这里所述的所有核酸都具有免疫调节作用。甲基化CpG基序是指胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列被甲基化(如5’端甲基化的胞嘧啶后为3’端鸟嘌呤，由磷酸键连接)。
CpG核酸是指具有下列组成方式的核酸5’X1X2CGX3X43’其中C未甲基化，X1X2和X3X4为核酸。在相关实施方案中，5’X1X2CGX3X43’序列是非回文序列。在某些实施方案中，X1X2的核酸序列可以是GpT，GpG，GpA，ApA，ApT，ApG，CpT，CpA，CpG，TpA，TpT和TpG；X3X4的核酸序列可以是TpT，CpT，ApT，TpG，ApG，CpG，TpC，ApC，CpC，TpA，ApA和CpA。的核酸序列可以是GpT，GpG，GpA，ApA，ApT，ApG，CpT，CpA，CpG，TpA，TpT和TpG；X3X4的核酸序列可以是TpT，CpT，ApT，TpG，ApG，CpG，TpC，ApC，CpC，TpA，ApA和CpA。在更加特殊的实施方案中，X1X2的核酸序列是GpA或GpT；X3X4的核酸序列是TpT。仍然是在其它实施方案中，X1X2同为嘌呤，X3X4同为嘧啶。在其它实施方案中，X2是T，X3是嘧啶。CpG核酸实例在下面或美国非临时专利申请系列号09/669,187，2000年9月25日提交，公开PCT专利申请PCT/US00/26383，公开号为WO01/22972中有详细描述。
富含T的核酸至少包括一个多聚T序列，且/或T核苷酸残基含量超过核苷酸组成的25％。具有多聚T序列的核酸至少包括四个连续排列的T，如5’TTTT3’。包含超过一个多聚T序列的富含T核酸比较适宜。在优选实施方案中，富含T的核酸包含二，三，四个等多聚T序列。根据本发明其它富含T核酸的核苷酸组成中T核苷酸残基含量超过25％，但不一定包括多聚T序列。在这里富含T的核酸中，T核苷酸残基可能被其它核苷酸残基分隔，如G，C和A。在一些实施方案中，富含T的核酸组成中T核苷酸残基超过35％，40％，50％，60％，70％，80％，90％和99％，T核苷酸残基和每个整数百分比之间。至少包含一个多聚T序列的富含T核酸比较适宜，T核苷酸残基含量超过核酸组成的25％。
多聚G核酸具有组成方式5’X1X2GGX3X43’其中X1，X2，X3和X4为核苷酸。在优选实施方案中，X3和X4中至少有一个为G。在其它实施方案中，X3和X4都为G。仍然是在其它实施方案中，组成方式为5’GGGNGGG3’，或5’GGGNGGGNGGG3’比较适宜，其中N代表0-20个核苷酸。
富含C核酸指至少含有一个或至少含有两个多聚C区域或C核苷酸残基含量超过50％的核酸分子，其中含两个多聚C区域的核酸比较适宜。多聚C区域至少包括4个连续的C。因此多聚C区域构成方式为5’CCCC3’。根据本发明其它富含C核酸的核苷酸组成中C含量超过50％，但不一定包括多聚C序列。在这些多聚C核酸中，C核苷酸残基可能被其它核苷酸残基分隔，如G，T和A。在一些实施方案中，富含C的核酸组成中C核苷酸残基超过35％，40％，50％，60％，70％，80％，90％和99％，T核苷酸残基和每个整数百分比之间。至少包含一个多聚C序列的富含C核酸或C核苷酸残基含量超过核酸组成的50％比较适宜，在一些实施方案中同时还富含T。
免疫调节核酸可以是双链也可以是单链。一般而言，在体内双链分子更加稳定，而单链分子能增强免疫活性。因此在本发明的一些方面，最佳选择为单链核酸分子，而在另一方面，最佳选择为双链分子。
这里交替使用术语“核酸”和“寡聚核苷酸酸”指代多个核苷酸(如由糖分子(如核糖或脱氧核糖)、磷酸基团和可调换的碱基(碱基可以是嘧啶(如胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶或是嘌呤(如腺嘌呤或鸟嘌呤))连接构成的分子。这里使用的术语指寡聚核糖核酸及寡聚脱氧核糖核酸。使用的术语还应当包括多聚核苷酸(不含磷酸的多聚核苷酸)和其它任何碱基聚合体。可以通过已经存在的核酸来源获得核酸分子(如基因组或cDNA)，但较好的选择是人工合成(如核酸合成获得)。
本发明中具有免疫调节作用的寡聚核苷酸酸与天然RNA和DNA相比，包含多种化学修饰和替代，包括核苷酸之间的磷酸二酯键桥，β-D核糖基团和/或天然核苷碱基(腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶)。本专业技术人员都了解化学修饰方面的实例，见Uhlmann E等人1990年在《Chem Rev》90卷第543页所描述的；由S.Agrawal编辑，美国Totowa Humana出版社1993年出版的《Protocols for Oligomucleotides andAnalogs》中“Synthesis and Properties&Synthesis and AnalyticalTechniques”，Crooke ST等人1996年在《Annu Rev PharmacolToxicol》36卷第107-129页描述的；由Hunziker J等人1995年在《Mod Synth Method》7卷第331-417页所描述的。根据本发明，与天然DNA或RNA构成的相同序列的寡聚核苷酸酸相比，这类寡聚核苷酸酸可以有一种或多种修饰，其中修饰位于特定核苷酸间的磷酸二酯键桥，位于β-D核糖基团和/或天然核苷碱基。
比如，寡聚核苷酸酸包括一个或多个修饰，其中每种修饰为下列中选取a)用修饰过的核苷酸间的桥替代位于3’端和/或5’端的核苷酸间的磷酸二酯键桥，
b)用去磷酸化的桥替代位于3’端和/或5’端的核苷酸间的磷酸二酯键桥，c)用其它基团替代糖-磷酸骨架上的糖-磷酸基团，d)用修饰过的糖基替代β-D核糖单位，和e)用修饰过的核苷碱基替代天然核苷碱基。
对寡聚核苷酸酸化学修饰更详细的实例如下所述。
核苷酸还包括替代嘌呤和替代嘧啶，如C-5丙炔嘧啶和7-deaza-7替代嘌呤碱基。Wagner RW等人1996年在《NatBiotechnol》14卷第840-844页所述。嘌呤和嘧啶包括但不局限于以下所述腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，5甲基胞嘧啶，2氨基嘌呤，2氨基-6氯嘧啶，2，6双氨基嘌呤，次黄嘌呤及其它天然或非天然存在的核苷碱基，含有或不含有芳香族替代基团。其它修饰方法为本领域专业认识所熟悉。前述所有的实施方案中，X残基可以是非天然的核苷，或核苷类似物，如这里所描述的一样。
修饰过的碱基可以是化学结构与通常存在于DNA和RNA中的天然碱基不同的任何碱基，天然碱基一般有T，C，G，A和U，但二者之间具有同样的基本结构。比如修饰过的核苷碱基可以是次黄嘌呤，尿嘧啶，脱氢尿嘧啶，假尿嘧啶，2-硫脲嘧啶，4-硫脲嘧啶，5-(C1-C6)烷基尿嘧啶，5-(C2-C6)烯烃尿嘧啶，5-(C2-C6)烷基尿嘧啶，5-(羟甲基)尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟乙酰尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羟基胞嘧啶，5-(C1-C6)烷基胞嘧啶，5-(C2-C6)烯烃胞嘧啶，5-(C2-C6)烷基胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟乙酰胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，N2-二甲基鸟嘌呤，2，4-二氨基嘌呤，8-氮杂嘌呤，替代碱基7-deazapurine，7-deaza-7-替代碱基和/或7-deaza-8-替代嘌呤，5-羟甲基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶，如5-羟基脱氧胞嘧啶，5-羟甲基脱氧胞嘧啶，N4-烷基脱氧胞嘧啶，如N4-乙基脱氧胞嘧啶，6-硫代脱氧鸟嘌呤和脱氧核糖核苷，nitropyrrole脱氧核糖核苷酸，C5-propynyl嘧啶，双氨基嘌呤如2，6-双氨基嘌呤，次黄嘌呤核苷，5-甲基胞嘧啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，次黄嘌呤或其它修饰过的天然核酸碱基。该列表为代表性的，不应认为具有局限性。
这里还描述了修饰碱基的特殊构成方式。如字母Y用来指代包括胞嘧啶或修饰过的胞嘧啶的核苷。这里所述修饰过的胞嘧啶是指天然或非天然存在的与胞嘧啶类似的嘧啶碱基，它可以替代寡聚核苷酸中的胞嘧啶但不影响其免疫调节活性。修饰过的胞嘧啶包括但不局限于5-替代胞嘧啶(如5-甲基胞嘧啶，5-氟乙酰胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，5-碘胞嘧啶，5-羟基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，5-二氯胞嘧啶和未替代或替代的5-炔基胞嘧啶)，6-替代胞嘧啶，N4替代胞嘧啶(如N4-乙基-胞嘧啶)，5-aza胞嘧啶，2-巯基胞嘧啶，异胞嘧啶(isocytosine)，假-isocytosine，包含闭环系统的胞嘧啶类似物(N，N’-丙烯胞嘧啶或吩嗪)，以及尿嘧啶和其衍生物(如5-氟乙酰尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-溴代乙烯基尿嘧啶，5-硫代尿嘧啶，5-羟基尿嘧啶，5-丙炔尿嘧啶)。优先选择的胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶，5-氟乙酰胞嘧啶，5-羟基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶和N4-乙基胞嘧啶。本发明的另一个实施方案中，胞嘧啶可以被通用碱基替代(3-硝基吡咯，P-碱基)，芳香环系统(如氟代苯或二氟代苯)或氢原子(dSpacer)。字母Z用来指代鸟嘌呤或修饰过的鸟嘌呤碱基。这里所述修饰过的鸟嘌呤是指天然或非天然存在的与鸟嘌呤类似的嘌呤碱基，它可以替代寡聚核苷酸中的鸟嘌呤但不影响其免疫调节活性。修饰过的鸟嘌呤包括但不局限于7-deaza鸟嘌呤，7-deaza-7替代鸟嘌呤(7-deaza-7(C2-C6)烷基鸟嘌呤)，7-deaza-8替代鸟嘌呤，次黄嘌呤，N2-替代鸟嘌呤(N2-甲基鸟嘌呤)，5-氨基-3甲基-3H，6H-噻唑基〔4，5-d〕嘧啶-2，7-二酮，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，吲哚，腺嘌呤，替代腺嘌呤，(如N6-甲基-腺嘌呤，8-氧腺嘌呤)8-替代鸟嘌呤(8-羟基鸟嘌呤和8-溴鸟嘌呤)和6-硫代鸟嘌呤。在本发明的另一个实施方案中，鸟嘌呤碱基被通用碱基取代(如4-甲基-吲哚，5-硝基-吲哚和K-碱基)，芳香环系统(如氟代苯或二氟代苯，1-甲基-1H-〔1，2，4〕三唑-3-氨基羧酸)或氢原子(dSpacer)。
寡聚核苷酸还包括对核苷酸之间的连接桥进行修饰，如在a或b中所描述。这些经过修饰的连接桥可能有部分抵抗降解的作用(如稳定性)。“稳定的核酸分子”指能抵抗体内降解作用(如内切酶或外切酶)的核酸。稳定性是长度或二级结构的功能体现。长度为数十到数百成千的核酸对体内的降解作用有相当的抵抗。对于较短核酸，二级结构能稳定和增强其作用。如，如果核酸3’端与上游区域具有互补结构，就可以折叠形成茎环结构起稳定核酸的作用，并表现出更高的活性。
还可以通过对磷酸骨架进行修饰增加核酸稳定性。在一些实施方案中具有硫代磷酸连接桥的寡聚核苷酸有最高的活性，使寡聚核苷酸免受胞内内切和外切酶的降解。
体内试验显示核酸骨架修饰后可以增强核酸活性。具有硫代磷酸连接桥的寡聚核苷酸有最高的活性，使寡聚核苷酸免受胞内内切和外切酶的降解。其它修饰过的核酸包括磷酸二酯修饰核酸，磷酸二酯和硫代磷酸同时修饰的核酸，甲基磷酸酯，甲基硫代磷酸，二硫代磷酸，p-乙氧基和以上修饰方式联合使用。这些修饰方式和它们对免疫细胞的特殊作用在PCT公开专利申请PCT/US95/01570(WO 96/02555)和PCT/US97/19791(WO 98/18810)中有详细描述。2001年2月27日批准的美国专利6,194,388 B1和2001年5月29日批准的美国专利6,239,116 B1，其全部内容在此通过引证并入本文。由于核酸修饰后增强了抵抗性，细胞摄取能力，蛋白结合和/或改变细胞内定位，修饰后的核酸表现出更强的调节活性。
其它稳定的核酸包括非离子DNA类似物，如烷基和芳基磷酸(其中带电荷的磷酸基团中的氧被芳基取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧分子被烷基化。含有吲哚的核酸如四乙基吲剁或六乙基吲剁，其中之一或两者末端都显示出抵抗核酸酶降解的作用。
寡聚核苷酸还含有一个或两个易接近的5’端。构建具有两个5’端的修饰寡聚核苷酸是可行的，如将两个寡聚核苷酸通过3’-3’端连接产生具有一个或两个易接近5’端的寡聚核苷酸。可以通过磷酸二酯键，硫代磷酸或任何其它经修饰的连接桥进行3’-3’端连接。本领域人员都了解连接方法。如Seliger，H.等人1991年发表在《核苷和核苷酸》10(1-3)第469-477页“具有3’-3’端和5’-5’端核酸连接的核酸类似物作为病毒基因表达的反义抑制子”；Jiang，等人1999年发表在《Bioorganic& MedicinalChemistry》7(12)第2727-2735页的“假环状寡聚核苷酸体内和体外的特性”。
此外，不是经磷酸二酯键，硫代磷酸或其它经修饰的连接桥进行连接的3’-3’端连接ODNs还可以通过其它空间结构如三个或四个乙烯基磷酸(Durand，M等人1992年发表在《Biochemistry》31(38)“通过两个六乙烯基乙二醇链连接的包括一个(dA)12和两个(dT)12序列的寡聚核苷酸形成三个螺旋构象”，美国专利号5658738，美国专利号56682650)。此外，非核苷酸连接子可以派生于使用标准氨基磷酸酯化学方法制备的乙二酰，丙二醇或来自无碱基的脱氧核糖基团(见Fontanel，Marie Laurence等人1994年发表在《核酸研究》22(11)第2022-2027页“5’端与寡聚核苷酸连接的非核苷酸组成T4多聚核苷激酶的空间识别”)。可以使用一个或多个非核苷酸连接子，或以希望的距离分割后在需要连接的ODNs的3’端联合使用。
位于核酸3’和5’端的磷酸二酯桥可以被修饰过的连接桥替代，其中修饰的连接桥包括硫代磷酸，二硫代磷酸，NR1R2-氨基磷酸酯，溴代磷酸，α-羟基苯甲基磷酸酯，磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯，磷酸-〔(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基〕酯，(C1-C8)磷酸烷基酯和/或(C6-C12)芳基磷酸酯连接子，(C7-C12)-α-羟甲基芳基(如WO95/01363中解密的)，其中(C6-C12)芳基，(C6-C20)芳基和(C6-C14)芳基可以有选择性的被下列基团替代卤素，烷基，烷氧基，硝基，氰基，R1和R2各自代表氢，(C1-C18)-烷基，(C6-C20)-芳基，(C6-C14)-芳基-(C1-C8)烷基，优先选择为氢，(C1-C8)烷基，(C1-C4)烷基和/或甲氧基，或R1和R2与构成它们的氮原子，形成5-6个杂环结构，能够包含更多来自O，S和N组的杂环原子。
由去磷连接桥(关于去磷连接桥的描述，见Uhlmann E和Peyman A在《分子生物学中的方法》第20卷；S.Agrawal编辑，Totowa Humana出版社1993年出版的《核酸及其类似物操作指南》第16章355页，)替代位于3’端和/或5’端的磷酸二酯连接桥，其中去磷连接桥可以是去磷连接桥formacetal，3’-硫代formacetal，甲基羟胺，肟，甲基亚乙基-次联氨基，二甲基亚砜和/或甲硅烷基基团。
本发明的组成方式还可以选择嵌合骨架。如这里所使用的，嵌合骨架指包括多于一种连接类型的骨架，嵌合骨架的组成方式可以表示如下5’Y1N1ZN2Y23’。Y1和Y2指含有1-10个核苷的核酸分子。Y1、Y2至少有一个是修饰过的连接桥。由于嵌合寡聚核苷酸中至少包括2个经骨架修饰的核苷，这些核酸是“稳定的免疫调节核酸”类型的实例说明。
在嵌合寡聚核苷酸中，Y1和Y2互相独立。即Y1和Y2可以具有不同或具有相同的序列和在同一分子中具有不同的连接骨架。在一些实施方案中，Y1和/或Y2含3-8个核苷。N1和N2为含有0-5个核苷的核酸分子，而N1Z N2的总长至少为6个核苷。N1Z N2核苷具有磷酸二酯骨架，不包括含有修饰骨架的核酸。Z为免疫调节核酸基序，优先从这里引用的基序中选择。
组成形式为Y1N1ZN2Y2的中心核苷(N1ZN2)具有磷酸二酯连接桥，Y1和Y2至少含1个，但也可以含多个或全部为修饰连接桥的核苷。在优选实施方案中，Y1和/或Y2至少含2个或2-5个修饰连接桥，或Y1含2个修饰连接桥，Y2含5个修饰连接桥，或Y1含5个修饰连接桥，Y2含2个修饰连接桥。在一些实施方案中，修饰的连接桥为磷酸三酯连接桥，磷酸二酯连接桥或p-乙氧基修饰连接桥。
核酸还包括除了在2’位置的羟基和5’位置的磷酸基团外，与低分子量有机基团共价连接的骨架糖基。因此修饰核酸包括2’-O-烷基核糖基团。此外修饰核酸中的糖除了核糖还包括阿拉伯糖，2’-氟代阿拉伯糖。因此核酸骨架可能由不同成份组成，包含与所有可能的聚合体单位进行连接如多肽-核酸(具有氨基酸骨架和核酸碱基)。在一些实施方案中，这些核酸骨架由相同成份组成。以下对其它实例进行了更加详细的描述。
可以用其它基团代替来自磷酸核糖骨架(如由磷酸糖基单位组成磷酸核糖骨架)中的一个磷酸糖基单位(如形成磷酸糖单位的β-D-核糖和核苷间的磷酸二酯连接桥)，其它基团应适合构建“吗啉代衍生”寡聚体(见Stirchak EP等人1989年发表于《核酸研究》17卷6129-6141页的文章)，即被吗啉代衍生基团取代；或构建聚酰胺核酸(“PNA“，见Nielsen PE等人1994年发表在《生物连接化学》5卷3-7页的文章)，即被PNA基团如2氨乙基甘氨酸取代。寡聚核苷酸还可以有其它碳水化合物骨架修饰和取代，如具有磷酸基团的多肽核酸(PHONA)，封闭的核酸(LNA)，骨架部分含有烷基连接子或氨基连接子的寡聚核酸。烷基连接子可以分枝或不分枝，取代或未取代，手性单一或外消旋混合物。
可以使用修饰过的糖基取代β-核糖基团或β-D-2’-脱氧核糖基团，其中修饰过的糖基可以为β-D-核糖，α-D-2’-脱氧核糖，L-2’-脱氧核糖，2’-F-2’-脱氧核糖，2’-F’-阿拉伯糖，2’-O-(C1-C6)烷基核糖，优先选择的2’-O-(C1-C6)烷基核糖是2’-O-(C1-C6)甲基核糖，2’-O-(C1-C6)烯基核糖，2’-〔O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基〕核糖，2’-NH2-2’-脱氧核糖，β-D-硫双二氯酚-呋喃糖，α-阿拉伯呋喃糖，2，4-双脱氧-β-D-赤-环吡喃糖和碳环形(见Froehler J1992年发表于《Am Chem Soc》114卷8320页的文章)和/或开链糖类似物(见Vandendriessche等人1993年发表于《四面体》49卷7223页的文章)和/或双环糖类似物(见Tarkov M等人1993年发表于《Helv Chim Acta》76卷481页的文章)。
在一些实施方案中，特别是一个或两个核苷酸通过磷酸二酯键或类似磷酸二酯键连接桥连接时，糖基为2’-O-甲基核糖。
在本发明的应用中，可以使用本论域的多种方法重新合成本发明的寡聚核苷酸。如b-.氰乙基，氨基磷酸酯方法(见Beaucage，S.L.和Caruthers，M.H.1981年发表于《Tet.Let》22卷1859页的文章)；核苷H-膦酸盐方法(见Garegg等人1986年发表于《Tet.Let》27卷4051-4054页的文章；Frothler等人1986年发表于《核酸研究》14页5399-5407页的文章；Garegg等人1986年发表于《Tet.Let》27卷4055-4058页的文章；Gaffney等人1988年发表于《Tet.Let》29卷2619-2622页的文章)。这些化学方法可以通过市场上多种自动核酸合成仪进行操作。这些寡聚核苷酸指人工合成的寡聚核苷酸。此外，还可以利用质粒大量制备富含T和/或TG二核苷的核酸(见Sambrook，T.等人编辑由纽约冷泉港出版社1989年出版的《分子克隆实验室手册》)和分散成小片断或以完整形式接种。可以使用已知的技术从已经存在的核酸序列(如基因组或cDNA)制备核酸，如使用限制性酶，内切酶或外切酶。
可以使用自动技术利用氨基磷酸酯或H-磷酸盐等化学物质合成经修饰的骨架如硫代磷酸。芳基和烷基磷酸盐可以通过下列方法制备见美国专利号4,469,863中的描述；使用自动固相合成仪利用商业上可购买的试剂制备烷基三磷酸盐(其中带电荷的氧分子被烷基化，如美国专利号5,023,243和欧洲专利号092,243中所描述)。其它获得DNA骨架修饰和替代的方法见相关描述(如Uhlmann，E.和Peyman A.1990年发表在《Chem.Rev》90卷第544页的文章；Goodchild J.1990年发表于《Bioconjugate Chem》1卷第165页的文章)。
使用这种方法制备的核酸是指分离的核酸。“分离的核酸”通常指核酸与其在天然状态下连接的成分分离。如与细胞分离，与细胞核分离，与线粒体或染色质分离。
在核酸与抗原(抗原由核酸载体编码，如这里所描述的一样)共同接种的应用实例中，优先选择核酸骨架为磷酸二酯和硫代磷酸(或其它磷酸修饰物)联合使用的嵌合骨架。存在硫代磷酸核酸时，细胞可能在摄取质粒载体方面产生问题。因此接种质粒和核酸时应该优先选择具有嵌合骨架或硫酸磷酸骨架的核酸，而质粒应当与接种媒介物一起直接进入细胞，避免细胞摄取。接种媒介物是本领域人员所熟悉的，如脂质体和基因枪。
本发明进一步体现了这里所引用方法中描述的核酸以及以前所描述的具有免疫调节核酸的用途。
根据本发明已经发现免疫调节核酸具有令人惊奇的增强免疫调节的作用。如这里所描述的核酸可能是通过全面调节免疫系统从而提供抗感染保护。具有上述作用的核酸序列编号为核酸序列编号1，核酸序列编号19；核酸序列编号45；核酸序列编号118或核酸序列编号141均能保护小鼠免受单纯疱疹病毒(HSV-2)的攻击。该类核酸可以提前接种或与病毒攻击同时进行。
这些核酸诱导产生免疫调节作用的能力显而易见，在人类或其它对象中作为有效的治疗剂可作为疫苗，免疫治疗癌症，免疫治疗哮喘，增强免疫功能，放疗或化疗后增强血细胞的恢复及其它免疫调节应用本发明中的核酸还可以单独作为治疗剂使用。单独治疗剂是指单独接种试剂或化合物后产生有益的预防或治疗作用的治疗剂。因此这里所述的核酸可以单独使用预防或治疗感染性疾病，癌症和哮喘和过敏，因为核酸能诱导产生有利于治疗该类疾病的免疫反应。这里所描述的方法是指核酸作为单独治疗剂，而其它方法指核酸与其它治疗剂联合使用。
作为疫苗使用时，核酸与抗原共同接种。应当优先选择特异预防或治疗疾病的抗原。如如果是感染性疾病，抗原应该来自感染性微生物(如细菌，病毒，寄生虫，真菌，等)。如果是癌症，抗原应该为癌抗原。
免疫调节核酸在本发明的一些方面如作为预防感染(如感染性疾病)，癌症，过敏或哮喘的疫苗，是有用的。预防性疫苗的接种对象应当没有诊断出以上疾病，或在这些疾病的高危人群中使用。如接种对象可能是感染某种微生物的高危人群，或已经检出特定癌抗原、患癌症的高危人群，或具有已知过敏史的易过敏的高危人群，或已知患哮喘的高危人群。
这里所述的高危人群指暴露于引起感染的病原、致癌物或过敏原的人群。高危人群还包括容易患病的体质较弱人群。这些人部分是由于遗传因素(可以通过基因分析或家族史进行鉴定)，部分是由于环境因素(如曾暴露于致癌物等)。容易感染的高危人群的一个实例生活或曾到存在或发现有特殊感染原的地区旅行的人，或在生活或治疗过程中直接或间接接触含有感染性微生物的液体。易发感染的高危人群还包括医疗机构推荐对特定感染性微生物进行预防的普通人群。
如果抗原为过敏原，接种对象对特定抗原产生过敏反应，且接种对象可能暴露于该抗原，如在花粉季节，那么接种对象就处于暴露于该抗原的危险中。易发过敏、哮喘的高危人群包括那些已经证实具有过敏史或哮喘史但使用免疫调节核酸的治疗后未发病，还包括那些由于遗传或环境因素易发这些疾病的人群。
用来进行短期预防感染、过敏或癌症时，免疫调节核酸可以不与抗原或过敏原同时接种，这种情况下重复接种可以提供长期保护。
易发癌症的高危人群是指具有高度发病可能的人群(如患癌症的可能性高于普通人群的可能性)。这些人群包括具有异常遗传的人，已经显示患癌症的相关性高于普通人群相关性的人群，暴露于引起癌症的物质如烟草，石棉或其它化学毒素的人群(如致癌物)，或以前治疗过癌症，肿瘤明显缩小的人群。使用特异性癌抗原对易发癌症的高危人群进行治疗时，接种免疫调节核酸可能将癌细胞杀死。如果已经开始形成肿瘤，接种对象将产生针对肿瘤抗原的特异免疫反应。
免疫调节核酸除了可以进行预防外，本发明还体现了免疫调节核酸用来治疗感染，过敏，哮喘或癌症的用途。
患有感染的接种对象指曾暴露于病原，急性或慢性感染，体内或排除体外的废液中有可检出的病原。免疫调节核酸用于治疗时，可以单独使用或与其它治疗剂联合使用。如免疫调节核酸可以与抗原同时使用诱导产生能够降低或消除感染性病原的抗原特异的体液或粘膜免疫反应。
这里所述的感染性疾病是指体内存在外来微生物时产生的疾病。研发保护机体粘膜的有效疫苗和治疗方法非常重要，粘膜是病原微生物入侵的第一道屏障。
正如这里所用的，术语治疗，已经治疗或正在治疗是指预防性治疗，即增强接种对象(易发生感染的高危人群)抵抗感染性病原或降低其感染疾病及感染后(接种对象已经感染)抵抗感染的能力，如减弱或消除感染或防止疾病恶化。
患有过敏症的接种对象指对过敏原具有或易发过敏反应。过敏反应指对某种物质(过敏原)有超敏感性。过敏状态包括但不局限于湿疹，过敏性鼻炎，花粉热，结膜炎，支气管哮喘，荨麻疹和食物过敏及其它遗传性过敏症。
目前，对过敏性疾病的治疗通常采用小剂量注射抗原后增加抗原剂量的方法。普遍认为这一方法可以诱导对过敏原的耐受从而预防进一步发生过敏反应。但是这些方法需要进行数年才能有效，并具有一定的副作用如过敏性休克。本发明的方法避免了这些问题。
过敏反应通常是产生了针对无害过敏原的IgE抗体而诱发。接种免疫调节核酸后产生的细胞因子主要是Th1类(如IL-12和IFN-r)，诱导产生体液免疫和细胞免疫。与Th1型反应相关的抗体类型通常具有更好的保护作用，因为它们具有更高的中和作用和调理能力。其它主要的免疫反应类型是与IL-4，IL-5和IL-10细胞因子相关的Th2型免疫反应。Th2反应包括优势抗体，但它们抗感染的保护作用较弱，一些Th2亚型(如IgE)与过敏反应相关。总之，过敏性疾病由Th2型免疫反应介导，而Th1型反应能提供抗感染的最佳保护，尽管过量的Th1型反应与自身免疫性疾病相关。根据免疫调节核酸具有将接种对象Th2型(与产生IgE抗体和过敏反应相关)反应转变为Th1型(能避免发生过敏反应)反应的能力，可以向接种对象接种有效剂量的免疫调节核酸，以诱导产生免疫反应用来治疗或预防过敏反应。
因此，免疫调节核酸在治疗过敏反应和非过敏反应如哮喘中具有显著的治疗作用。在哮喘患者的气管中Th2细胞因子，特别是IL-4和IL-5升高。这些细胞因子能加重哮喘炎症反应，包括IgE亚型转换，嗜曙红细胞趋化和激活及肥大细胞的生长。Th1细胞因子，特别是IFN-r和IL-12，能抑制形成Th2克隆和产生Th2细胞因子。哮喘是指呼吸系统出现紊乱，表现为炎症，气管狭窄和对吸入物反应增强的特征。尽管哮喘不总是与遗传性过敏或过敏症状相关，但其经常发生。
患有癌症的接种对象指在接种对象体内检查出癌细胞。癌症可以是恶性或良性。癌症或肿瘤包括但不局限于以下类型胆管癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；内皮细胞瘤；淋巴癌；肝癌；肺癌(如小细胞和非小细胞)；黑色素瘤；神经细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；恶性毒瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；肾癌及其它癌症和肉瘤。在一个癌症方面的实施方案中，癌症为毛细胞白血病，慢性骨髓性白血病，皮肤T细胞白血病，多发性骨髓瘤，滤泡淋巴瘤，恶性淋巴瘤，鳞状细胞癌，肾细胞癌，前列腺癌，膀胱细胞癌或结肠癌。
一些癌细胞具有抗原性，可以作为免疫系统作用的对象。一方面，联合应用免疫调节核酸和治疗癌症的药物，特别是那些用于免疫治疗的药物，能有效刺激针对癌抗原的特异免疫反应。
免疫监视作用指免疫系统的主要作用是在肿瘤形成前检出并消除肿瘤细胞。该作用的主要原理是癌细胞的抗原性与正常细胞不同，因而可以诱发免疫反应，与引起同种异体移植不相容反应相似。研究证实肿瘤细胞表达的抗原在量和质方面都有所不同。这类抗原指可交替作为肿瘤抗原或癌抗原。这些抗原中的一些还可以为肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原。“肿瘤特异抗原”指特异表达在肿瘤细胞表面但不存在于正常细胞表面的抗原。如由DNA或RNA病毒引起肿瘤中的病毒抗原。“肿瘤相关抗原”指既存在于肿瘤细胞也存在于正常细胞中的抗原，但其在肿瘤细胞中表达的量或表达形式与正常细胞不同。如癌胚抗原(如T和Tn抗原)，癌抗原产物(如HER/neu)。
已经证实体内或体外能杀死肿瘤靶细胞的不同类型细胞有自然杀伤细胞(NK-细胞)，细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，淋巴因子激活的杀伤细胞(LAKs)和活化的巨噬细胞。NK细胞不需要预先对特异抗原激活就可以杀伤肿瘤细胞，激活不需要靶细胞上存在主要组织相容性复合体(MHC)I类分子。认为NK细胞参与控制肿瘤的形成和恶性生长。与NK细胞相比，CTLs只有在受到肿瘤抗原激活且表达靶抗原的肿瘤细胞同时表达MHC I类分子时才能杀死肿瘤细胞。认为CTLs是抑制肿瘤迁移和由DNA病毒引起肿瘤的效应细胞。LAK细胞是与NK和CTL细胞群不同的原始淋巴细胞的一个子集。活化的巨噬细胞以既不是抗原依赖性也不是MHC限制性的方式杀伤肿瘤细胞。体外试验还证实存在其它免疫机制如抗体依赖，细胞介导的细胞毒反应和抗体、补体产生的溶解反应。但是普遍认为在体内这些免疫效应机制不如NK，CTLs，LAK和巨噬细胞重要(见Piessens，W.F.和David，J.1996年在Scientific AmericanMedicine，第2卷第1-13页发表的综述“肿瘤免疫学”)。
免疫治疗的目的是增强病人对已经存在肿瘤的免疫反应。免疫治疗的方法之一包括使用佐剂。佐剂来源于微生物，如结核分枝杆菌，在动物中提高免疫反应，增强对肿瘤的抗性。
这里所说的“抗原”是指能激发免疫反应的分子。抗原包括但不局限于细胞，细胞提取物，蛋白，聚合肽，多肽，多聚糖和其它分子，小分子，脂类，糖脂类，碳水化合物，病毒和病毒提取物及多细胞生物如寄生虫和过敏原。抗原的范围包括被宿主免疫系统视为异源的任何分子。抗原包括但不局限于癌抗原，微生物抗原和过敏原。
“微生物抗原”是指来自微生物的抗原，包括但不局限于病毒，细菌，寄生虫和真菌。这类抗原包括天然分离的完整微生物和片断或衍生物，还包括与天然微生物抗原等同或类似的化合物，能诱导产生针对某种微生物的特异免疫反应。如果某种化合物能诱导产生针对天然微生物抗原的免疫反应(体液和/或细胞免疫)那么这种化合物与与天然微生物抗原类似。该领域常规使用这类抗原，为普通专业人员所熟悉。
“癌抗原”是指一类化合物，如存在于肿瘤或癌细胞中的多肽或蛋白，当其与MHC分子表达于抗原呈递细胞表面时诱导产生免疫反应。可以对癌细胞粗提制备抗原，参见Cohen等人1994年发表在《癌症研究》54卷1055页的文章，或对抗原进行部分纯化，或使用重组技术或新合成一个已知的抗原。癌抗原包括但不局限于重组表达抗原，具有免疫原性的部分，或全部肿瘤或癌。这类抗原可以通过重组方法分离或制备，或使用本领域已知的其它方法制备。
癌症或肿瘤抗原由癌细胞进行差异表达，因此可以利用该特点攻击癌细胞。正常细胞也编码一部分癌抗原，尽管并不一定表达。这些抗原的特征各不相同，有的在正常细胞中保持沉默(如不表达)，有的只有在分化的特定阶段表达，有的暂时表达如胚胎和胎儿抗原。其它的癌抗原由突变的细胞基因编码，如癌基因(如活化的ras癌基因)，抑癌基因(如突变的p53)，染色体置换或内部删除导致产生的融合蛋白。其它的癌抗原还可以由病毒基因编码如RNA和DNA肿瘤病毒的基因。
在本发明的一些方面，接种对象“暴露”于抗原。如这里所使用的，术语“暴露”是指抗原与接种对象接触的主动步骤，或接种对象与抗原体内的被动暴露。主动暴露给抗原的方法为本论域熟知。通常抗原经静脉，肌肉，口服，皮肤，粘膜，鼻腔，气管或皮下途径直接进行接种。抗原可以全身或局部接种。接种抗原和免疫调节核酸的方法下面有更详细的描述。当抗原在体内暴露给免疫系统时，接种对象就被动暴露于抗原，如外来病原体进入人体，或肿瘤细胞在其表面表达外源性抗原。
接种对象被动暴露于抗原的方法特别依赖免疫调节核酸的接种时间。如在易患癌症或感染性疾病或过敏反应或哮喘反应的高危人群中，当危险增高如在过敏季节或暴露于致癌物后可以根据常规接种免疫调节核酸。此外在旅行者到具有高度危险的感染性地区旅行前还可以对其接种免疫调节核酸。同样当士兵或公务员有暴露于生物武器的危险时，还可以对他们接种免疫调节核酸以诱导全身或粘膜免疫反应。
尽管在一些优选实施方案中采用局部接种的方式，核酸和其它治疗剂还可以进行全身接种。局部接种包括粘膜表面的局部应用如口腔，阴道，肛门和阴茎。在一些采用局部接种特别是阴道，肛门和口腔粘膜表面的实施方案中，优先选择除CpG核酸之外的核酸。
在特殊的实施方案中，本方面还用于预防或治疗由HIV-1，HIV-2，HIV-3，HTLV-I，-II，-III，甲肝病毒，乙肝病毒，单纯疱疹病毒1和2型，乳头瘤病毒，淋球菌，螺旋体，Campylobactersp.，巨细胞病毒，沙眼衣原体和白色假丝酵母引起的人性传播疾病(STD)，采用局部粘膜接种未甲基化的CpG核酸。
如这里所使用的，STD指主要但不是必须通过性接触传播的疾病。除了与感染对象通过性接触传染外，一些STD还可以通过与感染对象的体液接触而感染。这里所述的“体液”包括血液，唾液，精液，阴道粘液，尿液，屎和泪液。STDs常见的传播方式包括血液，唾液，精液和阴道粘液。如输血和血液制品是多种性传播病原包括HIV和肝炎病毒最常见的传播途径。
性传播病原通常是自然界存在的细菌，病毒，寄生虫或真菌。引起STD的微生物包括细菌如淋球菌，沙眼衣原体，螺旋体，ducreyi嗜血杆菌，尖锐湿疣，Calymmatobacteriumgranulomatis和Ureaplasma urealyticum，病毒如人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)，人T淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)，单纯疱疹病毒2型(HSV-2)，人乳头瘤病毒(多型)，乙肝病毒，巨细胞病毒和传染性软疣病毒，寄生虫如阴道滴虫和Phthirus pubis，真菌如白色假丝酵母。
还要其它一些疾病为性传播疾病，虽然性传播不是它们的主要传播方式。后者包括由细菌如homimis支原体，阴道gardnerella，和B群链球菌，病毒如人人T淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)，丙肝和丁肝病毒，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和EB病毒，寄生虫如疥疮螨。
本发明中的STDs还包括粪-口暴露的性接触途径传播的疾病。这些STDs的病原为细菌如志贺氏菌属和Campylobacter，病毒包括甲肝病毒，寄生虫包括兰氏鞭毛虫和溶组织性内阿米巴。
“需要接种的对象”指STD高危人群或患有STD的人。
核酸在预防高危人群发生STD方面是有用的。“发生STD的高危人群”是指与感染对象或其体液接触，增大患STD危险的人。如与感染STD病原的人有或将要有性接触的人。高危人群还包括那些不考虑自己或伴侣是否存在感染而进行的未进行保护性行为，如口交，肛交或未使用避孕套(男用或女用)经阴道性交。高危人群还包括有多个性伙伴的人(如妓女或经常嫖娼的人)或有一名性伙伴但该人有多个性伙伴的人。其它发生STD的高危人群还包括其它高危传播行为如共用皮下注射器。接受输血的人也可以看作高危人群，特别是对血液供应的监察松懈时。如非洲亚撒哈拉国家的血液供应系统中，部分或全部含有STD病原(如HIV)。高危人群还可能包括计划到流行一种或多种STD病原的地区旅行的人，特别是当这类病原存在于当地血液供应系统时。其它的高危人群与为与感染者的体液有潜在接触的工作人员。包括但不局限于护士，医生，牙医和救护人员如救护车工作人员，护理人员，消防员和警察。高危人群还包括母亲为感染STD疾病的胎儿和新生儿。
以上描述的所有与传播STD疾病的相关的行为在这里称作“高危行为”。核酸和其它可以联合使用的预防和治疗性制剂可以在接种对象进行高危行为前，中，或后进行接种。如在进行性行为前如至少一个月，至少一周，至少48小时，至少24小时，至少12小时，至少6小时，至少4小时，至少2小时(或在这里所说时间段内的任何时间)接种核酸。适宜的接种时间在进行高危活动前，最好有足够时间激活免疫系统存在于身体中的感染性病原产生反应。高危活动后接种核酸的时间可以在2小时内，或在3，4，5，6，7，14，28天或更长(或在这里所说时间段内的任何时间)。
接种对象最好是非啮齿类动物。非啮齿类动物指人或脊椎动物，包括但不局限于狗，猫，马，牛，猪，绵羊，山羊，鸡，灵长类如猴，鱼(水产养殖品种)如鲑鱼，但不包括啮齿类如大鼠和小鼠。
抗原可以有多种来源，包括肿瘤，非肿瘤癌症，过敏原和感染性病原。这里所述的每一种列表都不限定范围。
在人类发现的病毒包括但不局限于逆转录病毒科(如人免疫缺陷病毒，HIV-1(也指HTLV-III，LAV，或HTLV-III/LAV，或HIV-III；及其它分离株，如HIV-LP))；小核糖核酸病毒科(如脊髓灰质炎病毒，甲肝病毒，肠道病毒，人柯萨奇病毒，鼻病毒，人肠道孤病毒)；Calciviriade(如引起肠胃炎的各分离株)；披膜病毒科(如马脑炎病毒，风疹病毒)；黄病毒科(如登革病毒，脑炎病毒，黄热病病毒)；冠状病毒科(如冠状病毒)；棒状病毒科(如水疱性口炎病毒，狂犬病毒)；(原文重复)filoviridae(如艾博拉病毒)；副粘病毒科(如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(流感病毒)；bungaviridae(如汉坦病毒，bunga病毒，phleboviruses和nairo病毒)；arena viridae(出血热病毒)；新病毒科(如新病毒，环状病毒和轮状病毒)；birnaviridae；肝炎病毒科(乙肝病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳头瘤病毒科(乳头瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2，带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)；Iridoviridae(如非洲猪热病毒)和未归类的病毒(如海绵状脑病的致病因子，δ肝炎的病原(认为是可检出的乙肝病毒随体)，非甲非乙肝炎病原(1类＝水平传播，2类＝母婴传播如丙肝)；诺沃克因子和相关病毒和astrovirus)。
尽管这里所述的许多微生物与人类疾病相关，本发明还可以用于治疗其它非人的脊椎动物。非人脊椎动物感染后可用这里所描述的免疫调节核酸进行治疗。如除了对人的感染性疾病进行治疗外，本发明的方法还可治疗动物的感染性疾病。
在脊椎动物中革兰氏阳性和阴性菌均可以作为抗原。革兰氏阳性菌包括但不局限于巴斯德菌属，葡萄球菌属，链球菌属。革兰氏阴性菌包括但不局限于大肠杆菌，假单胞菌属，沙门氏菌属。感染性细菌的特殊例子包括但不局限于幽门螺旋菌，borelia burgdorferi，肺炎军团菌，分枝杆菌sps(如结核分枝杆菌，avium分枝杆菌，胞内分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，gordonae分枝杆菌)，aureus葡萄球菌，奈瑟氏淋球菌，奈瑟氏脑膜炎球菌，李斯特monocytogenes，脓性链球菌(A组链球菌)，agalactiae链球菌(B组链球菌)，链球菌(viridans组)，faecalis链球菌，bovis链球菌，链球菌(非产气sps)，肺炎链球菌，致病性campylobacter sp.，肠道球菌sp.，流感嗜血杆菌，antracis杆菌，白喉棒状杆菌，棒状杆菌sp.，rhusiopathiae丹毒丝菌属，产气荚膜芽孢杆菌，产气肠杆菌，破伤风杆菌，肺炎杆菌，Pasturella multocida，类杆菌属，核粒梭菌，念珠状链杆菌，苍白密螺旋体，细弱密螺旋体，钩端螺旋体，立克次氏体和伊氏放线菌。
细菌病原的聚合多肽包括但不局限于铁离子调控的外膜蛋白(IROMP)，外膜蛋白(OMP)，引起疖病的气生沙门菌A蛋白，引起细菌性肾病(BKD)的Renibacterium salmoninarum，表面主要相关抗原(msa)，表达于表面的细胞毒素(mpr)，表达于表面的溶血素(ish)，耶尔森菌的鞭毛抗原；胞外蛋白(ECP)，铁离子调控的外膜蛋白(IROMP)，巴斯德菌的结构蛋白；OMP和vibrosis anguillarum和V.ordalii的鞭毛蛋白；鞭毛蛋白，OMP蛋白，aroA，purA Edwardsiellosis ictaluri和E.tarda；Ichthyophthirius的表面抗原；Cytophaga columnari的结构蛋白和调节蛋白；立克次氏体的结构蛋白和调节蛋白。
寄生虫抗原的多聚肽包括不局限于Ichthyophthirius的结构蛋白。
真菌包括新型隐球菌，荚膜组织胞浆菌，粗球孢子菌，皮炎芽生菌，沙眼衣原体，白色念珠菌。其它传染性生物(如原生生物)包括疟原虫属，间日疟原虫，鼠弓形体。血液和/或组织寄生虫包括疟原虫属，小巴贝虫，divergens巴贝虫，热带利什曼虫，利什曼虫属，巴西利什曼虫，杜氏利什曼虫，冈比亚锥虫，罗德西亚锥虫(非洲昏睡病)，克氏锥虫，(Chagas′s病)和刚地弓形体。其它与医学有关德微生物在文献中有大量描述，如参见C.G.A Thomas的《Medical Microbiology》，BailliereTindall Great Britain 1983，其全部内容通过引证被并入本文。
用于治疗非人脊椎动物疾病的疫苗参见1995年Bennett，K.编著的《兽医产品概略》第三版，North AmericanCompendiums，Inc。如上讨论的，感染性微生物的抗原包括病毒，寄生虫，细菌和真菌及来自于自然或人工合成的片断。对人和非人脊椎动物致病的病毒包括逆转录病毒，RNA病毒和DNA病毒。逆转录病毒包括简单逆转录病毒和复杂逆转录病毒。简单逆转录病毒包括B型、C型、D型逆转录病毒各亚组。B型逆转录病毒如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)。C型逆转录病毒包括C型A组(包括鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)，禽白血病病毒(ALV)，禽骨髓瘤病毒(AMV))和C型逆转录病毒B组(包括猫白血病病毒(FeL V)，长臂猿白血病病毒(GALV)，肾坏疽病毒(SNV)，reticuloendotheliosis病毒(RV)和猿肉瘤病毒(SSV))。D型逆转录病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和猿逆转录病毒1型(SRV-1)。复杂逆转录病毒包括慢病毒，T细胞白血病病毒，和泡沫病毒。慢病毒包括HIV-1，但也包括HIV-2，SIV，绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒，猫免疫缺陷病毒(FIV)和马贫血症病毒(EIAV)。T细胞白血病病毒包括HTLV-I，HTLV-II，猿T细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)，猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
脊椎动物致病的其它RNA病毒包括但不局限于新病毒家族的成员，包括orthoreovirus属(哺乳动物和禽逆转录病毒具有多个血清型)，环状病毒属(蓝舌病病毒，eugenangee病毒，Kemerovo病毒，非洲马疫病毒和科罗拉多壁虱热病毒)，轮状病毒属(人轮状病毒，内布拉斯加牛腹泻病毒，猿轮状病毒，牛或绵羊轮状病毒，禽轮状病毒)；小核糖核酸病毒家族的成员，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，人呼肠孤病毒(ECHO)，甲肝病毒，猿肠道病毒，猪肠道病毒)，cardiovirus属(脑心肌炎病毒(EMC)，门戈病毒)，鼻病毒属(人鼻病毒至少包括113种亚型，其它鼻病毒)，Apthovirus属(足口病毒(FMDV))；calciviridae家族的成员，包括猪小水疱疹病毒，San Miguel海狮病毒，猫细小病毒和诺沃克因子病毒；披膜病毒家族，包括alphavirus属(东方马脑炎病毒，Semliki森林病毒，Sindbis病毒，Chikungunya病毒，O’Nyong-Nyong病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊子传播的黄热病病毒，登革病毒，日本脑炎病毒，圣路易斯脑炎病毒，Murray峡谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，Kunjin病毒，中欧壁虱病毒，Omsk出血热病毒)，Rubivirus属(风疹病毒)，鼠疫病毒属(鼠疫病毒，猪瘟病毒，Border disease病毒)；Bunyaviridae家族，包括Bunyvirus属(Bunyamwera和相关病毒，加利福尼亚脑炎组病毒)，Phlebovirus属(西西里岛白蛉热病毒，裂谷热病毒)，Nairovirus属(克里米亚-刚果出血热病毒，奈洛比绵羊疫病毒)，Uukuvirus属(Uukuniemi和相关病毒)；正粘病毒家族，包括流感病毒属(流感病毒A型，大部分人亚型)，猪流感病毒，禽和马流感病毒，流感病毒B型，(大部分人亚型)，流感病毒C型(可能有种属差别)；副粘病毒家族，包括副粘病毒属(副粘病毒1型，仙台病毒，血细胞吸附病毒，副流感病毒2-5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性脑炎病毒，犬温热病病毒，牛瘟病毒)，Pneumovirus属(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和肺炎病毒)；棒状病毒家族，包括vesiculovirus(VSV)，钱迪普拉病毒，Flanders-Hart公园病毒)，狂犬病属(狂犬病毒)，鱼棒状病毒，两个可能的棒状病毒(马尔堡病毒和艾博拉病毒)；沙粒病毒家族，包括淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，Tacaribe病毒复合体和拉沙热病毒；冠状病毒家族，包括感染性支气管炎病毒(IBV)，肝炎病毒，人肠道冠状病毒和猫感染性腹膜炎(猫冠状病毒)。在脊椎动物中致病的DNA病毒抗原包括但不局限于痘病毒家族，包括正痘病毒(重型天花，轻型天花，猴痘，牛痘，水牛痘，兔痘，先天性缺肢畸形)，兔痘病毒属(粘液瘤，纤维瘤)，鸟禽痘病毒属(鸟痘，其它鸟禽痘病毒)，羊痘病毒属(绵羊痘，山羊痘)，猪痘病毒属(猪痘)，副痘病毒属(传染性postular皮炎病毒，伪牛痘，牛丘疹性口炎病毒)；Iridoviridae家族(非洲猪热病毒，青蛙病毒2、3型，鱼淋巴细胞囊肿病毒)；疱疹病毒家族，包括α-疱疹病毒(单纯疱疹1、2型，水痘-带状疱疹病毒，马流产病毒，马疱疹病毒2、3型，伪狂犬病毒，感染性角膜结膜炎病毒，感染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，感染性喉气管炎病毒)，β-疱疹病毒(人巨细胞病毒，猪、猴巨细胞病毒)；r-疱疹病毒(EB病毒，Marek’s疫病毒，saimiri疱疹，ateles单疱病毒，sylvilagus单疱病毒，豚鼠单疱病毒，Lucke肿瘤病毒)；腺病毒家族，包括Mastadenovirus属(人A，B，C，D，E亚组和未分组的；猿腺病毒(至少23种血清型)，感染性犬肝炎，牛、猪、绵羊、青蛙及其它多种动物的腺病毒)，禽腺病毒属(禽腺病毒)；无法培养的腺病毒；乳多空病毒家族，包括乳头瘤病毒属(人乳头瘤病毒，牛乳头瘤病毒，Shope兔乳头瘤病毒和其它动物的多种致病性乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猴空泡病原(SV-40)，兔空泡病原(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒和其它灵长类的空泡病毒如lymphotrophic乳头瘤病毒)；细小病毒家族，包括腺相关病毒属，细小病毒属(猫肠炎病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，Aleutian水貂疫病毒等)。最后，DNA病毒还包括不适合以上分类的病毒如库鲁病毒和克雅氏综合症病毒及慢性传染性神经病原(CHINA病毒)。
免疫调节核酸还可用来诱导产生免疫反应，在鸟/禽如母鸡，小鸡，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑和野鸡中产生抗原特异性免疫反应。鸟/禽是多种病原的感染目标。
孵化的鸟/禽在出生猴短时间暴露于病原性微生物。尽管这些鸟/禽开始得到来自母体抗体的保护，该保护作用是暂时的，鸟/禽自身不成熟的免疫系统必须为它自己提供保护。人们经常希望在雏鸟/禽易受感染的阶段能有效预防感染，还希望年长鸟/禽提供抗感染保护，特别是鸟/禽在封闭状态下饲养时，容易造成疾病的迅速传播。因此向鸟/禽接种本发明的免疫调节核酸和非核酸佐剂，在抗原存在时能增强抗原特异性免疫反应。
在小鸡中经常出现的感染是小鸡传染性贫血症病毒(CIAV)。CIAV首先于1979年在日本暂停接种调查马立克氏病时分离成功(参见Yuasa等人1979年发表在《禽类疾病》23卷366-385页的文章)。从那时起，在所有主要的家禽生产国都可检出CIAV(见Van Bulow等人1999年Iowa州立大学出版社出版的《禽类疾病》，第9版，690-699页)。
CIVA感染在年幼易感染鸡中产生临床疾病，其特征为贫血，出血和免疫抑制。胸腺和骨髓萎缩和CIAV感染小鸡出现持续性损伤也是CIAV感染的特征。胸腺中淋巴细胞损耗，偶见于法布氏囊中的淋巴细胞，导致产生免疫抑制，增加对二级病毒，细菌或真菌感染的可能性，从而使疾病更加复杂。感染一种或多种马立克氏病毒(MDV)、感染性粘液囊病毒、网状内皮组织增殖病毒、腺病毒或呼吸道肠道病毒后，免疫抑制能严重增加疾病程度。据报道CIAV能增加MDV的病程(DeBoer等人，1989，第38届西部禽类疾病大会会议录，第28页，Tempe，Ariz)。而且还有报道CIAV能增加感染性粘液囊疾病的病征(见Rosenberger等人于1989年发表在《禽类疾病》33卷707-713页的文章)。小鸡随着年龄增长增加对病毒包括CAA的抵抗力。在2周龄前完成这一功能非常重要，但老的鸡仍易发感染(见Yuasa，N.等人1979年；Yuasa，N.等人1980年发表在《禽类疾病》24卷202-209页的文章)。但是如果小鸡同时感染CAA和免疫抑制病毒(IBDV，MDV等)，抵抗疾病的年龄作用会随之延迟(Yuasa，N.等人1979，1980年；Bulow von V.等人1986年发表在《兽医药物》33卷93-116页的文章)。能加强疾病传播的CIAV的特征包括对环境灭活因素和一些普通消毒剂具有高抗性。CIAV感染对家禽产业的经济影响很明显疾病爆发时10％到30％的感染动物死亡。
与其它脊椎动物一样，可以在任何年龄对鸟进行免疫。通常在不超过12周龄时使用活微生物进行免疫，在14-18周时使用灭活微生物活其它类型的疫苗进行免疫。进行卵免疫时，在胚胎形成的后四分之一时进行免疫。疫苗可以采用皮下，喷雾，口服，眼内，气管内，鼻内或这里所述的其它粘膜接种形式进行免疫。因此按照常规免疫方法使用本发明的免疫调节核酸对鸟和其它非人脊椎动物进行免疫，免疫适当时间后使用抗原进行免疫。
牛和家畜同样易发生感染。影响这些动物的疾病造成严重经济损失，特别是在牛中。可以使用本发明的方法保护家畜如牛，马，猪，绵羊和山羊免受感染。
牛科病毒可以感染牛。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是小包膜正链RNA病毒，与猪霍乱病毒(HOCV)，绵羊边缘疾病病毒(BDV)同属于pestivirus属。尽管以前将pestivirus归类于囊膜病毒家科，一些研究认为它们应与黄病毒、丙肝病毒(HCV)一起重新归于黄病毒科(Francki等人，1991)。
BVDV是牛中的一种重要病原，通过细胞培养分析加以区别，分为细胞病变(CP)和非细胞病变(NCP)两种生物类型。尽管在牛中可发现两种生物类型，但NCP生物类型比较常见。如果怀孕的牛感染NCP生物类型株，出生的小牛将在其一生持续感染，出现特异的免疫耐受。持续感染的牛出现粘膜疾病，此时可以从动物中分离得到两种生物类型的病毒。临床表现包括流产，畸形生长和呼吸道疾病，粘膜疾病及轻微腹泻。此外，还描述了导致动物死亡、与牧群流行相关的严重血小板症，与该病相关的病毒株好像具有比传统BVDVs更强的毒力。
马单纯疱疹病毒(EHV)包括一组抗原性迥异的病原，在马中引起多种类型的感染，从亚临床到致命的疾病，包括马单疱病毒-1(EHV-1)，在马中普遍存在的病原。EHV-1与下列流行病流产、呼吸道疾病、中枢神经系统紊乱相关。幼马上呼吸道感染能引发8-10天的发热。有免疫力的母马还可以经呼吸道再次感染，但疾病不明显，所以在没有征兆的情况下经常发生流产。神经症状与呼吸道疾病或流产相关，对不同性别不同年龄的马都有影响，导致缺少协调，虚弱和背瘫(参见Telford，E.A.R.等人1992年发表在《Virology》189卷304-316页的文章)。其它的EHV包括EHV-2或马巨细胞病毒，EHV-3，马性交疹病毒，EHV-4，以前将其归类为EHV-1的亚型2。
绵羊和山羊可以感染多种危险的微生物包括绵羊髓鞘脱落病毒。
灵长类动物如猴，猿和恒河猴可以感染猴免疫缺陷病毒。据报道灭活的细胞病毒和无细胞猴免疫缺陷全病毒疫苗可以保护恒河猴免受感染(见Stott等人1990年发表在《柳叶刀》36卷1538-1541页的文章；Desrosiers等1989年发表在《PNASUSA》86卷6353-6357页的文章；Murphey-Corb等人1989年发表在《科学》246卷1293-1297页的文章；Carlson等1990年发表在《AIDS Res.Human Retrovirus》6卷1239-1246页的文章)。据报道重组HIVgp120疫苗在黑猩猩中可以提供保护(见Berman等人1990年《自然》345卷622-625页发表的文章)。
家猫和野生猫科动物均易感染多种微生物。如猫科传染性腹膜炎在家猫和野生猫科动物中如狮子，豹，印度豹和美洲虎经常发生。可以利用本发明的方法免疫猫科动物预防发生上述传染性疾病的发生。
家养猫可以感染数种逆转录病毒，包括但不局限于猫科白血病病毒(FeLV)，猫科肉瘤病毒(FeSV)，内源性concornavirus(RD-114)，猫科合胞病毒(FeSFV)。在这些病原中，FeLV是最主要的病原，引起多种症状，包括网状淋巴细胞和骨髓瘤，贫血，免疫介导的紊乱和与人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)类似的免疫缺陷症状。最近，设计为FeLV-AIDS的复制缺陷型FeLV突变株与免疫抑制有很强的相关性。
1987年Pedersen等人首次在《Science》235卷790-793页的文章中报告发现猫科T淋巴细胞T-lymphotropic lentivirus(也可以参见猫科免疫缺陷病)。FIV的特征在Yamamoto等人1988年《白血病》，十二月增刊2卷204s-215s的文章有报道；Yamamoto等人1988年在《Am J Vet Res》49卷1246-1258页的文章；Ackley等人1990年在《J Virol》64卷5652-5655页的文章。对FIV克隆和序列分析见Olmsted等人1989年在《P rocNatl Acad Sci USA》86卷2448-2452页和4355-4360页的文章。
猫科传染性腹膜炎(FIP)是一种在家养和野生猫科动物中经常散发的一种疾病。尽管FIP主要发生与家养猫科动物中，在狮子，山狮，豹，印度豹和美洲虎中也有发生。感染FIV的小型野生猫科动物包括山猫，狞獾，沙猫和pallas猫。在家养猫科动物中，该病主要发生在年幼动物中，尽管所有年龄段的猫都是易感对象。6-12个月龄是该病的发生的高峰期。5-13岁时该病的发生率下降，14-15岁时发病率又开始上升。
有鳍鱼类、甲壳类动物或其它水产养殖生物的病毒性、细菌性和寄生虫疾病给水产养殖业带来严重威胁。由于孵化池或封闭的海产养殖场中动物密度高，传染性疾病可能给养殖数量如有鳍鱼类，甲壳类动物或其它水生生物带来极大损失。预防该类疾病胜于疾病发生后的治疗。对鱼进行免疫是唯一长期有效的预防方法。许可给Davis的专利号为5,780,448的美国专利对核酸为基础的疫苗进行描述。
鱼的免疫系统与哺乳动物免疫系统有许多相似之处，如存在B细胞，T细胞，淋巴细胞，补体和免疫球蛋白。鱼还有淋巴细胞亚类，其作用在许多方面与哺乳动物的T、B细胞相似。可以通过浸泡或口服进行免疫接种。
水产养殖生物包括但不局限于有鳍鱼、甲壳类动物或其它水产养殖生物。有鳍鱼包括所有有脊椎的鱼，可以是多骨或软骨鱼，如鲑鱼，鲤鱼，鲶鱼，鲱鱼，seabream，seabass。
鲑科鱼属于有鳍鱼科，包括鲑鱼(包括虹鳟鱼)，大麻哈鱼和Arctic char。甲壳类动物包括但不局限于蛤，龙虾，对虾，螃蟹和牡蛎。其它水产养殖动物为鳗，鱿鱼和章鱼。
水产动物的病毒多肽包括出血性败血症病毒(VHSV)的糖蛋白(G)或核蛋白(N)；传染性造血坏死病毒(IHNV)的G或N蛋白；传染性胰坏死病毒(IPNV)的VP1，VP2，VP3或N结构蛋白；鲤鱼败血症病毒(SVC)的G蛋白，膜相关蛋白，海峡鲶鱼病毒(CCV)的膜相关蛋白，衣壳蛋白或糖蛋白。
感染马的典型寄生虫有胃蝇属，艾美球虫，贾第虫属，三毛滴虫属，巴贝虫属，泰累尔氏梨浆虫，锥虫属，Klossiella equi，肉孢子虫属。
感染猪的典型寄生虫有bebliecki艾美球虫，scabra艾美球虫，等孢子球虫属，贾第虫属，balantidium大肠杆菌，溶组织性阿米巴，刚地弓形体，肉孢子虫属和旋毛虫。
感染奶牛和肉牛的寄生虫主要包括艾美球虫属，似隐孢球虫属，贾第鞭毛虫，刚地弓形体，bovis焦虫病(RBC)，bigmina焦虫病(RBC)，锥虫属(血浆)，泰累尔氏梨浆虫属(RBC)；parva泰累尔氏梨浆虫(淋巴细胞)；foetus滴虫属和肉孢子虫属。
感染肉食鸟的寄生虫主要有gallinae滴虫病，双孢子球虫(艾美球虫属)，relictum疟原虫，leucocytozoon danilewskyi(猫头鹰)，haemoproteus属，锥虫属，组织滴虫，meleagridis隐孢菌属，baileyi似隐孢球虫属，贾第鞭毛虫，艾美球虫，弓形体。
感染绵羊和山羊的典型寄生虫有艾美球虫属，似隐孢球虫属，贾第鞭毛虫，刚地弓形体，巴贝虫属(RBC)，锥虫属(血浆)，泰累尔氏梨浆虫属(RBC)和肉孢子虫属。
感染家禽的典型寄生虫有由acevulina艾美球虫，E.necatrix，E.tenella，等孢子球虫属和truncata艾美球虫引起的球虫病；由meleagridis组织滴虫和gallinarum组织滴虫引起的组织滴虫病；由gallinae滴虫引起的滴虫病；由六鞭虫属meleagridis引起的hexamitiasis。家禽还可以感染maxima艾美球虫，meleagridis艾美球虫，adenoeides艾美球虫，meleagrimitis艾美球虫，似隐孢菌，brunetti艾美球虫，leucocytozoon属，疟原虫属，meleagridishaemoproteus，刚地弓形体和肉孢子虫。
本方面的方法还可以用于治疗和/或预防狗、猫、鸟、鱼和雪貂中的寄生虫感染。感染鸟类的典型寄生虫包括gallinae滴虫病，艾美球虫属，等孢子球虫属和贾第鞭毛虫；肉孢子虫属，刚地弓形体，haemoproteus/parahaemoproteus，疟原虫属，leucocytozoon/Akiba，Atoxoplasma，锥虫属(血浆)。感染狗的典型寄生虫包括旋毛虫，等孢子球虫属，肉孢子虫属，似隐孢球虫属，Hammondia属，Giardia duodenalis(犬)；balantidium大肠杆菌，溶组织性阿米巴，犬Hepatozoon；刚地弓形体；cruzi锥虫；犬艾美球虫；amastigotes利什曼原虫，犬属neospora。
感染猫科动物的典型寄生虫包括等孢子球虫属，刚地弓形体，肉孢子虫属，hammondia hammondi，巴贝虫属，，贾第鞭毛虫，溶组织性阿米巴，犬Hepatozoon，cytauxzoon sp，cytauxzoon sp，cytauxzoon sp(红细胞，RE细胞)。
感染鱼的典型寄生虫包括六鞭虫属，艾美球虫属，cryptobia属，小孢子虫属，myxosoma属，chilodonella属，车轮虫属，plistophora属，myxosoma henneguya；costia属，Ichthyophithirius属，Oodinium属。
感染野生动物的典型寄生虫包括贾第鞭毛虫属(肉食动物和草食动物)，等孢子球虫属(肉食动物)，艾美球虫属(肉食动物和草食动物)，泰累尔氏梨浆虫属(草食动物)，巴贝虫属(肉食动物和草食动物)，锥虫属(肉食动物和草食动物)，血吸虫属(草食动物)，肝片吸虫(草食动物)，Fascioloides magna(草食动物)，巨大吸虫(草食动物)，旋毛虫(肉食动物和草食动物)。
动物园中如果发生寄生虫感染将带来严重后果。感染牛科动物(大羚羊，羚羊，白臀野牛，非洲大羚羊，白肢野牛，黑斑羚，山羚，捻，瞪羚)的主要寄生虫包括艾美球虫属。感染鳍足科动物(海豹，海狮)的主要寄生虫包括phocae艾美球虫。感染骆驼科动物(骆驼)的主要寄生虫包括艾美球虫属。感染长颈鹿科动物(长颈鹿)的主要寄生虫包括艾美球虫属。感染象科动物(非洲象和亚洲象)的主要寄生虫包括Fasciola属。感染低等灵长类动物(黑猩猩，猩猩，猿，狒狒，恒河猴，猴)的主要寄生虫包括贾第鞭毛虫属，Balantidium大肠杆菌，溶组织性阿米巴，肉孢子虫属，刚地弓形体；plasmodim属(RBC)，巴贝虫属(RBC)，锥虫属(血浆)，利什曼原虫属(巨噬细胞)。
癌症是引起伴侣动物(如猫和狗)死亡的主要原因之一。在已经溶入家庭的家养宠物中，癌症多发于年老动物。年龄在10岁以上的狗有45％死于该病。最常见的治疗方法是手术，化疗和放疗。有成功使用经验的其它治疗方法有激光治疗，冷冻疗法，极高热和免疫治疗。根据不同类型癌症及其扩散程度选择治疗方法。除非恶性生长限制在体内分离的部位，否则在不影响正常细胞的情况下很难只将恶性组织除去。
通常在狗和猫中发现的恶性疾病包括但不局限于淋巴肉瘤，骨肉瘤，乳腺肿瘤，肥大细胞瘤，脑瘤，黑色素瘤，腺癌，良性肺肿瘤，支气管腺体瘤，支气管腺癌，纤维瘤，黏液腺瘤，肺部肉瘤，神经肉瘤，骨瘤，乳头瘤，眼癌，Ewing肉瘤，Wilm肿瘤，Brukitt淋巴瘤，小神经胶质细胞瘤，神经细胞瘤，破骨细胞瘤，口腔瘤，纤维肉瘤，骨瘤和横纹肌肉瘤。在狗中发生的其它瘤包括生殖器鳞状细胞癌，遗传性性病肿瘤，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，滋养细胞肿瘤，血管外皮细胞瘤，组织细胞瘤，绿色白血病(粒细胞肉瘤)，角膜乳头瘤，角膜鳞状细胞肉瘤，血管肉瘤，肋膜间皮瘤，基细胞瘤，胸腺瘤，胃瘤，肾上腺瘤，口腔乳头瘤，血管内皮瘤和cystadenoma。在猫中常见的其它恶性肿瘤包括囊泡淋巴瘤，肠道淋巴肉瘤，纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌。雪貂，一种曾经非常普遍的家养宠物，可能患胰岛瘤，淋巴瘤，肉瘤，神经瘤，胰岛细胞瘤，胃MALT淋巴瘤和胃腺瘤。
影响农业家畜的瘤性疾病有淋巴瘤，血管外皮细胞瘤和牛眼瘤(在牛中)；幽门纤维瘤，溃疡性鳞状细胞癌，幽门瘤，结缔组织瘤，肥大细胞瘤(在马中)；肝细胞瘤(在猪中)；淋巴瘤和肺腺瘤(在绵羊中)；肺肉瘤，淋巴瘤，Rous肉瘤，网状内皮瘤，纤维肉瘤，肾腹部胚细胞瘤，B细胞淋巴瘤和淋巴细胞增生(在鸟中)；成视网膜细胞瘤，肝细胞瘤，淋巴肉瘤(淋巴母细胞瘤)，浆细胞增多淋巴瘤，swimbladder肉瘤(在鱼中)，干酪样lumphadenitis(CLA)；在山羊和绵羊中由棒状杆菌假结核病引起的慢性、传染性疾病，在绵羊中由jaagsiekte引起的传染性肺肿瘤。
过敏原指在易感对象中诱导产生过敏反应或哮喘的物质(抗原)。过敏原种类很多，包括花粉，昆虫毒液，动物皮屑，真菌孢子和药物(如青霉素)。天然过敏原，动物和植物过敏原包括但不局限于下列种属的特异蛋白犬(犬科)；表皮螨属(如farinae表皮螨)；Felis(家养Felis)；豕草属(artemiisfolia豕草)；毒麦(如perenne毒麦或multiflorum毒麦)；柳杉(日本产柳杉)；链格孢属(Alternaria alternata)；桤木；赤杨(gultinoasa赤杨)；桦树(verrucosa桦树)；栎树(alba栎树)；洋橄榄(europa洋橄榄)；蒿属(vulgaris蒿属)；马樱丹属(lanceolata马樱丹属)；parietaria(officinalis parietaria或judaica parietaria)；blattella(germanica blattella)；蜜蜂(如multiflorum蜜蜂)；cupressus(sempervirens cupressus，arizonica cupressus，macrocarpa cupressus)；刺柏属(sabinoides刺柏属，virginina刺柏属，communis刺柏属和ashei刺柏属)；金钟柏(如orientalis金钟柏)；Chamaecyparis(obtuse chamaecyparis)；冰草属(repens冰草属)；黑麦(谷淀粉黑麦)；小麦(夏季小麦)；dactylis(glomeratadactylis)；festuca(elatior festuca)；禾本科(pratensis禾本科或compressa禾本科)；燕麦(sativa燕麦)；holcus(lanatus holcus)；anthoxanthum(odoratum anthoxanthum)；arrhenatherum(elatiusarrhenatherum)；agrostis(alba agrostis)；phleum(pretensephleum)；phalaris(arundinacea phalaris)；paspalum(notatumpaspalum)；高粱属(halepensis高粱属)和bromus(inermisbromus)。
抗原可以由核酸载体编码或不由核酸载体编码。在前者方案中，向接种对象接种核酸载体，抗原在体内进行表达。在后者方案中，直接向接种对象接种抗原。这里所述不由核酸载体编码的抗原指非核酸抗原。如本发明中不由核酸载体编码的抗原是多肽。对多肽抗原的氨基酸序列进行稍微修饰产生与未经修饰多肽的抗原活性相当的多肽。如修饰可以是人工进行定点突变，或自发突变。这里所述的所有多肽指修饰后抗原性仍然存在的多肽。如多肽可以是病毒多肽。
这里所用的术语“充分纯化”指多肽与其它蛋白、脂类、碳水化合物或其它在天然状态下连接的物质充分分离。本领域专业人员使用蛋白纯化的标准技术能够纯化病毒或细菌多肽。充分纯化的多肽在非还原性聚炳烯酰胺凝胶上产生单一条带。在部分糖基化的多肽或含有数个起始密码子的多肽中，在非还原性聚炳烯酰胺凝胶上产生多个条带，这些条带组成该多肽的特征图谱。还可以通过N端氨基酸序列分析验证病毒或细菌的纯化多肽。不由核酸载体编码的其它类型抗原包括以上所述的多聚糖，小分子和模拟物等，均包括在本发明中。
本发明还应用了编码抗原性多肽的多聚核酸。可以想像向接种对象接种编码抗原的核酸分子后，这类抗原将在体内进行表达。以核酸载体方式接种的抗原指由核酸载体编码的抗原。编码抗原的核酸与在真核细胞内表达抗原的基因编码序列相连。基因表达序列指任一调控核酸序列，如启动子序列或启动子-增强子联合，这些序列能有效增加抗原核酸的转录和翻译。比如基因表达序列可以是哺乳动物或病毒启动子，如组成型或诱导型启动子。组成型哺乳动物启动子包括，但不局限于下列基因的启动子次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPTR)，腺嘌呤脱氨基酶，丙酮酸激酶，β肌动蛋白启动子和其它组成型启动子。在真核细胞中组成型的病毒启动子有巨细胞病毒(CMV)启动子，猴病毒(如SV40)启动子，乳头瘤病毒启动子，HIV启动子，Rous肉瘤启动子，巨细胞病毒，莫洛尼氏白血病毒和其它逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其它的组成型启动子为本领域专业人员所熟悉。本发明中作为基因表达序列的有用启动子还包括诱导型启动子。诱导型启动子在存在诱导剂的情况下进行表达。如存在某些金属离子可以诱导金属硫因启动子启动转录和表达。其它诱导型启动子为本领域专业人员所熟知。
总之，基因表达序列在转录和翻译起始时必须包括5’非转录序列和5’非翻译序列，如TATA盒，帽子序列，CAAT序列等类似结构。特别是5’非转录序列还包括启动子区域，该区域的启动子序列控制与其连接的抗原核酸的转录。可以选择的基因表达序列包括增强序列或所希望的上游激活序列。
通过操作将抗原核酸与基因表达序列连接。如这里所使用的，通过操作将抗原核酸序列和基因表达序列共价连接，使表达或转录和/或翻译的抗原编码序列位于基因表达序列的影响或控制下。如果基因表达序列5’端的诱导型启动子导致抗原序列转录，且两个DNA序列的连接方式不造成(1)移码框架改变，(2)影响指导抗原序列进行转录的启动子的功能，(3)影响相应的RNA转录子翻译成蛋白的功能，就可以通过操作可以将两个DNA序列进行连接。如果基因表达序列能有效影响抗原核酸序列的转录，进而翻译为目的蛋白或多肽就可以将基因表达序列与抗原核酸序列连接。
本发明的抗原核酸可以单独导入免疫系统或与载体联合接种。在广泛意义上载体指任何能促进抗原核酸进入免疫系统细胞，抗原进行表达并呈现在免疫细胞表面的媒介。通常通过降低导致载体缺乏的降解作用，载体将核酸转运入免疫细胞。可选择的载体包括上述在免疫细胞中增强抗原核酸表达的基因表达序列。本发明中有用的载体包括，但不局限于质粒，噬菌体，病毒，来源于病毒或细菌、通过操作插入或整合抗原核酸序列的其它载体。优先选择病毒载体，包括但不局限于来自下列病毒的核酸序列逆转录病毒，如莫洛尼氏鼠白血病毒，Harvey鼠肉瘤病毒，鼠乳腺肿瘤病毒和Rous肉瘤病毒；腺病毒，腺相关病毒；SV-40型病毒；多瘤病毒；EB病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；痘病毒；脊髓灰质炎病毒；RNA病毒如逆转录病毒。可以使用以上为列出但本领域熟知的载体。
优先选择病毒载体的依据是有些病毒不引起真核细胞发生病变，可以将其非必需基因用目的基因代替。非细胞病变病毒包括逆转录病毒，其生活周期包括病毒RNA基因组逆转录为DNA，随后整合入宿主细胞DNA中。已经批准逆转录病毒用于人体基因治疗试验。逆转录病毒中最有用的是复制缺陷型(如能直接合成目的蛋白，但不能形成感染性颗粒)。这类改变基因的逆转录病毒表达载体在进行体内高效基因转导时有广泛的用途。Kriegler，M.，在1990年W.H.Freeman C.O.出版的《基因转移和表达，实验室操作手册》及Murry E J1991年HumanaPress，Inc.出版的《分子生物学方法》第7卷中提供了制备复制缺陷型逆转录病毒的标准步骤(包括外源基因整合入质粒，质粒转染组装细胞系，组装细胞产生重组逆转录病毒，从组织培养基中收集病毒颗粒，使用病毒颗粒感染靶细胞)。
有些应用方法优先选择腺相关病毒，双链DNA病毒。可以通过基因工程使腺相关病毒为复制缺陷型，感染范围较广的细胞类型和种类。还具有以下优点对热和脂溶剂稳定；在多种细胞系包括造血细胞中具有高转导效率；缺少超感染抑制因此可以进行多重系列转导。据报道，腺相关病毒能以位点特异的方式整合入人细胞DNA中，因此将插入突变的可能性和插入基因表达逆转录病毒感染的多变性降到最低。此外，在组织培养中野生型腺相关病毒感染在没有选择压力的情况下可以超过100代，说明腺相关病毒基因组的整合相对稳定。腺相关病毒还可以以染色体外的形式发挥作用。
其它的载体包括质粒载体。质粒载体在本领域有广泛描述，为专业人员熟知。参见Sambrook等人在1989年冷泉港出版社出版的《分子克隆，实验室手册》第二版。近几年来，发现质粒载体在体内将基因导入细胞方面具有特殊的优点，因为质粒不能进行自我复制和整合入宿主基因组。但这些质粒具有与宿主细胞相容的启动子，能够表达质粒内有效基因编码的多肽。常用的质粒包括pBR322，pUC18，pUC19，pRC/CMV，SV 40和pBlueScript。其它质粒为本领域专业人员所熟知。此外还可以使用限制性酶和连接反应通过去除和增加特殊DNA片断设计质粒。
最近发现细菌可以将携带质粒的基因导入免疫系统。质粒转染细菌如沙门氏菌后，修饰过的菌可以作为导入载体。可以使用口服或其它方法接种细菌导入载体。细菌可能以穿过肠道屏障的方式将质粒导入免疫细胞如B细胞，树突状细胞中。通过这一方法可以建立高水平的免疫保护作用。在本发明导入抗原，免疫调节核酸和/或其它治疗性制剂方面，这些导入方法是有用的。
因此除了适合单独使用外，免疫调节核酸还可以作为疫苗佐剂使用。以前发现CpG寡聚核苷酸是良好的免疫佐剂。为了在人和非啮齿类动物中筛选作为佐剂的最佳免疫调节核酸，对几种不同核酸在体内的作用进行了试验。对小鼠中进行的几个体外试验进行评价，预测其作为佐剂在体内的效果。在研究过程中，验证了一项可以证明体内试验有效的体外试验。令人惊奇的发现是B细胞和NK细胞的活化与免疫调节核酸在体内增强免疫系统针对某抗原反应的能力非常相关。
免疫调节核酸还可以促进树突状细胞的存活，分化，激活和成熟。免疫调节核酸具有促进树突状细胞存活，分化，激活和成熟的独特功能。通过免疫磁性细胞分离方法从血液中分离的树突状前体细胞与GM-CSF孵育2天后发育成具有形态特征和功能的树突状细胞。如果不存在GM-CSF，这些细胞将凋亡。在促进树突状细胞(表达MHCII，细胞大小，颗粒状)存活和分化方面，免疫调节核酸优于GM-CSF。免疫调节核酸还可以诱导树突状细胞成熟。由于树突状细胞表达可在局部环境中识别微生物分子如LPS的型别受体来呈递抗原，起着连接天然免疫系统和获得性免疫系统的作用。免疫调节核酸具有激活树突状细胞的能力支持使用这些核酸对疾病如癌症，过敏或感染性疾病进行体内和体外免疫治疗的策略。
免疫调节核酸还可以增强自然杀伤细胞的溶解细胞能力和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。还可以将免疫调节核酸与针对靶细胞如癌细胞的抗体联合使用诱导ADCC。免疫调节核酸与抗体联合接种免疫对象时，诱导其免疫系统杀死肿瘤细胞。在ADCC过程中使用的抗体包括在体内与细胞反应的抗体。本领域有关于这类特异针对靶细胞抗体的描述，许多抗体可以购买到。下述是免疫治疗癌症列表中的一些抗体实例。
核酸在将免疫反应从Th2型转为Th1型中同样有用。通过测量核酸反应产生的细胞因子水平(如诱导单核细胞和其它细胞产生Th1型细胞因子，包括IL-12，IFN-γ和GM-CSF)，可以检测免疫反应是否从Th2型转为Th1型。治疗哮喘时改变或重新平衡免疫反应(从Th2型转为Th1型)非常有效。如治疗哮喘的有效用量可以是能改变与哮喘有关的Th2型免疫反应为Th1型反应的用量。Th2型细胞因子特别是IL-4和IL-5在哮喘对象的呼吸道中升高。这些细胞因子加剧哮喘炎症反应的重要方面，包括IgE同种型的转换，嗜红细胞趋化因子，激活和肥大细胞生长。Th1型细胞因子特别是IFN-γ和IL-12能抑制形成Th2克隆和产生Th2细胞因子。本发明的免疫调节核酸能使Th1型细胞因子增高，重新平衡免疫系统，预防或降低与Th2免疫反应相关的副作用。
本发明还包括诱导产生抗原非特异性的天然免疫激活作用的方法，及使用免疫调节核酸获得对感染性病原的广谱抗性。这里所述的抗原非特异性天然免疫激活作用是指激活除了B细胞外的免疫细胞，这些细胞能够以抗原非依赖性方式发生反应细胞如激活NK细胞，T细胞，其它免疫细胞或这几种细胞的联合。因为免疫细胞处于活化形式，可以对任何入侵化合物或微生物发生反应从而诱导产生对感染性病原的广谱抗性。不需要某一特定抗原使这些细胞易感。这种免疫作用在生物武器和上述情形如旅行中特别有用。
本发明的核酸还可以与其它治疗性制剂包括抗微生物制剂，佐剂，细胞因子，抗癌制剂，治疗药物，治疗药物及其它类似物进行联合使用。
本发明的核酸还可以与抗微生物制剂联合接种免疫对象。这里所述的微生物制剂是指天然存在或合成的能杀死或抑制感染性微生物的化合物。本发明使用的抗微生物制剂类型根据免疫对象感染或存在感染危险的微生物类型不同而不同。抗微生物制剂包括但不局限于抗细菌制剂；抗病毒制剂；抗真菌制剂和抗寄生虫制剂。名词“抗感染制剂”，“抗细菌制剂”，“抗病毒制剂”，“抗真菌制剂”，“抗寄生虫制剂”和“驱虫剂”为本领域专业人员所熟知，在医学教科书中有标准定义。简单而言，抗细菌制剂能杀死或抑制细菌生长，包括抗生素及其它具有相似功能作用的合成或天然化合物。
抗生素是一类低分子量物质，可以在细胞如微生物的二级代谢中产生。一般而言，抗生素干扰细菌的一种或多种功能，或干扰微生物特有而宿主细胞没有的结构。可以分离天然的或合成能杀死或抑制病毒的抗病毒制剂。抗真菌制剂用来治疗表面真菌感染及条件性和原发性真菌感染。抗寄生虫制剂能杀死或抑制寄生虫。
抗细菌制剂能杀死或抑制细菌生长或发挥功能。主要抗细菌制剂为抗生素。能有效杀死或抑制较广范围细菌的抗生素指广谱抗生素。其它类型的抗生素主要包括能有效抗格兰氏阳性或格兰氏阴性菌的抗生素。这些类型的抗生素指窄谱抗生素。
其它能有效抗一种微生物或疾病但不抗其它细菌的抗生素指有限谱抗生素。根据抗细菌制剂的作用方式可以将其分类。一般而言，抗细菌制剂为细胞壁合成抑制剂，细胞膜抑制剂，蛋白合成抑制剂，核酸合成或功能性抑制剂及竞争性抑制剂。
本发明使用的抗细菌制剂包括但不局限于青霉素，半合成青霉素，克拉布兰酸，头孢菌素，枯草杆菌肽，，氨下青霉素，羧苄青霉素，甲苯异恶唑青霉素，azlocillin，梅兹洛西林，氧哌嗪青霉素，二甲氧苯青霉素，双氯青霉素，新青霉素，先锋霉素，头孢菌素VIII，头孢菌素IV，头孢羟唑，氯头孢菌素，头孢菌素V，cefuroxine，cefcillin，氨中噻肟头孢菌素，磺吡下头孢霉素，cefetamet，ceftriaxone，氧哌羟苯唑头，ceftazidine，羟羧氧酰胺菌素，咔唑胺，丙咪嗪，monobactems，euztreonam，万古霉素，多粘菌素，两性霉素B，制霉菌素，异吡唑，克霉唑，密康唑，苯并二氢呋喃酮，itraconazole，fluconazole，利福平，乙胺碘丁醇，四环素类，氯霉素，大环内酯，氨基糖苷类，链霉素，卡那霉素，托普霉素，.氨丁卡霉素，庆大霉素，四环素，二甲胺四环素，强力霉素，氯四环素，红霉素，聚酰胺纤维，clarithromycin，竹桃霉素，azithromycin，喹诺酮，co-trimoxazole，氟哌酸，卷须霉素，enoxacin，萘啶酸，temafloxacin，磺胺药，磺胺异恶唑和甲氧下氨嘧啶；二乙酰氨苯砜；乙酰砜钠；阿来霉素；双胍啶；Amdinocillin；AmdinocillinPivoxil；阿密四环素；Amifloxacin；甲磺酸Amifloxacin；氨丁卡霉素；硫酸氨丁卡霉素；对氨基水杨酸；对氨基水杨酸钠；羟氨苄青霉素；两性霉素，氨必西林；氨必西林钠；萘啶毒霉素钠；阿泊拉霉素；天冬菌素；硫酸阿司米星；卑霉素；Avoparcin；Azithromycin；Azlocillin；Azlocillin钠；盐酸氨下青霉素甲戊酯；枯草杆菌肽；亚甲基双水杨酸内酯枯草杆菌肽；枯草杆菌肽锌；班贝霉素；苯甲酰苯基钙；去氧红霉素；硫酸倍他霉毒；Biapenem；二硝霉素；联苯基氢氯化物；Bispyrithione镁；丁酰苷菌毒；硫酸丁酰苷菌素；硫酸缠霉素；卡巴氧；羧苄青霉素二钠；羧苄青霉素碘钠；羧苄青霉素苯钠；羧苄青霉素钾；Carumonam钠；氯头孢菌素；头孢羟氨下；头孢羟唑；Nafate头孢羟唑；.头孢羟唑钠；头孢哌罗；头孢三嗪；Cefazaflur钠；头孢菌素V；头孢菌素V钠；Cefbuperazone；Cefdinir；Cefepime；氢氯Cefepime；Cefetecol；Cefixime；氢氯头孢甲肟；头孢氰唑；头孢氰唑钠；盐沼单钠；盐沼钠；氧哌羟苯唑头钠；水溶性油；氨中噻肟头孢菌素钠；头孢双硫唑甲氧；头孢双硫唑甲氧二钠；氢氯噻乙胺唑头孢菌素；甲氧噻吩头孢菌素；甲氧噻吩头孢菌素钠；Cefpimizole；Cefpimizole钠；头孢吡四唑；头孢吡四唑钠；硫酸头孢菌属；Cefpodoxime Proxetil；Cefprozil；甲氧环烯头孢菌素；磺吡下头孢霉素钠；头孢噻甲羧肟；Ceftibuten；去甲噻肟头孢菌素钠；Cefiriaxone钠；头孢氨呋肟；Axetil头孢氨呋肟；Pivoxetil头孢氨呋肟；头孢氨呋肟钠；氰乙酰头孢菌素钠；头孢氨下；氢氯头孢氨下；头孢甘酸；头孢利定；头孢利定钠；头孢菌素VIII钠；环己烯胺头孢菌素；氢氯Cetocycline；Cetophenicol；氯霉素；棕榈酸氯霉素；泛酸复合物氯霉素；氯霉素琥珀酸钠；苯膦双氯苯双胍己烷；.氯二甲苯酚；硫酸氢氯四环素；氢氯氯四环素；噌恶星；卷须霉素；氢氯卷须霉素；西罗里霉素；Clarithromycin；氢氯棕榈酸，Clinafloxacin；磷酸氯林肯霉素；氯苯吩嗪；苄星邻氯苯甲异恶唑菌霉素；邻氯苯甲异恶唑菌霉素钠；氯洒西林；环丝氨酸；Dalfopristin；氨苯砜；Daptomycin；去甲金霉素；氢氯去甲金霉素；去甲四环素；Denofungin；Diaveridine；双氯青霉素；双氯青霉素钠；硫酸二氢氯化物；Dipyrithione；；Dirithromycin钙；强力霉素；硫酸磷双氢链霉素；Hyclate强力霉素；Droxacin钠；Enoxacin；Epicillin；氢氯差向四环素；红霉素；Acistrate红霉素；Estolate红霉素；丁二酸乙酯红霉素；Gluceptate红霉素；Lactobionate红霉素；丙酸红霉素；硬脂酸红霉素；氢氯乙胺碘丁醇；乙硫异烟胺；Fleroxacin；氟氯青霉素；Fludalanine；氟甲喹；磷霉素；氨基丁三醇磷霉素；Fumoxicillin；呋喃唑酮氯化物；酒石酸呋喃唑酮；Fusidate钠；梭链孢酸；硫酸庆大霉素；Gloximonam；短杆菌肽；碘氯苯炔醚；缩酮氨下青霉素；缩酮氨下青霉素钾；双己咪唑；Ibafloxacin；Imipenem；异康唑；Isepamicin；异烟肼；交沙霉素；硫酸卡那霉素；北里霉素；左旋呋喃它酮；Levopropylcillin钾；Lexithromycin；林肯霉素；氢氯林肯霉素；Lomefloxacin；氢氯Lomefloxacin；甲磺酸Lomefloxacin；Loracarbef；磺胺米隆；甲氯环素；磺基水杨酸甲氯环素；Megalomicin磷酸钾；美喹多司；Meropenem；甲烯土霉素；氢氯甲烯土霉素；六亚甲基四胺；马尿酸六亚甲基四胺；扁桃酸六亚甲基四胺；甲氧苯青霉素钠；美替普林；氢氯灭滴灵；磷酸灭滴灵；美洛西林；美洛西林钠；二甲胺四环素；氢氯二甲胺四环素；氢氯Mirincamycin；莫能菌素；莫能菌素钠；乙氧萘青霉素钠；Nalidixate钠；萘啶酮酸；游霉素；暗霉素；棕榈酸新霉素；硫酸新霉素；十一碳烯酸新霉素；硫酸乙基西梭霉素；中性霉素；硝呋拉定；硝呋地腙；硝呋拉太；硝呋隆；硝呋达齐；硝呋米特；硝呋吡醇；硝呋奎唑；硝呋噻唑；硝环素；呋喃妥英；硝米特；诺氟沙星；新生霉素钠；氧氟沙星；奥美普林；新青霉素二钠；Oximonam；Oximonam钠；奥索利酸；土霉素；土霉素钙；氢氯土霉素；Paldimycin；对氯酚；Paulomycin；培氟沙星；甲磺酸培氟沙星；醋甲西林；苄星青霉素G；青霉素G钾；青霉素G普鲁卡因；青霉素G钠；青霉素V；苄星青霉素V；Hhydrabamine青霉素V；青霉素V钾；Pentizidone钠；苯基氨基水杨酸；哌拉西林钠；吡苄西林钠；吡地西林钠；氢氯Pirlimycin，氢氯匹氨西林；双羟萘酸匹氨西林；Probenate匹氨西林；硫酸多粘菌素B；紫菜霉素；普匹卡星；吡嗪酰胺；羟基吡啶硫酮锌；乙酸喹地卡明；Quinupristin；消旋甲砜霉素；Ramoplanin；雷尼霉素；雷洛霉素；Repromicin；Rifabutin；Rifametane；Rifamexil；利福米特；利福平；利福喷丁；Rifaximin；罗利环素；硝酸罗利环素；蔷薇霉素；丁酸蔷薇霉素；丙酸蔷薇霉素；蔷薇霉素磷酸钠；硬脂酸蔷薇霉素；罗索沙新；罗沙胂；聚酰胺纤维；脱甲脱氧四环素；Sanfetrinem钠；Sarmoxicillin；沙匹西林；吸水真菌素；西索米星；硫酸西索米星；Sparfloxacin；氢氯奇放线菌素；螺旋霉素；氢氯司他霉素；斯堡霉素；硫酸链霉素；链霉素异烟胼；磺胺苯；.苯酰磺胺；磺胺醋酰；磺胺醋酰钠；Sulfacytine；磺胺嘧啶；磺胺嘧啶钠；磺胺多辛；磺胺林；磺胺甲基嘧啶；磺胺5-甲氧嘧啶；磺胺酸锌；磺胺硝苯；柳氮磺胺吡啶；磺胺甲基异噻唑；磺胺基唑；Sulfazamet；磺胺异嘧唑；乙酸磺胺异嘧唑；磺胺异嘧唑Diolamine；磺粘菌素；Sulopenem；Sultamicillin；森西林钠；氢氯酞氨苄西林；Teicoplanin；氢氯Tamafloxacin；Temocillin；四环素；氢氯四环素；磷酸复合物四环素；四氧普林；甲砜氯霉素；Thiphencillin钾；替卡西林甲苯基钠；替卡西林磷酸氢二钠；替卡西林单钠；替克拉酮；Tiodonium氯化物；磷酸托普霉素；Tosufloxacin；甲氧苄氨嘧啶；硫酸甲氧苄氨嘧啶；三重磺胺嘧啶；醋竹桃霉素；硫酸醋竹桃霉素；短杆菌素；万古霉素；氢氯万古霉素；威及霉素和佐尔博霉素。
抗病毒制剂是能预防病毒感染细胞或在细胞内进行复制的化合物。相对于抗细菌药物而言，抗病毒药物很少，原因是病毒复制过程与宿主细胞内DNA复制密切相关，非特异抗病毒制剂一般对宿主都有毒性。病毒感染一般有几个阶段，抗病毒药物可以在这些过程中发挥阻止或抑制作用。这些阶段包括病毒吸附到宿主细胞表面(免疫球蛋白或结合多肽)，病毒脱膜(如金刚烷胺)，病毒mRNA合成或翻译(如干扰素)，病毒RNA或DNA复制(核苷类似物)，新病毒蛋白成熟(如蛋白酶抑制剂)，组装释放病毒。
核苷类似物是与核苷结构相似，但包含不完全或异常脱氧核糖或核糖的合成化合物。核苷类似物进入细胞后，经过磷酸化产生三磷酸核苷，与正常核苷竞争组成病毒DNA或RNA。一旦三磷酸核苷类似物进入正在延伸的核酸链，就会引起病毒聚合酶不可逆转的交联，终止链的延伸。核苷类似物包括但不局限于无环鸟苷(用来治疗单纯疱疹病毒和水痘-带状疱疹病毒)，更昔罗韦(用来治疗巨细胞病毒)；疱疹净，三唑核苷(用来治疗呼吸道合胞病毒)，双脱氧胞嘧啶，zidovudine。干扰素是病毒感染细胞和免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素通过与感染细胞临近的细胞表面特异受体结合发挥作用，引起细胞产生抗病毒感染的改变。α和β干扰素还诱导感染细胞表面表达MHC I类和II类分子，增加抗原向宿主免疫细胞呈递识别的作用。还可以获得重组的α和β干扰素，用来治疗慢性乙肝和丙肝。有效控制病毒感染的干扰素剂量存在严重的副作用，如发热，不适和体重减轻。
免疫球蛋白治疗用来预防病毒性感染。免疫球蛋白治疗病毒感染与治疗细菌感染不同，因为免疫球蛋白通过与细胞外病毒颗粒结合防止它们吸附、进入病毒易感细胞。宿主体内存在抗体时可以进行预防病毒感染的治疗。通常有两种免疫球蛋白治疗方法，正常免疫球蛋白治疗和超免疫球蛋白治疗。使用从健康供血者血清或集中在一起的血清制备的抗体产品进行正常免疫球蛋白治疗。集中血清制备的产品中包含抗多种人类病毒如甲肝病毒，细小病毒，肠道病毒(特别是在新生儿中)的低效价抗体。使用从抗特定病毒的供血者血清中制备的高效价抗体进行高免疫球蛋白治疗。这些抗体用于对抗特定病毒。高免疫球蛋白的实例包括带状疱疹免疫球蛋白(用来预防免疫抑制的儿童和新生儿发生水痘)，狂犬病毒免疫球蛋白(被患有狂犬病的动物咬伤后起预防作用)，乙肝免疫球蛋白(用于预防乙肝病毒，特别是在暴露于病毒的对象中)和RSV免疫球蛋白(用于治疗呼吸道合胞病毒感染)。
免疫球蛋白治疗的另一种类型是主动免疫。包括接种针对病毒表面蛋白的抗体或抗体片断。目前已经有两种类型的疫苗用于乙肝主动免疫从血清制备的乙肝病毒抗体和重组乙肝病毒抗体。两种抗体均从HBsAg制备得到。在感染乙肝病毒的高危人群如护理人员，性伴侣为慢性携带者和婴儿中注射抗体，分三次剂量注射。
本发明使用的抗病毒制剂包括但不局限于免疫球蛋白，金刚烷胺，干扰素，核苷类似物和蛋白酶抑制剂。抗病毒制剂的特殊实例包括但不局限于Acemannan，无环鸟苷，无环鸟苷钠，Adefovir；Alovudine；Alovudine Sudotox；氢氯金刚烷胺；阿拉诺丁；阿立酮；甲磺酸Atevirdine；Avridine；Cidofovir；Cipamfylline；氢氯阿糖胞苷；甲磺酸Delavirdine；脱氧无环鸟苷；双脱氧腺苷；Disoxaril；Edoxudine；Enviradene；Enviroxime；泛西洛维；抑感灵；Fiacitabine；Fialuridine；磷钾酸钠；膦乙酸钠；丙氧鸟苷；丙氧鸟苷钠；Idoxuridine；乙氧丁酮醛；Lamivudine；Lobucavir；盐酸甲氧苯异喹；甲吲噻腙；Nevirapine；Penciclovir；Pirodavir；三氮唑核苷；盐酸金刚乙胺；甲磺酸噻喹努佛；Somantadine Hydrochloride；索利夫定；匐枝青霉素；Stavudine；盐酸泰洛龙；Trifluridine；ValacyclovirHydrochloride；阿糖腺苷；磷酸阿糖腺苷；磷酸阿糖腺苷钠；Viroxime；扎西它宾；叠氧胸苷；Zinviroxime。
抗真菌制剂用来治疗和预防真菌感染。有时抗真菌制剂按作用机制进行分类。一些抗真菌制剂是细胞壁合成抑制剂，抑制合成葡萄糖。这类制剂包括但不局限于basiungin/ECB。其它抗真菌制剂通过破坏细胞膜完整性起作用。这类制剂包括但不局限于immidazoles，如克霉唑，sertaconzole，氟康唑，intraconazole，酮康唑，密康唑和voriconacole，及FK463，两性霉素B，BATY38-9502，MK991，pradimicin，UK292，保泰松和terbinafine。其它抗真菌制剂通过裂解几丁质(如几丁质酶)或免疫抑制(501膏)发挥作用。表3列出一些商业上可购买的制剂。
表3
因此，本发明使用的抗真菌制剂包括但不局限于immidazoles，FK463，两性霉素B，BATY38-9502，MK991，pradimicin，UK292，保泰松，几丁质酶，501膏，吖啶琐辛；安布鲁星；Amorolfine，两性霉素B；Azaconazole；.氮丝氨酸；Basifungin；联苯苄唑；盐酸Biphenamine；Bispyrithionemagsulfex；硝酸布康唑；十一碳烯酸钙；加地霉素；碳酸品红液；.氯海因；olamine环匹罗司；Cilofungin；Cisconazole；克霉唑；铜迈克星，Denofungin；双硫氧吡啶；Doconazole；益康唑；硝酸益康唑；恩康唑；硝酸Ethonam；硝酸Fenticonazole；菲律宾菌素；氟康唑；氟胞嘧啶；真菌霉素；灰黄霉素；哈霉素；异康唑；伊曲康唑；卡拉真菌素；酮康唑；洛蒙真菌素；利迪霉素；美帕曲星；咪康唑；硝酸咪康唑；莫能菌素；莫能菌素钠；盐酸萘替芬；十一碳烯酸新霉素；硝呋拉太；硝呋美隆；盐酸硝拉明；制霉菌素；辛酸；硝酸奥康唑；硝酸奥昔康唑；盐酸奥昔芬近；盐酸帕康唑；帕曲星；碘化钾；丙氯醇；羟基吡啶硫酮锌；硝吡咯菌素；鲁塔霉素；SanguinariumChloride；Saperconazole；吸水真菌素；硫酸硒；西奈芬近；硝酸硫康唑；Terbinafine；特康唑；二硫四甲秋兰姆；替克拉酮；噻康唑；托西拉酯；托林达酯；托萘酯；三乙酸甘油酯，乙酸甘油酯；Triafungin；十一碳烯酸；绿暗黄菌素；十一碳烯酸锌和盐酸Zinoconazole。
抗寄生虫制剂的实例，指人接种后用来抗寄生虫感染，包括但不局限于丙硫咪唑，两性霉素B，benznidazole，并噻吩，盐酸氯喹，磷酸氯喹，氯洁霉素，去氢吐根碱，乙胺嗪，糠酸二氯散，eflornithine，呋喃唑酮，肾上腺皮质激素，卤泛曲林，iodoquinol，双氢除虫菌素，甲苯咪唑，甲氟喹，锑酸甲葡胺，硫胂蜜胺，metrifonate，甲硝哒唑，氯硝柳胺，nifurtimox，oxamniquine，巴龙霉素，isethionate戊烷脒，哌嗪，吡喹酮，磷酸伯氨喹，氯胍，双羟萘酸噻嘧啶，磺胺pyrimethanmine，磺胺胍pyrimethanmine，盐酸奎纳克林，硫酸奎纳克林，.葡糖酸奎纳克林，螺旋霉素，stibogluconate钠(葡糖酸锑钠)，苏拉明，四环素，强力霉素，噻苯咪唑，硝砜咪唑，磺胺甲基异恶唑trimethroprim和锥虫胂胺。一些单独使用，一些与其它联合使用。
在非人对象中使用的抗寄生虫制剂有哌嗪，乙胺嗪，噻苯咪唑，芬苯达唑，丙硫咪唑，奥芬达唑，奥苯达唑，非班太，左旋四咪唑，酒石酸噻嘧啶，敌敌畏，双氢除虫菌素，doramectic，milbemycin oxime，iprinomectin，moxidectin，N-丁基氯哌姆，甲苯，潮霉素B，硫代醋酸钠，melarsomine，吡喹酮，epsiprantel，苯咪唑如芬苯达唑，丙硫咪唑，奥芬达唑，clorsulon，丙硫咪唑，amprolium；地可喹酯，拉沙里菌素，4-磺胺-2，6-二甲氧嘧啶莫能菌素；磺胺二甲嘧啶，磺胺喹啉，甲硝哒唑。
在马中使用的抗寄生虫制剂包括甲苯哒唑，奥芬达唑，非班太，噻嘧啶，敌敌畏，敌百虫，双氢除虫菌素，哌嗪；forS.westeri双氢除虫菌素，benzimiddazoles如thiabendzole，堪苯达唑，奥苯达唑和芬苯达唑。在狗中使用的抗寄生虫制剂有milbemycin oxime，双氢除虫菌素，双羟萘酸噻嘧啶和双氢除虫菌素与噻嘧啶联合使用。用于治疗猪寄生虫的制剂包括.左旋四咪唑，哌嗪，噻嘧啶，噻苯咪唑，敌敌畏和芬苯达唑。在绵羊和山羊中使用的打虫药有左旋四咪唑或双氢除虫菌素双氢除虫菌素。Caparsolate在治疗猫的D.immits(恶丝虫)病有一定的效果。
免疫调节核酸还可以与抗癌制剂联合使用。抗癌制剂包括癌症药物，放疗和手术疗法。这里使用的“癌症药物”指接种免疫对象后用于治疗癌症。这里使用的“治疗癌症”包括预防癌症的发展，减少癌症症状和/或抑制已经存在的癌症生长。另一方面，癌症药物用于癌症高危人群，降低其发病的危险。这里描述了治疗癌症的不同类型药物。根据这一目的，癌症药物分为化疗制剂，免疫治疗制剂，癌症疫苗，激素治疗和生物反应调节剂。
这里使用的“治疗癌症”包括预防癌症的发展，减少癌症症状和/或抑制已经存在的癌症生长。另一方面，癌症药物用于癌症高危人群，降低其发病的危险。这里描述了治疗癌症的不同类型药物。根据这一目的，癌症药物分为化疗制剂，免疫治疗制剂，癌症疫苗，激素治疗和生物反应调节剂。此外，本发明使用的方法还包括多种癌症药物与免疫调节核酸联合使用。如实例中免疫调节核酸与化疗制剂和免疫治疗制剂联合使用。癌症药物可以为免疫治疗制剂和癌症疫苗，或化疗制剂和癌症疫苗，或化疗制剂，免疫治疗制剂和癌症疫苗联合应用达到治疗癌症患者或癌症高危人群发展癌症。
癌症药物以多种形式发挥作用。一些癌症药物通过针对肿瘤细胞特有的生理学机制发挥作用。实例中包括针对癌细胞中突变的基因及其产物(如主要是蛋白)。这类基因包括但不局限于癌基因(如Ras，Her2，bcl-2)，肿瘤抑制基因(如EGF，p53，Rb)和细胞周期中的靶目标(如CDK4，p21，端粒酶)。癌症药物还可作用于癌细胞中改变了的信号转导途径和分子机制。使用单克隆抗体对表达于癌细胞表面的表位进行作用。这里所述的后一种癌症药物一般指免疫治疗。
其它癌症药物的靶细胞不只是癌细胞。如一些药物激活免疫系统攻击肿瘤细胞(如癌症疫苗)。其它药物，如血管生成抑制剂，作用于实体瘤的血液供应对其进行攻击。由于大部分恶性癌症能够转移(如存在原位肿瘤，扩散至远端组织形成二级肿瘤)，阻止发生转移的药物在治疗癌症中也非常有用。血管生成抑制剂包括碱性FGF，VEGF，angiopoietins，angiostatin，endostatin，TNF-α，TNP-470，凝血栓蛋白1，血小板4因子，CAI和蛋白整合素家族的某些成员。该类型药物的一个种类是金属蛋白酶抑制剂，它能抑制癌细胞在肿瘤原位存活和外渗到其它组织中的酶的活性。
免疫治疗制剂是能特异识别和结合癌抗原的抗体或抗体片断。这里所述的癌抗原广义上指癌细胞表达的抗原。确切一些指表达于癌细胞表面的抗原。更确切的指正常细胞不表达，或至少其表达水平与在癌细胞中表达水平不同的抗原。以抗体为基础的免疫治疗机制通过与癌细胞表面结合发挥作用，从而激活内源性免疫系统攻击癌细胞。以抗体为基础的免疫治疗的另一作用机制是将毒性物质特异导入癌细胞。通常抗体与毒性物质如篦麻蛋白(如来自蓖麻子)，calicheamicin，maytansinoids，或与放射性同位素如碘131和钇，90，或与化疗制剂(如这里所述的种种)，或与生物反应调节剂连接。使用该方法，可以将毒性物质集中在癌症区域，对正常细胞的非特异性毒性作用降到最底。除了使用特异针对癌抗原的抗体外，本发明还使用了与结合脉管系统如与内皮细胞结合的抗体。其原因为实体瘤一般依赖新生血管存活，因此大多数肿瘤都具有启动和刺激新生血管生长的能力。因此，多数癌症药物作用的一种机制为攻击给肿瘤供血的血管和/或支持这类血管的连接组织(或基质)。
免疫调节核酸与免疫治疗性制剂如单克隆抗体联合使用，通过多种作用机制包括显著增强ADCC(如上)，激活自然杀伤细胞(NK)和增加IFNα的分泌水平，从而增加长期存活率。核酸与单克隆抗体联合使用，可以降低达到生物学效果所需要的剂量。
表4列出了目前使用或正在研发的癌症免疫治疗剂。
表4
根据本发明使用的其它类型的化疗制剂包括氨基导眠能，天冬酰胺酶，白血福恩，Carboplatin，Chlorombucil，盐酸阿糖胞苷，更生霉素，盐酸红比霉素，雌氮芥磷酸钠，足叶乙甙(VP16-213)，5-氟去氧尿苷(5-FU)，氟他米特，羟基脲(羟基尿素)，异环磷酰胺，干扰素α2a，α2b，醋酸leuprolide(LHRH-释放因子相似物)，环己亚硝脲(CCNU)，盐酸二氯甲二乙胺(氮芥)，颈基嘌呤，巯乙磺酸钠，邻氯苯对氯苯二氯乙烷(o.p‘-DDD)，盐酸米托蒽醌，octreotide，plicamycin，盐酸甲基苄肼，链脲霉素，柠檬酸它莫西芬，硫鸟嘌呤，硫替派，硫酸长春碱，安吖啶(m-AMSA)，阿扎胞苷，Erthropoietin，六甲密胺(HMM)，白介素2，丙脒腙(甲基-GAG；甲基乙二醛双脒基腙；MGBG)，戊糖苷(2’脱氧柯福霉素)，甲基环己亚硝脲(甲基-CCNU)，替尼泊甙(VM-26)和硫酸去乙酰长春酰胺。
癌症疫苗用于激活抵抗癌细胞的内源性免疫反应。目前生产的疫苗主要用来激活体液免疫细胞(如抗体依赖的免疫反应)。目前正在研发的疫苗用来激活细胞介导的免疫反应，包括能杀死肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞。癌症疫苗一般能够增强癌抗原呈递给抗原呈递细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)和/或其它免疫细胞如T细胞，B细胞和NK细胞的能力。
尽管癌症疫苗可能采用这里讨论的几种形式之一，其目的是将癌抗原和/或癌相关抗原导入抗原呈递细胞(APC)，促进APC介导的这类抗原的内源性加工过程，最终在细胞表面与MHC I类分子共表达。癌症疫苗的一种形式是全细胞疫苗，制备方法为从免疫对象中苗诱导免疫反应。癌症疫苗的另一种形式是多肽疫苗，使用癌症特异性或癌相关性小肽激活T细胞。癌相关蛋白指不是唯一由癌细胞表达的蛋白(如其它正常细胞也可以表达该类抗原)。但是某种特殊类型的癌症通常癌相关抗原持续高水平表达。癌症疫苗的其它形式为树突状细胞疫苗，包括在体外与癌抗原或癌相关抗原孵育过的树突状全细胞。树突状细胞的溶解产物或细胞膜片断也可以作为癌症疫苗。树突状细胞疫苗能够直接激活抗原呈递细胞。其它癌症疫苗包括神经节苷脂，热休克蛋白疫苗，病毒和细菌疫苗及核酸疫苗。
免疫调节核酸与癌症疫苗联合使用可以促进抗原特异性体液免疫反应和细胞介导的免疫反应，此外还可以激活NK细胞和内源性树突状细胞，增强IFNα表达水平。这一增强作用可以在降低疫苗使用剂量的同时到达同样的效果。在一些实施方案中，癌症疫苗还可以与如上所述的佐剂同时使用。
其它疫苗采用树突状细胞的形式，这些细胞在体外接触癌抗原后对抗原进行加工，在其表面表达与MHC分子相连的癌抗原，更有效的呈递给免疫系统的其它细胞。
本发明的一个方面是免疫调节核酸与以树突状细胞为基础的癌症疫苗联合使用。树突状细胞是专业抗原呈递细胞。由于树突状细胞表达可在局部环境中识别微生物分子如LPS的型别受体来呈递抗原，起着连接天然免疫系统和获得性免疫系统的作用。树突状细胞能高效将其接触的可溶性特异抗原内在化，加工和呈递。抗原内在化和呈递过程使主要组织相容性复合物(MHC)和共刺激分子的表达上调，产生细胞因子，迁移至淋巴器官参与激活T细胞。
表5列出多种已经使用或正在研发的癌症疫苗。

这里使用的化疗药物包含不属于免疫治疗药物或癌症疫苗的所有形式的癌症药物。这里使用的化疗药物包括化学和生物药物。这些药物的作用是抑制癌细胞赖以存活的细胞活性。化疗药物的种类包括烷化剂/生物碱，抗代谢，激素或激素类似物及多种抗瘤药物。大多数药物对癌细胞有直接毒性，不需要免疫刺激。化疗和免疫调节核酸联合使用可以最大程度增强对化疗剂量的耐受量。
临床使用或正在研发的化疗药物见表6。
在一个实施方案中，本发明在治疗癌症中使用免疫调节核酸代替使用IFNα治疗。目前，一些治疗方案要求使用IFNα。因为接种某些免疫调节核酸后会产生IFNα，这些核酸就可以产生内源性IFNα。
在另一个实施方案中，哮喘/过敏药物包括PDE-4抑制剂，支气管扩张剂/β-2拮抗剂，K+通道开放剂，VLA-4对抗剂，neurokin对抗剂，TXA2合成抑制剂，xanthanine，花生四烯酸对抗剂，5 lipoxygenase抑制剂，thromboxin A2受体对抗剂，thromboxane A2对抗剂，5-lipox激活蛋白抑制剂和蛋白酶抑制剂，但不局限于上述种类。在一些重要的实施方案中，哮喘/过敏药物是从包括salmeterol，salbutamol，terbutaline，D2522/formoterol，fenoterol，和orciprenaline的药物中选择的支气管扩张剂/β-2拮抗剂。
在另一个实施方案中，哮喘/过敏药物包括抗组胺药和前列腺素诱导剂。在一个实施方案中，抗组胺药包括loratidine，cetirizine，安其敏，ceterizine相似物，fexofenadine，特非那定，desloratadine，norastemizole，epinastine，ebastine，阿司咪唑，levocabastine，azelastine，曲尼司特，特非那定，mizolastine，betatastine，CS560和HSR 609。在另一个实施方案中，前列腺素诱导剂是S5751。
仍然是在另一个实施方案中，哮喘/过敏药物包括类固醇和免疫调节剂。免疫调节剂包括抗炎症药物，类脂化合物对抗剂，IL-4 muteins，可溶性IL-4受体，免疫抑制剂，抗IL-4抗体，IL-4对抗剂，抗IL-5抗体，可溶性IL-13 Fc受体融合蛋白抗IL-9抗体，CCR3对抗剂，CCR5对抗剂，VLA-4抑制剂和IgE下调表达，但不局限于上述种类。在一个实施方案中，通过抗IgE达到IgE下调表达。
在其它实施方案中，类固醇包括氯地米松，fluticasone，tramcinolone和布地缩松。仍然是在另一个实施方案中，免疫抑制剂是耐收多肽疫苗。
在一个实施方案中，免疫调节核酸同时作为哮喘/过敏药物。在另一个实施方案中，免疫对象处于免疫抑制状态。
免疫调节核酸还可以和其它治疗药物如佐剂联合使用以加强免疫反应。免疫调节核酸和其它治疗性药物可以同时或先后接种。其它治疗药物同时接种时，可以混合或分开接种，但在同一时间接种。其它治疗药物和免疫调节核酸需要分开接种时，按顺序进行接种。这些组份在接种间隔中的分离时间可能是几分钟或更长。其它治疗药物包括但不局限于佐剂，细胞因子，抗体，药物等。
本发明还包括非核酸佐剂。非核酸佐剂指除了这里所描述的免疫调节核酸外能刺激体液和/或细胞免疫反应的任何分子或化合物。非核酸佐剂包括产生储存作用的佐剂，免疫调剂佐剂，产生储存作用和调剂免疫系统的佐剂。
这里所述产生储存作用的佐剂指使抗原在体内缓慢释放的佐剂，因而延长了免疫细胞对抗原的暴露时间。这类佐剂包括但不局限于铝(氢氧化铝，磷酸铝)；或包括矿物油、非矿物油乳剂，油包水或水包油乳剂，水包油乳剂有Montanide佐剂的SeppicISA系列(如Montanide ISA 720，AirLiquide，巴黎，法国)；MF-59(用Span 85和吐温80稳定的水包鲨烯乳剂；凯龙公司，Emeryville CA；和PROVAX(包含稳定去污剂和形成微团制剂的水包油乳剂；IDEC，Pharmaceuticals，公司，圣迭哥，CA)。
免疫调节佐剂指能激活免疫系统细胞的佐剂。如可以诱导免疫细胞产生和分泌细胞因子。这类佐剂包括但不局限于从Q.saponaria树皮中纯化的皂角苷，如QS2l(一种糖脂，使用HPLC分离时第21个流出峰；Aquila Biopharmaceuticals，Inc，Worcester，MA)；多聚(carboxylatophenoxy)叠氮膦(PCPP聚合体；病毒研究所，美国)；脂多糖衍生物如单磷酰基脂质A(MPL，Ribi，ImmunoChem Research，Inc，Hamilton，MT)，muramyl二肽(MDP，Ribi)和threonylmuramyl二肽(t-MDP，Ribi)；OM-174(与脂质A相连的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，瑞士)；Leishmania延长因子(纯化的Leishmania蛋白；Corixa Corporation，西雅图，WA)。
产生储存作用和调节免疫系统的佐剂是同时具有上述作用的化合物。这类佐剂包括但不局限于ISCOMS(含有皂角苷，脂类的免疫刺激复核物，形成病毒大小的颗粒，其上有孔可以捕获抗原；CSL，Melbourne，澳大利亚)；SB-AS2(SmithKlineBeecham佐剂细胞#2，含MPL和QS21的水包油乳剂；SmithKline Beecham Biologicals[SBB]，Rixensart，比利时)；SB-AS4SmithKline Beecham佐剂细胞#4，含铝和MPL；SBB，比利时)；非离子阻断共聚体，形成如CRL1005(这些包括疏水的polyoxypropylene线性链，其两侧是polyoxyethylene链；Vaxcel，Inc，Norcross，GA)的微团；Syntex佐剂组成(SAF，含吐温80和非离子阻断公聚体的水包油乳剂，Chemicals，Inc，Boulder，CO)。
免疫调节酸自身还可以作为佐剂诱导产生体液免疫反应。因此可以向接触抗原的人接种免疫调节核酸增强针对抗原的免疫反应。
免疫调节核酸还可以作为粘膜佐剂使用。曾发现经粘膜免疫CpG核酸可以同时诱导产生全身免疫和粘膜免疫。针对CpG核酸的全身免疫反应包括针对特异抗原的体液免疫和细胞免疫，这种抗原单独进行粘膜免疫时不能诱导产生全身免疫反应。而且，CpG核酸和霍乱毒素(CT，诱导产生Th-2样反应的粘膜佐剂)均能诱导CTL。这一结果令人惊奇，因为在全身免疫反应中，出现Th-2类抗体时通常无CTL(Schirmbeck等人，1995)。根据这里所述的结果，希望免疫调节核酸有类似的作用。
此外免疫调节核酸还可以在局部(如肺)和远端粘膜部位(如消化道下端)诱导免疫反应。免疫调节核酸在远端粘膜部位诱导IgA抗体水平显著升高。通常认为CT是高度有效的粘膜佐剂。根据以前报道(Snider，l995)，CT主要诱导产生IgG1亚类的抗体，表明产生了Th-2反应。与此相反，免疫调节核酸主要诱导产生Th-1类的IgG2a抗体，特别时以上两种佐剂加强免疫或联合使用后。Th-1类抗体通常具有中和能力，而且在肺中尽量避免发生Th-2反应，因为该类反应与哮喘相关(Kay，1996，Hogg，1997)。因此使用免疫调节核酸作为佐剂具有其它粘膜佐剂不具备的优点。本发明的免疫调节核酸还可以作为诱导全身和粘膜免疫反应的粘膜佐剂。
非核酸粘膜佐剂可以与免疫调节核酸联合进行免疫。这里使用的非核酸粘膜佐剂是指除了免疫调节核酸外与抗原同时经粘膜免疫后，能在免疫对象体内诱导产生粘膜免疫反应的佐剂。粘膜佐剂包括但不局限于细菌毒素如霍乱毒素(CT)，CT衍生物包括但不局限于CT B亚单位(CTB)(Wu等人，1998，Tochikubo等人，1998)；CTD 53(缬氨酸到天冬氨酸)(Fontana等人，1995)；CTK97(缬氨酸到赖氨酸)(Fontana等人，1995)；CTK104(酪氨酸到赖氨酸(Fontana等人，1995)；CTD53/K63(缬氨酸到天冬氨酸，丝氨酸到赖氨酸)(Fontana等人，1995)；CTH54(精氨酸到组氨酸)(Fontana等人，1995)；CTE112K(谷氨酸到赖氨酸)(Yamamoto等人，1997a)；CTS61F(丝氨酸到苯丙氨酸)(Yamamoto等人，1997a，1997b)；CTS106(脯氨酸到赖氨酸)(Douce等人，1997，Fontana等人，1995)；CTK63(丝氨酸到赖氨酸)(Douce等人，1997，Fontana等人，1995)；闭锁小带毒素，zot，大肠杆菌热不稳定毒素，不稳定毒素(LT)，LT衍生物包括但不局限于LTB亚单位(LTB)(Verweij等人，1998)；LT7K(精氨酸到赖氨酸)(Komase等人，1998，Douce等人，1995)；LT61F(丝氨酸到苯丙氨酸)(Komase等人，1998)；LT112K(谷氨酸到赖氨酸)(Komase等人，1998)；LT118E(甘氨酸到谷氨酸)(Komase等人，1998)；LT146E(精氨酸到谷氨酸)(Komase等人，1998)；LT192G(精氨酸到甘氨酸)(Komase等人，1998)；LTK63(丝氨酸到赖氨酸)(Marchetti等人。1998，Douce等人，1997，1998，Di Tommaso等人，1996)；LTR72(丙氨酸到精氨酸)(Giuliani等人，1998)；百日咳毒素，PT(Lycke等人，1992，Spangler BD，1992，Freytag和Clemments，1999，Roberts等人，1995，Wilson等人，1995)包括PT-9K/129G(Roberts等人，1995，Cropley等人，1995)；毒素衍生物(见下述)(Holmgren等人，1993，Verweij等人，1998，Rappuoli等人，1995，Freytag和Clements，1999)；脂质体A衍生物(如单磷酸脂质体A，MPL)(Sasaki等人，1996，Ogawa等人，1989，Michalek等人，1983)；细菌外膜蛋白(如外膜蛋白A(OspA) Borrelia burgdorferi的脂蛋白，奈瑟氏脑膜炎球菌的外膜蛋白)(Marinaro等人，1999，Van de Verg等人，1996)；水包油乳剂(如MF59)(Barchfield等人，1999，Verschoor等人，1999，O’Hagan，1998)；铝盐(Isaka等人，1998，1999)；皂角苷(如QS21，Antigenics，Inc，Woburn MA)(Sasaki等人，1998，MacNeal等人，1998)；ISCOMS，MF-59(用Span 85和吐温80稳定的水包鲨烯乳剂；凯龙公司，Emeryville CA)；Montanide佐剂的SeppicISA系列(如Montanide ISA 720，AirLiquide，巴黎，法国)；PROVAX(包含稳定去污剂和形成微团制剂的水包油乳剂；IDEC，Pharmaceuticals，公司，圣迭哥，CA)；Syntex佐剂组成(SAF，Chemicals，Inc，Boulder，CO)；多聚(carboxylatophenoxy)叠氮膦(PCPP聚合体；病毒研究所，美国)；Leishmania延长因子(纯化的Leishmania蛋白；Corixa Corporation，西雅图，WA)。
还可以通过共免疫或共表达细胞因子诱导或促进免疫反应(Bueler&Mulligan，1996；Chow等人，1997；Geissler等人，1997；Iwasaki等人，1997；Kim等人，1997)或免疫调剂核酸与B7共刺激分子同时免疫或表达(Iwasaki等人，1997；Tsuji等人，1997)。可以直接注射细胞因子，或以编码细胞因子如可以在体内表达细胞因子的核酸载体的方式进行免疫。这里所述的细胞因子是对多种从纳克到皮克浓度范围调节体液的可溶性蛋白和多肽的总称，无论在正常或在病理状态，这些细胞因子均能调节单个细胞和组织的功能。这些蛋白还可以直接介导细胞间的相互作用和调节细胞外环境中的调节过程。
细胞因子实例包括但不局限于IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-15，IL-18，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，γ干扰素(γ-IFN)，IFN-α，肿瘤坏死因子(TNF)，TGF-β，FLT-3配体，CD40配体。
细胞因子在介导T细胞反应中发挥作用。辅助型(CD4+)T细胞通过分泌作用于其它免疫细胞包括其它T细胞的可溶性因子协调哺乳动物的免疫反应。大部分成熟CD4+辅助型细胞表达两类细胞因子中的一种Th1或Th2。Th1类促进迟发型超敏反应，细胞介导的免疫作用，免疫球蛋白向IgG2a亚类转换。Th2类通过激活B细胞诱导产生体液免疫反应，促进生成抗体，诱导免疫球蛋白向IgG1和IgE亚类转换。在一些实施方案中，优先选择的细胞因子是Th1细胞因子。
免疫调节核酸可以直接进行免疫或与核酸接种复合物同时免疫。核酸接种复合物指核酸分子与一些加强分子(如与靶细胞(如B细胞表面)有高度亲和性的分子和/或增加靶细胞摄取能力)连接形成(如通过离子键或共价键连接；或包裹在内)。核酸接种复合物实例包括与下列物质连接固醇(如胆固醇)，脂类(如阳离子脂类，病毒颗粒或脂质体)，或靶细胞特异结合剂(靶细胞特异受体识别的配体)。优选复合物在体内应具有足够的稳定性，防止被靶细胞内在化前出现明显解离。但复合物在细胞内的适当条件下应能被切割释放核酸行使作用。
以上描述了向表面接种抗原和核酸的导入载体或导入方法。免疫调节核酸和/或抗原和/或其它治疗药物可以单独接种(如在生理盐水或缓冲液中)或使用本领域熟知的其它导入载体。如下述的导入载体Cochleates(Gould-Fogerite等人，1994，1996)；Emulsomes(Vancott等人，1998，Lowell等人，1997)；ISCOMs(Mowat等人，1993，Carlsson等人，1991，Hu等人，1998，Morein等人，1999)；脂质体(Childers等人，1999，Michalek等人，1989，1992，de Haan 1995a，1995b)；活菌载体(如沙门氏菌，大肠杆菌，志贺氏菌，乳酸杆菌)(Hone等人，1996，Pouwels等人，1998，Chatfield等人，1993，Stover等人，1991，Nugent等人1998)；活病毒载体(如痘病毒，腺病毒，单疱病毒)(Gallichan等人，1993，1995，Moss等人，1996，Nugent等人，1998，Flexner等人，1988，Morrow等人，1999)；微球体(Gupta等人，1998，Okada等人，1997，Ishii等人，1997)；二聚体(如羧甲基纤维素，壳聚糖)(Hamajima等人，1998，Lowell等人，1988，1996，1997)；氟化钠(Hashi等人，1998)；转基因植物(Tacket等人，1998，Mason等人，1998，Haq等人，1995)；病毒颗粒(Gluck等人，1992，Mengiardi等人，1995，Cryz等人，1998)；病毒样颗粒(Jiang等人，1999，Leibl等人，1998)。其它导入载体为本领域熟知，在下面关于载体的讨论中提供了一些实例。
可以通过多种免疫细胞试验检测免疫调节核酸的刺激指数。优先选择的是，通过检测鼠B细胞培养中3H标记尿苷的结合，得到关于B细胞增生的免疫调节核酸刺激指数至少是5，至少是10，较优先的是至少是15，最优先的选择至少是20，在上述方法中，B细胞与20uM核酸在37℃孵育20小时，然后加入1uCi3H标记的尿苷；4小时后收获细胞，在公开的专利申请PCT/US95/01570(WO96/02555)和PCT/US97/19791(WO98/18810)中描述，上述两个申请要求美国申请No.08/386,063和No.08/960,774的优先权，两个美国申请分别于1995年2月7日和1997年10月30日提交。如体内使用时，免疫调节核酸能诱导产生抗体。
免疫调节核酸在非啮齿类脊椎动物中作用明显。根据免疫对象的不同类型和免疫调节核酸的序列不同，免疫调节核酸均可诱导产生适当的免疫刺激作用。根据本发明发现多种脊椎动物对同一类的免疫调节核酸，有时特指人类特异的免疫调节核酸产生反应。但是啮齿动物对不同的核酸发生反应。如这里所示在人体内诱导产生适当免疫刺激的免疫调节核酸在小鼠中并不能诱导产生适当的刺激作用，反之亦然。但是在人体内诱导产生适当免疫刺激的免疫调节核酸在其它动物如牛，马，绵羊等中也能诱导产生适当的刺激作用。本领域专业人员根据这里描述和/或本领域已知的方法，及这里提供的指导原则确定用于特定种类动物的适当核酸序列。
免疫调节核酸的有效用量指能产生希望生物学效应的必需量或足够量。如诱导产生粘膜免疫的免疫调节核酸的有效用量指接触抗原后诱导产生针对抗原的IgA所需的量，而诱导产生全身免疫反应的量指接触抗原后诱导产生针对抗原的IgG所需的量。通过在不同活性成份和权重因素如效力，相对生物利用度，病人体重，副反应的严重程度及优选接种方式中加以选择，得出不会引起强烈毒性但有效的预防或治疗方案。任一特定应用的有效用量根据下列因素如疾病类型或需要治疗的状态，接种的免疫调节核酸类型，抗原，免疫对象大小或疾病的严重程度不同而不同。本领域专业人员根据经验不进行试验就能够确定特定免疫调节核酸和/或抗原和/或其它治疗性制剂的有效用量。
这里描述的粘膜或局部免疫的化合物用量根据每天免疫，每周免疫或每月免疫及免疫的时间间隔在每次0.1ug到10mg之间。更多使用的剂量是10ug到5mg之间，最常用的用量是100ug到1mg，间隔数周或数天后接种2-4次。一般选择的免疫刺激用量范围在每次1ug到10mg，最常用的每天或每周接种时免疫刺激用量范围在每次10ug到1mg。这里描述的通过注射方式诱导产生抗原特异免疫反应的化合物用量比作为疫苗佐剂或免疫调节应用时的有效粘膜用量高5到10,000倍，这里所述的化合物与抗原同时接种，但不与其它治疗性药物同时接种，比较常用的用量高10到1000倍，比最常用的用量高20到100倍。当免疫调节核酸与其它治疗药物联合接种或以特殊方式接种时，这里描述的使用注射方式诱导产生天然免疫反应或增加ADCC或诱导产生抗原特异免疫反应的免疫剂量根据每天免疫，每周免疫或每月免疫及免疫的时间间隔在0.1ug到10mg之间。较常用的注射用量在10ug到5mg之间，最常用的在100ug到1mg之间，间隔数周或数天后接种2-4次。在一些实施方案中，注射剂量比上述常用剂量高5到1000倍。
这里所述任何化合物的有效治疗用量最初来自动物模型。有效治疗剂量还可以来自CpG寡核苷在人体试验的数据(已经开始人体临床试验)，及有相似药理学活性的化合物，如其它粘膜佐剂如LT和用于粘膜或局部免疫接种的其它抗原在人体的数据。注射接种时需要高剂量。可以根据相对生物利用度和接种化合物的效力对实际用量进行调节。根据上述方法和本领域专业人员熟知的其它方法调节接种剂量达到最佳效果。
本发明以药学界认可的溶液形式组成，可以含有药学界认可浓度的盐，缓冲试剂，防腐剂，相容剂，佐剂和其它可选择的治疗性组分。
用于治疗目的时，有效用量的免疫调节核酸通过任何将核酸导入粘膜或全身的方法进行接种。本领域专业人员熟知本发明含治疗性成份的接种方法。优先选择的接种方法包括但不局限于口服，注射，肌肉注射，鼻腔，气管内，吸入，眼睛，阴道和直肠接种。
口服接种时，化合物(如免疫调节核酸，抗原和其它治疗性制剂)可以与药学界认可的活性化合物赋形剂联合组成。这里赋形剂能使本发明的成份形成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体制剂，凝胶剂，糖浆剂，膏剂，悬浊液及适用于治疗对象口服摄取的类似制剂。口服用途的药物配制品包括固体赋形剂，碾磨过的混合物，加工过的混合物颗粒，需要时加入适当辅助剂得到片剂或糖衣药核。适当的赋形剂特别是填充剂包括乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇；纤维素配制品如玉米淀粉，小麦淀粉，水稻淀粉，土豆淀粉，凝胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚烯吡酮(PVP)。如果需要还可以加入分散剂如交联聚烯吡酮，琼脂或褐藻酸或盐类如藻酸钠盐。口服形式的制剂还可以在生理盐水或缓冲液中以中和内部偏酸的状态，或不需要任何载体直接进行接种。
糖衣药核用适当外衣进行包裹。为达到这一目的，需要使用一定浓度的糖溶液，可以含有阿拉伯树胶，滑石粉，聚烯吡酮，聚羰乙烯胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和适当有机溶剂或混和溶剂。药片或糖衣中可以加入染料或色素用于确证或区分不同组成的活性成份。
口服用途的药物配制品包括由凝胶制成的推入配合胶囊，及由凝胶和可塑剂如丙三醇或山梨醇制成的密闭的软胶囊。推入配合胶囊在填充剂如乳糖，结合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁及可选择的稳定剂的混合物中包括活性组份。在软胶囊中，活性组份可以溶解或悬浮在适当溶液中，如脂肪油，液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，还可以加入稳定剂。微球组成形式也可以用于口服。本领域关于这类微球有详细的定义。口服用药的所有组成形式都应含适当的给药剂量。
口腔给药时，按传统方法采用片剂或锭剂的组成形式。
吸入给药时，根据本发明使用的化合物能方便的使用具有密封装置或使用适当推进气体如二氯二氟甲烷，.三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它适当气体的喷雾器以气溶胶喷雾的形式进行接种。在密封装置情况下通过计量阀测量气溶胶的剂量。吸入器或吹入器中使用的胶囊和凝胶药盒可以包含化合物的粉末混合物核适当的基质粉末如乳糖或淀粉。
当希望进行全身给药时，混合物的组成形式适合注射接种，如弹丸注射或连续注射。注射的组成形式可以按每安瓿一次注射剂量如或每个包装含多剂量，并添加了防腐剂。组成形式包括在油或水介质中的悬浮液，溶液或乳状液，还可能包括其它试剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。
注射接种的组成方式包括水溶性活性化合物的水溶液形式。此外，活性化合物的悬浊液还可以为适当的油质注射悬浊液。适当的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或人工合成的脂肪酸如油酸乙酯或甘油三酸酯或脂质体。水溶性注射悬浊液还包含能增加悬浊液粘性的物质，如羧甲基纤维素钠，山梨醇或右旋糖苷。悬浊液还可以包含适当的稳定剂，用来增加化合物的溶解度以制备高度浓缩的溶液。
活性化合物的组成形式还可以为粉末，使用前与适当介质如无菌，无热源的水混和。
化合物其它的组成形式还可以适合眼睛或阴道给药，如栓剂或保留灌肠，如包含常规的栓剂基质如可可油脂或其它丙三醇。
除了以前所述的组成形式外，化合物的组成形式还可以以储存方式构成。这种长时间作用的组成形式与适当聚合体或疏水物质(如溶于认可油脂中的乳剂)或离子交换树脂，或sparingly可溶性的衍生物，如sparingly可溶性盐。
药物的组成中还可以包括适当的固体或凝胶支持物或赋形剂。这类支持物或赋形剂包括但不局限于碳酸钙，磷酸钙，多种糖，淀粉，纤维素衍生物，凝胶和聚合体如聚乙二醇。
适当的液体或固体药物组成形式还有用于吸入的水溶液或盐溶液，微胶囊形式，encochleated，包被微小金颗粒，被脂质体包被，雾化，气溶胶，植入皮肤的小球，或干燥于尖锐物体表面用于皮肤划痕的形式。药物组成形式还包括颗粒，粉末，片剂，糖衣片，(微)球体，栓剂，糖浆剂，乳剂，悬浊液，霜剂，能够延长释放活性组份的滴剂，其中的含有常规使用的赋形剂，添加剂和/或辅助剂如崩解剂，结合剂，包被剂，膨胀剂，润滑剂，调味品，增甜剂或增溶剂。药物组成形式适用于多种给药系统。参考Langer于1990年发表在《Science》249卷1527-1533页的文章，可以对给药方法有简要简要了解，这篇文章在此通过引证被并入本文。
可以单独接种免疫调节核酸和其它治疗性制剂和/或抗原，也可以以药学界认可的盐溶液形式接种。作为药物使用时，应使用药学界认可的盐，但可以使用非药学界认可的盐制备药学界认可的盐。这类盐包括但不局限于由下列酸制备所得到盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，马来酸，乙酸，水杨酸，p-甲苯酸性硫酸，酒石酸，柠檬酸，甲烷酸性硫酸，蚁酸，丙二酸，琥珀酸，萘-2-硫酸，苯硫酸。这类盐还可以为碱金属或碱土金属，如钠，钾或羧酸族钙盐。
适当的缓冲液包括乙酸和盐(1-2％ w/v)；柠檬酸和盐(1-3％ w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％ w/v)；磷酸和盐(0.8-2％ w/v)。适当的防腐剂包括杀藻胺(0.003-0.03％ w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％ w/v)；对羟基苯甲酸脂类(0.01-0.25％w/v)硫栁汞(0.004-0.02％ w/v)。
正如这里详细描述的一样，本发明的药物组成包含有效用量的免疫调节核酸和可以选择的抗原和/或其它包括药学界认可的介质构成的治疗性制剂。术语“药学界认可的介质”是指一种或多种相容性固体或液体填充物，稀释剂或适用于人体或其它脊椎动物的胶囊材料。术语“介质”是指天然或合成的无机或有机组份，活性组份与之结合有利于使用。药物组成中的组份与本发明的组份在不互相作用影响药效的情况下，还能够互相混和使用。
本发明中使用的免疫调节核酸可以与佐剂，其它治疗性制剂或抗原混和后给药。混合物中除了包含免疫调节核酸或几种抗原或其它治疗剂外，还可以包含几种佐剂。
可以使用多种免疫途径。根据使用的特定佐剂或所选择抗原，治疗对象的状态及达到治疗效果所需剂量的不同选择适当的免疫途径。一般而言，本发明的方法可以采用医学上认可的任何方法进行免疫，即能产生有效免疫反应但不会产生临床上不能接受的副作用的方法。优先选择的免疫方法已经在上面进行过讨论。
药物组成应为方便的一次注射剂量形式，其制备方法为药学领域熟知。所有的方法都包括使化合物与包含一种或多种必需组份的介质交联。化合物与液体介质，微小的固体介质或二者进行均一、充分混和制备获得药物组份，如果需要还可以对其塑型。液体剂量单位是瓶装或安瓿。固体剂量单位是药片，胶囊或栓剂。对治疗病人而言，根据化合物的活性，接种方式，免疫目的(如预防或治疗)，疾病的性质或严重程度，病人年龄和体重不同需要不同的剂量。一定剂量可以采用单次注射或多次小剂量注射的方式进行接种。多次接种之间间隔一定星期或月是为了加强特定的抗原反应。
其它给药系统包括延时释放，缓释或持续释放的系统。这些系统能避免重复免疫，便于医生和病人使用。本领域专业技术人员熟知多种类型的释放给药系统。包括聚合体基质系统如多聚(丙交酯-乙交酯)，copolyoxalates，聚己酸内酯，聚酰胺酯，聚邻位酯，聚羟基酪酸和多聚酐。
包含药物的微胶囊聚合体见美国专利5,075,109中的描述。给药系统还包括非聚合体系统包括固醇如胆固醇，胆甾醇酯和饱和脂肪酸的脂类或中性脂肪如单价，二价和三价甘油酯；水凝胶释放系统；sylastic系统；以多肽为基础的系统；蜡包被系统；使用常规粘合剂和赋形剂制备的压缩片剂；部分熔合的植入物及类似物。特殊的实例包括但不局限于(a)侵蚀系统，由本发明的试剂与基质联合组成，见美国专利号为4,452,775，4,675,189，5,736,152中描述，(b)扩散系统，其中的活性成份以固定速率从聚合体中渗出，见美国专利号3,854,480，5,133,974，5,407,686中描述。此外还可以使用以泵为基础的硬件给药系统，其中的一些适用于移植。
通过下列实例对本发明进行进一步说明，而不应解释为进一步限制。所有参考资料的全部内容(包括参考文献，已批准专利，已出版专利的应用，待批准专利的应用)在此通过引用被并入本文。
实例例1(ODN 10102)简述本报告总结了ODN 10102(序列编号1)与ODN 7909(序列编号2)在人细胞中表现相似，在某些方面前者优于后者的体外试验数据。小鼠中的体外和体内试验数据表明CpG ODN10102与CpG ODN 7909在活化固有免疫系统方面作用相似，有时表现更好，与抗原共同接种时能促进小鼠HBsAg特异性体液和细胞免疫反应。
使用的检测方法是受体结合(TLR9)，B细胞活化(细胞表面表达活化标记，B细胞增生)和分泌细胞因子(IL-10，IP-10，IFN-α和TNF-α)。所有检测表明ODN 10102即使不比ODN7909更好的话，则具有与其几乎等同的特性。
使用未致敏BALB/c小鼠脾细胞进行体外研究(如B细胞增生试验，NK细胞裂解活性，细胞因子分泌特性)。通过检测这两种ODN对乙肝B抗原(HBsAg)特异免疫反应的增强潜力进行体内比较研究。
材料和方法人类细胞试验寡聚脱氧核苷所有的ODN由Coley PharmaceuticalGmbH(Langenfeld，德国)提供。对照ODN包括无刺激性CpG基序。ODN用磷酸盐缓冲液稀释，储存在-20℃。所有稀释液均为无热源试剂。
TLR9试验本试验使用的细胞表达人TLR9受体，含有报告基因结构。细胞与ODN孵育16小时。每个数据点进行三次检测。裂解细胞分析报告基因的活性。根据介质中没有添加ODN的报告基因活性计算刺激指数。
纯化细胞来自健康献血者的外周血由德国红十字会(Rathingen，德国)提供，通过Ficoll-Hypaque(Sigma，德国)离心纯化PBMC。纯化的PBMC可以立即使用，也可以重悬于冷冻介质中储存于-70℃。需要时，将细胞融化，洗涤，重悬于添加10％(v/v)经热灭活的FCS，1.5mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI 1640培养基中。
检测细胞因子融化或新鲜PBMC重悬后调整浓度为5×106个/ml，加入48孔平底培养板(1ml/孔)，培养板中没有液体或加入不同浓度的ODN。在37℃孵箱中培养细胞。指定时间点收集细胞培养上清。如果不立即使用，上清冻存于-20℃备用。使用商业购买的ELISA试剂盒(IL-10，Diaclone，美国)或使用购买的抗体(Pharmingen或PBL；分别为德国或美国)自行开发的ELISA方法检测上清中的细胞因子。
流式细胞仪检测分析B细胞活化从Becton Dickinson(德国)购买抗CD19和CD86的单克隆抗体。PBMC与不同浓度ODN或不与ODN孵育48小时。通过流式细胞仪检测是否表达CD19验证B细胞。检测数据记录在FACSCalibur(Becton Dickinson)。使用CellQuest(Becton Dickinson)计算机程序分析数据。通过流式细胞仪检测CFSE(CFSE为可以结合到所有细胞表面的荧光染料)含量的减少评估CFSE标记PBMC培养后的CD19阳性B细胞增殖。
小鼠的体内和体外试验寡聚脱氧核苷CpG ODN(GMP质量等级)由ColyPharmaceutical Inc提供(Wellesley，MA)。所有ODN重悬于pH8.0灭菌无内毒素TE中(OmniperR；EM Science，Gibstown，NJ)，储存和处理过程中按照无菌要求操作，防止受到微生物和内毒素污染。检测用ODNs的稀释使用pH7.2的灭菌无内毒素PBS(Sigma Chemical Company，St，Louis，MO)。
动物所有试验均使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，试验动物由加拿大Charles River(Quebec，加拿大)提供，并饲养于Ottawa Hospital Research Institute(Civic Site)的试验动物饲养机构的小型隔离容器内。
脾细胞的获得和培养所有体外试验中均使用未致敏BALB/c小鼠的脾细胞。试验动物异荧烷麻醉后，颈椎脱臼处死。无菌条件下摘取脾脏并置于含0.2％牛血清白蛋白(SigmaChemical Company)的PBS中。脾脏研磨后，使用含2％正常鼠血清(Cedarlane Laboratories，Ontario，Canada)，青霉素-链霉素溶液(终浓度分别为1000U/ml和1mg/ml，Sigma ChemicalCompany)和5×10-5Mβ-巯基乙醇(Sigma Chemical Company)的RPMI 1640组织培养基中(Life Technologies，Grand Island，NY)。
B细胞增殖试验使用完全RPMI 1640制备的脾细胞悬液调整至终浓度为5×106个/ml。100μl脾细胞悬液和100μl用完全RPMI 1640培养液稀释至合适浓度的刺激物加入U型底的96孔组织培养板中。使用的刺激物为CpG ODN 7909，10102，10103，10104，1015，或10106(浓度为1，3，10μg/ml)。刀豆球蛋白A(10μg/ml，Sigma化学公司)和LPS(10μg/ml，Sigma化学公司)作为阳性对照，只加培养基的细胞作为阴性对照。每种脾细胞样品平行做三孔，细胞在37℃ 5％ CO2孵箱中孵育96小时。孵育结束后，加入3H标记的胸腺嘧啶(20μCi/ml)作用16小时，收获细胞检测放射活性。
分泌细胞因子的特性制备脾细胞悬液，按B细胞增殖试验中描述的方法加入U型底的96孔组织培养板中。每种脾细胞样品平行做三孔，细胞在37℃ 5％ CO2孵箱中孵育6小时，12小时或48小时。孵育结束后，96孔板1200rpm离心5分钟，收获上清，冻存于-80℃备用。使用商业购买的检测试剂盒(小鼠OptEIA试剂盒；PharMingen，Mississauga，ON)根据说明书分别对培养6小时(TNF-α)、24小时(IL-12)和48小时(IL-6和IL-10)的细胞上清进行检测。
NK细胞试验按前述方法制备脾细胞悬液，用完全RPMI1640培养液调整其终浓度为3×106个/ml。10ml脾细胞悬液(30×106个细胞)和CpG ODN 7909，10102，10103，10104，1015，或10106(浓度为1，3，10μg/ml)中的一种混合加入T-25组织培养瓶中(Fisher Scientific，Ottawa，ON)。只加培养基的细胞作为阴性对照。每种脾细胞样品在37℃ 5％ CO2孵箱中孵育24小时。孵育结束后，按不同效靶比在U型底的96孔组织培养板中加入浓度为5×104个/ml51Cr标记的靶细胞(100μl/孔)。NK敏感性小鼠淋巴细胞系YAC-1(ATCC#TIB-160，ATCC，Manassas，VA)作为靶细胞系。每个样品平行作三孔，细胞在37℃ 5％ CO2孵箱中孵育4小时。靶细胞单独与培养基或2N HCl孵育分别检测其自发分泌和最大分泌量。孵育结束后，收获上清，通过γ计数器检测放射活性的水平。使用下列公式计算裂解百分数 免疫小鼠单独使用HBsAg ad亚型(International Enzymes，CA)或分别与10μg CpG ODN 7909或10102，10103，10104，1015，或10106联合使用免疫BALB/c小鼠(每组10只)。初次免疫后4周采血并加强免疫。加强免疫后1周，每组麻醉5只动物，取脾用于CTL检测试验。
检测抗体反应通过终点稀释ELISA法检测和定量检测抗HBsAg特异抗体(总IgG，IgG1和IgG2a)，每个动物样品平行检测三次。以非免疫血浆吸光值的2倍加0.05作为阈值，免疫血浆在最高稀释度时的吸光值大于此阈值的稀释度为终点效价。这一结果作为组平均效价±SEM。
统计学分析使用InStat软件(Graph PAD软件，圣迭哥)进行统计学分析。通过Student’s检验(用于2组之间)或Tukey’s检验(用于3组或更多组之间)的单因素ANOVA对原始数据或转换数据(对异方差群体进行以10为底的对数转换)进行组间统计学差异分析。
结果TLR9结合试验最近验证了识别CpG序列的的受体结构，为Toll样受体(TLR)家族成员(Hemmi等人，2000)。TLR9受体可以被包含适宜免疫调节CpG序列的ODNs激活。我们将稳定表达人TLR9的细胞系分别与不同浓度的ODNs 7909和10102及对照ODN进行孵育(图1)。
结果显示，ODN 10102激活TLR9的效果等同或优于ODN7909的作用效果。两种ODNs具有相同的剂量反应曲线，在相同浓度到达最高活性。使用的对照ODN在最高浓度12μg/ml也未能诱导TLR9活化。
人B细胞试验B型ODNs的一个特点是具有有效激活B细胞的能力(Krieg等人，1995)。B细胞和浆细胞DC是已知表达TLR9的免疫细胞(Krug等人，2001；Bauer等人，2001)。因此我们检测了由ODNs 7909和10102诱导产生的B细胞活化a.细胞表面标记CD86表达上调(图2)，b.检测B细胞增生(图3)。对表达CD86的B细胞而言，健康献血者的PBMC与不同ODNs孵育，按照材料与方法中的描述检测B细胞活性。
两种检测结果都表明10102和7909均为非常有效的人B细胞刺激剂。图2显示这些CpG ODNs在体外浓度仅为0.4μg/ml时就能激活B细胞。在浓度为1.6μg/ml时达到平台期。诱导B细胞增生试验得到相似结果(图3)，刺激指数在1.6μg/ml时达到最高。
分泌细胞因子试验B型ODNs在体内和体外均能诱导Th1为主的免疫反应。已经发现它们能诱导产生典型的Th1型细胞因子如IFN-和IFN-Th1相关的趋化因子如MCP-1和IP-10。此外还可以检测到少量分泌的炎症细胞因子IL-6和TNF-分泌负调节因子IL-10。我们检测了Th1型细胞因子如IFN-趋化因子IP-10，调节因子IL-10和前炎症因子TNF-.图4为来自3名不同供血者的细胞在ODNs浓度为0.2，0.4，1.6和5μg/ml时体外检测IFN-分泌的试验结果。
两种CpG ODNs，7909和10102，在最高浓度为0.4(7909)或1.6μg/ml(10102)时均能诱导分泌最高水平的IFN-α。但是与7909相比，10102刺激后IFN-α的分泌作用更显著。对照ODN在浓度为5.0μg/ml时仅诱导分泌少量IFN-α。此外，与对照ODN相比，ODNs 7909和10102诱导产生大量的趋化因子IP-10，如图5所示。
进行类似试验检测IL-10的分泌量(图6)。同样，如上述IFN-α试验所示，CpG ODNs 7909和10102表现出相似的特征，在某些试验中10102的效果更好一些。对照ODN只在最高浓度时诱导分泌IL-10。
如图7所示，与LPS相比，两种CpG ODNs 7909和10102及对照ODN表现出较弱的分泌前炎症因子TNF-α的特点。同样，在本试验中两种ODNs具有相似的作用。
在第一个试验设计中，进行了诱导鼠脾细胞增生的试验。根据图8所示，CpG ODN 10102与CpG ODN 7909在所有的试验浓度中诱导鼠B细胞增生的作用相当。
在第二个试验设计中，进行了10102，7909和2137诱导脾细胞分泌多种细胞因子的试验。根据图9所示，CpG ODN 10102和7909增强鼠脾细胞分泌细胞因子的作用相当。
根据图10中的数据，CpG ODN 10102和7909在鼠脾细胞培养中具有基本相同的增强NK细胞裂解活性的作用。
根据本研究的结果(图11)，与单独使用HBsAg相比，无论使用CpG ODN 7909或10102均能显著增强抗HBsAg的抗体效价(p＜0.001)，而对照ODN与HBsAg联合使用未能明显增强抗HBs的反应(p＝0.86)。
使用CpG ODN 7909比使用CpG ODN 10102使总IgG水平稍微增高，但具有显著意义(p＝0.04)。
在小鼠中广泛使用IgG亚类代表免疫反应的种类，IgG2a/IgG1比值高时表示以Th1型反应为主(Constant和Bottomly，1997)。在本研究中，与单独使用抗原或与对照ODN 2137联合使用相比，使用CpG ODN能显著增加IgG2a的效价(使用抗原与7909或10102相比，或抗原与抗原+21377相比，p＜0.001)。但是无论CpG ODN 7909或10102与HBsAg联合使用，IgG2a的反应水平均相似(p＞0.05)。因此CpG ODN7909或10102在诱导Th1为主的免疫反应方面具有相同的效力，该类免疫反应通过IgG2a的增高水平高于IgG1的方法进行检测。
结论人类细胞的系列体外试验数据显示ODN 10102的效果等同或优于之前确认的ODN 7909的效果。
小鼠中的体内和体外实验结果表明CpG ODN 10102具有与ODN 7909等同或更好的作用效果，与抗原同时免疫时，二者均具有下述能力体外试验中作用于固有免疫反应，体内试验中增强抗原的特异反应。
例2(ODN 10103)简述比较ODN 10103(序列编号19)和ODN 7909(序列编号2)在体外刺激人类PBMC的能力。通过检测受体(如TLR9)，B细胞激活(如细胞表面激活标志物的表达和B细胞增殖)和细胞因子的分泌(如IL-10，IP-10，IFN-α，IFN-α的分泌)分析免疫刺激作用。所有检测结果显示ODN 10103在这些方面具有等同或优于ODN 7909的作用效果。
ODN 10103在体内和体外实验中刺激鼠类免疫细胞的能力同ODN 7909进行了比较。在体外实验中(如B细胞增殖实验，NK细胞杀细胞活性和细胞因子分泌特性)使用未致敏BALB/c小鼠的脾细胞。体内实验进行了两种ODNs增强乙肝病毒表面抗原(HBsAg)特异性免疫反应的检测，其中同时分析了体液免疫(抗体)和细胞介导的免疫反应(CTL活性)。另外通过检测IgG2a/IgG1比值分析了诱发免疫反应中的Th1介导免疫反应，并检测了CTL反应强度。
材料和方法在人细胞试验中，参考实例1中关于寡聚脱氧核苷，TLR9试验，人细胞增殖试验，检测细胞因子和使用流式细胞仪分析B细胞活化的描述。
在小鼠的体内和体外研究中，参考实例1中关于寡聚核苷酸，动物，收获和培养脾细胞，B细胞增殖试验，细胞因子分泌特性，NK细胞试验，免疫小鼠，，检测抗体反应和统计学分析方面的描述。
小鼠的体外和体内研究CTL反应的评估CTL分析按照之前Davis等人的描述进行。用不同效应细胞∶靶细胞比例(E∶T)条件下的特异性杀伤百分比表示结果。
结果TLR9试验我们分别将ODN 7909，ODN 10103和对照ODN在不同浓度下同稳定表达人类TLR9的细胞系进行孵育(图.13)。两种ODN在剂量-反应曲线中都表现出浓度依赖性，并在相同的浓度达到最大活化效应。对照ODN即使在24μg/m1最高浓度仍没能诱导TLR9的活化。在低剂量处ODN 10103表现出比ODN 7909更强的刺激能力(如在6和12μg/ml处)，说明可以使用更低浓度的ODN 10103获得相同的免疫刺激指标，同时也可以降低潜在的毒性作用。
人类B细胞B型ODNs的一个重要特点是具有高效活化B细胞的能力(Krieg等人.，1995)。B细胞和浆细胞样树突状细胞是目前已知的仅有的两种表达TLR9的免疫细胞(Krug等人，2001；Bauer et al.，2001)。于是我们通过分析ODNs 7909和10103对细胞表面标志物CD86的上调检测它们直接激活B细胞(图.14)和刺激B细胞增殖(图.15)的能力。分别将不同的ODNs同来自健康供血者的PBMC中表达CD86的B细胞进行孵育，并按照材料和方法中的描述检测B细胞活性。
两个检测的结果表明10103对人类B细胞的刺激能力至少等同于7909。图14显示体外实验中所有的CpG ODNs能够在低至0.4μg/ml的浓度下刺激B细胞的活化，在浓度为1.6μg/ml时达到平台期，此时有大于60％的B细胞上调其CD86，与此相比，对照样品在相同浓度时刺激效果远小于CpG ODNs。所有三个供血者的检测中，ODN 10103在比ODN 7909低的剂量时能够刺激产生更强的CD86表达水平(如0.4μg/ml)，再次证明可以用更低剂量的ODN 10103来获得相同的免疫刺激效果。B细胞增殖实验中也获得了相同的结果(图15)。
分泌细胞因子试验B类ODNs在体内和体外都能诱导Th1介导的免疫反应。研究发现它们诱导IFN-α和IFN-β等Th1类细胞因子的同时也能诱导MCP-1和IP-10等趋化因子。另外它们还能诱导前炎症细胞因子IL-6和TNF-α以及负调节因子IL-10的分泌。于是我们检测了Th1类细胞因子INF-α，趋化因子IP-10，调节细胞因子IL-10和前炎症细胞因子TNF-α的分泌。
图16显示了体外实验中在0.2，0.4和0.6μg/ml浓度的刺激下6个不同供血者IFN-α的分泌。CpG ODNs 7909和10103在全部供血者的实验中均诱发了明显的IFN-α分泌。对照样品在1名供血者中诱发了弱的IFN-α分泌，其余5名供血者中没有诱发明显的分泌。数据表明在一些患者中存在个体差异性，他们对ODN 10103的反应性要优于ODN 7909。结果显示ODN应根据治疗对象的反应性进行分类。
除INF-α外，ODN 7909和10103可以诱发IP-10的分泌(图17)。在所有剂量组中ODN 10103诱发了等同或高于ODN 7909的IP-10分泌。需特别指出的是在0.4μg/ml剂量时ODN 10103诱发IP-10的量高于ODN 7909。在1.6μg/ml剂量时ODN 10103高于ODN 7909诱发IP-10量的25％。
如图18所示，CpG ODN 7909和10103表现出几乎相同的诱发IL-10的能力。
如图19所示，与LPS相比较，在所有检测浓度下ODN 7909，ODN 10103和对照ODN均显示出较弱的诱导前炎症细胞因子TNF-α分泌的能力。在最高检测浓度(如6μg/ml)，ODN 10103比ODN 7909能刺激产生更高浓度的IL-10。剂量-反应曲线见图19。
小鼠体外研究数据表明CpG ODN 7909和ODN 10103在刺激小鼠B细胞增殖，增加小鼠脾细胞分泌细胞因子和增强小鼠脾细胞中NK细胞的杀伤活性方面表现出相同的能力(图22)。在刺激IL-6和TNF-α分泌方面，ODN 10103表现出更高的能力，特别是在低浓度检测时。同样，ODNs在增强NK细胞杀细胞活性方面表现出浓度依赖性。
小鼠体内研究结果表明同时使用CpG ODN 7909或10103比单独使用HBsAg能明显提高特异性抗体的效价(分别为p＜0.001和p＜0.01)。使用对照ODN与HBsAg一同免疫没有明显提高特异性抗体的效价(p＝0.85)(见图23和图24)。
同时，使用HBsAg+ODN 7909和HBsAg+ODN 10103分别免疫小鼠，两者诱发的HBSAg特异性免疫反应强度没有显著性差异(p＝0.13)，说明ODN 7909和10103增强抗体反应的能力基本相同。
广泛使用小鼠IgG亚类分布确定免疫反应的种类IgG2a/IgG1高比值标志着Th1介导的免疫反应(1)。本研究中同时使用CpG ODNs比单独使用抗原和同时使用对照ODN 2137能明显提高IgG2a的效价(使用Ag与7909或10103相比p＜0.001；Ag+7909与Ag+2137相比p＜0.01；Ag+10103与Ag+2137相比p＜0.05)。与抗原一起同时使用CpG ODN 7909或10103时，IgG2a反应的水平相似(p＞0.05)。可以看出CpGODN 7909和10103增强Th1介导免疫反应的能力基本相同。
如图25所示，同时使用ODN 10103比同时使用ODN 7909免疫能在动物体内诱发更强的HBsAg特异性CTL反应。
结论人类PBMC系列体外实验显示B类ODNs分子(7909和10103)在进行的所有实验中表现出相似但不完全相同的能力。需特别注意的是在其中几项检测和功能性分析中，ODN 10103比之前确认的ODN 7909表现出更强的免疫刺激能力。这些区别说明CpG核苷酸可以根据使用对象的不同情况进行选择，同时较低剂量的CpG ODNs在降低潜在毒性的同时也可以达到理想的治疗效果。
例3(ODN 10104)体内效果简述合成寡聚脱氧核苷酸(ODN)含有未甲基化的CpG二聚核苷酸，显示出能够诱发针对传染因素的固有免疫反应和激活Th1样免疫反应的能力。利用CpG ODN的粘膜穿透能力进行生殖道粘膜给药的方式，检测ODN对阴道内(IVGA)感染单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)的保护和治疗能力。
材料和方法所有ODN均由Coley Pharmaceutical Group(Langenfeld，德国)提供，使用Limulus检测(Bio Whittaker，Verviers，Belgium)未检测到内毒素(＜0.1EU/ml)。ODN重悬于灭菌的无内毒素Tris-EDTA溶液(Sigma，Deisenhofen，德国)中，储存和处理过程中按照无菌要求操作，以防止微生物和内毒素的污染。使用无热源的磷酸盐缓冲液(Life Teehnologies，Eggenstein，Germmany)进行稀释。
在雌性C57B1/6小鼠阴道内(IVGA)感染HSV-2之前和之后的不同时间点，CpG ODN和非CpG ODN分别阴道内给药。病毒攻击后每天检测生殖道病变，小鼠存活和生殖道内病毒滴度。
结果
使用HSV-2阴道内攻毒前24小时经CpG ODN生殖道内处理过的雌性小鼠，攻毒后全部存活，表现出很低的阴道病变，感染后六天内在阴道洗液内检测不到病毒。应特别注意的是，感染前经生殖道粘膜接种CpG ODN的保护效果明显优于经肌肉接种CpG ODN的效果。同时，使用对照ODN处理没有表现出保护效果，出现严重的病变，阴道洗液中检出高滴度的HSV-2。阴道内HSV-2攻毒后短时间内给予CpG ODN处理，有部分保护效果，阴道内检出低滴度的HSV-2病毒。在阴道内HSV-2攻毒后24和72小时给予CpG ODN处理的小鼠中没有表现出保护效果(见图26和27)。
结论这些结果显示HSV-2攻击前或攻击后短时间内，经局部生殖道粘膜免疫CpG ODN可以有效预防性传播病毒的感染，也说明了CpG可以诱发固有免疫反应。
体外效果材料和方法来自健康献血者的外周血由德国红十字会(Rathingen，德国)提供，通过Ficoll-Hypaque(Sigma，德国)离心纯化PBMC。纯化的PBMC直接使用或悬于冻存培养基中-70℃。当需要使用时，将分装冻存的细胞溶解，洗涤，并重悬于含10％灭活牛血清、1.5mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640中。
融化或新鲜分离的PBMC细胞浓度调整为5×106个/mL，加入平底48孔板中(1mL/孔)，板中未加液体或加入不同浓度的ODN。置37℃ 5％ CO2孵箱中培养。48小时后收集上清。如果不立即使用，上清冻存于-20℃备用。使用商业上可购买的ELISA试剂盒(IL-10，Diaclone，美国)或购买抗体(Pharmingen，德国或PBL，美国)自行开发的ELISA检测方法(IFN-α)检测上清中的细胞因子含量。
结果B型ODNs可以在体内和体外诱导产生Th1为主的免疫反应。已经发现它们可以诱导分泌Th1型细胞因子如IFN-α，IFN-r及Th1型趋化因子MCP-1和IP-10。此外，还可以分泌少量的前炎症因子IL-6，TNF-α和负调节因子IL-10。因此我们检测了Th1型细胞因子IFN-α和调节因子IL-10的分泌量。图28为来自3名供血者的细胞分别与浓度为0.02，0.05，0.1，0.2，0.5和1.0μg/ml的10104或对照核酸孵育后，体外检测IFN-α的分泌结果。
核酸10104诱导分泌高水平的IFN-α，表现出剂量依赖性，10104核酸为0.1μg/ml时出现分泌高峰。对照核酸仅诱导产生少量的IFN-α，与单独加入培养基诱导产生的量相似(图28)。
进行了相似的试验检测IL-10的分泌(图4)。与上述IFN-α一样，核酸10104诱导产生的IL-10表现出剂量依赖性，分泌高峰出现在浓度为0.2μg/ml。对照核酸表现出类似但更低的诱导活性，尽管其高峰转移为0.5μg/ml。在本试验中，对照诱导产生的水平高于培养基诱导产生的水平。
TLR 9试验材料与方法
前面对表达人TLR9的稳定转染的HEK293细胞进行过描述〔Bauer等人；PNAS；2001〕。简言之，使用电穿孔将表达人TLR9和6xNFkB-荧光素酶的质粒载体转染HEK293细胞。稳定转染子(3×104个细胞/孔)与ODN在37℃孵箱中孵育16小时。每个数据点平行作三次。裂解细胞分析荧光素酶的活性(使用Perkin-Elmer的Brightlite试剂盒，Ueberlingen，德国)。根据未加ODN的培养基中报告基因的活性计算刺激指数。
结果最近验证了识别CpG序列的的受体结构，为Toll样受体(TLR)家族成员(Hemmi等人，2000)。TLR9受体可以被包含适宜免疫调节CpG序列的ODNs激活。我们将稳定表达人TLR9的细胞系分别与不同浓度的10104及对照ODNs进行孵育(图30)。
结果显示，ODN 10104激活TLR9具有剂量依赖性，在浓度为0.625μg/ml时达到最大刺激作用。另一方面，对照ODN仅在10μg/ml时出现刺激作用，但仍低于该浓度时10104核酸的作用。
与接种方法无关的CpG 10104的作用图61A和61B显示HSV-2经阴道攻击后使用BEMA盘或溶于生理盐水的CpG局部接种的作用效果。雌性C57/B16小鼠每只皮下注射2mg黄体酮(病毒攻击前4天)。溶于生理盐水或浸渍于可生物降解的粘膜吸附盘(BEMA)上的CpG 10104(浓度为1，10或100mg)在病毒攻击24小时前逐渐灌输到阴道腔内(IVAG)。病毒攻击时，先用棉拭子擦洗IVAG，将小鼠背向下进行氟烷麻醉，在1小时内缓慢滴注10ml含104PFU的HSV-2(333株)。病状分为5个等级0为没有感染；1为外阴轻微发红；2为外阴红肿；3为外阴和周围组织严重红肿；4为生殖器和周围组织出现溃疡，并伴有红肿，掉毛；5为扩散到周围组织的严重生殖器溃疡。达到第5阶段时处死小鼠。图表显示与感染后时间(天数)相关的病理等级，图61A为CpG吸附到BEMA盘的结果，图61B为采用溶于生理盐水的结果。
结果显示CpG吸附到BEMA盘或溶于生理盐水后，采用小鼠IVAG免疫形式能降低随后进行的IVAG HSV-2感染导致的阴道病理情况。
图62A和62B显示使用BEMA盘或溶于生理盐水的CpG局部免疫对HSV-2阴道内攻击后小鼠存活率的影响。小鼠处理方式如上所述。每天进行监测，出现扩散到周围组织的严重生殖器溃疡时处死小鼠。图表显示与感染后时间(天数)相关的存活百分数，图62A为CpG吸附到BEMA盘的结果，图62B为采用溶于生理盐水的结果。
结果显示CpG吸附到BEMA盘或溶于生理盐水后，采用小鼠IVAG免疫形式能增加随后进行的IVAG HSV-2感染导致的存活率。
注射免疫CpG 10104图63和64显示注射免疫CpG 10104对小鼠血浆中IP-10和IFN-r水平的影响。雌性BALB/c小鼠皮下注射100nM溶于生理盐水的CpG 10104或resiquimod(R-848)。注射后在多个时间点(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12小时)采血，收集血浆，使用ELISA检测IP-10水平。
结果显示皮下注射CpG 10104后，能显著增加血浆中IP-10和IFN-r的水平，该水平高于注射R-848产生的水平。
粘膜免疫CpG 10104图65显示阴道内免疫CpG 10104对小鼠血浆中IP-10水平的影响。溶于生理盐水的CpG 10104，溶于生理盐水的CpG 7909或resiquimod(R-848)滴注雌性BALB/c小鼠阴道腔内，每只100nM。免疫后在多个时间点(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12小时)采血，收集血浆，使用ELISA检测IP-10水平。结果显示CpG 10104进行IVAG滴注后能显著增加血浆中IP-10的水平。
图69显示阴道内免疫CpG 10104对小鼠阴道洗液中IP-10水平的影响。溶于生理盐水的CpG 10104，溶于生理盐水的CPG 7909或resiquimod(R-848)滴注雌性BALB/c小鼠阴道腔内，每只100nM。免疫后在多个时间点(15分钟，30分钟，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12小时)用75ml PBS冲洗小鼠阴道腔，冲洗三次。使用ELISA检测阴道洗液中的IP-10水平。结果显示CpG 10104进行IVAG滴注后能显著增加阴道腔中IP-10的水平。
局部免疫CpG 10104图67显示HSV-2阴道攻击后，局部免疫CpG 10104对局部病理的影响。雌性C57/B16小鼠每只皮下注射2mg黄体酮(病毒攻击前4天)。病毒攻击24小时前将溶于生理盐水的CpG 10104(浓度为1，10或100mg)或Resiquimod(浓度为1，10或100mg)滴注小鼠阴道腔(IVAG)。病毒攻击时，先用棉拭子擦洗IVAG，将小鼠背向下进行氟烷麻醉，在1小时内缓慢滴注10ml含104PFU的HSV-2(333株)。HSV-2攻击后每天监测生殖器病变情况，在未知情况下记录病理结果。病状分为5点等级0为没有感染；1为外阴轻微发红；2为外阴红肿；3为外阴和周围组织严重红肿；4为生殖器和周围组织出现溃疡，并伴有红肿，掉毛；5为扩散到周围组织的严重生殖器溃疡。达到第5阶段时处死小鼠。
图表显示使用溶于生理盐水的CpG 10104或Resiquimod免疫后，平均病理等级与感染后时间(天数)的相关性。结果显示CpG 10104经IVAG免疫小鼠后能降低与IVAG HSV-2感染相关的阴道病理等级，CpG 10104比10倍剂量的R-848更有效。
图68显示局部免疫CpG 10104后HSV-2阴道攻击对小鼠存活率的影响。按上述方法处理小鼠。每天对小鼠进行监测，出现扩散到周围组织的的严重生殖器溃疡时处死小鼠。图表显示溶于生理盐水的CpG 10104或Resiquimod免疫后，与感染后天数相关的存活百分数。
结果显示在小鼠中采用IVAG免疫CpG 10104，在随后的IVAG HSV-2感染中能增强存活率，CpG 10104比10倍剂量的R-848更有效。
图70A和70B显示局部免疫CpG后，在随后使用HSV-2阴道内攻击时对小鼠存活率和局部病状的影响。按上述方法处理小鼠。病毒感染4小时后，分别单独滴注溶于生理盐水的CpG 10104(100mg)或水包油乳膏于阴道腔(IVAG)中，或二者联合使用，每天一次连续滴注5天。HSV-2攻击后每天监测生殖器病理情况，在未知情况下记录病理结果。病状分为5点等级0为没有感染；1为外阴轻微发红；2为外阴红肿；3为外阴和周围组织严重红肿；4为生殖器和周围组织出现溃疡，并伴有红肿，掉毛；5为扩散到周围组织的严重生殖器溃疡。达到第5阶段时处死小鼠。图表显示使用溶于生理盐水的CpG 10104免疫后，与感染后天数有关的存活百分数(图70A)和局部病状等级(图70B)。
结果显示溶于生理盐水的CpG 10104或水包油乳膏经IVAG免疫后能降低病状，增强曾对小鼠是致死剂量HSV-2感染后的存活率。
免疫动物图71A和71B显示在BALB/c小鼠中增强抗HBsAg体液反应方面，CpG 10104具有和CPG 7909同样有效的作用。在BALB/c小鼠中单独使用1mg HBsAg或与10mg ODN和/或铝佐剂(25mg AL3+)联合使用，左胫前肌注射免疫。初次免疫4周后加强免疫。加强免疫2周后通过终点ELISA法检测抗体效价。图71A为无铝佐剂的试验结果，图71B为有铝佐剂的试验结果。
图72A和72B显示在BALB/c小鼠中促进产生抗HBsAg的以Th1反应为主的免疫反应方面(由IgG2a与IgG1的高效价比决定)，CpG 10104具有和CPG 7909同样有效的作用。在BALB/c小鼠中单独使用1mg HBsAg或与10mg ODN和/或铝佐剂(25mg AL3+)联合使用，左胫前肌注射免疫。初次免疫4周后加强免疫。加强免疫2周后通过终点ELISA法检测IgG各亚型的水平。
例4(ODN 10105)简述该报告总结了使用人细胞进行的体外试验中ODN 10105与ODN 7909具有同样优异或更好作用的试验数据。此外，在小鼠的体内和体外试验数据显示ODN 10105与ODN 7909具有同样优异或更好作用，表明ODN 10105可以激活先天免疫系统，与HBsAg共同免疫时能促进抗原特异性的体液和细胞免疫反应。
使用的试验方法是受体结合(TLR9)，B细胞活化(细胞表面表达活化标记，B细胞增生)和分泌细胞因子(IL-10，IP-10，IFN-α和TNF-α)。所有试验表明ODN 10105具有与ODN7909相似或更好的特性。使用未致敏BALB/c小鼠脾细胞进行体外研究(如B细胞增生试验，NK裂解活性，细胞因子分泌特性)。通过检测这两种ODN对乙肝B抗原(HBsAg)特异免疫反应的增强潜力进行体内比较研究。
材料与方法在人细胞试验中，参考实例1中关于寡聚脱氧核苷，TLR9试验，人细胞增殖试验，检测细胞因子和使用流式细胞仪分析B细胞活化的描述。
在小鼠的体内和体外研究中，参考实例1中关于寡聚核苷酸，动物，收获和培养脾细胞，B细胞增殖试验，细胞因子分泌特性，NK细胞试验，免疫小鼠，，检测抗体反应和统计学分析方面的描述。
结果TLR9试验我们将稳定表达人TLR9的细胞系与不同浓度的ODNs 7909和10105及对照ODN共同孵育(图31)。结果显示在活化TLR9方面两种B型ODNs没有显著差异。两种ODNs表现出相同的剂量反应曲线，在相同浓度达到最高活性。对照ODN即使在最高浓度24μg/ml也未能诱导TLR9活化。
人B细胞B型ODNs的一个特点是具有有效激活B细胞的能力(Krieg等人，1995)。B细胞和浆细胞DC是已知表达TLR9的免疫细胞(Krug等人，2001；Bauer等人，2001)。通过细胞表面标记CD86表达上调(图32)和B细胞增生(图33)对ODNs 7909和10105直接激活B细胞的能力进行了检测。对表达CD86的人B细胞而言，健康献血者的PBMC与不同ODNs孵育，按照材料与方法中的描述检测B细胞活性。
两种检测结果都表明10105和7909均为非常有效的人B细胞刺激剂。图32显示这些CpG ODNs在体外浓度仅为0.4μg/ml时就能激活B细胞。在浓度为1.6μg/ml时达到平台期，与没有刺激作用的对照相比，超过70％的B细胞上调表达CD86。除了10105在最高剂量6μg/ml时仍能诱导B细胞增殖，而7909在1.6到3.0μg/ml时达到平台期外，二者在诱导B细胞增殖试验中得到相似结果(图33)。
分泌细胞因子试验B型ODNs在体内和体外均能诱导Th1为主的免疫反应。已经发现它们能诱导产生典型的Th1型细胞因子如IFN-γ和IFN-α及趋化因子如MCP-1和IP-10。此外还可以检测到少量分泌的炎症细胞因子IL-6和TNF-α及分泌负调节因子IL-10。使用10105和7909免疫后，检测了Th1型细胞因子如IFN-α，趋化因子IP-10，调节因子IL-10和前炎症因子TNF-α。图34为来自6名不同供血者的细胞在ODNs浓度为0.2，0.4和1.6μg/ml时体外检测IFN-α分泌的试验结果。
两种CpG ODNs在最高浓度为0.4到1.6μg/ml时均能诱导分泌最高水平的IFN-α。对照ODN在浓度为5.0μg/ml时仅诱导分泌少量IFN-α。与ODN 7909相比，ODN 10105在1.6和5.0μg/ml时诱导产生高水平的IFN-α。与对照ODN相比，ODNs7909和10105诱导产生趋化因子IP-10，如图35所示，在浓度为0.4μg/ml时，ODN 10105诱导产生的趋化因子水平更高。
还对不同细胞因子的时间依赖性进行了分析。来自不同供血者的PBMC孵育8小时，24小时，36小时和/或48小时后，检测IL-10或IFN-α的分泌量。图36和37显示来自2名不同供血者的细胞孵育8小时和24小时后(图36)或36小时和48小时后(图37)IFN-α的检测结果。与CpG ODN孵育至少8小时后开始分泌IFN-α，24小时和48小时达到最高分泌量。LPS不诱导分泌IFN-α。对两名供血者而言，在浓度为1.6μg/ml时孵育8小时后，ODN 10105刺激产生较高水平的IFN-α。
检测IL-10分泌试验得到类似结果(图38和39)。尽管该细胞因子在48小时时达最高分泌量，它与IFN-α表现出相似的特点。如以上IFN-α试验所示，两种CpG ODNs 7909和10105在所有试验中均表现出相似的特点。
小鼠的体外研究如图40所示，在所有的试验浓度中ODN10105比ODN 7909具有更强的刺激B细胞增殖的作用。根据图41显示的数据，CpG ODN 7909和10105均能刺激分泌IL-10，IL-12，IL-6和TNF-。就分泌IL-12和TNF-而言，在所有试验浓度ODN 10105比7909作用更强。
在小鼠脾细胞培养中，CpG ODN具有几乎相同的增强NK细胞裂解活性的效力(图42)。
如图43所示，与单独使用抗原相比，无论CpG ODN 7909或10105均能限制增强抗HBsAg的抗体效价(p＜0.0001)，对照ODN与HBsAg联合使用时，抗HBs反应没有限制增强(p＝0.85)。
如图44所示，两种CpG ODN诱导总IgG的升高水平相似。在小鼠中广泛使用IgG亚类代表免疫反应的种类，IgG2a/IgG1比值高时表示以Th1型反应为主(Constant和Bottomly，1997)。在本研究中，与单独使用抗原或与对照ODN 2137联合使用相比，使用CpG ODN能显著增加IgG2a的效价(使用抗原与7909或10105相比，p＜0.001；或抗原+7909与抗原+21377相比，p＜0.01；或抗原+10105与抗原+2137相比，p＜0.05)。但是无论CpG ODN 7909或10105与HBsAg联合使用，IgG2a的反应水平均相似(p＞0.05)。因此CpG ODN 7909或10105在诱导Th1为主的免疫反应方面具有相同的效力，该类免疫反应通过IgG2a的增高水平高于IgG1的方法进行检测。
结论人细胞试验的体外数据显示ODN 10105与ODN 7909作用相似，在某些应用中前者效果更好。根据小鼠中的研究结果，CpG ODN 7909和10105具有相似的免疫增强特点，与抗原同时免疫时，二者均具有下述能力体外试验中作用于固有免疫反应，体内试验中增强抗原的特异反应。
例5(ODN 10106)HCV研究简述本研究比较了CpG ODN 10106和CpG ODN 7909对PBMCs的免疫激活特点，PBMCs从健康成年人和慢性HCV感染者中分离获得。对这两种ODNs激活B细胞增殖，分泌细胞因子(IL-10和IFN-α)和趋化因子(IP-10)的能力进行了检测。所有试验显示ODN 10106具有与ODN 7909几乎相当或更好的作用，从健康成年人和慢性HCV感染者中分离获得的PBMCs试验中得到相似结果。
材料与方法人(HCV)研究寡聚脱氧核苷根据与Coley Pharmaceutical集团签订的合同生产了CpG ODN 7909，10106和对照ODN 4010。所有的ODN重溶于无菌，无内毒素，pH8.0的TE中(OmniperR；EMScience，Gibstown，NJ)，储存和处理过程中按照无菌要求操作，防止受到微生物和内毒素污染。对照ODN 4010不含刺激CpG基序。使用前用RPMI 1640完全培养基(Gibco，BRL，GrandIsland，NY)配制ODNs的稀释液，含10％正常人AB血清(WisentInc，St.Bruno，QC)(热灭活)，1％青霉素/链霉素(Gibco，BRL，Grand Island.NY)。
使用的ODNs序列如下表所示
表1试验中使用的ODN序列分离PBMC从10名健康成年人和10名HCV慢性感染者使用含有肝素、顶部为绿色的真空采血袋静脉采集20mL全血，其中的HCV慢性感染者不处于以IFN-α为基础的前6个月疗程阶段。使用Ficoll-Pacque 400×g离心35分钟分离外周血单核细胞(PBMCs)。用含有10％健康人AB血清(热灭活)和1％青霉素/链霉素的RPMI完全培养基制备浓度为10×106个/mL的细胞悬液。
B细胞增殖试验用含有10％健康人AB血清(热灭活)和1％青霉素/链霉素的RPMI完全培养基稀释ODNs至下列浓度2，6，12μg/ml。稀释好的ODNs加入圆底96孔板中，每孔100μL。用含有10％健康人AB血清(热灭活)和1％青霉素/链霉素的RPMI完全培养基重悬新分离到的PBMCs，细胞终浓度为1×106个/mL，然后加入96孔板(100μL/孔)，使ODN的终浓度为1，3，6μg/ml。培养5天后，加入3H标记的胸腺嘧啶(1μCi/孔)孵育16到18小时。孵育结束后，用滤纸进行过滤收获细胞，检测放射活性。与未处理的培养基对照相比，结果以刺激指数(ST)表示。
检测细胞因子用含有10％健康人AB血清(热灭活)和1％青霉素/链霉素的RPMI完全培养基稀释ODNs至下列浓度2，6，12μg/ml。稀释好的ODNs加入平底96孔板中，每孔100μL。每孔加入新分离的细胞浓度为10×106个/mL的PBMCs(100μL/孔)，使ODN的终浓度为1，3，6μg/mL。细胞在37℃ 5％ CO2孵箱中孵育48小时后，收集每孔中的上清，冻存于-80℃备用。
使用购买自R&D Systems，Minneapolis，MN(货号分别为#41105，D1000和DIP100)的ELISA试剂盒，按照说明书检测IFN-α，IL-10和IP-10的水平。
统计学分析使用InStat软件(Graph PAD软件，圣迭哥)进行统计学分析。通过Tukey-Kramer多重比较检验的单向ANOVA对原始数据或转换数据(以10为底的对数转换)进行组间统计学差异分析。如果数据转换后，Bartlett检验表明标准偏差之间存在显著差异，使用非参数ANOVA(Kurskal-Wallis检验)进行分析。
结果B细胞增殖试验B型ODNs的一个特点是具有有效激活B细胞的能力(Krieg等人，1995)。两种B型ODNs，7909和10106刺激B细胞增殖的能力如图45所示。
与CpG ODN 7909相比，10106具有相同的刺激B细胞增殖的作用。此外，它们刺激PBMCs的能力没有显著差异，无论PBMCs来自健康成年人或慢性HCV感染者。
分泌细胞因子/趋化因子试验B型ODNs在体内和体外均能诱导Th1为主的免疫反应。已经发现它们能诱导产生典型的Th1型细胞因子如IFNα和IFN-α及趋化因子如MCP-1和IP-10。此外还可以检测到少量分泌的炎症细胞因子IL-6和TNF-α及分泌负调节因子IL-10。图46，47，48显示了B型ODNs刺激产生Th1类细胞因子IFN-α，趋化因子IP-10及调节细胞因子IL-10的能力。
B型ODNs，7909和10106，诱导分泌相似浓度的IFN-α。
使用两种CpG ODNs之一，7909或10106刺激PBMCs后，分泌相同浓度的IP-10。两种ODNs刺激分离自健康成年人或慢性HCV感染者的PBMCs分泌IP-10的能力没有差异。ODN 7909和10106在浓度为3μg/ml时均能诱导分泌最高水平的IP-10。对IL-10进行了同样的分析试验(图48)。
CpG ODNs 7909和10106能诱导分离自两种人群的PBMCs产生相似浓度的IL-10。两种ODNs浓度为6μg/ml时诱导分泌最高水平的IL-10。
结论分离自两个不同人群(正常健康人和以前未接受过IFN-α治疗的慢性HCV感染者)的外周血单核细胞的体外试验数据表明B型CpG ODNs 7909和10106在同一人群中具有相同的刺激B细胞增殖，分泌IFN-α，IL-10和IP-10的能力，在两个人群中也具有同样的作用。
非HCV研究简述CpG ODN 10106属于B型核酸。本研究中的试验将CpGODN 10106和CpG ODN 7909的免疫激活特点进行了比较。对体外和体内的免疫学参数进行了评估。
通过比较ODNs 10106和7909对人PBMC的作用得到体外试验数据。进行的试验包括受体结合(TLR9)，B细胞活化(细胞表面表达活化标记，B细胞增生)和分泌细胞因子(IL-10，IP-10，IFN-α和TNF-α)。所有试验表明ODN 10106具有与ODN 7909相似的特性。
使用未致敏BALB/c小鼠脾细胞进行体外研究(如B细胞增生试验，NK裂解活性，细胞因子分泌特性)。通过检测这两种ODN对乙肝B抗原(HBsAg)特异免疫反应的增强潜力进行体内比较研究。体内比较研究中，既可以增强体液免疫反应(抗体)，也可以增强细胞介导的免疫反应(CTL活性)。此外，通过IgG2a/IgG1的比率检测诱导产生的免疫反应种类(如Th1与Th2)及CTL反应的强度。
材料与方法在人体细胞方面，参考实例1中关于寡聚脱氧核苷，TLR9试验，人细胞纯化，检测细胞因子和使用流式细胞仪检测B细胞活化方面的描述。
小鼠的体外和体内研究中，参考实例1关于寡聚脱氧核苷，动物，收获和培养脾细胞，B细胞增殖试验，分泌细胞因子的特点，NK试验，免疫小鼠，检测抗体反应和统计学分析方面的描述。
结果TLR9试验我们将稳定表达人TLR9的细胞系与不同浓度的ODNs 7909和10106及对照ODN共同孵育(图49)。结果显示在活化TLR9方面两种B型ODNs没有显著差异。两种ODNs表现出相同的剂量反应曲线，对照ODN即使在最高浓度12μg/ml也未能诱导TLR9活化。
激活人B细胞B型ODNs的一个特点是具有有效激活B细胞的能力(Krieg等人，1995)。B细胞和浆细胞DC是已知表达TLR9的免疫细胞(Krug等人，2001；Bauer等人，2001)。因此我们检测了由ODNs 7909和10106诱导直接激活B细胞上调表达细胞表面标记CD86(图50)及.B细胞增生(图51)。对表达CD86的人B细胞而言，健康献血者的PBMC与不同ODNs孵育，按照材料与方法中的描述检测B细胞活性。
B细胞增殖试验所有的检测结果显示10106和7909均为有效的B细胞刺激剂。图50显示在体外试验中这些CpG ODNs在浓度仅为0.4μg/ml时就具有很强的B细胞刺激作用。浓度为1.6μg/ml时达到平台期。诱导B细胞增殖试验(图51)中得到同样的结果，在浓度为0.8μg/ml时刺激指数达到最高。
分泌细胞因子B型ODNs在体内和体外均能诱导Th1为主的免疫反应。已经发现它们能诱导产生典型的Th1型细胞因子如IFN-γ和IFN-α及趋化因子如MCP-1和IP-10。此外还可以检测到少量分泌的炎症细胞因子IL-6和TNF-α及分泌负调节因子IL-10。因此我们检测了Th1型细胞因子如IFN-α，趋化因子IP-10，调节因子IL-10和前炎症因子TNF-α。
图52显示来自3名不同供血者的细胞在ODNs浓度为0.2，0.4，1.6和5μg/ml时体外检测IFN-α分泌的试验结果。两种ODNs，7909和10106，前者在浓度为0.4μg/ml，10106浓度为1.6μg/ml时均能诱导分泌高水平的IFN-α。但是与7909相比，10106刺激后三个显著因素之一是IFN-α达到最大分泌量。对照ODN在浓度为5.0μg/ml时诱导分泌少量IFN-α。
此外，与对照ODN相比，ODNs 7909和10106诱导分泌大量的趋化因子IP-10，如图53所示。本试验中浓度为0.2μg/ml时达到平台期。
进行类似的试验检测IL-10的分泌(图54)。同IFN-α试验一样，两种CpG ODNs 7909和10106在所有的检测中表现出几乎相同的特点。对照ODN仅在最高浓度时诱导分泌IL-10。
图55显示，与LPS相比，ODNs 7909和10106与对照ODN在所有的检测浓度表现出较弱的分泌前炎症因子TNF-α的特点。使用两种ODNs刺激后可以观察到相似的特征。
根据试验数据，两种ODNs 7909和10106具有基本相同的增强小鼠脾细胞分泌细胞因子的效力(图57)。
B细胞增殖根据试验数据，在诱导B细胞增殖的所有试验浓度中，CpG ODN 10106如果不优于CpG ODN 7909，也具有与其相同的效力(图56)。
NK试验根据试验数据，在小鼠脾细胞培养中两种CpGODNs 7909和10106具有相同的增强NK细胞裂解活性的效力(图58)。
总IgG反应根据本研究的结果，与单独使用HBsAg相比，无论使用CpG ODNs 7909或10106均能显著增强抗HBsAg的抗体效价(p＜0.0001)，而使用抗原+CpG ODN 7909或抗原+CpG ODN 10106免疫动物为出现显著差异(p＝0.86)。对照ODN与HBsAg联合使用不能显著增强抗HBs反应(p＝0.86)(图59)。使用CpG ODN 7909使总IgG水平稍微但明显高于使用CpG ODN 10106时增高水平(p＝0.04)。
体液反应的种类(IgG1与IgG2a的比率)在小鼠中广泛使用IgG亚类代表免疫反应的种类，IgG2a/IgG1比值高时表示以Th1型反应为主(Constant和Bottomly，1997)。在本研究中，与单独使用抗原或与对照ODN 2137联合使用相比，使用CpG ODN能显著增加IgG2a的效价(使用抗原与7909相比，p＜0.01；或抗原与10106相比，p＜0.001；或抗原+7909与抗原+2137相比，p＜0.001；或抗原+10106与抗原+2137相比，p＜0.01)。但是无论CpG ODN 7909或10106与HBsAg联合使用，IgG2a的反应水平均相似(p＞0.05)。因此CpG ODN 7909或10106在诱导Th1为主的免疫反应方面具有相同的效力，该类免疫反应通过IgG2a的增高水平高于IgG1的方法进行检测(图60)。
结论人外周血单核细胞的体外数据表明B型的两种分子(7909和10106)在进行的多种试验中作用如果不相同也相似。在某些试验中，ODN 10106优于ODN 7909。
根据在小鼠研究中的结果，CpG ODN 7909和10106具有相似的免疫增强特点，与抗原同时免疫时，二者均具有下述能力体外试验中作用于固有免疫反应，体内试验中增强抗原的特异反应。
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7.McCluskie，M.J.，and H.L.Davis 1998.CpG DNA is a potent enhancer of systemicand mucosal immune responses against hepatitis B surface antigen with intranasaladministration to mice J Immunol.1614463-6等同物通过以上实例，本领域的专业人员能够掌握本发明的方法。通过实例说明本发明的一个方面，其它作用相似的实施方案同样在本发明的范围之中，因此本发明不局限于以上提供的实例中。本领域的专业人员很容易认识到，除了这里描述的修改外，对本发明进行的多种修改均在所附录权利的范围内。以上所述的每一个实例不需要全部体现本发明的优点和目的。
序列表<110>科勒制药集团有限公司<120>调节免疫反应的核酸成份<130>C01037.70041.WO<140>US 60/394,090；US 60/394,091；US 60/393,880；US 60/394,164；US60/394,193<141>2002-07-03<160>142<170>patentIn version 3.2<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>寡聚脱氧核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n is a，c，g，or t<400>109tcgtcgtttc gtcgttttgt ngtt 24<210>110<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>110cgtcgtttcg tcgttttgtc gtt 23<210>111<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>111gtcgtttcgt cgttttgtcg tt 22<210>112<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>112tcgtttcgtc gttttgtcgt t21<210>113<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>113cgtttcgtcg ttttgtcgtt 20<210>114<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>114gtttcgtcgt tttgtcgtt 19<210>115<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>115tcgtcgtttc gtcgttttgt cgt 23<210>116<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>116tcgtcgtttc gtcgttttgt cg 22<210>117<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>117tcgtcgtttc gtcgttttgt c21<210>118<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>118tcgtcgtttt gtcgtttttt tcga 24<210>119<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>n is a，c，g，or t<400>119nnnnnnnnnn nnnnnttttt tcga 24<210>120<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>120ttttttcga 9<210>121<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(20)..(24)<223>n is a，c，g，or t<400>121tcgtcgtttt gtcgtttttn nnnn 24<210>122<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>122tcgtcgtttt gtcgttttt 19<210>123<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>123tcgtcgtttt gtcgtttttt tcg 23<210>124<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>124tcgtcgtttt gtcgtttttt tc 22<210>125<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>125tcgtcgtttt gtcgtttttt t21<210>126<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>126tcgtcgtttt gtcgtttttt 20<210>127<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>127cgtcgttttg tcgttttttt cga 23
<210>128<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>128gtcgttttgt cgtttttttc ga 22<210>129<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>129tcgttttgtc gtttttttcg a21<210>130<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>130cgttttgtcg tttttttcga 20<210>131<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>131gttttgtcgt ttttttcga 19<210>132<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>132ttttgtcgtt tttttcga18<210>133<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>133tttgtcgttt ttttcga 17<210>134<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>134ttgtcgtttt tttcga 16<210>135<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>135tgtcgttttt ttcga 15<210>136<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>136gtcgtttttt tcga14
<210>137<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>137tcgttttttt cga 13<210>138<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>138cgtttttttc ga 12<210>139<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>139gtttttttcg a 11<210>140<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>140tttttttcga 10<210>141<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>141tcgtcgtttt tcgtgcgttt tt 22<210>142<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脱氧核苷酸<400>142tgctgctttt tgctggcttt tt 2权利要求
1.一种组合物，包括由序列编号1，序列编号19，序列编号45，序列编号118或序列编号141核苷酸序列组成的免疫调节核酸分子。
2.如权利要求1的组合物，其中免疫调节核酸分子由序列编号1，序列编号19，序列编号45，序列编号118或序列编号141的核苷酸序列组成。
3.如权利要求1的组合物，其中还包括抗原。
4.如权利要求3的组合物，其中抗原可以为微生物抗原，癌抗原或过敏原。
5.如权利要求4的组合物，其中微生物抗原可以为细菌抗原，病毒抗原，真菌抗原或寄生虫抗原。
6.如权利要求3的组合物，其中抗原由核酸载体编码。
7.如权利要求3的组合物，其中核酸载体与免疫调节核酸不同。
8.如权利要求3的组合物，其中抗原为多肽抗原。
9.如权利要求1的组合物，其中还包括佐剂。
10.如权利要求9的组合物，其中的佐剂可以为粘膜佐剂。
11.如权利要求1的组合物，其中还包括细胞因子。
12.如权利要求1的组合物，其中还包括治疗性制剂如抗微生物制剂，抗癌制剂，或过敏/哮喘药物。
13.如权利要求12的组合物，其中抗微生物制剂可以为从下列组中选取，包括抗细菌制剂，抗病毒制剂，抗真菌制剂和抗寄生虫制剂。
14.如权利要求12的组合物，其中抗癌制剂包括化疗制剂，癌症疫苗和免疫治疗制剂。
15.如权利要求12的组合物，其中过敏/哮喘药物可以为PDE-4抑制剂，支气管扩张剂/β-2拮抗剂，K+通道开放剂，VLA-4对抗剂，neurokin对抗剂，TXA2合成抑制剂，xanthanine，花生四烯酸对抗剂，5 lipoxygenase抑制剂，thromboxin A2受体对抗剂，thromboxane A2对抗剂，5-lipox激活蛋白抑制剂和蛋白酶抑制剂。
17.如权利要求1的组合物，其中免疫调节核酸的核苷酸骨架至少包括一种修饰。
18.如权利要求17的组合物，其中骨架修饰为硫代磷酸修饰。
19.如权利要求17的组合物，其中核苷酸骨架修饰为嵌合修饰。
20.如权利要求17所述，其中核苷酸骨架为全部修饰。
21.如权利要求1的组合物，其中还包括药学界认可的载体。
22.如权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸是未甲基化的CpG二核苷酸。
23.如权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸至少包括4个CpG基序。
24.如权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸富含T。
25.如权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸包括多聚T序列。
26.如权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸包括多聚G序列。
27.如权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸以口服形式配制。
28.如权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸以营养添加剂形式配制。
29.如权利要求28的组合物，其中的营养添加剂的形式有胶囊，丸剂或舌下片剂。
30.如权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸采用局部给药方式配制。
31.如权利要求1的组合物，其中免疫调节核酸采用注射给药方式配制。
32.如权利要求1的组合物，其中免疫调节核酸采用持续释放给药装置的方式配制。
33.如权利要求1的组合物，其中免疫调节核酸采用粘膜表面给药方式配制。
34.如权利要求1的组合物，其中粘膜表面是从包括下列的组中选取的，包括口腔，鼻腔，直肠，阴道和眼睛粘膜表面。
35.如权利要求1的组合物，其中免疫调节核酸刺激产生粘膜免疫反应。
36.如权利要求1的组合物，其中的免疫调节核酸刺激全身免疫反应。
37.如权利要求1的组合物，其中提供能有效刺激产生粘膜免疫反应所需量的免疫调节核酸。
38.如权利要求1的组合物，其中提供能有效刺激产生全身免疫反应所需量的免疫调节核酸。
39.如权利要求1的组合物，其中提供能有效刺激固有免疫反应所需量的免疫调节核酸。
40.如权利要求1的组合物，其中提供能有效治疗或预防感染性的疾病所需量的免疫调节核酸。
41.如权利要求1的组合物，其中提供能有效治疗或预防过敏反应所需量的免疫调节核酸。
42.如权利要求1的组合物，其中提供能有效治疗或预防哮喘所需量的免疫调节核酸。
43.如权利要求1所述的组合物，其中提供的免疫调节核酸的用量能有效治疗或预防癌症。
44.如权利要求32所述的组合物，其中的持续释放装置为微粒体。
45.如权利要求40所述的组合物，其中的感染性疾病为单纯疱疹病毒感染。
46.一种在需要免疫的对象中刺激产生免疫反应的接种方法使用由序列编号1，序列编号19，序列编号45，序列编号118或序列编号141核苷酸序列组成的免疫调节核酸分子进行接种，接种量为能有效刺激产生免疫反应。
47.如权利要求46的方法，其中的免疫对象为已经感染或易感染的高危人群。
48.如权利要求47的方法，其中的感染可以为细菌性感染，病毒性感染，真菌感染和寄生虫感染。
49.如权利要求48的方法，其中的的感染性病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)，人T淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)，人T淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，单纯疱疹病毒2型(HSV-2)，人乳头瘤病毒(多型)，甲肝病毒，乙肝病毒，丙肝和丁肝病毒，EB病毒(EBV)，巨细胞病毒和传染性软疣病毒。
50.如权利要求49的方法，其中病毒感染为单纯疱疹病毒感染。
51.如权利要求46的方法，其中免疫对象为具有过敏史或易过敏的高危人群。
52.如权利要求46的方法，其中免疫对象为患哮喘或易患哮喘的高危人群。
53.如权利要求46的方法，其中免疫对象为患癌症或易患癌症的高危人群。
54.如权利要求46的方法，还可以向免疫对象接种抗原。
55.如权利要求53的方法，其中抗原是从包括下列的组中选取的，包括微生物抗原，癌抗原，自身抗原和过敏原。
56.如权利要求54的方法，其中微生物抗原从包括下列的组中选取的，包括细菌抗原，病毒抗原，真菌抗原和寄生虫抗原。
57.如权利要求55的方法，其中抗原可以来源于下列微生物疱疹病毒属，逆转录病毒属，orthomyroviridae，弓形体，haemophilus，campylobacter，梭状芽孢杆菌，大肠杆菌和葡萄球菌。
58.如权利要求46的方法，其中免疫反应是抗原特异的免疫反应。
59.如权利要求53的方法，其中的抗原由核酸载体编码。
60.如权利要求59的方法，其中核酸载体与免疫调节核酸不同。
61.如权利要求54的方法，其中抗原为肽抗原。
62.如权利要求46的方法，还可以向免疫对象接种佐剂。
63.如权利要求62的方法，其中佐剂为粘膜佐剂。
64.如权利要求46的方法，还可以向免疫对象接种第二种治疗性制剂。
65.如权利要求64的方法，其中第二种治疗性制剂为抗微生物制剂。
66.如权利要求65的方法，其中抗微生物制剂为抗细菌制剂，抗病毒制剂，抗真菌制剂和抗寄生虫制剂。
67.如权利要求64的方法，其中第二种治疗性制剂为抗癌制剂。
68.如权利要求67的方法，其中抗癌制剂可以为化疗制剂，癌症疫苗和免疫调节剂。
69.如权利要求64的方法，其中第二种治疗性制剂为过敏/哮喘药物。
70.如权利要求69的方法，其中过敏/哮喘药物是从包括下列的组中选取的，包括PDE-4抑制剂，支气管扩张剂/β-2拮抗剂，K+通道开放剂，VLA-4对抗剂，neurokin对抗剂，TXA2合成抑制剂，xanthanine，花生四烯酸对抗剂，5 lipoxygenase抑制剂，thromboxin A2受体对抗剂，thromboxane A2对抗剂，5-lipox激活蛋白抑制剂和蛋白酶抑制剂。
71.如权利要求46的方法，其中免疫调节核酸的核苷酸骨架至少包括一种修饰。
72.如权利要求71的方法，其中骨架修饰为硫代磷酸修饰。
73.如权利要求71的方法，其中核苷酸骨架修饰为嵌合修饰。
74.如权利要求71的方法，其中核苷酸骨架为全部修饰。
75.如权利要求46的方法，其中免疫调节核酸是未甲基化的CpG二核苷酸。
76.如权利要求46的方法，其中免疫调节核酸包括多聚G序列。
77.如权利要求46的方法，其中免疫调节核酸采用口服方式。
78.如权利要求46的方法，其中免疫调节核酸采用局部接种方式。
79.如权利要求46的方法，其中免疫调节核酸采用注射接种的方式。
80.如权利要求46的方法，其中的免疫调节核酸采用持续释放给药装置的方式。
81.如权利要求46的方法，其中免疫调节核酸采用粘膜表面接种的方式。
82.如权利要求46的方法，其中免疫反应为粘膜免疫反应。
83.如权利要求46的方法，其中免疫反应为全身免疫反应。
84.如权利要求81的方法，其中粘膜表面是从包括下列的组中选取的，包括口腔，鼻腔，直肠，阴道和眼睛表面。
85.如权利要求46的方法，还包括从免疫对象中分离得到的免疫细胞，与有效剂量的免疫调节核酸孵育后，将活化的免疫细胞回输给免疫对象。
86.如权利要求85的方法，其中免疫细胞为淋巴细胞。
87.如权利要求85的方法，其中免疫细胞为树突状细胞。
88.如权利要求85的方法，还可以将免疫细胞与抗原进行接触。
89.如权利要求46的方法，其中免疫对象为人。
90.如权利要求46的方法，其中免疫对象是从包括下列的组中选取的，包括狗，猫，马，牛，猪，绵羊，山羊，鸡，猴和鱼。
91.如权利要求46的方法，其中免疫对象为感染性疾病患者或高危人群，其中的方法是治疗或预防感染性疾病的方法。
92.如权利要求46的方法，其中免疫对象为哮喘患者或高危人群，其中的方法为治疗或预防免疫对象哮喘的方法。
93.如权利要求46的方法，其中免疫对象为过敏患者或高危人群，其中的方法为治疗或预防过敏的方法。
94.如权利要求46的方法，其中免疫对象为癌症患者或高危人群，其中的方法为治疗或预防癌症的方法。
95.如权利要求94的方法，其中癌症是从包括下列的组中选取的胆道癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；结缔组织癌；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；胃癌；何杰金淋巴瘤；内皮瘤；喉癌；淋巴瘤；肝癌；肺癌(如小细胞和非小细胞)；黑色素瘤；神经细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌和肾癌。
96.如权利要求46的方法，还可以接种特异针对细胞表面抗原的抗体，其中产生的免疫反应为抗原依赖的细胞毒作用(ADCC)。
97.一种预防免疫对象发生疾病的方法，免疫对象接种免疫调节核酸，其中免疫调节核酸包括序列编号1，序列编号19，序列编号45，序列编号118或序列编号141的核苷酸序列。
98.一种诱导产生天然免疫反应的方法，免疫对象接种免疫调节核酸的用量能有效激活天然免疫反应，其中免疫调节核酸包括序列编号1，序列编号19，序列编号45，序列编号118或序列编号141的核苷酸序列。
99.一种用于验证免疫调节核酸的方法，包括以下方面检测免疫细胞群与免疫调节核酸接触后活化的对照水平，使用的免疫调节核酸包括序列编号1，序列编号19，序列编号45，序列编号118或序列编号141的核苷酸序列；检测免疫细胞群与试验核酸孵育后活化的试验水平；比较活化的对照水平和活化的试验水平，其中试验水平等于或高于对照水平表示为免疫调节核酸。
全文摘要
本发明提供了包含CpGA基序的免疫调节核酸和其刺激免疫力的使用方法。
文档编号A61P31/00GK1678188SQ03820863
公开日2005年10月5日 申请日期2003年7月3日 优先权日2002年7月3日
发明者阿瑟·M·克里格 申请人:科勒制药集团有限公司